UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E GENÉTICA
PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos
de peixes marinhos e estuarinos
WASHINGTON CANDEIA DE ARAÚJO
NATAL-RN 2009
ii
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E GENÉTICA
PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos
de peixes marinhos e estuarinos
WASHINGTON CANDEIA DE ARAÚJO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular do Centro de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Genética e Biologia Molecular.
Orientador: Prof. Dr. Wagner Franco Molina
NATAL-RN 2009
iii
A José Inácio e Adelma
iv
“As he stood upon the watch deck
Looking out onto the sea
It would offer no solutions
Only silent company” (The Wake of Magellan)
v
AGRADECIMENTOS
Este trabalho, resultado de quase dois anos de pesquisa, foi possível
graças à participação (direta ou indiretamente) de algumas pessoas.
Sobretudo, deixo meus sinceros agradecimentos ao orientador Dr. Wagner
Franco Molina, por ter fornecido a oportunidade de aprender e vislumbrar esta
ciência tão instigante. Agradeço por sua paciência, compreensão e entusiasmo.
A todos os professores e funcionários do Programa de Pós Graduação em
Genética e Biologia Molecular, especialmente a Leyla, sempre disposta a nos
ajudar.
Aos professores: Dr. Carlos Blaha, Dr. Veríssimo e Dra. Regina, pela
importante participação na correção da imberbe versão desta dissertação. Ao
Professor Dr. Marcos Antonio Nóbrega de Sousa, por sua importante participação
na banca examinadora e observações pertinentes que muito somaram à
dissertação.
A todos do Laboratório de Genética de Recursos Marinhos: Allyson, Eurico,
Paulo, Layse; a Gideão Wagner Werneck, por ter ajudado tempestivamente nas
necessidades técnicas; Rodrigo Xavier, sempre solícito na identificação dos
peixes, além da ajuda nas fotos; a Clóvis, pela grande ajuda nas coletas e
transporte do material; Uedson Jacobina e Pablo Martinez, por dividirem um pouco
de sua grande experiência e conhecimento da citogenética; a Inailson Marcio,
pelos conselhos e pelo exemplo de dedicação; a Divana Eliva, pela amizade e por
vi
toda ajuda ao longo dos últimos meses, nas coletas, preparação do material,
análises e importante ajuda na montagem das fotos desta dissertação.
Aos meus colegas de turma.
Ao Dr. Ricardo Rosa (UFPB) e sua orientanda Luciana Alcântara (UFPB),
além do Dr. Garcia Jr. (UFRN) por sua ajuda na identificação das espécies
presentes neste trabalho.
A Maxwell da Silva e Anthonini pela amizade, partidas de futebol e pelos
bons momentos vividos neste último ano.
Ao meu amigo Diego e sua família, pela força e ajuda aqui em Natal.
Ao meu grande amigo John Paul Albuquerque Caldas, por todo o apoio e
amizade, além da ajuda durante a preparação da apresentação desta dissertação.
A Debinha, que me cativou, e cuja amizade e presença marcante em minha
vida ajudaram a me fortalecer. A você, o meu amor.
Não poderia deixar de agradecer sinceramente a meus pais, Adelma e José
Inácio, por terem me fornecido todos os meios de continuar neste árduo e
compensador caminho do conhecimento. Aos meus irmãos, Tardelli e Wellington,
por esta amizade e amor incondicional.
vii
RESUMO
Estudos citogenéticos têm revelado uma grande diversidade até então não
detectada em diversas famílias de peixes. Muitos destes grupos, sobretudo os que
exibem grande diversidade, como Perciformes e Siluriformes, possuem espécies
de difícil caracterização morfológica, chamadas de espécies crípticas, muitas
vezes só detectadas através de análises cariotípicas, as quais revelam variações
interespecíficas marcantes quanto ao número e estrutura cromossômica. Desta
forma, o presente trabalho pretende contribuir para o conhecimento citogenético
de espécies marinhos e estuarinos, que, por não serem exploradas
comercialmente ou terem hábitos de vida peculiares são pouco estudadas quanto
aos seus aspectos genéticos. Assim, análises cariotípicas foram desenvolvidas em
uma espécie da família Apogonidae (Perciformes), em duas espécies de bagres
marinhos da família Ariidae (Siluriformes), além de uma espécie de siluriforme
estuarino, Paurachenipterus galeatus (Auchenipteridae) através de bandamento C,
Ag-RONs, coloração com DAPI e CMA3, bem como pela FISH (Fluorescent in situ
hibridization), utilizando sondas ribossomais 5S e 18S. Os resultados aqui
apresentados indicam grande diversidade inerente a estes grupos. Outras
abordagens (análises morfológicas e ferramentas moleculares) permitirão obter
maior entendimento acerca da diversidade biológica da ictiofauna brasileira.
Palavras-chave: bandas de replicação, evolução cromossômica, espécies
crípticas, especiação alopátrica, citótipos.
viii
ABSTRACT
Cytogenetic studies have been revealing a great diversity not detected, until then,
in several families of fishes. Many of these groups, especially those that exhibit
great diversity, like Perciformes and Siluriformes, possess species with difficult
morphologic characterization, called cryptic species, commonly detected through
karyotypic analyses, which reveals outstanding interespecific variations with
relationship to the number and its chromosomal structures. Thus, the present work
intends to contribute for the cytogenetic knowledge of marine and brackish fish
species, because they peculiar life habits and by lack of cytogenetic data of your
genetic aspects. Therefore, cytogenetic studies were developed in a species of
Apogonidae (Perciformes), two species of sea catfishes of the family Ariidae
(Siluriformes) and brackish fish Paurachenipterus galeatus (Siluriformes,
Auchenipteridae), through C banding, Ag-NOR, use of base-specific
flourochromes (DAPI and CMA3), as well as FISH (Fluorescent in situ
hybridization) using ribosomal DNA probes 5S and 18S. The present results
contribute to a better understanding of the processes of differentiation patterns and
chromosome evolution in these groups. The use of other approaches (the
morphology and molecular tools) will allow a larger understanding of the genetic
and biological diversity of the Brazilian ichthyofauna.
Key words: replication banding, karyotipic evolution, cryptic species, allopatric
speciation, cytotypes.
ix
Lista de Figuras Figura 1. Mapa do Brasil evidenciando os pontos de coleta no litoral do Rio
Grande do Norte e a Bahia.....................................................................................10
CAPÍTULO 1
Figura 1. Exemplar de Apogon americanus. Barra = 1cm.....................................18
Figura 2. Cariótipo de Apogon americanus corado com giemsa. Barra = 5µ........20
Figura 3. Banda C de A. americanus. Barra = 5µ..................................................20
Figura 4. Cariótipo de A. americanus através de RBG-banding. Barra = 5µ.........21
Figura 5. Cariótipo de A. americanus através de ER EcoRI. Barra = 5µ...............21
Figura 6. Metáfases de A. americanus após coloração com CMA3 (a); DAPI (b).
Barra = 5µ...............................................................................................................22
Figura 7. Hibridação fluorescente in situ em A. americanus com sondas: rDNA
18S (a); rDNA 5S (b). Barra = 5µ............................................................................22
Figura 8. Idiogramas de A. americanus: RBG-banding (a); banda C (b). Barra =
5µ............................................................................................................................23
CAPÍTULO 2
Figura 1. Exemplares de Cathorops spixii (a); Sciades cf. emphysetus. (b). Barra =
5cm.........................................................................................................................33
Figura 2. Cariótipo de Cathorops spixii (a); Sciades cf. emphysetus (b) submetidos
à coloração com Giemsa. Em destaque à direita, de cima para baixo, os pares
nucleolares submetidos ao FISH com sonda 18S, coloração pela Cromomicina A3
e Ag-RONs. Barra = 5µ...........................................................................................35
Figura 3. Metáfases de C. spixii (a) e de Sciades cf. emphysetus. (b) após
tratamento com AgNO3. As setas indicam os cístrons ribossômicos. Barra =
5µ............................................................................................................................36
Figura 4. Metáfases de C. spixii (a); Sciades cf. emphysetus. (b) após tratamento
com CMA3. Barra = 5µ...........................................................................................36
Figura 5. Hibridação fluorescente in situ em: C. spixii (a); Sciades cf. emphysetus.
(b). Barra = 5µ.........................................................................................................37
x
CAPÍTULO 3
Figura 1. Exemplar de Parauchenipterus galeatus. Barra = 1cm..........................46
Figura 2. Cariótipo do P. galeatus submetido à coloração com Giemsa...............47
Figura 3. Bandamento C em cromossomos de P. galeatus. Barra = 5µ................47
Figura 4. Metáfase de P. galeatus após tratamento com AgNO3. As setas indicam
cístrons ribossômicos. Barra = 5µ..........................................................................48
Figura 5. Metáfases de P. galeatus. a e b) FISH evidenciando cístrons 18S rDNA.
Barra = 5 µ..............................................................................................................48
Figura 6. Metáfases de P. galeatus. CMA3 a); CMA3 evidenciando associação de
RONs b); DAPI c). ..................................................................................................48
xi
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 1
Tabela 1. Dados citogenéticos disponíveis para a família Apogonidae.................24
CAPÍTULO 2
Tabela 1. Dados citogenéticos disponíveis para a família Ariidae.........................38
CAPÍTULO 3 Tabela 1. Revisão dos dados cariotípicos da família Auchenipteridae..................49
xii
LISTA DE ABREVIATURAS
BrdU – 5’-bromodesoxiuridina
CMA3 – cromomicina A3
DAPI – 4’,6 – diamidino-2-fenilindol
ER – enzima de restrição
FISH – Fluoresence In Situ Hybridization
NF – número fundamental.
RBG-banding – Bandas de replicação através de BrdU usando Giemsa
(Replication bands by BrdU using Giemsa)
rDNA – DNA ribossomal
RON – região organizadora de nucléolo
SSC – citrato de sódio salino (saline sodium citrate)
xiii
SUMÁRIO AGRADECIMENTOS............................................................................................... v
RESUMO................................................................................................................ vii
ABSTRACT........................................................................................................... viii
LISTA DE FIGURAS............................................................................................... ix
LISTA DE TABELAS............................................................................................. xii
LISTA DE ABREVIAÇÕES................................................................................... xiii
1. INTRODUÇÃO....................................................................................................01
1.1. Conservação genética.....................................................................................01
1.2. A citogenética como fonte de inferências evolutivas.......................................01
2. OBJETIVOS.......................................................................................................08
3. MATERIAL E MÉTODOS...................................................................................09
3.1. MATERIAL.......................................................................................................09
3.2. MÉTODOS.......................................................................................................11
3.2.1. PREPARAÇÕES CROMOSSÔMICAS.........................................................11
3.2.1.1. TÉCNICA DE ESTIMULAÇÃO MITÓTICA................................................11
3.2.2. OBTENÇÃO DE CROMOSSOMOS MITÓTICOS........................................11
3.2.3. PREPARAÇÃO DE LÂMINAS......................................................................12
3.2.4. ANÁLISE CROMOSSÔMICA E MONTAGEM DOS CARIÓTIPOS..............12
3.2.5. TÉCNICAS DE BANDAMENTOS CROMOSSÔMICOS...............................12
3.2.5.1. Detecção das regiões organizadoras de nucléolos (RONs)..................... 12
3.2.5.2. Detecção de heterocromatina constitutiva (Banda-C)...............................12
3.2.6. Técnicas de coloração com fluorocromos base-específicos........................13
3.2.7. Bandamentos com enzimas de restrição (ERs)............................................13
xiv
3.2.8. Método de incorporação do análogo de base 5’BrdU...................................13
3.2.9. Hibridação in situ fluorescente (FISH)..........................................................14
CAPÍTULO 1
Análises citogenéticas em Apogon Americanus (Perciformes: Apogonidae):
evidências de marcante redução cromossômica..............................................15
Resumo...................................................................................................................15
Introdução...............................................................................................................15
Objetivos.................................................................................................................17
Material e Métodos.................................................................................................17
Resultados..............................................................................................................19
Discussão...............................................................................................................25
CAPÍTULO 2
Análises cromossômicas em espécies da família Ariidae (Teleostei,
Siluriformes) do Litoral NE Brasileiro.................................................................29
Resumo...................................................................................................................29
Introdução...............................................................................................................29
Objetivos.................................................................................................................31
Material e Métodos.................................................................................................31
Resultados..............................................................................................................34
Discussão...............................................................................................................39
CAPÍTULO 3
Novo citótipo para o cangati, Parauchenipterus galeatus (Siluriformes,
Auchenipteridae) no NE do Brasil: Evidência de um complexo de
espécies.................................................................................................................43
Resumo...................................................................................................................43
xv
Introdução...............................................................................................................43
Objetivos.................................................................................................................45
Material e Métodos.................................................................................................45
Resultados..............................................................................................................46
Discussão...............................................................................................................49
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS...............................................................................53
6. CONCLUSÕES...................................................................................................55
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................56
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
1
1. INTRODUÇÃO
Uma das mais importantes aplicações da genética da conservação
biológica consiste da caracterização precisa de populações e espécies,
permitindo revelar muitas vezes uma diversidade biológica ainda desconhecida.
Não raro certas espécies são morfologicamente muito semelhantes entre si,
entretanto, quando em simpatria, se mostram isoladas reprodutivamente (Mayr,
1977). A falta de estudos genéticos mais amplos e aprofundados impossibilita
apontar se a presença de espécies crípticas pode estar relacionada com certos
habitats, latitudes ou grupos taxonômicos particulares (Bickford et al., 2006).
