Giovanni DI BONAVENTURA, Ph.D.
CI Medicina di Laboratorio
CL Medicina e Chirurgia
Università “G. d’Annunzio” di Chieti-Pescara
AA 2014-2015
L’ingestione di microrganismi patogeni può causare un gran numero di infezioni, confinate all’intestino o disseminate
Quotidianamente vengono ingerite quantità rilevanti di microrganismi. Tuttavia, grazie ai numerosi meccanismi di difesa dell’ospite, raramente essi sopravvivono fin all’intestino in un numero sufficiente per causare infezione
Un’ampia gamma di microrganismi, sia batterici che virali, può infettare il tratto gastroenterico
Le tossinfezioni alimentari insorgono in
seguito ad ingestione di cibo contaminato
con tossine batteriche (Clostridium
botulinum, Staphylococcus aureus)
Nel caso di infezioni veicolate da alimenti,
il cibo costituisce terreno di coltura per i
patogeni che si accrescono fino a raggiungere
concentrazioni infettanti (Salmonella)
oppure il cibo funge da solo veicolo
(Campylobacter)
La diarrea è il sintomo più comune delle infezioni del tratto gastroenterico
Esse possono presentarsi come forme lievi, moderati e gravi fino all’exitus del paziente
Rappresentano un meccanismo di clearancedell’infezione ma anche di sua diffusione
Nel Terzo Mondo la diarrea è tra le principali cause di morte nell’infanzia
non diagnosticate per modesta sintomatologia
assenza di strutture mediche adeguate
Nei Paesi industrializzati, invece, la diarrea è modesta ed auto-limitante, tranne che nei neonati, anziani ed immunocompromessi
Escherichia coli appartiene alla Famiglia delle Enterobacteriaceae.
E’ uno dei patogeni più versatili esistenti in natura. Accanto ai ceppi apatogeni (flora autoctona intestinale) esistono ceppi virulenti in grado di causare infezioni nel tratto gastroenterico ed in altri apparati, quello urinario in particolare.
Inizialmente tutti classificati come enteropatogeni, E. coli in grado di causare infezioni gastroenteriche con meccanismi peculiari sono classificati in 6 diversi gruppi: E. coli ENTEROPATOGENI (EPEC)
E. coli ENTEROTOSSIGENI (ETEC)
E. coli ENTEROEMORRAGICI (EHEC)
E. coli ENTEROINVASIVI (EIEC)
E. coli ENTEROAGGREGATIVI (EAEC)
E. coli DIFFUSIVI-AGGREGATIVI (DAEC)
EPEC sono in grado di aderire all’epitelio del tenue grazie alla produzione di: pili riuniti in fasci (bundle-forming pili, Bfp)
intimina (adesina)
proteina associata all’intimina (traslocated intiminreceptor, Tir)
Provocano distruzione dei microvilli con conseguente diarrea (soprattutto nei lattanti e bambini)
Insieme con ETEC, gli EPEC sono gli agenti causali di diarrea più frequenti in tutto il mondo
DIAGNOSI DI LABORATORIO: Coprocoltura (isolamento)
Determinazione del sierotipo con sieri polivalenti
Tests molecolari per fattori di adesività
Adesione a cellule in coltura (colorazione con actina fluorescente)
EPEC and EHEC bind to plasma membrane of epithelial cells via
hollow EspA filaments (a). Protein translocation is followed by
interaction between the outer membrane adhesin intimin (d)
and Tir (e,f). Intimin-Tir interaction leads to reorganisation of
both micro (e) and intermediate (ck) filaments (f) underneath
the attached bacteria, pedestal formation (c) and intimate
attachment (b).
EPEC aderiscono agli enterociti, distruggendo la normale architettura dei
microvilli, inducendo la caratterisica lesione “adesione-distacco”. Riarangiamenti
del citoscheletro sono accompagnati da risposta infiammatoria e diarrea. 1.
Adesione iniziale, 2. Traslocazione proteina mediante secrezione di tipo III, 3.
