Etude de la variabilité du potentielprotéolytique de paroi chezStreptococcus thermophilus
Caractérisation de la variabilité du gène prtS
Sous la direction Pr. Annie DARY et Dr. Clarisse PERRIN
Wessam GALIAEcole Doctorale RP2E
15 janvier 2009
L'équipe Domestication en aquaculture continentale L'équipe Micropolluants & résidus dans la chaîne alimentaire
L'équipe Protéolyse & biofonctionnalités des protéines et des peptides
Production de peptides bioactifs
Le peptide bioactif d’origine alimentaire :
• ne répond pas seulement aux besoins nutritionnels
• joue un rôle bénéfique chez le consommateur
- rôle anxiolytique ou anti hypertensif...
Production de peptides bioactifs issus du lait
Les protéines du lait renferment dans leur séquence une grande variété de peptides potentiellement bioactifs :
par protéolyse in vitro ajout à l’aliment
directement dans l’organisme générés par des protéases endogènes 2 % des gènes humains codent pour des protéases ou des inhibiteurs de protéases
pendant la fabrication / transformation de l’aliment (fermentation, affinage) générés par des bactéries lactiques (Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus ..)
Production de peptides bioactifs par voie microbienne
Mieux comprendre le potentiel protéolytique d’une bactérie lactique : Streptococcus thermophilus
Caractérisation du potentiel protéolytique – Caractériser les différents acteurs du système
– Caractériser sa variabilité au sein de l’espèce St. thermophilus
dans le but de sélectionner des souches capables de libérer des peptides bioactifs.
Présentation de Streptococcus thermophilus
Une des bactéries lactiques les plus utilisées dans l’industrie des ferments (du lait)
Homofermentaire et se développe entre 37 et 42°C
Appartient au genre Streptococcus
Non pathogène
Séquençage complet de 3 génomes a révélé :- l’absence des gènes de virulence- une faible variabilité de séquence
Bolotin et al., Nature Biotechnology (2004) 22:1554-1558
Variabilité phénotypique chez St. thermophilus
Variabilité phénotypique affecte différents caractères tels que :- morphologie des colonies,- taille des chaînettes,- résistance à différents stress,- vitesse de croissance et d’acidification du lait
Système protéolytique de St. thermophilus
Milieu extracellulaire
Paroi bactérienne
Cytoplasme
Monnet, Bull. Soc. Fr. Microbiol (2006) 21:23-28
CW M C
Cell WallMembraneCytoplasme
Savijoki et al., 2006 Appl Microbiol Biotechnol 71: 394–406
Les protéases extracellulaires chez les bactéries lactiques
CW M C
Cell WallMembraneCytoplasme
Prédomaine (signal+proséquence)
PP
PP
PP
PP
PP PR
PR
PR
PR
PR
Domaine catalytique
A
A
A
A
A
?
W
W
W
W
W
Espaceur
Savijoki et al., 2006 Appl Microbiol Biotechnol 71: 394–406
Les protéases extracellulaires chez les bactéries lactiques
CW M C
Cell WallMembraneCytoplasme
H
H
H
Positionnement de A et B
AN
Ancrage
AN
AN
Savijoki et al., 2006 Appl Microbiol Biotechnol 71: 394–406
Les protéases extracellulaires chez les bactéries lactiques
Caractéristiques de PrtS chez la souche CNRZ 385
Protéase de 169 kDa et de 153 kDa après maturation
Appartient à la famille des protéases à sérine, famille des subtilisines
Capable d’hydrolyser les caséines S1 et
Gène de 4755 pb, exprimé en conditions de carence azotée
Régulation du gène prtS est inconnue
Fernandez-Espla et al., AEM (2000)
Caractéristiques de PrtS chez la souche CNRZ 385
Protéase de 169 kDa et de 153 kDa après maturation
Appartient à la famille des protéases à sérine, famille des subtilisines
Capable d’hydrolyser les caséines S1 et
Gène de 4755 pb, exprimé en conditions de carence azotée
Régulation du gène prtS est inconnue
Fernandez-Espla et al., AEM (2000)
Activité protéolytique de surface retrouvée uniquement chez quelques souches
Shahbal et al., AEM (1993)
Démarche expérimentale
• Evaluer la variabilité génétique d’une collection de souches de St. thermophilus
• Evaluer la variabilité du potentiel protéolytique de surface de St. thermophilus
Gène ARNr 16S Gène ARNr 23SITS 16S-23S
ITS-I AAGGCCAAAAATAAITS-III ..........T...ITS-IV ...A.......... ITS-V ...A......T...ITS-II ..........-...Consensus..........t...