Reconhecer adequadamente estas espécies permite avaliar o real status da
diversidade genética existente e sua distribuição espacial (Galetti et al., 2008).
Para o efetivo manejo dos recursos pesqueiros, um reconhecimento
taxonômico correto é imprescindível, tendo em vista que os órgãos públicos de
controle e defesa ambiental necessitam avaliar quantitativa e qualitativamente
as capturas e, em caso de indicação de esgotamento dos estoques, permitir
intervenção apropriada.
Apesar de dois terços de todas as espécies habitarem os trópicos, a
maioria dos estudos se detém a espécies de zonas temperadas (Bickford et al.,
2006). Diante deste quadro de carência de informações genéticas, e por sua
efetiva utilidade na identificação de novas espécies, a citogenética tem sido
usada como uma primeira abordagem genética voltada à caracterização de
populações ou espécies.
1.1. A citogenética como fonte de inferências evolutivas
Análises cariotípicas têm ajudado a detectar diversidade em grupos de
difícil caracterização por análises morfológicas, através de múltiplos caracteres
advindos de variações intra e interespecíficas em relação o número diplóide,
fórmula cromossômica, padrão de distribuição de heterocromatina constitutiva
e localização de sítios ribossômicos (Bertollo et al., 2000). Assim, o uso da
citogenética é de grande importância na mitigação de erros taxonômicos,
principalmente em conjunto com caracteres morfológicos e morfométricos
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
2
(Galetti, et al., 2000; Benzaquem et al., 2008), na elucidação de padrões
populacionais, além de condições para sua conservação (Carvalho-Costa et al.,
2008; Kantek et al., 2008).
Evolutivamente, em alguns grupos de peixes, a estrutura cariotípica
quando comparada com as mudanças morfológicas, parece ter sofrido poucas
mudanças. Dentre os peixes, a Ordem Perciformes, a maior entre os peixes,
caracteriza-se como um modelo apropriado para o entendimento geral da
estrutura genética de populações marinhas, pois são encontrados neste grupo,
exemplos tanto de conservação cromossômica, compartilhado por vários
grupos taxonômicos, quanto de diversificação cariotípica em outros (Brum e
Galetti, 1997). Este grupo não apresenta suas relações filogenéticas ainda bem
definidas, podendo constituir um grupo polifilético (Nelson, 2006). Estudos
cariotípicos têm sido realizados com o intuito de auxiliar no esclarecimento de
seus padrões sistemáticos e taxonomia. Cerca de 8% do número total de suas
espécies tiveram seus cariótipos descritos, evidenciando número modal de
2n=48a para cerca de 63% do total das espécies (Affonso, 2000).
Um cariótipo composto exclusivamente por 48 cromossomos
acrocêntricos, onde se observa a presença de blocos heterocromáticos
reduzidos encontrados preferencialmente em posição pericentromérica, além
da presença de regiões organizadoras de nucléolos (NOR) simples, é
considerado basal para Perciformes (Molina, 2006). Assim, grupos que
apresentam outras composições cariotípicas representam uma condição
derivada. Naqueles grupos de Perciformes com representantes em águas
interiores, uma maior divergência cariotípica tem sido identificada,
particularmente devido ao isolamento geográfico, como visto em espécies de
Cichlidae. Padrões de evolução cariotípica mais significativos tem sido
observados em diversos grupos marinhos desta Ordem, como é observado em
Pomacentridae (Molina e Galetti, 2002) e Apogonidae (Rivlin et al., 1986).
Grande parte das espécies de Perciformes tiveram seus cariótipos
descritos com base em técnicas convencionais. Em outros grupos, no entanto,
como os Nothothenioidae (peixes antárticos) vêm sendo empregadas
largamente técnicas moleculares, permitindo evidenciar uma grande
diversificação cromossômica e processos ativos de reestruturação genômica
(Mazzei et al., 2006; Pisano et al., 2003; Pisano e Ozouf-Costaz, 2000).
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
3
Apesar da riqueza cariotípica observada em espécies marinhas do
Atlântico Ocidental (Sena e Molina, 2007), para grande parte das famílias são
desconhecidos os processos que levaram à diferenciação devido ao ainda
incipiente conhecimento disponível sobre a estrutura dos seus cromossomos
como, por exemplo, na família Apogonidae.
É sabido que em Perciformes, as espécies apresentam geralmente um
número fundamental (NF – número de braços cromossômicos) igual a 48
(cerca de 60% de todas as espécies já estudadas), o que se acredita ser uma
condição plesiomórfica (Molina, 2006). No entanto, pode ser observada uma
variabilidade, tanto no número diplóide, quanto de braços cromossômicos. Na
Subordem Percoidei, por exemplo, algumas famílias apresentam número
diplóide e fundamental basais (2n e NF=48), como em Chaetodon striatus –
Chaetodontidae (Affonso e Galetti, 2005), enquanto outras exibem maior
diversificação cromossômica, como os membros da família Apogonidae. Isto é
particularmente evidente nas espécies do gênero Apogon, as quais apresentam
números diplóides reduzidos e NF elevados, resultado de modificações
cromossômicas mediadas principalmente por rearranjos Robertsonianos e
inversões pericêntricas (Rivlin et al., 1987).
Os Apogonídeos são encontrados com relativa freqüência em ambientes
recifais. Entre eles se destaca Apogon, gênero cujas espécies são as mais
numerosas e dominantes nos recifes de corais, compreendendo ao menos 174
representantes de distribuição mundial. São pequenos predadores noturnos
que se alimentam de pequenos crustáceos, ovos e larvas de peixes. A idade
mínima deste gênero está referenciada ao isolamento do Mediterrâneo, no
Oligoceno e Mioceno (Mabuchi et al., 2006).
A estrutura dos cromossomos dos Perciformes, revelada através de
bandamentos cromossômicos mostram certa conservação entre as espécies.
Desta forma pequenas mudanças estruturais identificadas estão associadas a
padrões autapomórficos espécie-específicos, sistemas de cromossomos
sexuais, além de polimorfimos populacionais (Molina e Galetti, 2002; Galetti et
al., 2000).
As RONs, observadas através da técnica de impregnação por AgNO3 ou
pela hibridação com sondas ribossomais (FISH) constituem efetivos
marcadores citotaxonômicos para peixes (Affonso, 2000), podendo variar em
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
4
tamanho, número, posição e atividade no cariótipo das espécies, populações
ou indivíduos (Capistano et al., 2008). A presença de um único par portador de
RONs representa a condição mais freqüente em Perciformes, sendo apontada
com condição basal para o grupo (Galetti et al., 2000).
Baseado em dados citogenéticos tem sido possível a identificação de
inúmeros complexos de espécies. Um exemplo clássico de complexo de
espécies ocorre nos peixes neotropicais da família Erythrinidae, “Hoplias
malabaricus”, amplamente distribuídos (do Suriname à Argentina). Análises
citogenéticas demonstraram a existência de uma grande diversificação
cariotípica entre amostras de diferentes regiões geográficas, com a existência
de pelo menos sete tipos diferentes de citótipos (A - G), onde estão presentes
combinações particulares de números e morfologias cromossômicas, além de,
em alguns casos, presença de diferentes sistemas de cromossomos sexuais. A
efetiva presença de espécies crípticas é demonstrada pela ausência de
híbridos quando diferentes citótipos ocorrem em simpatria (Bertollo et al.,
2000).
Entre outros casos de espécies crípticas na região Neotropical,
identificados a partir de estudos cariotípicos, destaca-se pela grande
quantidade de dados citogenéticos disponíveis e diversidade cariotípica, o
complexo “Astyanax scabripinnis”. Constituído por espécies de cabeceiras de
rios, a análise citogenética em larga escala deste complexo, além de aspectos
de evolução cariotípica, também vem permitindo realizar inferências
biogeográficas sobre as espécies (Vicari et al., 2008).
Constituindo a biodiversidade íctica da região neotropical, os
Siluriformes se destacam por sua diversidade. Distribuídos por todos os
continentes, compreendem 35 famílias, 446 gêneros, 2.867 espécies, sendo
2.740 de água doce (Nelson, 2006). Algumas de suas espécies toleram bem a
salinidade, vivendo em ambientes estuarinos, além de espécies marinhas que
se distribuem pela costa e próxima a ilhas. Possuem ossos muito duros, sendo
facilmente fossilizados, além de grandes otólitos, o que leva a identificação de
muitas espécies através de seus esqueletos fósseis (Ferraris, 2007). Tais
registros datam do final do Cretáceo e início do Paleoceno, na Bolívia,
Paleoceno, na Argentina, Eoceno médio, nos Estados Unidos, final do Eoceno
e Início do Oligoceno, no continente Antártico, Mioceno médio, na Colômbia,
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
5
bem como em depósitos marinhos do Eoceno no Arkansas, E.U.A (Hutchins et
al., 2003). O conjunto destes registros mostra que este grupo teve uma elevada
irradiação, sendo encontrados registros em todos os continentes, exceto na
Austrália (Nelson, 2006). Suas características morfológicas são muito
peculiares. Têm corpo descoberto de escamas, embora em alguns casos
possa ser revestido por placas ósseas, possuindo geralmente quatro ou mais
pares de bárbulas, o que lhes dá um aspecto característico, além de espinhos
duros nas nadadeiras dorsal e peitoral. Algumas espécies são consideradas
venenosas, em função da inoculação de substâncias do muco epitelial, através
de ferimentos provocados pelos espinhos duros, que constituem estruturas de
defesa do animal. Há espécies bem pequenas, como Vandellia cirrhosa, o
temido candiru, encontrada na região Amazônica, parasita de outros peixes,
nos quais se aloja em suas brânquias; há ainda aquelas que alcançam três
metros de comprimento, como Silurus glanis. Possuem características
comportamentais variáveis quanto à natação e período de atividade (diurnos e
noturnos) (Betancur-R, 2007). Quanto a sua sistemática pertencem ao grupo
dos Ostariophysi, que abriga outras quatro Ordens: Gymnotiformes,
Gonorynchiformes, Characiformes e Cypriniformes. Assim como todos os
Ostariophysi, possuem um aparelho de Weber, que envolve cinco vértebras e
seu esqueleto caudal numa comunicação óssea usada para captação de
estímulos e sensações.
Uma evidência do sucesso evolutivo deste grupo são as constantes
nomeações de novas espécies, principalmente na região Neotropical (Ng et al.,
2008; Hardman, 2008; Darden, 2008).
Possivelmente devido a este sucesso evolutivo e diversificação, bem
como a características morfológicas peculiares, a taxonomia e filogenia deste
grupo mostra-se ainda muito difícil, com muitas questões latentes acerca da
classificação, além de muitos desacordos sobre a relação entre os organismos
deste táxon (Nelson, 2006).
Os Siluriformes formam um grupo de peixes dominantes nas águas
doces de todo o mundo, sofrendo uma grande irradiação neste ambiente.
Porém, significantes migrações marinhas foram feitas, o que é evidenciado
pela presença famílias marinhas Plotosidae e Ariidae (Marceniuk e Menezes,
2007).
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
6
Plotosidae constitui um grupo de peixes marinhos e de água doce,
encontrado apenas no Oceano Índico e oeste do Pacífico (no Japão, Austrália
e Fiji), sendo que as espécies marinhas geralmente são encontradas em corais
ou rochas.
Por sua vez, Ariidae possui distribuição circuntropical e constitui a única
família exclusivamente marinha de Siluriformes, sendo encontrados também
em estuários e desembocaduras de rios (Nelson, 2006). Apenas um restrito
grupo de espécies é essencialmente marinho, sendo encontradas em
profundidades de até 150 metros. Formada por 26 gêneros e 133 espécies,
com pelo menos 13 representantes fósseis. Sua morfologia externa é muito
semelhante entre as espécies, acarretando dificuldades de classificação e
diagnose, obtidas geralmente com base na disposição das placas de dentes
relacionadas ao vômer e placas acessórias (Marceniuk, 2003). Devido a esta
condição, ainda continua insatisfatória a obtenção de dados que permitam uma
boa determinação dos táxons incluídos na família. Esforços têm sido feitos para
auxiliar a compreensão da história evolutiva do grupo e vários estudos têm
focado não só a morfologia e distribuição geográfica, mas também aspectos
genéticos advindos do uso de ferramentas moleculares. Todos os enfoques
apontam uma condição monofilética para a família (Sullivan et al., 2006;
Marceniuk e Menezes, 2007; Betancur-R, 2007).
Os representantes deste clado compartilham características biológicas
peculiares, como por exemplo, reprodução especializada, onde alguns machos
incubam os ovos na cavidade bucal, para um posterior desenvolvimento não
pelágico, o que acaba refletindo em uma capacidade de dispersão limitada,
restringindo a maioria das espécies às águas continentais (Betancur-R et al.,
2007).
No Brasil são registradas ocorrências de espécies desta família, cujos
gêneros mais comuns são: Arius, Aspistor, Bagre, Genidens, Notarius,
Potamarius e Cathorops (Marceniuk e Menezes, 2007). Os estudos cariotípicos
para estas espécies têm utilizado principalmente as técnicas convencionais e,
embora haja dificuldade de resolução satisfatória devido ao pequeno tamanho
cromossômico destes animais, estas técnicas têm ajudado a revelar os
padrões carioevolutivos dentro e entre os grupos e sanar dúvidas taxonômicas.
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
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No litoral do Rio Grande do Norte, encontram-se representantes desta
família principalmente em regiões de estuários, com a embocadura do rio
Potengi, em Natal, bem como de toda a região da costa. As espécies mais
comumente encontradas neste litoral são Arius herzbergii, Aspistor luniscutis,
Bagre bagre, B. marinus e Cathorops spixii (Garcia, 2006).