Formazione di pedestalli.
ETEC sono in grado di aderire all’epitelio del tenue grazie alla produzione di adesine fimbriali
Producono potenti enterotossine: Tossina termolabile (LT-1), causa sindrome colera-like poichè simile
per struttura e meccanismo d’azione alla tox colerica
Altri ceppi producono le tossine termostabili (ST-s), da sole o in associazione con LT-1. Meccanismo simile a LT-1: attivano la guanilato–ciclasi causando un aumento di GTP e conseguente incremento di secrezione di fluidi nel lume intestinale
Principale causa della diarrea del viaggiatore. Insieme con gli EPEC, ETEC sono la più frequente causa batterica di diarrea nel mondo
L’acqua contaminata da deiezioni umane/animali è la principale fonte di contagio
DIAGNOSI DI LABORATORIO: Abbondanti feci diarroiche acquose
Coprocoltura (isolamento)
Ricerca sierologica delle tossine nel surnatante di colture batteriche
Tests molecolari (sonde geniche) per i geni codficanti LT-1 e STs, per la ricerca in feci, alimenti ed acqua
Laboratory methods for isolation and identification of ETEC.
(Medical Microbiology. S. Baron, 4th edition)
EHEC sono in grado di aderire all’epitelio del crasso con un
meccanismo simile agli EPEC
Producono la verotossina (tossica vs cellule Vero), simile a quella
prodotta da Shigella, che danneggia direttamente l’epitelio
causando diarrea con abbondante sangue. Sono agenti di:
Colite emorragica
Sindrome uremo-emolitica (recettori per verotox anche sull’epitelio
renale)
Il sierotipo più comune è O157:H7
Alimenti (carne cruda) e latte pastorizzato sono importanti per la
diffusione
DIAGNOSI DI LABORATORIO:
Coprocoltura (isolamento): la proporzione di EHEC nel campione può
essere molto bassa (< 1% E. coli totali)
Ricerca sierologica (ELISA, EIA) della verotox nel campione fecale
Saggio biologico
Sonde geniche per la ricerca dei geni codificanti verotox
EIA, ELISA tests per la ricerca di verotox
EHEC causa adesione-distruzione nel colon.
Caratteristica di EHEC è la produzione di
verotox, il cui assorbimento sistemico determina
gravi complicanze.
(Kaper, JB, Nataro JP, Mobley HLT. 2004.
Pathogenic Escherichia coli. Nature Reviews
Microbiology 2, 123-140)
EHEC invadono le cellule sfruttando il meccanismo della
endocitosi
Una volta nelle cellule, lisano il vacuolo e invadono cellule
adiacenti, provocando danno tessutale, infiammazione, necrosi
(alla base del reperto di sangue e muco nelle feci)
Infezioni di origine esclusivamente alimentare
DIAGNOSI DI LABORATORIO:
Coprocoltura (isolamento)
Ricerca sierologica (ELISA, EIA) delle proteine invasive
Saggio di invasività in colture cellulari
Tests molecolari per la ricerca di geni codificanti proteine
invasive
EIEC invadono l’epitelio colico, lisano i fagosomi e si muovono
attraverso le cellule nucleando i microfilamenti di actina.
I batteri possono muoversi lateralmente attraverso l’epitelio
attraverso cellule contigue o possono uscire per poi re-
invadere la cellula nella membrana baso-laterale.
(Kaper, JB, Nataro JP, Mobley HLT. 2004. Pathogenic
Escherichia coli. Nature Reviews Microbiology 2, 123-14)
EAEC
tendono a formare aggregati, per la presenza di fimbrie codificate da
plasmidi. Producono anche tossine termo-labili sebbene a significato
patogenetico incerto.
Causano diarree infantili persistenti nei Paesi in via di sviluppo
DAEC
producono una -emolisina ed il fattore citotossico necrotizzante 1
incerto significato patogenetico nella malattia diarroica
DIAGNOSI DI LABORATORIO:
Coprocoltura (isolamento)
Utilizzo di colture cellulari per l’evidenziazione del caratteristico
pattern aggregativo-adesivo
Tests molecolari per la ricerca di geni codificanti proteine invasive
EAEC aderisce al piccolo e largo intestino organizzandosi come
biofilm e secerne enterotossine e citotossine.
