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Exoom sequencing
Joris Veltman
Afdeling Genetica
UMC St. Radboud
Email: [email protected]
AGGCACCTCTGCATGCTGGATATTTGCTTTGCAGTTGGGGACGGTGGACAGACATTCTTTCCCACGGACGCTATAAACGCCAACTCACTGAGCAAGATGTAGAAACCATCTGCAGAACCATCCTGGTGTACTGTCTTAATCATTACAAAGGGGATGAGAATATCAAAAGCTTCATCTGGGATCTGATCACACCCACAGCGGATGGCCAGACTCGAGCCTTGGTCAACCATTCCGGTAGGTCTCCACCATGCTGTTTGTGCTACAGGGTCACAAAGCCACCAGGAACTTTTGTGACACACTGTTGATAAAGAGATGTGACATAAACCCCATATTTCCCTGCCTCGTGCATTAAGCTCTCTGCCATTGACACTATAATTGGAATGTAAAAGGCTTCTATTATTATTATGATGGTGATTCTAGGTTTGTCAGCTCCTGTGCCAAGGGGAAGGAAGGGAAAGAAGGTGAAAGCCCAGAGCACACAGCCGGTGGTGCAGGATGCCGACTGGCTGGCCAGCTGCAA
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Familie-onderzoek:
Welke genetische
merkers erven over
samen met ziekte?
Associatie-onderzoek: Welke
genetisch merkers verschillen
tussen grote groepen mensen
met en zonder ziekte.
Traditionele genetica: Familie-onderzoek en Associatie-onderzoek
Merker A1 erft over samen met ziekte
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Veel hersenaandoeningen komen voor bij kinderen van gezonde ouders en leiden tot vermindere voortplanting
Verstandelijke beperking
Autisme
Schizofrenie
Zeldzame hersen-
aandoeningen
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Onderzoek naar oorzaak van verstandelijke handicap
Gezonde ouders krijgen soms een kind met deze ziekte
De ziekte heeft vaak een oorzaak in het DNA
Extra chromosoom 21
Ouders hebben extra
chromosoom niet!
Nieuw foutje
in het DNA?
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1953 2001 2008 2011 2020?
De genetica, een jong en supersnel ontwikkelend vakgebied
DNA is Referentie 1ste persoonlijke Genoom Genoom bij
dubbele helix! genoom genoom in kliniek geboorte?
Microscoop Sanger sequencing DNA chips Genoom sequencing Genetica computervak
AGGCACCTCTGCATGCTGGATATTTGCTTTGCAGTTGGGGACGGTGGACAGACATTCTTTCCCACGGACGCTATAAACGCCAACTCACTGAGCAAGATGTAGAAACCATCTGCAGAACCATCCTGGTGTACTGTCTTAATCATTACAAAGGGGATGAGAATATCAAAAGCTTCATCTGGGATCTGATCACACCCACAGCGGATGGCCAGACTCGAGCCTTGGTCAACCATTCCGGTAGGTCTCCACCATGCTGTTTGTGCTACAGGGTCACAAAGCCACCAGGAACTTTTGTGACACACTGTTGATAAAGAGATGTGACATAAACCCCATATTTCCCTGCCTCGTGCATTAAGCTCTCTGCCATTGACACTATAATTGGAATGTAAAAGGCTTCTATTATTATTATGATGGTGATTCTAGGTTTGTCAGCTCCTGTGCCAAGGGGAAGGAAGGGAAAGAAGGTGAAAGCCCAGAGCACACAGCCGGTGGTGCAGGATGCCGACTGGCTGGCCAGCTGCAA
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Ideale start van genetische onderzoek
DNA uit bloed
Genoom sequentie
met alle variatie
Belangrijke eigenschappen: - Accuraat - Snel - Goedkoop
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Next generation sequencing: Een technologische revolutie!
Vroeger: 1 DNA fragment per keer lezen
Nu: miljoenen tegelijk!
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5500XL
454
Veel bedrijven, veel concurrentie; Snelle ontwikkeling!