O uso de banda C para caracterização de populações de peixes tem
propiciado identificar um grande número de casos de diferenciação cariotípicas
interpopulacionais, cromossomos B e cromossomos sexuais (Kantek et al.,
2008; Porto-Foresti et al., 2008; Santos et al., 2008).
Em Leporinus elongatus, polimorfismos relacionados à a presença de
heteromorfismos cromossômicos relativos à presença ou ausência de
segmentos heterocromáticos nos pares de RONs, com 3 citótipos possíveis
revelaram uma estruturação populacional devido às barreiras formadas por
sucessivas construções de barragens entre os rios Mogi-Guaçú e
Paranapanema (Molina et al., 2008).
A maioria dos modelos de especiação cromossômica tem como
característica comum a aparição de mecanismos de isolamento pós-zigóticos
devido a diferenças cromossômicas que se acumulam entre as novas espécies
e seus ancestrais, dificultando a fertilidade ou viabilidade de híbridos
interespecíficos, reduzindo, desta forma, o fluxo gênico (Rieseberg, 2001).
Dentre estes fatores, os rearranjos cromossômicos são um dos mais
importantes, tendo relevante papel como fonte de diversificação cariotípica,
contribuindo sobremaneira para o isolamento genético de populações (Molina e
Galetti, 2002). De forma destacada, as inversões pericêntricas têm sido
reportadas como um dos mais freqüentes mecanismos associados à
diversificação e evolução cariotípica.
Tais inversões podem ser facilmente estimadas pela observação da
mudança no número total de braços cromossômicos (NF). Os Perciformes - por
exibirem um cariótipo basal composto exclusivamente por cromossomos
acrocêntricos - constitui um dos melhores grupos para estudo e observação de
tais inversões, constituindo-se assim como um excelente grupo-modelo para
estudos carioevolutivos.
Do ponto de vista evolutivo, a presença de cromossomos sexuais
desempenha papel relevante em relação ao cariótipo dos peixes, sobretudo
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
8
marinhos. Rearranjos envolvendo cromossomos sexuais funcionam como um
via de atuação efetiva na formação de barreiras pós-zigóticas, por prevenir ou
afetar negativamente o pareamento mitótico e segregação dos híbridos
(Molina, 2006). As próprias modificações estão associadas principalmente ao
grande montante de partições nos ambientes continentais, ocasionados por um
grande número de obstáculos ao fluxo gênico (Moreira-Filho e Bertollo, 1991).
Técnicas mais resolutivas de análises estruturais dos cromossomos,
como a FISH (Fluorescent in situ Hibridization) são atualmente muito utilizadas
e vêm se mostrando eficientes ferramentas no estudo da evolução cariotípica
de peixes, principalmente devido ao mapeamento de seqüências ribossomais
5S (Martins e Galetti, 2001; Molina, 2005). Com o advento de seqüenciamento
em grande escala de genomas eucarióticos, uma ponte conectando a
genômica e a citogenética emergiu, trazendo consigo efetivo enfoque às
análises comparativas (Eichler e Sankoff, 2003). Análises cariotípicas
envolvendo FISH na localização de seqüências do gene 5S têm ajudado na
elucidação de mecanismos tais como a presença de inversões pericêntricas
(Martins e Galetti, 2001), além da identificação de sua relação com a formação
e possível distribuição de regiões heterocromáticas (Affonso e Galetti, 2005).
Dentro desta visão, as análises citogenéticas clássicas e moleculares
permitem um acesso valioso ao patrimônio genético auxiliando na
compreensão da história evolutiva de um grupo taxonômico, bem como da sua
distribuição biogeográfica, caracterizando-se como ferramentas apropriadas
para os estudos relacionados à filogenia e evolução cromossômica (Bertollo et
al., 2000; Gorshkova et al.; 2002; Rieseberg, 2001).
2. OBJETIVOS
Diante dos dados apresentados, o presente trabalho tem por objetivo:
1. Caracterizar citogenéticamente através de coloração convencional, Ag-
RONs e bandamento C, as espécies de peixes das famílias Apogonidae
(Apogon americanus) e marinhas/estuarinas da família Ariidae -
Cathrops spixii e Sciades sp. (Siluriformes), além de Paurachenipterus
galeatus (Siluriformes, Auchenipteridae);
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
9
2. Realizar o mapeamento estrutural através de técnicas moleculares, pelo
uso de enzimas de restrição (ER), FISH com sondas 5S e 18S, CMA3,
DAPI, além de bandas de replicação utilizando 5’BrdU destas espécies;
3. Inferir possíveis tendências evolutivas nestas espécies e, em seus
respectivos grupos (Apogonidae e Siluriformes);
4. Comparar citogenéticamente diferentes amostras geográficas de
Apogon americanus com vistas a identificar possíveis diversificações
cariotípicas interespecíficas ao longo de populações litorâneas do Rio
Grande do Norte e Bahia;
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. MATERIAL
Análises citogenéticas foram realizadas em espécies marinhas das
famílias Apogonidae e Ariidae, e em uma espécie dulcícola da família
Auchenipteridae. 14 espécimes de Apogon americanus (Apogonidae),
Perciformes coletados no litoral da Bahia em Salvador (12º58’S, 38º31’W) (2
machos, 4 fêmeas e 8 imaturos) e 30 espécimes coletados no litoral do Rio
Grande do Norte (RN) (05º47'S, 35º12'W), na cidade de Natal e em Búzios,
Município de Nísia Floresta. Foram coletados seis espécimes de Cathorops
spixii Agassis, 1829 (imaturos) e quatro de Sciades sp. Bloch, 1794 (imaturos)
(Siluriformes, Ariidae), na praia de Ponta Negra, no litoral do Rio Grande do
Norte (RN); e 19 espécimes (2 machos, 9 fêmeas e 8 juvenis) de
Parauchenipterus galeatus Linnaeus, 1766 (Siluriformes, Auchenipteridae) no
rio Pium, RN.
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
10
Figura 1. Mapa do Brasil evidenciando os pontos de coleta no litoral do Rio
Grande do Norte e a Bahia.
Os espécimes foram coletados por meio de anzóis, redes de arrasto e
puçás. Após a captura, os exemplares foram transferidos ao Laboratório de
Genética de Recursos Marinhos, da Universidade Federal do Rio Grande do
Norte, sendo mantidos em tanques e aquários aerados até que se procedesse
à realização das preparações cromossômicas. A identificação taxonômica das
espécies foi realizada pelos Drs. José Garcia Jr. (UFRN) e Ricardo Rosa -
UFPB).
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
11
3.2. MÉTODOS
3.2.1. PREPARAÇÕES CROMOSSÔMICAS
3.2.1.1 TÉCNICAS DE ESTIMULAÇÃO MITÓTICA
A suspensão de levedura tem sido utilizada rotineiramente na
estimulação mitótica em peixes. No laboratório de Genética de Recursos
Marinhos têm sido caracterizadas outras possíveis alternativas para
estimulação, como é o caso dos fármacos Munolan® (de acordo com Molina,
2001) e Aminovac®, que têm como produtos ativos, lisados bacterianos e
fúngicos. A solução com antígenos (fármacos) foram diluídas em água
destilada na concentração de 0,5ml/5ml sendo a solução inoculada na região
intraperitoneal e muscular, entre a linha lateral e a nadadeira dorsal do
organismo, numa proporção de 1ml para cada 100g de peso corporal do
animal. Em seguida, os animais foram mantidos em um aquário aerado por 24
a 48 horas, até que fossem sacrificados e dado início aos procedimentos de
obtenção de cromossomos mitóticos.
3.2.2. OBTENÇÃO DE CROMOSSOMOS MITÓTICOS
Para a obtenção de cromossomos mitóticos, foram retirados os rins
anterior e posterior, além de fragmentos do baço. Os tecidos foram colocados
em 9 ml de meio de cultura RPMI 1640 sendo dissociados através de
aspirações repetidas com o uso de seringas de vidros de 5 ou 10 ml. Uma vez
dissociado o material foi transferido para tubos Falcon, completando o volume
até 10 ml de meio RPMI. Um total de cinco gotas de colchicina 0,025% foi
adicionado, deixando-se agir por 30 minutos em temperatura ambiente. O
material foi então centrifugado por 10 minutos a 900rpm. O sobrenadante foi
removido e 9ml de solução hipotônica de KCl (0,075M) foi adicionada, agindo
por 30 minutos em temperatura ambiente. Decorrido este tempo, centrifugou-se
por 10 minutos. Uma solução fixadora contendo metanol e ácido acético (3:1)
foi usada para fixar o material por três vezes, em ciclos sucessivos de
centrifugação por 10 minutos cada. Ao término, o material foi acondicionado em
tubos plásticos de 1,5 ml, com tampa e mantidos em freezer.
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
12
3.2.3. PREPARAÇÃO DE LÂMINAS
A análise do material foi desenvolvida a partir de lâminas nas quais
foram gotejadas de três a quatro gotas da suspensão celular sobre um filme
d’água aquecido à 60ºC, escorridas, secas ao ar e coradas em seguida com
solução de Giemsa 5%, diluído em tampão fosfato pH 6,8.
3.2.4. ANÁLISE CROMOSSÔMICA E MONTAGEM DO CARIÓTIPO
As lâminas foram analisadas através de microscópio ótico, sob aumento
de 1.000 X. Uma média de 30 metáfases foi amostrada para cada exemplar,
visando o estabelecimento do valor modal para cada espécie e definição dos
padrões estruturais dos cromossomos. As melhores metáfases de cada
espécie foram fotografadas em microscópio Olympus BX42, com sistema digital
de alta resolução DP72. Os cromossomos foram organizados por tamanho em
ordem decrescente e classificados em grupos, quanto à posição do
centrômero, em metacêntricos (m), submetacêntricos (sm), subtelocêntricos
(st) e acrocêntricos (a), de acordo com nomenclatura desenvolvida por Levan
et al. (1964).
3.2.5. TÉCNICAS DE BANDAMENTOS CROMOSSÔMICOS
3.2.5.1. Detecção das regiões organizadoras de nucléolos (RONs) As RONs foram caracterizadas utilizando-se impregnação pela prata
idealizada por Howell e Black (1980) (com algumas modificações), preparando-
se previamente uma solução gelatinosa contendo 1g de gelatina acrescida de
50 ml de água e 0,5 ml de ácido fórmico. Sobre a lâmina adicionou-se de 6 a 9
gotas de solução gelatinosa, nitrato de prata (AgNO3) 50% e por fim, água. A
solução misturada foi coberta com lamínula, sendo colocada numa estufa a
60ºC até que uma coloração âmbar pudesse ser vista.
3.2.5.2. Detecção de heterocromatina constitutiva (Banda-C)
A observação de regiões de heterocromatina constitutiva foi realizada
utilizando-se o método desenvolvido por Summer (1972) com pequenas
alterações, visando uma melhor qualidade das preparações. A lâmina foi
imersa em HCl 0,2 N à temperatura ambiente, por 30 minutos, lavada em água
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
13
destilada e seca ao ar. Foi então mantida em solução de 2xSSC à 60ºC por 15
minutos, lavada e seca. Em seguida, incubada à 42ºC em uma solução
saturada de Ba(OH)2.8H2O à 5% (em períodos variáveis para cada espécime)
lavada rapidamente em HCl 0,2N e mantidas em solução de 2xSSC à 60ºC por
cerca 1 hora. Após esta fase, as lâminas foram coradas com Giemsa 5% por
10 minutos e visualizadas.
3.2.6. Técnicas de coloração com fluorocromos base-específicos
Um total de 80µl de solução de distamicina (DA) (0,1mg/ml) foi
depositado em cada lâmina, coberta com a lamínula por 15 min, no escuro.
Uma série de lavagens utilizando tampão Mcllvaine foi realizada.
Posteriormente, a lâmina recém preparada, foi mergulhada em solução de
DAPI (0,3mg/ml), por 20 minutos, no escuro. Após lavagem com tampão
Mcllvaine e fortes jatos de água, foi recoberta com 80µl de Cromomicina,
coberta com lamínula e mantida por 30 minutos em escuridão. Após a
montagem da lâmina com sacarose saturada e duas gotas de anti-fading
VectaShield, o material foi preservado em temperatura de 4ºC por 15 dias até a
sua análise em microscópio de epifluorescência com filtros apropriados.
3.2.7. Bandamentos com enzimas de restrição (ERs) As enzimas de restrição EcoRI foram diluídas em buffer EcoRI, de
acordo com o fabricante, para obtenção de uma concentração de 10 U/µL.
Cerca de 25 µL desta solução foi adicionada a uma lâmina previamente
gotejada, cobrindo com uma lamínula e deixando agir por período de 10h em
estufa a 37ºC. Decorrido este tempo as lâminas foram lavadas em água
destilada e coradas por 10 min com Giemsa diluído a 5% em tampão fosfato
pH 6,8, deixando-se secar ao ar.
3.2.8. Método de incorporação do análogo de base 5’BrdU
A incorporação de 5’BrdU para obtenção do padrão de bandas de
replicação foi realizadas segundo metodologia desenvolvida por Giles et al.