DAEC induce una caratteristica trasduzione del segnale negli
enterociti del piccolo intestino che si manifesta con la formazione di
proiezioni cellulari finger-like che avvolgono il batterio.
AAF, aggregative adherence fimbriae; DAF, decay-accelerating factor;
EAST1, enteroaggregative E. coli ST1; ShET1, Shigella enterotoxin 1.
(Kaper, JB, Nataro JP, Mobley HLT. 2004. Pathogenic Escherichia coli.
Nature Reviews Microbiology 2, 123-140)
E’ la causa più frequente di diarrea associata al consumo di alimenti in molte nazioni sviluppate
Appartiene alla Famiglia delle Enterobacteriaceae. Oltre 2000 sierotipi: antigeni di parete cellulare (O)
antigeni flagellari (H)
Tutte le salmonelle, ad eccezione di S. typhi e S. paratyphi, si repertano sia negli animali che nell’uomo
S. enterica è la più virulenta per l’uomo
Esistenza di un rilevante serbatoio animale che trasferisce all’uomo l’infezione mediante ingestione di cibi (pollame, prodotti caseari) contaminato. Meno frequente è la diffusione dell’infezione mediante acqua
E’ possibile la trasmissione interpersonale epidemie secondarie all’interno di nuclei familiari
DIAGNOSI DI LABORATORIO:
La diarrea da Salmonella può essere
diagnosticata mediante isolamento colturale
(coprocoltura):
Semina su terreni selettivi
Incubazione per 24 h (non esigente)
Rapida identificazione preliminare
Tipizzazione completa richiede almeno 48 h
Sono fra le più comuni cause di diarrea.
La diarrea è clinicamente simile a quella
causata da Salmonella e Shigella, sebbene la
malattia possa avere un periodo di
incubazione più lungo.
Analogamente a Salmonella, esiste un
importante serbatoio animale da cui l’uomo
(per ingestione di cibi, acqua e latte
contaminati) contrae l’infezione.
Microaerofili e termofili (optimum di crescita
a 42°C)
A differenza di Salmonella e Campylobacter, V. cholerae causa infezioni solo nell’uomo
Gli individui asintomatici sono probabilmente il serbatoio naturale della malattia
La trasmissione diretta interpersonale è infrequente ed avviene principalmente mediante contaminazione fecale del cibo
La sua azione patogena è da ricondursi alla produzione di una enterotossina, sebbene mostri anche altri fattori di virulenza
Sierotipo O1 (2 biotipi: classico, El Tor) è il più importante
Produzione di feci ad “acqua di riso” (perdita di fluidi > 1 L/h, fino a 20 L/die)
In assenza di terapia, la mortalità è pari al 40-60%
Morfologia caratteristica (RNA ds, frammentato)
I rotavirus in attiva proliferazione causano diarrea in quanto interferiscono con i normali meccanismi di trasporto delle molecole e dei fluidi nell’intestino
L’infezione è comune nei bambini < 2 aa, con sintomatologia più grave nei Paesi in via di sviluppo
DIAGNOSI DI LABORATORIO: Microscopia elettronica
Individuazione antigeni virali nelle feci (ELISA)
A differenza della semplicità di raccolta del campione, l’isolamento dei
patogeni è, invece, complicata dalla presenza di un’abbondante flora
autoctona a livello intestinale
Il campione fecale viene raccolto e posto in un recipiente apposito a bocca
larga a chiusura ermetica (tappo a vite). Evitare contaminazione con urine
Il campione deve essere trasportato in lab entro 1-2 h dal prelievo.
Alternativamente, almeno 2 gr di campione prelevati mediante tampone,
debbono essere trasferiti in terreno di trasporto (Stuart, Amies, Cary-Blair).
