La historia del canthin-6-ona : un potencial
nuevo tratamiento de la enfermedad de Chagas
aislado a partir de la planta paraguaya Z.
chiloperone (tembetary hu)
Alain FOURNET, PhD
UMR217 - IRD
Laboratorio de Farmacognosía
Facultad de Farmacia-Paris 11
Châtenay-Malabry 92290 – Francia
Primer Congreso Paraguayo sobre Medio Ambiente y
Desarrollo Sostenible
Hotel Excelsior Asunción, Paraguay
28 Jul. 2010 – 30 Jul. 2010
Proporción de nuevas drogas desarolladas
durante el periodo 1975-2005 para las
enfermedades desatendidas tropicales y la
tuberculosis
Chirac P., Torreele E. Lancet. 2006 May 12; 1560-1561.
Criterios etnofarmacológicos y
químiotaxonomicos (presencia de
alcaloides)
Actividad in vitro sobre tres cepas de
Leishmania y tres clones de Trypanosoma
cruzi
Métodos de selección
Zanthoxylum chiloperone var. angustifolium
Engl. (Rutaceae)
tronco frutas
Nombre vernacular: tembetary hu (tembé = labio, ità = piedra, y = arbol, hu =
negro)
Uso: antiparasitico, antimálarico, antiinflamatorio
Aislamiento y identificación
de los principios activos
Esquema de extracción de la corteza del tronco de
Zanthoxylum chiloperone (Rutaceae)
Cortezas del tronco de Zanthoxylum chiloperone (1.9 kg)
Amoladura y alcalinización
Con NH4OHSoxhlet CH2Cl2 y
Soxhlet MeOH Extracto
CH2Cl244 gExtracto MeOH
258.5 gCC flash elución AcOEt/ CH2Cl2 (8:2)
CC= columna cromatográfica
CLHP = cromatografía líquida de
alta performance
f1
3.81 g
f2
16.52 g
f3
2.32 g f4
3.78 g
f5
1.99 g
f6
1.65 g
f7
1.99
g
f8
1.88 gf9
6.52 gEt2O/Ac2O (v/v)
F6a
soluble
1.35 g
F6b
insoluble
306 mg
CLHP semi-preparativa
con 197 mg
5-metoxi-canthin-6-ona
150 mg
Cristalización en acetona
f3a
16.52 g
f3b
520 mgf4a
1.84 gf4b
1.94
g
canthin-6-ona 3.2 g
Moléculas responsables de la actividad antifúngica
1 2 3 41 2 31 2 3 41 2 3 4
Perfil CCM(a 254 nm)
Candida albicans
N-oxi-canthin-6-ona
5-metoxi-canthin-6-ona
canthin-6-ona
1 2 3 41 2 3 41 2 3
Aspergillus fumigatus
(cepa resistante)
C6
Candida albicans
1 2 3 41 2 3C6
Canthin-6-ona
3 C6 21
Saccharomyces cerevisiae
Cryptococcus neoformans
1 23 C6
Actividad antifúngica del canthin-6-ona y de
5-MeO-canthin-6-ona
Thouvenel C., Gantier J. C., Duret P., Fourneau C., Hocquemiller R., Ferreira M. E., Rojas de Arias A., Fournet A.
(2003) Antifungal compounds from Zanthoxylum chiloperone var. angustifolium. Phytotherapy Research 17, 678-680
Estudio biológico sobre
Trypanosoma cruzi
Químoterapia existante de la enfermedad
de Chagas
Fase aguda
NifurtimoxBenznidazole
Ningún tratamiento realmente eficaz
para tratar la fase crónica
Drogas en estudio preclínico o en desarollo
clínico
Compuestos antifúngicos de tipo triazoles
D0870
(Zeneca Pharmaceuticals)SCH56592 Posaconazole
(Schering)
BMS-207,147
(ravuconazole)
UR-9825
(Grupo Uriach)TAK-187
(Takeda Co)
Características de la droga ideal para tratar la
enfermedad de Chagas
Nuevo tratamiento por adultos y niños eficaz en los
estadios agudo y crónico
Prioridad a la formulación pediatrica
Eficaz contra todas las cepas de T. cruzi
Menos tóxico y más eficaz que las drogas en el
mercado
« Facil de uso »
– Tratamiento de 30 dias maximo
– De preferencia por via oral
– De preferencia una vez por dia
Estable en medio tropical
Costo abordable
Compuestos de origen natural activos in
vivo sobre Trypanosoma cruzi
….no hay !!
Compuestos aislado y probados en la enfermedad de Chagas
experimental
Canthin-6-ona
5-metoxi-canthin-6-ona
N-oxi-canthin-6-ona
benzo[4,5]-canthin-6-ona
N
N
O
Efecto del benznidazole, canthin-6-ona y 5-MeO-canthin
-6-ona en ratones Balb/c infectados con Trypanosoma cruzi en fase aguda
Químoterapia de la enfermedad de Chagas
J. Ethnopharmacol. 2007, 109, 258-263
Patente IRD/Universidad Nacional de Asuncion: PCT/FR03/03459 du 24/11/2003.