(1988) com modificações. O análogo 5’BrdU (100mg de 5’BrdU em 20ml de
solução de NaCl a 0,9%) foi injetado via intraperitoneal, na proporção de
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
14
1ml/100g de peso corporal do peixe, agindo por 6 horas. Após, a preparação
cromossômica foi realizada seguindo os mesmos passos descritos no subitem
3.2.2. As lâminas gotejadas com este material foram lavadas em solução de
2xSSC e imersas em uma solução de Hoescht 6024 (Sigma) (1mg de Hoescht
em 1ml de metanol e 100ml de 0,5xSSC) por 30 minutos em escuridão, sendo
lavadas em água destilada e secas ao ar. A lâmina foi coberta com um filme
de 2xSSC, sendo exposta à luz UV por 45 minutos sob uma distância de 10cm,
sendo em seguida, lavada em água destilada e seca ao ar. As lâminas foram
coradas com Giemsa 5% diluído em tampão fosfato.
3.2.9. Hibridação in situ fluorescente (FISH)
A aplicação da técnica de hibridação in situ fluorescente foi realizada
com base no procedimento adotado por Pinkel et al. (1986), com modificações.
As sondas 5S e 18S DNAr foram marcadas com biotina-11-dATP, através de
“nick translation”, utilizando o kit BionicKTM Lablling System (Gibco.BRL),
seguindo especificações do fabricante.
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
15
CAPÍTULO 1
Análises citogenéticas em Apogon americanus (Perciformes:
Apogonidae): Evidências de marcante redução cromossômica
Araújo, W.C. e Molina, W.F.
Resumo
Peixes recifais da Ordem Perciformes constituem um dos grupos de grande interesse quanto às suas características genéticas e citogenéticas, em função do seu padrão evolutivo dinâmico e nem sempre bem compreendido. Neste grupo existem exemplos de grande conservação cromossômica, em sua maioria, e de grupos que apresentam uma evolução cariotípica mais dinâmica. Um cariótipo com 2n=48 cromossomos acrocêntricos é considerado basal para este grupo, sendo considerados derivados cariótipos com outras fórmulas. Algumas de suas famílias apresentam maior diversificação cariotípica, como Apogonidae, para a qual não se dispunha de informações citogenéticas sobre qualquer representante no Atlântico Sul. Análises citogenéticas realizadas em Apogon americanus proveniente do litoral de Salvador-BA, Nordeste do Brasil. A espécie revelou um número diplóide modal de 2n=36 (12m+6sm+16st+2a; NF=66), com notável presença de pares de grandes cromossomos metacêntricos. Os sítios Ag-RONs estão localizados no braço curto do 9º par, em posição telomérica. Condição coincidente com os sinais de hibridação pelo FISH com sondas 18S. Os genes da subunidade 5S estão distribuídos em dois pares cromossômicos em condição não sintênica a subunidade ribossomal 45S. A heterocromatina está reduzida e localizada na posição pericentromérica na maioria dos pares cromossômicos. O padrão de replicação inicial revelou bandas longitudinais, com replicação tardia dos blocos heterocromáticos. Os dados obtidos sugerem uma evolução cariotípica mediada por fusões Robertsonianas e inversões pericêntricas. Apesar dos rearranjos estruturais no cariótipo, características composicionais e da estrutura cromossômica refletem características simplesiomórficas com outros clados Perciformes. �
Palavras-chave: rearranjos Robertsonianos, bandas de replicação, Atlântico Ocidental. 1. Introdução
Os representantes da família Apogonidae são encontrados em regiões
costeiras associados a recifes de corais, apresentando características
conspícuas, como territorialidade e hábitos noturnos, representando parcela
importante da ictiofauna recifal (Mabuchi et al., 2006). No entanto, o status
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
16
taxonômico deste grupo permanece confuso. Destaca-se na famíla o gênero
Apogon cujas espécies são as mais numerosas e dominantes nos recifes de
corais, compreendendo ao menos 174 espécies de distribuição mundial. Tais
peixes têm hábitos noturnos, ocupando o lugar de predadores e alimentando-
se de plâncton, como pequenos crustáceos, ovos e larvas de peixes. Questões
acerca da posição taxonômica de Apogon e de outros grupos da família ainda
precisam ser esclarecidas. Várias espécies são crípticas, além de haver
divisões em complexos morfológicos, o que dificulta o posicionamento
taxonômico e filogenético deste grupo. Greenfield (2001) caracterizou para o
Indo-Pacífico dois complexos de espécies Apogon “erythrinus” e A. “coccineus”.
Dentro de Apogonidae, a idade mínima deste gênero data do isolamento do
Mediterrâneo, no Oligoceno e Mioceno (Mabuchi et al., 2006).
Na região Nordeste do Brasil, tem sido evidenciada a presença de cinco
espécies dessa família: Apogon americanus, A. pseudomaculatus, A.
quadrisquamatus, A. puncticulatus e Phaeoptyx pigmentaria (Garcia, 2006), a
maioria delas sem descrição cariotípica.
Entretanto, apesar da existência de informações citogenéticas básicas
para representantes de Apogonidae não se dispõem de dados cariotípicos de
seus representantes no Atlântico Ocidental.
Apogonidae se destaca por apresentar números cromossômicos
extremamente reduzidos para um representante dos Perciformes, portando
ainda, de acordo com as espécies já analisadas, grande diversificação
cariotípica também em relação fórmula cariotípica. Esta redução do número
diplóide se reflete em valores tão baixos quanto 2n=34, observado em Apogon
maculatus (Rivlin et al., 1988). Apesar do reduzido número cromossômico,
sugerindo uma alta incidência de fusões cêntricas são encontrados números
fundamentais (NF) elevados, como evidenciado em Apogon nubilis (2n=46,
NF=92), o que indica a participação de outros rearranjos cromossômicos, como
inversões pericêntricas, envolvidos na diversificação cromossômica deste
grupo.
Estudos citogenéticos utilizando espécies deste grupo têm auxiliado na
elucidação do posicionamento taxonômico dentro desta família. De acordo com
a filogenia clássica os gêneros Apogon e Phaeoptyx parecem estar próximos,
sendo Phaeoptyx considerado o mais basal entre eles. Através de análises
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
17
citogenéticas desenvolvidas em A. pseudomaculatus, A. nubilus e P.
pigmentaria aponta Phaeoptyx como mais derivado, sendo A. pseudomaculatus
mais proximamente relacionado a este do que a A. nubilus (Rivlin e Dale,
1986). Devido à sua diversidade cariotípica, íntima relação com os recifes de
corais e ecologia, Apogonidae caracteriza-se como um modelo adequado ao
estudo de tendências carioevolutivas na Ordem Perciformes
2. Objetivos
Diante das peculiaridades da família Apogonidae e escassez de
informações citogenéticas neste grupo, para espécies Atlânticas, o presente
trabalho teve como objetivo caracterizar citogeneticamente a espécie Apogon
americanus, presente no litoral do Rio Grande do Norte, visando ampliar o
conhecimento sobre a diversidade cariotípica do grupo e possibilitar inferências
acerca de seus aspectos carioevolutivos. Para tanto foram utilizados, métodos
resolutivos de análise estrutural dos cromossomos, como Ag-RONs; banda C;
digestão pelas enzimas de restrição AluI, EcoRI; bandas de replicação (RBG-
banding) e hibridização in situ com sondas fluorescentes das subunidades
ribossomais 5S e 18S.
3. Material e Métodos
Um total de 14 espécimes de Apogon americanus foram coletados no
litoral de Salvador (BA) (12º58’S, 38º31’W) (2 machos, 4 fêmeas e 8 imaturos),
juntamente com 30 espécimes coletados na praia de Búzios (05º47'S,
35º12'W), município de Nísia Floresta, Rio Grande do Norte (RN), utilizando
puçás e tarrafas (Fig. 1). Após a captura, os exemplares foram acondicionados
em sacos plásticos com água e conduzidos ao Laboratório de Genética de
Recursos Marinhos, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, sendo
mantidos em tanques ou aquários aerados até que se procedesse à realização
de preparações cromossômicas.
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
18
Figura 1. Exemplar de Apogon americanus. Barra = 1cm.
Os exemplares foram submetidos à estimulação mitótica de acordo com
os métodos desenvolvidos por Lee e Elder (1980) e Molina (2002), por um
período de 24 a 48 horas. As preparações cromossômicas seguiram a
metodologia preconizada por Gold et al. (1990). O material foi corado com
Giemsa 5% diluído em tampão fosfato pH 6,8. Análises citogenéticas foram
desenvolvidas com o uso de microscopia ótica com aumento de 1.000 X. Cerca
de trinta metáfases foram analisadas para cada exemplar. As melhores
metáfases foram fotografadas em microscópio Olympus BX42, com sistema
digital de alta resolução e utilizadas na definição do cariótipo.
Os cromossomos foram classificados em grupos, e organizados em
ordem decrescente de tamanho, de acordo a posição do centrômero, segundo
a nomenclatura desenvolvida por Levan et al. (1964). As RONs foram
identificadas utilizando-se impregnação pela prata conforme preconizada por
Howell e Black (1980). A observação de regiões de heterocromatina
constitutiva foi realizada utilizando-se o método desenvolvido por Summer
(1972) com pequenas alterações, visando uma melhor qualidade das
preparações. A qualificação das regiões heterocromáticas foi obtida pela
coloração com fluorocromos base-específicos DAPI e CMA3 (Schweizer, 1980).
Como contracorante foi utilizada uma solução de distamicina (DA) (0,1mg/ml)
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
19
em cada lâmina, cobrindo com a lamínula por 15 min. Uma série de lavagens
utilizando tampão Mcllvaine foi realizada. Posteriormente, a lâmina recém
preparada, foi mergulhada em solução de DAPI (0,3mg/ml), por 20 minutos, no
escuro. Após lavagem nova coloração com Cromomicina por 30 minutos. Após
a montagem da lâmina o material foi preservado em temperatura de 4ºC por 15
dias até a sua análise em microscópio de epifluorescência com filtros
apropriados.
Padrões de digestão dos cromossomos de A. americanus pela enzima
de restrição, foram definidos a partir de testes de tempo, temperatura e
concentração. Um total de 10u/µl da enzima EcoRI, diluída em um tampão
apropriado (EcoRI) de acordo com o fabricante e foi depositado sobre lâmina
previamente preparada e coberta com lamínula. Após a incubação por 10 h em
estufa a 37ºC, lavadas em água destilada e coradas com Giemsa 5% diluído
em tampão fosfato pH 6,8, e secas ao ar.
4. Resultados
Análises citogenéticas realizadas nos espécimes de Apogon americanus
coletados no litoral do Rio Grande do Norte e Bahia permitiram estabelecer um
número diplóide modal de 2n=36. Não foram encontradas diferenciações
significativas com relação à macroestrutura cariotípica ou números
cromossômicos entre os indivíduos. A fórmula cariotípica da espécie é
representada por 12m+6sm+16st+2a, NF=66 (Fig. 2). Através da impregnação
por nitrato de prata, o 9º par (sm) foi identificado como portador da RON.
Foram analisados espécimes de ambos os sexos, não sendo verificado
heteromorfismo cromossômico sexual.
A presença de cístrons ribossomais Ag-RON sobre o 9º par, em posição
telomérica do braço curto, foi confirmada através da FISH utilizando sondas de
rDNA 18S. Evidenciou-se cístrons rDNA 5S presentes sobre dois pares
cromossômicos, em condição não sintênica com os sítios 45S presentes no par
organizador nucleolar. Através de banda C, verificou-se pequenos blocos
heterocromáticos em posição pericentromérica e telomérica de alguns dos
pares cromossômicos (Fig. 3).
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
20
O padrão de bandas de replicação obtido por incorporação do análogo
de base 5BrdU, no início da fase S, evidenciou a presença de grandes blocos
de replicação tardia nas regiões pericentroméricas dos cromossomos e em
regiões intersticiais nos braços longos dos pares 1º, 2º e 4º (Fig. 4).
A digestão com enzimas de restrição (ER) permitiu identificar bandas
discerníveis pelo uso da EcoRI. O padrão de bandamento obtido foi muito
semelhante àquele evidenciado pelas bandas de replicação (Fig. 5).
Figura 2. Cariótipo de Apogon americanus corado com Giemsa. Barra = 5µ.
Figura 3. Banda C de A. americanus. Barra = 5µ.
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
21
Figura 4. Cariótipo de A. americanus através de RBG-banding. Barra = 5µ.
Figura 5. Cariótipo de A. americanus através de ER EcoRI. Barra = 5µ.
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
22
Figura 6. Metáfases de A. americanus após coloração com CMA3 (a); DAPI (b).
Barra = 5µ.
Figura 7. Hibridação fluorescente in situ em A. americanus com sondas: rDNA
18S (a); rDNA 5S (b). Barra = 5µ.
a b
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
23
Figura 8. Idiogramas de A. americanus: RBG-banding (a); banda C (b). Barra =
5µ.
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
24
Tabela 1. Dados citogenéticos disponíveis para a família Apogonidae.