1st cluster: Sept 2009 2nd cluster: Aug 2010
HiSeq
Ion Torrent
Pacific biosciences Complete Genomics
AGGCACCTCTGCATGCTGGATATTTGCTTTGCAGTTGGGGACGGTGGACAGACATTCTTTCCCACGGACGCTATAAACGCCAACTCACTGAGCAAGATGTAGAAACCATCTGCAGAACCATCCTGGTGTACTGTCTTAATCATTACAAAGGGGATGAGAATATCAAAAGCTTCATCTGGGATCTGATCACACCCACAGCGGATGGCCAGACTCGAGCCTTGGTCAACCATTCCGGTAGGTCTCCACCATGCTGTTTGTGCTACAGGGTCACAAAGCCACCAGGAACTTTTGTGACACACTGTTGATAAAGAGATGTGACATAAACCCCATATTTCCCTGCCTCGTGCATTAAGCTCTCTGCCATTGACACTATAATTGGAATGTAAAAGGCTTCTATTATTATTATGATGGTGATTCTAGGTTTGTCAGCTCCTGTGCCAAGGGGAAGGAAGGGAAAGAAGGTGAAAGCCCAGAGCACACAGCCGGTGGTGCAGGATGCCGACTGGCTGGCCAGCTGCAA
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DNA sequencing wordt snel goedkoper!
From: Stein Genome Biology 2010 11:207
Moore’s law
AGGCACCTCTGCATGCTGGATATTTGCTTTGCAGTTGGGGACGGTGGACAGACATTCTTTCCCACGGACGCTATAAACGCCAACTCACTGAGCAAGATGTAGAAACCATCTGCAGAACCATCCTGGTGTACTGTCTTAATCATTACAAAGGGGATGAGAATATCAAAAGCTTCATCTGGGATCTGATCACACCCACAGCGGATGGCCAGACTCGAGCCTTGGTCAACCATTCCGGTAGGTCTCCACCATGCTGTTTGTGCTACAGGGTCACAAAGCCACCAGGAACTTTTGTGACACACTGTTGATAAAGAGATGTGACATAAACCCCATATTTCCCTGCCTCGTGCATTAAGCTCTCTGCCATTGACACTATAATTGGAATGTAAAAGGCTTCTATTATTATTATGATGGTGATTCTAGGTTTGTCAGCTCCTGTGCCAAGGGGAAGGAAGGGAAAGAAGGTGAAAGCCCAGAGCACACAGCCGGTGGTGCAGGATGCCGACTGGCTGGCCAGCTGCAA
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DNA sequencing output neemt enorm toe
E Mardis. Nature 2011
AGGCACCTCTGCATGCTGGATATTTGCTTTGCAGTTGGGGACGGTGGACAGACATTCTTTCCCACGGACGCTATAAACGCCAACTCACTGAGCAAGATGTAGAAACCATCTGCAGAACCATCCTGGTGTACTGTCTTAATCATTACAAAGGGGATGAGAATATCAAAAGCTTCATCTGGGATCTGATCACACCCACAGCGGATGGCCAGACTCGAGCCTTGGTCAACCATTCCGGTAGGTCTCCACCATGCTGTTTGTGCTACAGGGTCACAAAGCCACCAGGAACTTTTGTGACACACTGTTGATAAAGAGATGTGACATAAACCCCATATTTCCCTGCCTCGTGCATTAAGCTCTCTGCCATTGACACTATAATTGGAATGTAAAAGGCTTCTATTATTATTATGATGGTGATTCTAGGTTTGTCAGCTCCTGTGCCAAGGGGAAGGAAGGGAAAGAAGGTGAAAGCCCAGAGCACACAGCCGGTGGTGCAGGATGCCGACTGGCTGGCCAGCTGCAA
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Van sequentie tot genoom:Veel puzzelwerk
Miljoenen korte DNA fragmenten per individu
Totale genoomsequentie 1 individu
Zeer veel computer
Rekenkracht!!!!!!!!
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Het genoom
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We kunnen het totale genoom van een mens nu lezen
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Hoeveel verschilt het genoom van 2 “gezonde” mensen: Hoe verschillend zijn ze nu echt?
3 miljoen
verschillen
5,997 miljard
overeenkomsten
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DNA sequencing methode nog niet perfect
• 1 keer lezen van een DNA sequentie:
~1 op 10,000 nucleotiden incorrect
Voor totale genoom: 600.000 fouten!
• 10 keer lezen van een DNA sequentie:
~1 op 100,000 nucleotiden incorrect
Voor totale genoom: 60.000 fouten!
• 100 keer lezen van een DNA sequentie:
~1 op 1,000,000 nucleotiden incorrect
Voor totale genoom: 6,000 fouten!