Serología ensayos in vivo fase crónica
(cepa CL, T. cruzi)
J. Ethnopharmacol., 2007, 109, 258Serología: ELISA anti-T. cruzi.
1/ 75 dias post-infección; 15 dias post-tratamiento
2/ 105 dias post-infección; 45 dias post-tratamiento. Valor de P vs no tratados
Patente IRD/Universidad Nacional de Asuncion: PCT/FR03/03459 du 24/11/2003
Nueva Estrategia de
Desarollo - Investigación
Extracción Síntesis
•Uso de recursos renovables
(hojas, frutos, semillas…)
• Preparación de extractos
estandarizados
• Confirmación de la eficacia
• Busqueda de socios
industriales
Para preservar el recurso natural: dos opciones
•Preparación por via síntetica
de una biblioteca de
canthinonas
• Optimización
• Estudios de farmacología
• Cambio de escala
ESTUDIOS A PARTIR DE LOS EXTRACTOS
La bioautografía
Extracto CH2Cl2Ketoconazole
Fase mobile : CH2Cl2/MeOH (8/2)
Extracto MeOH
Cryptococcus neoformans
KetoconazoleExtracto MeOHExtracto CH2Cl2
Candida albicans
Análisis por HPLC
Cromatogramas de los productos de referencias
(HPLC-UV)
Concentraciones en compuestos activos de los varios
extractos preparados a partir de los diferentes organos de
Z. chiloperone
Canthin-6-one
(mg/g extracto)
5-MeO-canthin-
6-one
N-oxido-canthin-
6-one
Corteza de tronco
(diclorometano)
64,7 29,4 63,2
Corteza de tronco
(metanol)
85,6 19,1 8,2
Hojas
(diclorometano)
5.2 10.8 ND
Hojas (metanol) 2.5 5.0 ND
Frutos ND 3.5 ND
Corteza de raiz 8.2 2.5 ND
Resina 0.6 5.0 1.9
ND= no detectado
Actividad tripanocida in vitro de los extractos de Z. chiloperone
(formas tripomastigote e amastigote)
Tripomastigotes
(% lisis)*
Amastigotes
Intracelulares
(µM)
% anti-amastigotes
actividad
Corteza de tronco
(diclorometano)51 -
Corteza de tronco
(metanol)56 -
Hojas (diclorometano) 73 -
Hojas (metanol) 78 -
Frutos 45 -
Corteza de raiz 48 -
Canthin-6-ona 79 15,1 90
5-metoxi-canthin-6-ona 75 15,1 66,4
Violeta de genciana 100 - -
Benznidazole 87 192 97,5
*% de lisis a 250 µg/ml
ACTIVIDAD IN VIVO DEL EXTRACTO ETANOLICO DE HOJAS
SOBRE RATONES INFECTADOS CON T. CRUZI
Cepa CL
Cepa Y
Elaboración de una pomada antifúngica a base de
un extracto total de la corteza de Z. chiloperone var.
angustifolium
« pie de atleta » tratado con la
pomada
pomada Uña con infección fúngica
… y tratado con la pomada durante
tres meses
ESTUDIOS A PARTIR DE LAS MOLECULAS
DE SINTESIS
Síntesis química
Síntesis de la canthin-6-ona y sus análogos
(ciclización de Bischler-Napieralski)
55 %
CH2Cl2, 18h, ATNH
NH2
R3
R1
R2
OOO
NH
O
R3
O
HO
NH
NH
O
R3
O
R1
R2
MeO
NH
R1
R2
N
DBU, CH2Cl2, 18h, AT
POCl3
refluxing benzene, 2h
Amberlit H-15 ¨MeOH, 18 h, 60¡C
R3
O
MeO
NH
R1
R2
N
N
O
Unos compuestos análogos obtenidos
10-metoxi-canthin-6-ona 9-fluoro-canthin-6-ona 2-metil-canthin-6-ona benzo[4-5]-canthin-6-ona
1,4-di-fluorobenzo[4-5]-
canthin-6-onapirazino[4-5]-canthin-6-ona ciclohexil[4-5]-canthin-6-ona
Síntesis de más de 40 canthinonasSoriano-Agaton F., J. Nat. Prod. 2005, 68, 1581
Optimización de la síntesis
Majoramiento de los rendimientos (80-85 %)
Preparación de 2-3 g de un golpe
Nuevo metodo « one spot »
Reducción drástica de los residuos y de los
catalizadores con metales pesados
Enfoque del mecanismo de
acción
Busqueda de blancos potenciales
Canthin-6-ona antifúngica se acumula en las gotas lipidicas y
afecta el metabolismo de los acidos grasos de
Saccharomyces cerevisiae
Localización de canthin-6-
one en el colorante rojo de
Nilo en Saccharomyces
cerevisiae por microscopia
confocal
Lagoutte et al., Biomed. Pharmacother. 2008, 62, 99.
Hipotesis: una estimulación de la cadena alkila de la enzima desaturasa. Los agentes
antifúngico clasicos no afectan el nivel de desaturasa.