Espécie
2n
NF
Fórmula Cariotípica
Par/RONs
Referências
Apogon americanus 36 70 12m+6sm+16st+2a 9 Presente estudo
Apogon binotatus 36 50 14m-sm+22st-a - Rivlin et al., 1987
35 59 14m-sm+21st-a - Rivlin et al., 1987
36 62 26m-sm+10st-a - Rivlin et al., 1987
Apogon doederleini 46 50 4sm+42st-a - Ojima e Kojima, 1985
Apogon endekataenia 46 46 46a - Rishi, 1973
Apogon maculatus 34 61 27m-sm+7st-a - Rivlin et al., 1988
Apogon moluccensis 46 46 46a - Rishi, 1973
Apogon notatus 46 52 52m+4sm+40st-a - Ojima e Kojima, 1985
46 53 2m+5sm+39st-a - Ojima e Kojima, 1985
Apogon nubilis 46 92 2m+36sm+8st - Rivlin et al., 1986
Apogon orbicularis 46 50 4sm+42st-a - Ojima e Kojima, 1985
Apogon
pseudomaculatus
36 68 8m+22sm+2st+4a Rivlin et al., 1986
36 66 30m-sm+6st-a - Rivlin et al., 1988
Apogon semilineatus 46 54 2m+6sm+38st-a - Ojima e Kojima, 1985
Phaeoptyx pigmentaria 38 74 6m+30sm+2a - Rivlin et al., 1986
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
25
5. Discussão
Entre as Ordens de peixes existentes, os Perciformes destacam-se por
agruparem exemplos tanto de grande conservação cromossômica (estase)
quanto de tendências marcantes de diversificação ao longo da história
evolutiva de alguns grupos (Molina, 2006). Uma maior diversidade cariotípica
tem sido verificada para representantes dulcícolas em função da maior
quantidade de restrições ao fluxo gênico neste ambiente em relação ao
marinho (Moreira-Filho e Bertollo, 1991; Molina e Galetti, 2004a; Molina e
Galetti, 2004b).
Não foram encontradas diferenciações significativas com relação à
macroestrutura cariotípica ou números cromossômicos, entre as populações do
litoral do Rio Grande do Norte e Bahia da espécie, apesar de separadas por
cerca de 1.000km. Estes resultados podem indicar a existência de fluxo gênico
efetivo capaz de manter coesão genética à espécie. Contudo, populações de
outros grupos de Perciformes no litoral brasileiro, mesmo espaçadas por
grandes distâncias, em muitos casos não tem evidenciado diferenciações
cromossômicas (Brum e Galetti, 1997). Um exemplo disso ocorre em
Abudefduf saxatilis (Pomacentridae), espécie de ampla distribuição geográfica,
que se distribue no litoral brasileiro do Sudeste até o Nordeste do Brasil, além
das regiões de ilhas oceânicas, como o Arquipélago de São Pedro e São Paulo
(ASPSP), Fernando de Noronha e Atol das Rocas (distantes 960 e 360 km do
continente). Embora análises morfométricas tenham revelado marcante
variação inter-populacional entre as regiões NE e SE, ASPSP e Atol das
Rocas, constituindo uma clina em relação aos seus elementos seriais (Molina,
2001 apud Molina, 2006), os cariótipos não exibem diferenciações discerníveis.
De forma geral, a ausência de barreiras ao fluxo gênico no ambiente
marinho permite que populações costeiras no Atlântico Ocidental mantenham-
se geneticamente coesas, contribuindo assim, para um menor grau de
polimorfismos cariotípicos em diferentes estoques (Molina, 2006).
Na família Apogonidae, 66% de todas as espécies analisadas até o
momento (N=12) tem valor diplóide 2n=46 (Tabela 1), o que sugere tal valor
como basal para a família. Algumas espécies como A. endekataenia e A.
moluccensis (Rishi, 1973), por exemplo, possuem um cariótipo com grande
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
26
número de cromossomos acrocêntricos, similar a condição basal encontrada
nos Perciformes (2n=48, NF=48). No entanto, a maior parte dos dados
disponíveis apontam uma grande diversidade cariotípica na evolução do grupo,
tanto em relação ao número diplóide quanto às fórmulas cromossômicas
(refletida em números fundamentais elevados, 46<NF<92), o que sugere que
os mecanismos envolvidos na diversificação cariotípica deste grupo são
diversos, principalmente inversões pericêntricas e rearranjos Robertsonianos.
A. americanus apresenta um número diplóide modal de 2n=36 (NF=70),
cuja fórmula cariotípica é 12m+6sm+16st+2a. Esse padrão cariotípico é
semelhante ao encontrado para outras espécies de Apogonidae, dos gêneros
Phaeoptyx, Apogon maculatus e A. pseudomaculatus, distribuídos no Atlântico,
no litoral da Flórida (E.U.A.) (Rivlin et al.,1986; Rivlin et al., 1988). Apesar de
relatos de cromossomos sexuais para a família, não foi evidenciada a presença
de heteromorfismo cromossômico sexual no cariótipo de A. americanus pelas
técnicas utilizadas.
A presença nesta família de números diplóides menores que 48, grandes
cromossomos metacêntricos e, entre algumas espécies, a presença de
números diplóides diferentes sem que o NF se modifique sugere a ocorrência
de fusões cêntricas que, aliadas às inversões pericêntricas, tiveram papel
importante no processo de diversificação cariotípica da família. As inversões
pericêntricas tem sido consideradas o mecanismo mais frequente de mudanças
cariotípicas em Perciformes (Molina e Galetti, 2004b).
Menos freqüentes são as modificações cromossômicas derivadas de de
rearranjos Robertsonianos em Perciformes. Dentro da subfamília Chrominae
(Pomacentridae) tais rearranjos são extensivos e, constituem um dos principais
mecanismos de mudanças cromossômicas no processo de diversificação das
espécies (Molina e Galetti, 2002). Em Labridae, Xyrichtys dea e X. pavo
apresentam 2n=44a, enquanto uma marcante redução no número diplóide
(2n=22), em X. tuvistii é creditada a ocorrência de eventos do tipo fusão
cêntrica (Ueno e Takai, 2000 apud Molina, 2006).
Em A. americanus identificou-se a presença de quatro grandes
cromossomos metacêntricos e dois pares metacêntricos menores, aliada a uma
fórmula cromossômica com marcante redução no valor diplóide (2n=36),
sugere também nesta espécie a ocorrência de fusões cêntricas. Caso este
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
27
mecanismo tenha de fato atuado na modelagem do atual cariótipo da espécie,
os seis eventos de fusão cêntrica, que podem ser explicados a partir de um
cariótipo basal com 48 elementos acrocêntricos, são referendados pela
presença de quatro pares de metacêntricos grandes e dois menores.
Associado às fusões, o elevado número fundamental (NF=70) observado é
indicativo de que inversões pericêntricas também foram importantes fontes de
diferenciação cromossômica para a espécie.
Embora a presença de rearranjos Robertsonianos em alguns grupos
como Pomacentridae e Salmonidae ocorram em algumas espécies ainda em
estado transitório polimórfico, isto não foi observado em A. americanus.
Possivelmente, características históricas ou biológicas, como pequena
capacidade dispersiva e populações de tamanho reduzido, associadas a uma
condição seletivamente neutra ou vantajosa, tenham se propiciado à fixação
dos rearranjos Robertsonianos observados na espécie. Condições intrínsecas
do cariótipo, decorrentes de suas características estruturais (como o aumento
no NF) poderia aumentar a taxa de recombinação gerando uma condição
vantajosa para seus portadores. Quanto às características estruturais dos
cromossomos, A. americanus apresenta um baixo conteúdo de
heterocromatina constitutiva com pequenos blocos heterocromáticos
distribuídos nas regiões teloméricas e pericentroméricas dos cromossomos. Os
grandes cromossomos metacêntricos presentes em A. americanus (com o
maior deles correspondendo a cerca de quase 10% do complemento total),
apesar do tamanho, apresentam pequeno conteúdo heterocromático. Tal
padrão é o comum para os peixes da Ordem Perciformes.
O tratamento com a endonuclease de restrição EcoRI, produziu um
padrão de bandamento semelhante ao de bandas de replicação, em quase
todos os cromossomos do complemento. Alguns blocos heterocromáticos
intersticiais foram observados, principalmente nos pares 1, 2 e 3. Tais blocos
podem ser explicados por inversões paracêntricas, reorganizando blocos
heterocromáticos originalmente localizados em posições pericentroméricas. Um
grau de heterogeneidade heterocromatínica pode ser inferida a partir de
respostas dos blocos heterocromáticos à digestão pela EcoRI. É possível que a
realocação de segmentos heterocromáticos em posição ectópicas ao
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
28
centrômero - durante o processo carioevolutivo da espécie - tenha propiciado
as condições para a diferenciação qualitativa dos segmentos heterocromáticos.
A existência desta heterogeneidade é também evidenciada através dos
padrões de bandamento de replicação utilizando o análogo de base 5’ BrdU
(RGB). As bandas de replicação obtidas revelam similaridades com a digestão
com a EcoRI. Este análogo de bases foi incorporado durante o início da fase S
do ciclo celular. As regiões replicadas tardiamente são as mais pálidas e
coincidem com aquelas regiões heterocromáticas observadas através de
bandamento C. Tais padrões de replicação tardia são observados também em
regiões intersticiais dos pares 1, 2 e 3, bem como, no braço curto do par
organizador nucleolar, coincidindo com os sítios Ag-RONs.
O uso de RONs tem ajudado a formular hipóteses filogenéticas em
alguns grupos, constituindo um importante marcador citotaxonômico em
citogenética comparativa (Cross et al., 2006). Apesar do cariótipo rico em
rearranjos estruturais, se evidencia em A. americanus uma condição
conservativa quanto ao número de cístrons ribossomais. As RONs identificadas
tanto pela impregnação pela prata, como pelo FISH, estão localizadas sobre
um único par portador de RONs, em posição telomérica, nos braços curtos do
par 9, submetacêntrico.
FISH com sondas de 5S DNAr têm sido úteis na caracterização de
diversos grupos de peixes. O presente estudo, revelou dois pares
cromossômicos portando estas seqüências, localizadas em condição não
sintênica ao par 9 (portador dos cístrons Ag-RONs). A não sintenia entre as
diferentes subunidades ribossomais tem sido observada em vários grupos
Perciformes, reforçando a hipótese de evolução independente entre estas
famílias gênicas (Martins e Galetti, 2001).
Os resultados obtidos sugerem a ocorrência de intensas mudanças
cromossômicas no cariótipo de A. americanus. Fatores biogeográficos,
biológicos e próprios do cariótipo basal desta família podem estar envolvidos
na fixação destas divergências. Outros trabalhos envolvendo um maior número
de espécies dessa família, com distribuição pelo Atlântico Ocidental, serão
necessários para melhor entendimento do cenário de diversificação cariotípica
experimentando por este peculiar grupo de peixes.
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
29
CAPÍTULO 2
Análises Cromossômicas em Espécies da Família Ariidae
(Teleostei, Siluriformes) do litoral NE brasileiro
Araújo, W.C. e Molina, W.F.
Resumo Os Siluriformes constituem um dos mais conspícuos grupos da ictiofauna neotropical. Pelo menos 1.727 espécies ocorrem exclusivamente nas Américas. Porém, ainda há muitas questões acerca da classificação neste grupo, e restam desacordos no que diz respeito às relações entre algumas famílias, principalmente devido ao elevado número de espécies, sua ampla distribuição geográfica e semelhança morfológica existente entre elas. Análises citogenéticas foram realizadas utilizando espécies do Nordeste brasileiro da família Ariidae com o intuito de avaliar a diversidade cariotípica apresentada e, fazer inferências acerca da história evolutiva deste clado. No cariótipo de Cathorops spixii o número diplóide modal foi 2n=56, 12m+16sm+24st+4a, NF=108, enquanto que Sciades sp. exibiu 2n=56, com a fórmula cariotípica composta por 14m+10sm+22st+10a e NF=108. Os dados obtidos confirmam o marcante conservadorismo numérico exibido pela família. Os resultados aqui encontrados contribuem com o estabelecimento de padrões citotaxonômicos para a família, bem como para um melhor entendimento dos processos e padrões de diferenciação e evolução cromossômica dos Siluriformes marinhos. Palavras-chave: Cathorops spixii, Sciades cf. emphysetus, inversões
pericêntricas, citogenética de peixes.
1. Introdução Aproximadamente um em cada vinte vertebrados é um bagre (Nelson,
1994), como são popularmente conhecidos os Siluriformes, que estão entre os
grupos da fauna ictiológica neotropical mais representativos, estando também
distribuídos nas demais regiões biogeográficas. Compreendem 35 famílias, 446
gêneros, 2.867 espécies sendo 2.740 de dulcícolas, com cerca de 1.727
ocorrendo exclusivamente nas Américas (Nelson, 2006). Formam um grupo de
peixes dominantes nas águas doces de todo o mundo, com uma grande
irradiação neste ambiente. Seu sucesso evolutivo remonta o Cretáceo (~63
M.A) tendo sido encontrados em todos os continentes (com exceção da
Austrália), inclusive na Antártica, o que sugere uma distribuição cosmopolita de
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
30
longa data (Grande e DePinna, 1998; Lundberg, 1993; Cione e Prasad, 2002;
de la Pena e Soler-Gijón, 1996).
Apesar disso, apenas uma família (Ariidae) é estritamente marinha
dentro deste grupo (Marceniuk e Menezes, 2007). Os Ariidae apresentam uma
morfologia externa muito semelhante entre si, tornando difícil sua classificação
e diagnose. Os caracteres mais importantes do ponto de vista sistemático,
geralmente se relacionam com a disposição das placas de dentes do vômer e
placas acessórias (Marceniuk, 2003).
No Atlântico Ocidental os gêneros mais comumente são Arius, Aspistor,
Bagre, Genidens, Notarius, Potamarius e Cathorops. No litoral do Rio Grande
do Norte, são encontrados representantes principalmente ao longo da costa e
em regiões estuarinas. As espécies mais comuns nesta região são Arius
herzbergii, Aspistor luniscutis, Bagre bagre, Bagre marinus e Cathorops spixii
(Garcia, 2006).
Inúmeros trabalhos atestam a importância ecológica dos Ariidae, mas
ainda pouco conhecidas quanto aos seus aspectos genéticos e citogenéticos
(Sczepanski, 2008). As relações entre os táxons que compõem os Ariidae têm
advindo de análises morfológicas, distribuição geográfica, das espécies, e em
menor grau avaliando seus aspectos moleculares. Não obstante, a monofilia da
família parece ser bem suportada por ambas as abordagens (Sullivan et al.,
2006; Marceniuk e Menezes, 2007; Betancur-R, 2007).