Bedenk: 1 DNA fout/variatie kan al tot ziekte leiden!
Probleem: Meer lezen is duurder en verlaagt throughput!
Van genoom naar exoom sequencing
‘Exoom’ (alle exonen van een genoom) ~1% van het humane genoom
‘Alle’ coderende sequenties van het humane genoom (>180,000 exons), in één experiment gemeten Hypothese: Meeste ziekte- veroorzakende mutaties zitten in de genen
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Exoom verrijking voorafgaand aan sequencing
DNA fragmenten Biotin-labelled “Baits”
representing all exons of ~18,000 genes
sequencing
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seq reads
targets
genes
Resultaat van exoom sequencing experiment
Alle genetische variatie in een lijstje
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Variatie in normale populatie Ziekte-veroorzakende variatie
Van groot belang: Inzicht in normale en ziekteveroorzakende genoomvariatie
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Hoeveel varieert het exoom, hoe interpreteer je dit?
Aantal coderende varianten:
~ 20,000
Aantal unieke varianten
met effect op eiwit:
~ 150-200
Hoe identificeer je die ene pathogene variant?
Voorbeeld 1: Een zeldzame ziekte
Exomen sequencen!
All variants Filtered variants
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Essentieel: Goede klinische verzameling
Our study Literature: 46 cases
Gender 6 f/7 m Neurodevelopmental anomalies Developmental delay 11/11 39/39 Seizures 12/13 32/35 Vision impairment 8/9 11/12 Hearing impairment 8/9 8/11 Craniofacial features Large anterior fontanelle 10/12 Prominent forehead 12/13 43/43 Mid-face retraction 13/13 46/46 Hypertelorism 12/13 Short, upturned nose 13/13 40/42 Low-set ears 12/13 37/39 Structural anomalies Genital 13/13 35/38 Hydronephrosis or vesicoureteral reflux
13/13 42/45
Cardiac defect 7/13 20/35 Characteristic skeletal
malformations 11/11
Choanal stenosis 4/13 12/29
Based on: Lehman, A.M. et al. AJMG A. (2008)
Am J Med Genet. 1978;1(4):361-75.
Schinzel-Giedion Syndroom: zeldzame sporadische ziekte
Ziektegen identificatie: Filter & combineer
Variants Patient 1 Patient 2 Patient 3 Patient 4 Mean
Genes with
variants in all
samples
Total called 22,916 22,602 22,152 19,528 21,800 4,735
Exonic + SpliceSites(SS) 12,196 12,255 11,796 10,498 11,686 3,331
Non-synonymous (NS) +
SS 5,556 5,618 5,427 4,802 5,351 1,634
Novel (not in dbSNP130) 405 401 390 387 396 35
Novel (not in in-house db) 299 289 275 288 288 12
...en filter meer!
Variants Patient 1 Patient 2 Patient 3 Patient 4 Mean
Genes with
variants in all
samples
Total called 22,916 22,602 22,152 19,528 21,800 4,735
Exonic + SpliceSites(SS) 12,196 12,255 11,796 10,498 11,686 3,331
Non-synonymous (NS) +
SS 5,556 5,618 5,427 4,802 5,351 1,634