Eccezionalmente, il campione può essere conservato a +4°C per max 24 h.
Il campione viene “arricchito” in terreno liquido:
Brodo-selenite F: inibisce la crescita di commensali (E. coli ed altri batteri
coliformi, batteri Gram-positivi, lieviti), favorendo la crescita di Salmonella e
Shigella
Acqua peptonata alcalina (peptone 1%, NaCl 1%, pH 8.6) per V. cholerae
Semina brodo di arricchimento su terreni selettivi:
Salmonella-Shigella (SS) agar, Hektoen enteric (HE) agar: per Salmonella e Shigella
Agar saccarosio tiosolfato citrato ai sali biliari (TCBS): per V. cholerae
Incubazione: Salmonella e Shigella richiedono 24h a 37°C (10% CO2, 42°C, 48-
72h per isolamento Campylobacter)
Identificazione di specie mediante saggi biochimici e sierologici
Ricerche particolari (Yersinia, Clostridium difficile,Vibrioni, E. coli O157, Rotavirus, protozoi) devono essere specificamente richieste. Se il campione di feci non è accompagnato da richieste specifiche, il laboratorio di norma esegue di base la ricerca di Salmonella, Shigella e Campylobacter.
La richiesta di indagini aggiuntive potrebbe richiedere più campioni.
ROTAVIRUS. Dopo i 5/6 anni di età la ricerca dei Rotavirus è sconsigliata in quanto i pazienti sono nella quasi totalità immunizzati.
CLOSTRIDIUM DIFFICILE. La ricerca di C. difficile va richiesta nei pazienti sottoposti a terapia antibiotica, comunque in situazioni di dismicrobismo.
MICOBATTERI. Raccogliere tre campioni fecali n tre giorni diversi (consegnare ogni campione entro 2 h dal prelievo)
PROTOZOI. Nel caso di ricerca di Giardia o Amoeba porre il campione in un contenitore termostatico (thermos).
La malattia può essere diagnosticata mediante ricerca
diretta del parassita su differenti campioni (feci; succo
duodenale, mediante enterotest; biopsia duodenale).
E’ consigliabile ripetere la ricerca (positività: 70% con
un singolo esame, 85% con un secondo esame, 95% con
un terzo esame) in quanto nelle forme croniche il
parassita ha dei periodi di replicazione alternati con
periodi di stasi.
Esame microscopico (feci, succo duodenale da entero-
test; biopsia duodenale)
«a fresco», di feci normoformate per la ricerca di cisti
(con 2 o 4 nuclei) oppure di feci diarroiche per la ricerca
di trofozoiti (mobili, con 2 o 4 flagelli, forma "a goccia«, a
volte è visibile il disco adesivo con il quale il parassita si
lega al tessuto intestinale).
di campioni colorati con Ematossilina ferrica, colorazione
di Lugol o Giemsa.
Ricerca di Ag mediante DFA (Direct Fluorescent Assay):
100% sensibilità/specificità
DFA (Direct Fluorescent Assay)
Trofozoiti. Colorazione di Lugol
Cisti. Osservazione «a fresco»
Entero-test (string test)
Esame colturale (isolamento da feci)
non si effettua di routine, in quanto tecnicamente difficoltosa.
tuttavia, può essere utile per escludere la presenza di altri
patogeni quali causa di infezione.
Trofozoiti. Isolamento da campione fecale
Esame istologico (biopsia duodenale) previa colorazione
H/E o PAS per la ricerca di trofozoiti «annidati» nelle
cripte duodenali.
Ricerca antigene specifico GSA-65 di G. intestinalis,
mediante:
EIA (Enzyme ImmunoAssay): 87%-100% sensibilità / 100%
specificità
Immunocromatografia: rapido (10 min)
Ricerca «molecolare» di sequenze geniche specifiche
mediante PCR.
La giardiasi non è associata ad eosinofilia. EIA (Enzyme ImmunoAssay)
Esame istologico di biopsia duodenale
PCR (Polymerase Chain Reaction)