O uso de estudos citogenéticos para auxiliar no entendimento das
relações entre estes grupos tem sido extensivamente realizados em famílias de
água doce (ver Artoni et al., 2001; Alves et al., 2006; Garcia e Moreira-Filho,
2005). No entanto, estudos cariotípicos em espécies marinhas de Siluriformes,
incluindo Ariidae são escassos (Sczepanski, 2008), sobretudo para a região NE
do Brasil. No Brasil se concentram na costa Sudeste e Sul, necessitando de um
número maior de dados para possibilitar o conhecimento sobre a estrutura
cariotípica, auxiliar na solução de questões taxonômicas, verificar a existência
e compreender sistemas de diferenciação sexual, permitindo assim e
vislumbrar sua história evolutiva e gerar informações úteis na conservação das
populações destes peixes.
Esta Ordem, juntamente com Characiformes e Cypriniformes pertencem
aos Ostariophysi, compartilhando especialmente o aparelho de Weber. A
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
31
condição diplóide dentre os Ostariophysi varia de 2n=50 a 98, com o conteúdo
de DNA variando de 27-51% daqueles encontrados para mamíferos e,
demonstrando que os membros desta Subordem enfrentaram extensos
rearranjos cromossômicos bem como incremento nos seus conteúdos de DNA
causados por duplicação de segmentos cromossômicos (Muramoto et al.,
1968; Oliveira et al., 1988). Tais estudos indicam também que o cariótipo dos
Siluriformes é mais suscetível a inversões pericêntricas, além de rearranjos dos
tipos fissões e fusões cêntricas – embora, ao que parece, em menor escala –
resultando em mudanças nos números fundamentais quanto em variações dos
números diplóides (LeGrande, 1981).
O número diplóide 2n=56 (±2) tem sido evidenciado como ancestral para
a Ordem Siluriformes (Oliveira e Gosztonyi, 2000) (Tabela 1), juntamente com
NF de valores elevados (>80), dentro da família Ariidae.
2. Objetivos
Dados citogenéticos da família Ariidae para o litoral NE do Brasil são
escassos. O baixo conhecimento de seus aspectos citogenéticos dificulta ainda
o reconhecimento da diversidade de espécies e conhecimento de aspectos
evolutivos do grupo. Diante disso, o presente trabalho objetivou realizar
análises citogenéticas comparativas em duas espécies da costa do Rio Grande
do Norte, Cathorops spixii e Sciades cf. emphysetus avaliando a diversidade
cariotípica apresentada e, permitindo inferir acerca da história evolutiva deste
clado, utilizando técnicas de bandamento C, Ag-RONs, coloração com CMA3,
além do mapeamento de cístrons ribossomais 18S e 5S, utilizando a técnica de
FISH.
3. Material e Métodos
No presente estudo foram analisados seis exemplares de Cathorops
spixii Agassis, 1829 e quatro espécimes de Sciades cf. emphysetus Bloch,
1794 (Fig. 1), todos imaturos, na praia de Ponta Negra, no litoral do Rio Grande
do Norte (RN). Os exemplares foram submetidos à estimulação mitótica de
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
32
acordo com Lee e Elder (1980) e Molina (2001), com o intuito de aumentar a
taxa de divisão celular, provocada por meio de uma inoculação de lisados
fúngicos e bacterianos, visando um maior número de metáfases na suspensão
cromossômica. Cromossomos mitóticos foram obtidos através da técnica de
Gold et al. (1990). O material foi corado com Giemsa 5% diluído em tampão
fosfato pH 6,8. Análises citogenéticas utilizando microscópio ótico com
aumento de 1.000 X, estabeleceram o valor diplóide modal para as espécies a
partir da contagem de 30 metáfases para cada exemplar. As melhores
metáfases foram fotografadas em microscópio Olympus BX42, com sistema
digital de alta resolução. Os cromossomos foram organizados por tamanho em
ordem decrescente e classificados em grupos de acordo com nomenclatura
desenvolvida por Levan et al. (1964), em metacêtricos, submetacêntricos,
subtelocêntricos e acrocêntricos.
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
33
Figura 1. Exemplares de Cathorops spixii (a); Sciades cf. emphysetus (b).
Barra = 5cm.
Os cístrons ribossomais foram caracterizadas utilizando-se impregnação
pela prata (Howell e Black, 1980) e FISH (fluorescent in situ hybridization) com
o uso de sondas 18SrDNA. As regiões heterocromáticas foram identificadas
pelo método desenvolvido por Summer (1972), com pequenas alterações.
Coloração pelo fluorocromo base-específico CMA3 seguiu o método
preconizado por Schweizer (1980).
a
b
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
34
4. Resultados As análises citogenéticas realizadas no cariótipo de Cathorops spixii
identificaram para a espécie um valor diplóide modal de 2n=56, com fórmula
cariotípica 14m+20sm+18st+4a, e NF=108. Sítios Ag-RONs estavam presentes
em posição telomérica no braço curto de dois pares cromossômicos. Para
Sciades cf. emphysetus foi estabelecido um número diplóide modal de 2n=56,
com a fórmula cariotípica composta por 14m+14sm+24st+4a e NF=108 (Fig. 2).
Também nesta espécie apresenta dois pares organizadores nucleolares, cujos
sítios estavam localizados, nos braços curtos, em posição telomérica (Fig. 3), o
que foi confirmado através de CMA3 (Fig. 4) e hibridação fluorescente in situ
com sondas 18S rDNA (Fig. 5). Em ambas as espécies não foi possível
determinar com precisão a posição destes pares.
Em C. spixii, blocos heterocromáticos estavam presentes nas regiões
centroméricas, pericentroméricas, bem como em posição telomérica de alguns
pares, alguns ocupando todo o braço curto de cromossomos, como observado
nos pares, submetacêntricos. Sciades cf. emphysetus apresentou um padrão
de bandamento C muito semelhante ao encontrado no cariótipo de C. spixii,
com a presença de marcações blocos heterocromáticos nas regiões
centroméricas e pericentroméricas, teloméricas. Também no cariótipo desta
espécie, foram evidenciados blocos ocupando toda a extensão dos braços
curtos de dois cromossomos submetacêntricos.
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
35
Figura 2. Cariótipo de Cathorops spixii (a); Sciades cf. emphysetus (b)
submetidos à coloração com Giemsa. Em destaque à direita, de
cima para baixo, os pares nucleolares submetidos ao FISH com
sonda 18S, coloração pela Cromomicina A3 e Ag-RONs. Barra =
5µ.
b
a
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
36
Figura 3. Metáfases de C. spixii (a) e de Sciades cf. emphysetus (b)
após tratamento com AgNO3. As setas indicam os cístrons
ribossômicos. Barra = 5µ.
Figura 4. Metáfases de C. spixii (a); Sciades cf. emphysetus (b) após
tratamento com CMA3. Barra = 5µ.
a b
a b
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
37
Figura 5. Hibridação fluorescente in situ com sondas 18S rDNA em C. spixii
(a); Sciades cf. emphysetus (b). Barra = 5µ.
b a
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
38
Tabela 1. Dados citogenéticos disponíveis para a família Ariidae.
Espécie
2n
NF
Fórmula Cariotípica
Local
Referências
Arius dussumieriy 54 84 12m+18sm+12st+12a Oceano Índico Rishi et al., 1983
Arius felis 54 80 26sm+28st Golfo do México LeGrande, 1980
Arius felis 54 102 16m+12sm+20st+6a Campeche, México Garcia-Molina e
Uribe-Alcocer,1988
Arius melanopus 52 104 16m+30sm+6st Golfo do México Ramirez, 1985
Arius nenga 54 108 16m+36sm+2st Mar Gopalpur, Orissa,
India
Choudhury, Prasad e
Das, 1993
Arius parkeri=
Aspistor luniscutis
56 88 16m+16sm+22st+2a Cananéia, SP, Brasil Gomes et al., 1994
Arius serratus 56 112 8m+24sm+24st Mar Gopalpur, Orissa,
India
Choudhury, Prasad e
Das, 1993
Aspistor luniscutis 56 112 14m+22sm+20st Ilha do Mel; Baía de
Guaratuba, PR
Sczepanski, 2008
Bagre bagre 56 106 24m+26sm+6st Cananéia, SP, Brasil Gomes, Phan e
Passos,1990
Bagre marinus 54 74 12m+8sm+34st NE do Golfo do
México
Fitzsimons et al., 1988
Cathorops sp. 54 80 13m+13sm+28st Cananéia, SP, Brasil Gomes et al., 1992
Cathorops spixii 56 108 14m+20sm+18st+4a Ponta Negra, Natal, RN Presente estudo
Galeichthys
caerulescens
52 102 16m+24sm+10st+2a Tres Palos, Guerrero,
México
Arreguin, 1983
Genidens barbus 56 108 14m+16sm+22st+4a,
XX/XY
Baía de Guaratuba, PR Sczepanski, 2008
Netuma barba=
Genidens barbus
56 92 18m+18sm+18st+2a,
XX/XY
Cananéia, SP, Brasil Gomes et al., 1994
G. genidens 56 108 14m+22sm+16st+4a Baía de Antonina; Pontal
do Paraná, PR
Sczepanski, 2008
G. genidens 56 88 12m+20sm+20st+4a Cananéia, SP, Brasil Gomes et al., 1994
Hexanematichthys
herbergii
56 104 24m+24sm+6st+2a Lago de Maracaibo,
Venezuela
Molina et al., 2004
Sciades cf.
emphysetus
56 108 14m+14sm+24st+4a Ponta Negra, Natal, RN Presente estudo
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
39
5. Discussão
Dentro da família Ariidae, dados cariotípicos fornecidos pelo presente
estudo reforçam a hipótese da manutenção do número diplóide, com variação
nas fórmulas cariotípicas, sugerindo que inversões pericêntricas foram
preponderantes na evolução cariotípica deste grupo.
No presente trabalho, ambas as espécies apresentaram um mesmo
valor diplóide 2n=56 e número fundamental (NF) igual a 108, mas com
diferentes fórmulas cariotípicas. O cariótipo de Cathorops spixii é formado por
14m+22sm+16st+4a, enquanto que Sciades cf. emphysetus apresenta
14m+14sm+24st+4a.
Análises realizadas em populações de três espécies da família Ariidae
(Genidens genidens, G. barbus e Aspistor luniscutis) do litoral do Paraná
(região Sul do Brasil) (Sczepanski, 2008), demonstraram conservadorismo no
valor diplóide, e fórmulas cariotípicas com NF aproximados a C. spixii e
Sciades cf. emphysetus. (Tabela 1). Aquelas três espécies, juntamente com
estas duas, tem o mesmo número de cromossomos metacêntricos (14m) e
acrocêntricos (4a; exceto A. luniscutis, que não possui cromossomos deste
tipo). Uma revisão dos dados citogenéticos disponíveis demonstra um relativo
conservadorismo cariotípico presente no grupo, em relação aos números
diplóides (2n=52-56, com 2n=56 como valor modal), fórmulas cariotípicas (ricas
em elementos bibraquiais, m, sm e st) e números fundamentais (NF=74-112).
Uma vez que os números diplóides permanecem os mesmos e os NFs variam
para valores altos (>70), tais características sugerem que as mudanças
carioevolutivas dentro de Ariidae podem ser resultantes principalmente de
rearranjos do tipo inversão pericêntrica que, como observado nos diferentes
trabalhos já realizados, constitui uma tendência de mudança estrutural
cariotípica do grupo. A inversão pericêntrica tem sido considerada um rearranjo
importante na evolução cariotípica de muitos grupos de peixes, como
evidenciado para aqueles com números diplóides conservados, porém, com
grande variabilidade cariotípica, como visto em representantes Perciformes das
famílias Pomacanthidae (Affonso e Galetti, 2005) e Pomacentridae (Molina e
Galetti, 2004).
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
40
Um fato interessante são as discrepâncias quanto aos números
diplóides e as fórmulas cariotípicas de algumas espécies para diferentes
regiões geográficas. C. spixii encontrada no litoral do NE difere em relação aos
dados citogenéticos da população Cananéia, São Paulo (Gomes et al., 1992),
obtidas para Cathorops sp. (depois identificado com C. spixii), que apresenta
2n=54 (13m+13sm+28st, NF=80). O mesmo foi observado entre amostras de
Genidens genidens e G. barbus do litoral do Paraná e de São Paulo (Tabela 1).
Estas diferenciações cromossômicas podem estar relacionadas à existência de
espécies crípticas, apresentando diferenciações citogenéticas conspícuas
surgidas em função de isolamento alopátrico. Contudo, devido à grande
dificuldade na identificação taxonômica precisa para as espécies desta família
(Dr. Ricardo Rosa, comunicação pessoal), não pode se descartar imprecisão
de identificação.
A presença de números diplóides próximos de 2n=56 juntamente com
NF elevados é evidenciada em outros grupos de Siluriformes, como nas
famílias Trichomycteridae (Borin e Martins-Santos, 1999), Doradidae (Eler et
al., 2007), Loricariidae (Artoni e Bertollo, 2001; Alves et al., 2005; Kavalco et
al., 2005) e Auchenipteridae (Garcia, 2005). É evidente que modificações
cariotípicas recorrentes dentro desta Ordem têm levado a números diplóides de
54, 56 e 58, levando Eler et al. (2007) a sugerir 2n=56 como número basal para
Siluriformes.