Novel (not in dbSNP130) 405 401 390 387 396 35
Novel (not in in-house db) 299 289 275 288 288 12
Novel (not in ~100 exomes) 180 186 154 172 173 1
De novo mutaties in het SETBP1 gen
Patient 1
Patient 2
Patient 3
Patient 4
Ziektegen identificatie in versnelling door exoom sequencing
AGGCACCTCTGCATGCTGGATATTTGCTTTGCAGTTGGGGACGGTGGACAGACATTCTTTCCCACGGACGCTATAAACGCCAACTCACTGAGCAAGATGTAGAAACCATCTGCAGAACCATCCTGGTGTACTGTCTTAATCATTACAAAGGGGATGAGAATATCAAAAGCTTCATCTGGGATCTGATCACACCCACAGCGGATGGCCAGACTCGAGCCTTGGTCAACCATTCCGGTAGGTCTCCACCATGCTGTTTGTGCTACAGGGTCACAAAGCCACCAGGAACTTTTGTGACACACTGTTGATAAAGAGATGTGACATAAACCCCATATTTCCCTGCCTCGTGCATTAAGCTCTCTGCCATTGACACTATAATTGGAATGTAAAAGGCTTCTATTATTATTATGATGGTGATTCTAGGTTTGTCAGCTCCTGTGCCAAGGGGAAGGAAGGGAAAGAAGGTGAAAGCCCAGAGCACACAGCCGGTGGTGCAGGATGCCGACTGGCTGGCCAGCTGCAA
CCCAGATGCCCTGTTCCAGGAGGACAGCTACAAGAAACACCTGAAGCATCACTGTAACAAGTATGTTATTAGAGGGTGGACCTGGAGAGCTTAATTCCCTTTTTATTCTTTAAAAAATACATGCAGCCGGCCCTTCACGTCTGCAGATGCAGAACTCGCAGATTTGGAGGGTCAACTGAGGGACCTGAGCATCTGCGGATCTTGGTGTCTGAGGGGGGTCCTGGAACCATACTCCCGCGGATATGGAGGGACAGCTCTGTTATTAAGACTTTTAAATGGTATAGTTATTGCCTTTGCACAGCCTTATCATTTTTCTTGAAATGTGGTGTCAAGTTGCAGGAGAGCGTACCTTTAGGTGACTGATTATTTTTTAACATGGTAAGATACACAACACAACGTTTACCATTTTTACCATTTATAAGTGAACAATTCATTGGCATTAATTACACTCACAATGCTGTATACTCACTATCTGTACCTGAAATGTTTCCATCTTCCCAAATATAAACACTGTATCAATTAAACA
CCCAGATGCCCTGTTCCAGGAGGACAGCTACAAGAAACACCTGAAGCATCACTGTAACAAGTATGTTATTAGAGGGTGGACCTGGAGAGCTTAATTCCCTTTTTATTCTTTAAAAAATACATGCAGCCGGCCCTTCACGTCTGCAGATGCAGAACTCGCAGATTTGGAGGGTCAACTGAGGGACCTGAGCATCTGCGGATCTTGGTGTCTGAGGGGGGTCCTGGAACCATACTCCCGCGGATATGGAGGGACAGCTCTGTTATTAAGACTTTTAAATGGTATAGTTATTGCCTTTGCACAGCCTTATCATTTTTCTTGAAATGTGGTGTCAAGTTGCAGGAGAGCGTACCTTTAGGTGACTGATTATTTTTTAACATGGTAAGATACACAACACAACGTTTACCATTTTTACCATTTATAAGTGAACAATTCATTGGCATTAATTACACTCACAATGCTGTATACTCACTATCTGTACCTGAAATGTTTCCATCTTCCCAAATATAAACACTGTATCAATTAAACA
Onderzoek naar oorzaak van verstandelijke handicap
Aandoening meestal bij kind van gezonde ouders
De ziekte heeft vaak een oorzaak in het DNA
Extra chromosoom 21
Ouders hebben extra
chromosoom niet!
Nieuw foutje
in het DNA?
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Nieuwe hypothese: De novo mutaties Van belang bij evolutie maar ook oorzaak ziekte?
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Detectie van alle de novo mutaties is nu mogelijk! Exoom sequencing van patiënt-ouder trios
Alle variatie in genen Trio-sequencing om erfelijke variatie te filteren
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De novo mutaties ontstaan meestal bij aanleg zaadcel!
Genoom sequencing 78 patient - ouder trios
Gemiddeld 63 de novo mutations/patient
80% mutaties komt van vader
Aantal mutaties neemt toe in
zaad van oudere vaders!