Mise en évidence d’un nouveau type ITS-V
Génotypage de souches de St. thermophilus
Séquençage de la région Internal Transcribed Spacer 16S-23S
ITS-I AAGGCCAAAAATAAITS-III ..........T...ITS-IV ...A.......... ITS-V ...A......T...ITS-II ..........-...
(Galia et al., 2009)
Génotypage de souches de St. thermophilus
Mise en évidence d’une variabilité génétique au sein de la collection de
souches de St. thermophilus
Variabilité du système protéolytique de surface
Détermination de l’acidité Dornic (acide lactique produit) permet d’évaluer la croissance d’une souche en milieu lait
Présence de la protéase de surfaceForte croissance = fort pouvoir acidifiant
Absence de la protéase de surfaceFaible croissance = faible pouvoir acidifiant
Variabilité du système protéolytique de surface ?
Variabilité du système protéolytique de surface
12 Souches à fort pouvoir acidifiant 53,4 ± 4,5°D
2 Souches à faible pouvoir acidifiant 11,0 ± 2,4°D
16 Souches à moyen pouvoir acidifiant 29,8 ± 4,2°D
après 6 h de croissance en lait(° Dornic)
Variabilité du système protéolytique de surface
Recherche du gène prtS
800 pb
11/16 souches posséderaient le gène prtS
12/12 souches posséderaient le gène prtS
5/16 souches ne possèdent pas le gène prtS
2/2 souches ne possèdent pas le gène prtS
Souches à fort pouvoir acidifiant
Souches à faible pouvoir acidifiant
Souches à moyen pouvoir acidifiant
Variabilité du système protéolytique de surface
Recherche de l’activité de la protéase PrtS par zymographie
PB18o
PrtS
CNRZ1066 LMD9
Variabilité du système protéolytique de surface
Recherche de l’activité de la protéase PrtS par zymographie pour toutes les souches
PrtS
Pouvoir acidifiant
Nombre de souches
Faible
2
Moyen
5
Moyen
8
Moyen
3
Fort
12
Présence du gène prtS - - + + +
Activité protéolytique - - - + +++
• Pourquoi ? Gène prtS muté Gène prtS non exprimé
Séquençage du gène prtS chez :- 4 souches à moyen pouvoir acidifiant (prtS+ PrtS-)- 3 souches à fort pouvoir acidifiant (prtS+ PrtS+)
Comparaison de séquences : - 100% identiques entre elles et avec la souche LMD-9- 95% identiques avec la souche CNRZ385
Variabilité de l’activité protéolytique de surface
Variabilité du système protéolytique de surface
Séquençage du gène prtS :
SS PP PR A H W ANPB18o ou LMD9 1 36 177 492 1110 1477 1583
1618CNRZ 385 1 36 145 460 1077 1444 1550
1585
PB18O OU LMD9 60SESPVAEELVDTSVEATSTDVTTTDNEEETLGSESPVVEELVDTSVEATPTDVTTTDNVEETLGSE126
CNRZ385 60--------------------------------SESPVVEELVDTSVEATSTDVTTTDNEEETPGSE94
PB18o ou LMD9 720VQNGLITLAPRLLAEIPGGKVTVQ743
CNRZ 385 688AQKRIDHLGSTSISRDSWRKVTVK711
fonction inconnue
PB18o ou LMD9 936SGNKNFYSGDP946
CNRZ 385 904SGDKNIYSGNP914
Région fixation du substrat
PB18o Moyen pouvoir acidifiantLMD9 Fort pouvoir acidifiant
Variabilité du système protéolytique de surface
Séquençage du gène prtS :
PB18o ou LMD9 936SGNKNFYSGDP946
CNRZ 385 904SGDKNIYSGNP914
Région fixation du substrat
PB18o Moyen pouvoir acidifiantLMD9 Fort pouvoir acidifiant
Conclusion
Variabilité du système protéolytique de surface
Pouvoir acidifiant
Gène prtS Activité caséinolytique
Fortes 12/12 12
Moyennes 11/16 3/16
Faibles 0/2 0/2
Variabilité affecte la régulation du gène
- Variabilité en terme de présence / absence du gène prtS
- 2 allèles prts différents ont été mis en évidence chez S. thermophilus
Perspectives :
- Etude de la régulation du gène prtS entre
- les souches qui ont le gène et qui l’expriment fortement
- et les souches qui ont le gène et qui l’expriment peu ou pas.