Nos Siluriformes, a distribuição de heterocromatina constitutiva é mais
comum nas regiões centroméricas e teloméricas (Kavalco et al., 2005). Para as
espécies do presente estudo, a localização de heterocromatina constitutiva foi
evidenciada nas regiões centromérica e pericentromérica, além da telomérica.
Algumas marcações de banda C coincidiram com pares portadores de regiões
organizadoras de nucléolo (RON). Dentro dos Siluriformes em geral, isto
parece ser comumente observado para outros grupos como, por exemplo, em
Auchenipteridae (Garcia, 2006), Pimelodidae (Eler et al., 2007), Loricariidae
(Andreata et al., 2006), indicando que tal característica pode refletir um padrão
ancestral (plesiomórfico). Uma mesma disposição e conteúdo de blocos
heterocromáticos foram evidenciados para G. genidens, G. barbus e A.
luniscutis no litoral do Paraná (Sczepanski, 2008), confirmando esta condição
como um padrão conservado na família Ariidae.
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
41
Nos cariótipos de C. spixii, e Sciades cf. emphysetus as RONs foram
evidenciadas em posição terminal, no braço curto de dois pares
subtelocêntricos tanto pela técnica de Ag-RONs quanto pela hibridação in situ
com sondas 18S rDNA. RONs múltiplas também foram identificadas no Ariídeo
A. luniscutis (Sczepanski, 2008), que apresenta três pares cromossômicos
portando sítios ribossomais. Múltiplos cístrons ribossomais tem sido detectados
no cariótipo de outros grupos de Siluriformes, como em Loricariidae (Kavalco et
al., 2005) e Callichthyidae (Shimabukuro-Dias et al., 2004).
A presença de um único par portador de RONs, localizadas
terminalmente num braço curto é uma condição comumente encontrada, sendo
vários os casos de RONs simples observados em Siluriformes, com em
Loricariidae (Artoni e Bertollo, 2001; Kavalco et al., 2005; Alves et al., 2005),
Doradidae (Eler et al., 2007), Trichomycteridae (Borin e Martins-Santos, 1999),
Auchenipteridae (Garcia, 2005) e Pimelodidae (Garcia e Moreira-Filho, 2005).
No estudo realizado por Sczepanski (2008), G. barbus e G. genidens
apresentaram sítios Ag-RONs sobre um único par cromossômico, com a
existência heteromorfismo de tamanho destas regiões entre os homólogos. Na
presente análise, não foi detectado nos espécimes analisados, polimorfismos
de tamanho dos sítios ribossomais.
Como alternativa a outros tipos de bandamentos cromossômicos, o uso
de fluorocromos base-específicos tem ajudado a evidenciar grande
variabilidade e diversidade em peixes. Estes são corantes fluorescentes
ligantes de DNA. A Cromomicina A3 (CMA3), por exemplo, tem sido utilizada
para destacar regiões ricas em bases GC. Tais caracterizações tem ajudado a
prover informações sobre a composição e o conteúdo de heterocromatina em
peixes (Mantovani et al., 2004). Nas duas espécies aqui estudadas a coloração
com CMA3 mostrou-se praticamente uniforme em todos os cromossomos, com
exceção das RONs, as quais mostraram-se CMA3+ . Esta característica de
fluorocromos GC-específicos apresentarem relação com as RONs identificadas
por impregnação por nitrato de prata é comum em alguns peixes. Isto pode ser
conseqüência da natureza dos cístrons ribossomais da família 45S, os quais
tem um maior conteúdo de bases GC em suas regiões espaçadoras ou entre
seqüências de DNA repetitivos adjacentes (Pendáz et al., 1993). Padrões
semelhantes, onde as RONs fluorescem sem nenhuma outra marcação
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
42
adicional encontrada, em grupos como Hepapteridae (Roman et al., 2002),
Pimelodidae (Borin e Martins-Santos, 2000; Swarça et al., 2001; Souza et al.,
2002; Souza et al., 2004), Trichomycteridae (Borin e Martins-Santos, 1999) e
Loricariidae (Kavalco et al., 2005), entre outros.
No presente trabalho e em outros Ariidae já analisados (Sczepanski,
2008) as RONs apresentam-se heterocromáticas, conforme o padrão
evidenciado por bandamento C, demonstrando tais regiões como as únicas no
complemento cariotípico de natureza rica em GC.
A soma dos dados citogenéticos disponíveis para a família Ariidae
permite indicar as inversões pericêntricas como principais responsáveis pela
diversificação cariotípica deste grupo, enquanto a pequena amplitude de
valores diplóides encontrados fornece indicações de um papel mais discretos
de fusões cêntricas na evolução cariotípica. Levantamentos citogenéticos
envolvendo outras espécies da família e análises filogenéticas moleculares
permitirão esclarecer a existência de espécies crípticas ao longo do litoral
brasileiro.
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
43
CAPÍTULO 3
Novo citótipo para o cangati, Parauchenipterus galeatus
(Siluriformes, Auchenipteridae) no NE do Brasil: Evidência de
um complexo de espécies Araújo, W.C. e Molina, W.F.
Resumo A região neotropical possui grande diversidade ictiológica, sendo os Siluriformes um dos principais grupos, com muitas espécies, principalmente no ambiente continental. Estes ambientes constituem berço de formação da diversidade, devido principalmente a processos de especiação causados em decorrência de partições nestes ambientes continentais. Endemismo ao longo das bacias hidrográficas brasileiras se apresenta como um fenômeno comum, sendo amplamente disperso através de grupos de peixes, principalmente devido à vicariância ou dispersão, além do isolamento e estabilidade climática. Análises citogenéticas realizadas em Parauchenipterus galeatus revelaram um cariótipo com 2n=58 (24m+16sm+10st+8a; NF=108), com RONs simples localizadas em região distal de um par cromossômico submetacêntrico e regiões heterocromáticas reduzidas. O padrão de heterocromatina parece ter função importante na diferenciação citogenética entre P. galeatus de diferentes bacias, os quais apresentam cariótipos diversificados. O cariótipo de P. galeatus da Região Hidrográfica Atlântico Nordeste Oriental mostrou-se diferenciado daqueles descritos para populações da Bacia do Amazonas e São Francisco. Em função do tempo de divergência entre estas bacias, das diferenças citogenéticas encontradas, capazes de representar efetivas barreiras reprodutivas pós-zigóticas, sugere-se que este novo citótipo descrito represente evidências da existência de um complexo de espécies tendo como sinonímia Parauchenipterus galeatus.
Palavras-chave: cangati, espécies crípticas, citogenética de peixes,
especiação alopátrica.
1. Introdução A região Neotropical possui um dos maiores contingentes de
biodiversidade de peixes, principalmente em relação à ictiofauna dulcícola,
onde o número de espécies pode exceder 8.000 spp. (Toledo e Foresti, 2001).
Grande parte desta diversidade se originou por processos de especiação
decorrentes de isolamento histórico de bacias. Endemismo ao longo das bacias
hidrográficas brasileiras se apresenta como um fenômeno comum, sendo
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
44
amplamente disperso através de grupos de peixes, principalmente devido à
vicariância ou dispersão, além do isolamento e estabilidade climática, as quais
podem influenciar este grau de endemismo (Marques et al., 2008).
Entre as bacias hidrográficas do NE brasileiro a do São Francisco é
considerada como uma área de endemismo, condição corroborada por uma
grande quantidade de dados citogenéticos provenientes de espécies nativas
(ver Garcia e Moreira-Filho, 2005; Peres, 2005; Marques et al., 2008). Outras
bacias, nesta região, embora com padrões biogeográficos decorrentes de
ciclos climáticos e geológicos próprios tem uma ictiofauna praticamente
desprovida de informações citogenéticas, como a Região Hidrográfica Atlântico
Nordeste Oriental, que abrange uma extensão de 287.348 km2, que
corresponde à cerca de 3% do território brasileiro. Esta bacia drena valiosas
áreas vegetais como fragmentos de floresta Atlântica, caatinga, uma parcela
pequena de cerrado além de biomas costeiros (ANA, Brasil; disponível em <
http://www.ana.gov.br/mapainicial/pgMapaF.asp>). Além disso, a região
costeira do NE brasileiro possui várias regiões estuarinas. Tais ecossistemas
nordestinos podem ser considerados como um sistema hidrográfico costeiro
semi-fechado, abastecido por águas oceânicas e fluviais, devido ao ciclo das
marés, o que gera um ambiente de grande fertilidade, produzindo grande
quantidade de matéria orgânica, importante para cadeia alimentar destas
regiões, proporcionando assim ecossistema para muitos invertebrados e
vertebrados (MMA,1998).
Até o momento nenhum estudo citogenético foi realizado em
representantes da Ordem Siluriformes encontrados nesta bacia. Sendo assim,
dados sobre a constituição cariotípica de grupos de grande distribuição
geográfica não estão disponíveis.
Neste sentido, análises citogenéticas foram realizadas no siluriforme
dulcícola, Parauchenipterus galeatus, que exibe ampla distribuição na América
do Sul, constituindo um típico representante da ictiofauna neotropical de
Siluriformes, popularmente chamado “cangati”. Ocorre geralmente nas áreas
de matas alagadas e sob vegetação aquática flutuante, possuindo hábitos
noturnos (Medeiros et al., 2003). Possui peculiaridades em relação ao seu
modo de reprodição, apresentando fertilização interna e dimorfismo sexual
marcante, o qual nos machos é mais evidente devido à modificação de seu
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
45
primeiro raio da nadadeira anal em um órgão intromitente. As fêmeas possuem
uma estrutura sacular no oviduto onde espermatozóide é armazenado após
fertilização (Sanches et al., 1999). Análises cromossômicas realizadas na
espécie em outras bacias hidrográficas apresentaram cariótipos divergentes
(Souza et al., 2002; Garcia, 2005).
2. Objetivos Dados citogenéticos de Siluriformes da bacia do Atlântico NE Oriental
permanecem escassos e o baixo conhecimento de seus aspectos citogenéticos
dificulta o reconhecimento da diversidade de espécies. Diante disso, o
presente trabalho tem como objetivo realizar análises citogenéticas em
espécimes de P. galeatus Linnaeus, 1766 presentes no rio Pium, Natal-RN,
utilizando para isso bandamentos clássicos (banda C, Ag-RONs) e
moleculares, como CMA3/DAPI e hibridação in situ fluorescente (FISH) com
sondas de DNAr 18S. Desta forma, esperou-se reunir dados sobre o padrão
cromossômico desta espécie, correlacioná-los com os estudos já existentes
para outras bacias hidrográficas, procurando compreender melhor os
processos de diferenciação cromossômica e evolução cariotípica dentro deste
grupo.
3. Material e Métodos No presente estudo foram analisados 19 exemplares (2 machos, 9
fêmeas e 8 juvenis) de Parauchenipterus galeatus (Fig. 1), coletados no rio
Pium, Natal-RN (05°46'24"S, 35°11'W). Os peixes foram coletados com ajuda
de anzóis e redes, acondicionados em sacos plásticos com água e levados ao
Laboratório de Genética de Recursos Marinhos – UFRN, permanecendo em
tanques bem aerados. A estimulação mitótica foi realizada de acordo com Lee
e Elder (1980) e Molina (2001), com o intuito de aumentar a taxa de divisão
celular, provocada por meio de uma inoculação de lisados fúngicos e
bacterianos, visando um maior número de metáfases na suspensão
cromossômica. As preparações cromossômicas seguiram o método de
preparação direta in vitro (Gold et al., 1990). O material foi corado com Giemsa
5% diluído em tampão fosfato pH 6,8. Análises citogenéticas foram
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
46
desenvolvidas utilizando microscópio ótico com aumento de 1.000 X, sendo
analisadas em média trinta metáfases para cada exemplar. As melhores
metáfases foram fotografadas em microscópio Olympus BX42, com sistema
digital de alta resolução. Os cromossomos foram organizados por tamanho em
ordem decrescente e classificados em grupos, como metacêntricos,
submetacêntricos, subtelocêntricos e acrocêntricos, de acordo com
nomenclatura desenvolvida por Levan et al. (1964). As RONs foram
caracterizadas utilizando-se impregnação pela prata (Howell e Black, 1980). A
heterocromatina foi analisada pelo bandamento C (Summer, 1972), bem como
pelo fluorocromo Cromomicina A3 (Schweizer, 1980). FISH foi utilizado para
identificação de seqüências ribossomais utilizando sondas 18S rDNA obtidas
da espécie de peixe Prochilodus argenteus (Hatanaka e Galetti, 2004).
Figura 1. Exemplar de Parauchenipterus galeatus. Barra = 1cm.
4. Resultados
Parauchenipterus galeatus apresenta um número diplóide modal de
2n=58, composto por uma fórmula cariotípica igual a 24m+16sm+10st+8a
(NF=108) (Fig. 2). O bandamento C evidenciou blocos heterocromáticos
presentes predominantemente em regiões centroméricas e pericentroméricas
(Fig. 3). A impregnação por nitrato de prata evidenciou a presença de dois
pares portadores de regiões organizadoras nucleolares (AgRONs), em posição
distal dos braços curtos de um par submetacêntrico (Fig. 4). Este padrão foi
coincidente com as análises utilizando sondas de 18S rDNA (Figura 5)
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
47
O uso de CMA3 evidenciou marcações positivas nas regiões distais dos
braços curtos do par portador das RONs (Fig. 6 a e b). O uso de fluorocromo
base-específico DAPI revelou um padrão uniforme (Fig. 6c).