Jours
0%
20%
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J0 J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7 J8 J9 J10 J11 J12 J13 J14
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J0 J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7 J8 J9 J10 J11 J12 J13 J14
C6 20 IP
Jours
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J0 J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7 J8 J9 J10 J11 J12 J13 J14
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J0 J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7 J8 J9 J10 J11 J12 J13 J14
C6 20 VO (canthin-6-one 20 mg/kg/j par voie orale)
Jours
% de
survie
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J0 J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7 J8 J9 J10 J11 J12 J13 J14
C6 10 IP
fluconazole
Actividad in vivo del canthin-6-ona
Canthin-6-ona
No tratado
Actividad in vivo de la 9-fluoro-canthin-6-ona
Jours
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J0 J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7 J8 J9 J10 J11 J12 J13 J14
% de
survie
C6-9F 20 VO
Jours
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J0 J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7 J8 J9 J10 J11 J12 J13 J14
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J0 J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7 J8 J9 J10 J11 J12 J13 J14
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20%
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80%
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J0 J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7 J8 J9 J10 J11 J12 J13 J14
% de
survie
C6-9F 20 IP
no tratado
9-fluro-canthin-6-one
kétoconazole
la metilación
reduce la actividad
la quaternización
reduce la actividad
auscencia de
sustitución
un atómo de fluor favorece
la actividad
la metoxilación
reduce la actividad
Relación estructura-actividad
N
N
O
2
4
5
10
9
Colaboración entre
IRD y DNDi
(Drugs for Neglected Diseases initiative)
Consorsio « canthin »
IRD, CNRS, Paris 11 (Francia), Universidad Nacional de Asuncion (Paraguay): redes y proveedores de hits
Centre for Drug Candidate Optimisation (CDCO), Monash Institute of Pharmaceutical Sciences, Australia, ADMET (administración, distribución, metabólismo, excreción y toxicología), bioensayos in vitro contra Trypanosoma cruzi
Alpha Chimica (Francia): síntesis de canthin-6-ona y derivados
OTROS ESTUDIOS CON CANTHIN-6-ONA
Estudio farmacéutico de la forma
galénica
Preparación de sales de canthinonas y
ensayos de cristalización
Perfíl fisicoquímico y formulación
Estudio de la estabilidad física y química
bajo estrés y estudio de polimorfismo
Formulación relevante por la
administración por via oral
Parametros farmacologicos de la canthin-6-ona
Propriedades fisicoquímicas
– in silico predictions consistent with “drug-like” properties
– Moderate to good aqueous solubility, pH dependent
– Moderately protein bound (91.1%)
Intermediate to high in vitro metabolism (microsomes)
– EH 0.80 (mouse); 0.63 (human)
High permeability in PAMPA (52% recovery)
In vivo mouse exposure
– Rapidly absorbed following IP dosing; Cmax ~5 min
– Good exposure following PO dosing; Cmax ~15min, exposure out to >7.5h
– Data suggests reasonable oral BA
Structure-based toxicity alerts
– No alerts
– Toxicity: LD50 reported at around 400 mg/kg.
Perspectivas
A corto plazo:
• Micropropagación de plantines (comunidades campesinas en
Itaipu)
• Desarollo local de productos fitofarmacos con extractos para
tratamiento de las infecciones fúngicas
•Estudios complementarias de la actividad antichagasica, de
toxicología del extracto
Con las canthin-6-onas y derivados de síntesis:
• Nuevos analogos, optimización de la síntesis, nuevas
propriedades biológicas (malaria…), toxicología, cambio de
escala (scale-up), farmacología, formulación…..
ANUNCIO
Busquamos inversionistas o facilidores en Paraguay
para desarollar productos antifúngicos a base de
Z. chiloperone (hojas)
Uso como fitofarmacos para medicinas humana y
veterinaria
Muchas gracias a todas las personas que participaron
a los estudios sobre Z. chiloperone y las canthin-6-onas
Laboratoire de Pharmacognosie, UMR 217(CNRS-Paris 11, IRD), Faculté de Pharmacie, Université Paris-
Sud, Châtenay-Malabry France
-Pr Reynald Hocquemiller Dr Bruno Figadère, Pr Erwan Poupon
-- Dra Delphine Lagoutte Dra Flor Agaton Dr Gerardo Cebrian
-Dr Alain Fournet
Instituto de Investigaciones en las Ciencias de la Salud, Departamento de Medicina Tropical, Universidad de
Asunción, Asunción, Paraguay
- Dra Antonieta Rojas de Arias -Lic. Maria Elena Ferreira, - Lic. Ninfa Vera de Bilbao
-Dra Alicia Schinini - Dr Hector Nakayama, - Lic. Susana de Ortiz, - Lic.
Luis Sanabria, - Lic. Elva Serna
CEDIC, Asuncion, Paraguay:
Dra Antonieta Roja de Arias Dra Miriam Rolon
Dra Celeste Vega
Alpha Chimica, Faculté de Pharmacie, Châtenay-Malabry, France:
Dr. Bernardin AKAGAH Dr Anh Tuan LORMIER
Muchas gracias por su
atención !!