Voorbeeld 2: Veelvoorkomende aandoening
2010
3 oktober 2012
Variants Average of 10
patients
Total called 21,755
After exclusion of nongenic, intronic & synonymous variants
5,640
Private variants 143
After exclusion inherited variants 5
Validation Sanger sequencing 0-2
Prioritizatie van kandidaat de novo varianten
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Visualisatie van een de novo mutatie
a
Patient
reads
Mother
reads
Father
reads
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De novo mutaties in negen verschillende genen
Gene Mutation (cDNA)
Mutation (protein)
Gene function
DYNC1H1 c.11465A>C p.His3822Pro Retrograde axonal transporter; interacts with PAFAH1B1 (causing Lissencephaly – a neurodevelopmental disorder)
ZNF599 c.532C>T p.Leu187Phe Unknown
RAB39B c.557G>A p.Trp186X Known X-linked mental retardation gene
YY1 c.1138G>T p.Asp380Tyr Ubiquitously expressed transcription factor; Mouse knock down results in growth retardation, neurulation defects and brain abnormalities; interacts with MeCP2, a known MR gene
BPIL3 c.887G>A p.Arg269His Innate immune respons
PGA5 c.1058T>C p.Val353Ala Precursor of pepsin
DEAF1 c.683T>G p.Ile228Ser Transcription factor; Regulator of 5-HT1A receptor in the brain; Mouse knockout causes neural tube defects
CIC c.1474C>T p.Arg492Trp Granule cell development in central nervous system
SYNGAP1 c.998_999del p.Val333AlafsX Known autosomal dominant mental retardation gene
AGGCACCTCTGCATGCTGGATATTTGCTTTGCAGTTGGGGACGGTGGACAGACATTCTTTCCCACGGACGCTATAAACGCCAACTCACTGAGCAAGATGTAGAAACCATCTGCAGAACCATCCTGGTGTACTGTCTTAATCATTACAAAGGGGATGAGAATATCAAAAGCTTCATCTGGGATCTGATCACACCCACAGCGGATGGCCAGACTCGAGCCTTGGTCAACCATTCCGGTAGGTCTCCACCATGCTGTTTGTGCTACAGGGTCACAAAGCCACCAGGAACTTTTGTGACACACTGTTGATAAAGAGATGTGACATAAACCCCATATTTCCCTGCCTCGTGCATTAAGCTCTCTGCCATTGACACTATAATTGGAATGTAAAAGGCTTCTATTATTATTATGATGGTGATTCTAGGTTTGTCAGCTCCTGTGCCAAGGGGAAGGAAGGGAAAGAAGGTGAAAGCCCAGAGCACACAGCCGGTGGTGCAGGATGCCGACTGGCTGGCCAGCTGCAA
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Verdeling de novo mutaties in 10 patiënten
MR trio Link to MR No link to MR
1 DYNC1H1 ZNF599
2 RAB39B
3 YY1 BPIL3
4 PGA5
5 DEAF1
6 CIC
7
8 SYNGAP1
9
10 JARID1C*
* De novo in moeder van een patiënt
3 mutaties in “verstandelijke
handicap” genen
4 ernstige mutaties in goede
kandidaat genen voor
verstandelijke handicap
Een nieuw inzicht in oorzaak van
Verstandelijke handicap!
.
Vissers et al. Nature Genetics 2010
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Het gevolg: Exoom sequencing in de diagnostiek!
Uitdagingen: - Schaalvergroting: Van 100 naar 4000 exomen! - Interpretatie: Hoe zeker weten we welke variant de ziekte veroorzaakt? - Ethiek: Vinden we ook andere informatie in exoom? - Kosten: Kan dit voor zonder verhoging kosten?
AGGCACCTCTGCATGCTGGATATTTGCTTTGCAGTTGGGGACGGTGGACAGACATTCTTTCCCACGGACGCTATAAACGCCAACTCACTGAGCAAGATGTAGAAACCATCTGCAGAACCATCCTGGTGTACTGTCTTAATCATTACAAAGGGGATGAGAATATCAAAAGCTTCATCTGGGATCTGATCACACCCACAGCGGATGGCCAGACTCGAGCCTTGGTCAACCATTCCGGTAGGTCTCCACCATGCTGTTTGTGCTACAGGGTCACAAAGCCACCAGGAACTTTTGTGACACACTGTTGATAAAGAGATGTGACATAAACCCCATATTTCCCTGCCTCGTGCATTAAGCTCTCTGCCATTGACACTATAATTGGAATGTAAAAGGCTTCTATTATTATTATGATGGTGATTCTAGGTTTGTCAGCTCCTGTGCCAAGGGGAAGGAAGGGAAAGAAGGTGAAAGCCCAGAGCACACAGCCGGTGGTGCAGGATGCCGACTGGCTGGCCAGCTGCAA
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Is deze aanpak nuttig in de diagnostiek?
• De novo mutatie oorzaak ernstige verstandelijke beperking bij 13% van de patiënten • Daarnaast 3% erfelijke oorzaken gevonden • Mogelijke oorzaak bij nog 19 patiënten gevonden, hierbij zal vervolgonderzoek plaatsvinden • Diagnostische uitslag bij alle 100 patiënten verstuurd
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Exoom sequencing bij mitochondriële aandoeningen!