Figura 2. Cariótipo de P. galeatus submetido à coloração com Giemsa, com
2n=58 cromossomos (NF=108).
Figura 3. Bandamento C em cromossomos de P. galeatus. Barra = 5µ.
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
48
Figura 4. Metáfase de P. galeatus após tratamento com AgNO3. As setas
indicam cístrons ribossômicos. Barra = 5µ.
Figura 5. Metáfases de P. galeatus. a e b) FISH evidenciando cístrons 18S rDNA. Barra = 5 µ.
Figura 6. Metáfases de P. galeatus. CMA3 a); CMA3 evidenciando associação de RONs b); DAPI c).
a b
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
49
Tabela 1. Revisão dos dados cariotípicos da família Auchenipteridae.
5. Discussão A Ordem Siluriformes abriga um dos maiores grupos de peixes de
ambientes continentais da região neotropical, composta por 15 famílias e cerca
de 1.548 espécies neotropicais (Reis et al., 2003). Dentro deste grupo, tem sido
descrito uma grande quantidade de dados citogenéticos, com relatos exibindo
para vários grupos diversidade e variabilidade cromossômica, tanto numérica
quanto estrutural, assim como a presença de sistemas de cromossomos
sexuais (Artoni et al., 2001; Andreata et al., 2006; Centofante et al., 2006;
Oliveira et al., 2006; Milhomen et al., 2008, entre outros). Auchenipteridae é uma família com características biológicas peculiares,
como fecundação interna, provavelmente extensiva a todas as espécies
(Nelson, 2006). A amostra de P. galeatus da Região Hidrográfica Atlântico
Nordeste Oriental, no Rio Grande do Norte, possui um cariótipo com 2n=58
cromossomos e fórmula cariotípica composta por 24m+16sm+10st+8a
Espécies
2n
NF
Fórmula
cariotípica
Par/RONs
No
RONs
Localidade
Referências
Aucheniptericht
hys thoracatus
58 104 18m+16sm+12st+12a T; p, par 23 Simples B. Amazônica-
AM
Souza et al.
(2002)
Glanidium
ribeiroi
58 106 22m+16sm+10st+10a P; p, par 13 Simples R. Iguaçu-PR Roman et al.
(2001)
Glanidium
ribeiroi
I; par, 1 Simples R. Iguaçu-PR Fenocchio et
al. (2004)
Liosomadoras
oncinus
58 104 16m+22sm+8st+12a T; p; st-a Múltipla B. Amazônica-
AM
Souza et al.
(2002)
Parauchenipter
us galeatus
58 104 20m+14sm+12st+12a T; p, par 20 Simples B. Amazônica-
AM
Souza et al.
(2002)
Parauchenipter
us galeatus
58 108 24m+20sm+6st+8a T; p, par 20 Simples B. São
Francisco-MG
Garcia, 2005
Parauchenipter
us galeatus
58 108 24m+16sm+10st-8a T; p; sm Simples B NE Oriental-
RN
Presente
estudo
P. leopardinus 58 110 24m+24sm+4st+6a Par 20 Simples B. São
Francisco-MG
Garcia, 2005
Tracheliopiterch
thys taeniatus
58 104 20m+18sm+8st+12a T; p, par 24 Simples B. Amazônica-
AM
Souza et al.
(2002)
T- terminal; I – intersticial; P – pericentromérica; p – braço curto.
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
50
(NF=108). Este citótipo é similar quanto ao valor diplóide, mas conspicuamente
diferente quanto aos padrões cromossômicos estruturais daqueles identificados
para a bacia Amazônica (2n=58; 20m+14sm+12st+12a; NF=104) (Souza et al.,
2002) e bacia do rio São Francisco (2n=58; 24m+20sm+6st+8a; NF=108)
(Garcia, 2005). Todas os citótipos, incluindo o da bacia do Atlântico NE,
apresentam um único par organizador nucleolar (submetacêntrico), com RONs
localizadas em posição telomérica no braço curto, corroborada também pela
presença de seqüência 18S rDNA. A presença de RONs únicas é considerada
uma condição simplesiomórfica para os Siluriformes (Oliveira et al., 2000;
Artoni e Bertollo, 2001; Kavalco et al., 2005).
Tendências de modificações cariotípicas são pronunciadas no ambiente
continental, principalmente por maior quantidade de divisões e obstáculos ao
fluxo gênico (Galetti et al., 2000). No caso de peixes de água doce, o
confinamento aos sistemas hidrográficos resulta de um estreito relacionamento
entre as histórias das bacias e suas histórias evolutivas (Kavalco, 2003).
Devido a pequena quantidade de caracteres cromossômicos obtidos de
forma rotineira em preparações citogenéticas em peixes, a banca C representa
para este grupo vertebrado uma valiosa ferramenta de análise (Souza et al.,
1996). É observado que os Siluriformes apresentam pouca quantidade de
heterocromatina, distribuída predominantemente em região pericentromérica e
telomérica, com relatos de ocorrência de marcações intersticiais e
polimorfismos (Artoni e Bertollo, 2001; Kavalco et al., 2005). Em P. galeatus, da
bacia do Atlântico NE Oriental, analisados no presente estudo, bem como em
amostras da Bacia Amazônica e do São Francisco, a heterocromatina está
distribuída de forma discreta, predominantemente nas regiões
pericentroméricas e centroméricas. Na bacia do São Francisco a espécie
apresenta também regiões teloméricas C+ evidentes em alguns cromossomos.
Pequenas diferenciações nos padrões de heterocromatina para
amostras geográficas de P. galeatus se estende também aos seus aspectos
composicionais. Desta forma enquanto que na bacia do São Francisco foi
detectado um par de cromossomos portadores de blocos DAPI+, coincidentes
com regiões de heterocromatina constitutiva (Garcia, 2005), no entanto, esta
característica não foi verificada para os espécimes da bacia do Atlântico NE
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
51
Oriental, cuja coloração cromossômica por este fluorocromo exibiu um padrão
neutro sem evidenciar regiões ricas em bases AT sobre os cromossomos.
Embora diferenças no padrão de bandamento C possam estar
relacionadas às dificuldades da técnica, é provável que de fato sejam
características peculiares dos cariótipos analisados, assim como propõem
Azevedo et al. (2005) para espécies de Achiridae (Teleostei,
Pleuronectiformes) brasileiras.
Este padrão de diferenciação causado pela natureza de heterocromatina
foi detectado em outros Siluriformes. Na subfamília Hypotopomatinae
(Loricariidae) quatro espécies (Hisonotos A e D, H. nigricauda e H.
leucofrenatus) foram separadas em dois grupos distintos em relação ao seu
conteúdo de heterocromatina detectada por banda C (Andreata et al., 2006).
Baixa quantidade de banda tem sido observada em outras espécies de peixes
como, Oligosarcus hepsetus (Characiformes) (Kavalco et al., 2005b). Citótipos
apresentando diferenças na distribuição de heterocromatina foram encontrados
em Astyanax scabripinnis e outros Characidae (Maistro et al., 2000; Portela-
Castro et al., 2007; entre outros).
Regiões ricas em bases GC (sinais fluorescentes CMA+) foram
evidenciados no cariótipo de P. galeatus na região distal dos braços curtos de
um par de cromossomos, coincidentes com as RONs, evidenciando a natureza
rica em GC destas regiões neste peixe. Este mesmo padrão já havia sido
encontrado em espécimes de P. galeatus da bacia do São Francisco, os quais
também apresentaram marcações CMA3+ coincidentes com as RONs (Garcia,
2005). A coincidência entre as marcações obtidas pela aplicação de
fluorocromos GC-específicos e os resultados obtidos por impregnação por
nitrato de prata seria possível devido à ocorrência de grandes quantidades de
bases GC nas regiões espaçadoras dos genes ribossomais ou, entre
seqüências de DNA repetitivos adjacentes (Pendáz et al., 1993).
Tais resultados são semelhantes àqueles relatados para outros Siluriformes,
como em Pariolius hollandi (Roman et al., 2002), Rhamdia branneri (Roman et
al., 2002b), R. quelen (Fenocchio et al., 2002; Maistro et al., 2002), contudo,
condições diferentes de ocorrência de RONs tem sido descritas para outras
famílias, como por exemplo, nas espécies do gênero Trichomycterus
(Siluriformes, Trichomycteridae) que exibe marcações CMA3+ em regiões
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
52
intersticiais dos pares portadores de RONs em três espécies estudadas (Borin
e Martins-Santos, 1999).
Os dados obtidos demonstram que o padrão cariotípico de P. galeatus
encontrados na bacia do Atlântico NE Oriental possui diferenciação daqueles
da bacia do Amazonas e São Francisco em relação à fórmula cariotípica e
natureza da heterocromatina. Porém, quanto à macroestrutura cariotípica ele
se assemelha mais ao da Bacia do São Francisco, do qual difere na definição
de cromossomos submetacêntricos e subtelocêntricos. Este fato possivelmente
remete a uma condição de maior proximidade filogenética entre estas
amostras, oriunda da gênese das bacias envolvidas. P. galeatus da Bacia do
Atlântico NE Oriental, desta forma, parece representar uma das formas
biológicas particulares dentro de um complexo de espécies denominado
genericamente “P. galeatus”, ainda não diferenciado morfologicamente, mas
com diferenciações citogenéticas que apontam uma sensível diversificação
cariotípica.
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
53
CONSIDERAÇÕES FINAIS
O presente estudo constou um levantamento cariotípico quanti-
qualitativo para espécies ícticas da região NE do Brasil, consideradas crípticas,
em função do nível de dificuldade de identificação taxonômica ou do limitado
conhecimento genético que se tem de seus grupos taxonômicos.
Estes marcadores de cunho citogenético têm sido utilizados com
sucesso com o intuito de evidenciar padrões de evolução cariotípica em
diversos grupos de peixes, além de ajudar na elucidação de questões
taxonômicas, evidenciar padrões populacionais, fornecendo bases eficientes
para a aplicação dessa ferramenta de grande utilidade para conservação,
programas de manejo e identificação correta de espécies crípticas.
As análises desenvolvidas em Apogon americanus permitiram avançar
no entendimento de estrutura cromossômica de um Perciformes com cariótipo
intensamente diversificado, revelando ainda assim a presença de caracteres
comuns ao grupo, como baixo conteúdo heterocromático e cístrons
ribossomais únicos.
Além disso, algumas características comuns aos Siluriformes
observadas neste estudo corroboram com as evidências de estabilidade
cariotípica dentro do grupo e mesmo na família Ariidae. Nas espécies
analisadas observou-se como característica um alto valor de número
fundamental indicando a presença de elevado número de cromossomos meta-
submetacêntricos no cariótipo de Siluriformes, o que de fato parece ser um
caráter ancestral amplamente compartilhado no grupo. Esta característica
revela a grande variação estrutural no cariótipo deste grupo, principalmente
proporcionada por mecanismos de inversões pericêntricas.
No bagre dulcícola, P. galeatus observou-se um número diplóide, 2n=58
e fórmula cariotípica particular em relação a outras amostras geográficas desta
espécie. Estas informações contribuem no estabelecimento de um complexo de
espécies, sob a sinonímia “P. galeatus”, com padrões biológicos e
características genéticas próprias. O citótipo descrito aqui para a Bacia do
Atlântico NE Oriental, possibilitou os dados sobre a biodiversidade local e
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
54
contribuir para estudos mais pormenorizados envolvendo esta forma biológica,
que pode vir a se constituir na descrição de uma nova espécie.
Enfim, estes resultados contribuem para um melhor entendimento dos
processos e padrões de diferenciação e evolução cromossômica da fauna
ícticas da região Nordeste do Brasil. Associações com outras abordagens,
como o uso de análises morfológicas e ferramentas moleculares, permitirão
uma maior compreensão da diversidade genética e biológica da ictiofauna
brasileira.
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
55
CONCLUSÕES
a) Entre os Apogonidae, rearranjos Robertsonianos aliados às inversões
pericêntricas constituem um dos principais mecanismos de diferenciação
cromossômica ao longo da evolução do grupo, este último mecanismo
sugerido pelos elevados valores de NF e relativa manutenção do número
diplóide modal de alguns representantes do grupo;
b) Apesar da grande distância entre populações de A. americanus do litoral
do Rio Grande do Norte até a Bahia, não foram evidenciadas diferenças
nos cariótipos entre estas duas populações, evidenciando que a
manutenção de fluxo gênico continua a propiciar coesão genética à
espécie ou que a mesma apresenta divisão populacional recente;
c) Embora apresentem um cariótipo numérica e estruturalmente diferenciado
do modelo basal dos Perciformes, os Apogonidae, revelam através dos
padrões estruturais detectados, grandes similaridades conservadas com
estes, ou seja, sítios 5S e 18S não sintênicos, RONs simples e reduzido
conteúdo heterocromático;
d) As espécies Cathorops spixii e Sciades cf. emphysetus corroboram a
marcante estabilidade cariotípica, no que se refere ao número
cromossômico, proposta para Siluriformes e extensamente difundida entre
os Ariidae;
e) Altos valores de NF, associados às fórmulas cariotípicas divergentes,
foram observados entre os Ariidae analisados, sugerindo tratar-se de
caracteres simplesiomórficos para os Siluriformes, derivados de intensos
mecanismos de inversões pericêntricas;
f) P. galeatus da Bacia do Atlântico NE Oriental (RN) apresentou fórmula
cariotípica e na composição de segmentos heterocromáticos diferenciados
de outras amostras geográficas distintas (Bacias do São Francisco e
Amazônica), sugerindo que “P. galeatus” represente um complexo de
espécies.
Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos
56
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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