September 2011: Start pilot studie met 500 samples voor
5 genetische aandoeningen:
Aandoening 1st stap 2nd stap
Verstandelijke handicap
Genoomwijde de novo mutaties
(trio-sequencing) -
Mitochondriële aandoeningen
Analyse bekende ziektegenen
Genoomwijde analyse
Blindheid
Doofheid
Bewegingsstoornissen
Eerste stap voor 50 mitochondriële aandoeningen bijna afgerond!
AGGCACCTCTGCATGCTGGATATTTGCTTTGCAGTTGGGGACGGTGGACAGACATTCTTTCCCACGGACGCTATAAACGCCAACTCACTGAGCAAGATGTAGAAACCATCTGCAGAACCATCCTGGTGTACTGTCTTAATCATTACAAAGGGGATGAGAATATCAAAAGCTTCATCTGGGATCTGATCACACCCACAGCGGATGGCCAGACTCGAGCCTTGGTCAACCATTCCGGTAGGTCTCCACCATGCTGTTTGTGCTACAGGGTCACAAAGCCACCAGGAACTTTTGTGACACACTGTTGATAAAGAGATGTGACATAAACCCCATATTTCCCTGCCTCGTGCATTAAGCTCTCTGCCATTGACACTATAATTGGAATGTAAAAGGCTTCTATTATTATTATGATGGTGATTCTAGGTTTGTCAGCTCCTGTGCCAAGGGGAAGGAAGGGAAAGAAGGTGAAAGCCCAGAGCACACAGCCGGTGGTGCAGGATGCCGACTGGCTGGCCAGCTGCAA
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CCCAGATGCCCTGTTCCAGGAGGACAGCTACAAGAAACACCTGAAGCATCACTGTAACAAGTATGTTATTAGAGGGTGGACCTGGAGAGCTTAATTCCCTTTTTATTCTTTAAAAAATACATGCAGCCGGCCCTTCACGTCTGCAGATGCAGAACTCGCAGATTTGGAGGGTCAACTGAGGGACCTGAGCATCTGCGGATCTTGGTGTCTGAGGGGGGTCCTGGAACCATACTCCCGCGGATATGGAGGGACAGCTCTGTTATTAAGACTTTTAAATGGTATAGTTATTGCCTTTGCACAGCCTTATCATTTTTCTTGAAATGTGGTGTCAAGTTGCAGGAGAGCGTACCTTTAGGTGACTGATTATTTTTTAACATGGTAAGATACACAACACAACGTTTACCATTTTTACCATTTATAAGTGAACAATTCATTGGCATTAATTACACTCACAATGCTGTATACTCACTATCTGTACCTGAAATGTTTCCATCTTCCCAAATATAAACACTGTATCAATTAAACA
Wat kunnen we met al die genetische kennis?
Inzicht in de onderliggende biologie
Betere diagnose, prognose en counseling
Aangrijppunten voor therapie?
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Conclusies
Next generation sequencing revolutie:
Ziektegen identificatie is eenvoudig geworden
Genetische oorzaak zeldzame hersenziekten snel opgelost!
Van paradox naar paradigm:
De novo mutaties zijn een belangrijke oorzaak van hersenziekten zoals verstandelijke beperking en autisme
Van onderzoek naar diagnostiek:
Exoom sequencing kan als generieke test in de diagnostiek
van hersenziekten van groot nut zijn!
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Genoomsequencing: Integratie van expertise!
Diagnostiek & onderzoek
Laboratorium & bioinformatica
Mutatie & structurele variatie
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Bedankt!
Genoom Diagnostiek Helger Yntema Marcel Nelen Dorien Lugtenberg Rolph Pfundt Kornelia Neveling Hans Scheffer
Klinische genetica Marjolein Willemsen Bregje van Bon Tjitske Kleefstra David Koolen Anneke Vulto-van Silfthout Marlies Kempers Bert de Vries Han Brunner
Genoom Onderzoek Lisenka Vissers Joep de Ligt Alex Hoischen Christian Gilissen Jayne Hehir-Kwa Marisol del Rosario Nienke Wieskamp Rick de Reuver Thessa Kroes Petra de Vries Gaby van de Ven-Schrobbers Michael Kwint Irene Janssen Marloes Steehouwer