Emissão de luz
•Luminescência•Fluorescência
•Fosforescência
•Quimioluminescência
•Bioluminescência
Luminescência é o termo que se usa quando a energia da excitação provém da absorção de fótons. Inclui a Fluorescência e a Fosforescência.
Quimiluminescência é um termo geral para produção de luz quando a energia de excitação é proveniente de uma reação química.
Bioluminescência é a denominação de um fenômeno de quimiluminescência onde a reação química é realizada em um organismo, como o vaga-lume por exemplo.
Quimioluminescência
A fluorescência é uma forma de fotoluminescência em que a emissão de luz desaparece tão logo cessa a absorção da radiação excitadora. (O tempo de vida de uma fluorescência é da ordem de 10-8 s).
Fosforescência é semelhante a fluorescência sendo que o produto excitado é mais estável, de forma a demorar mais tempo (de um microsegundo até minutos) até que a energia seja liberada totalmente. Esse fenômeno está relacionado com o fato dos interruptores de tomada em sua casa brilharem no escuro. Em seu polímero, são colocados pigmentos de fósforo, um elemento que possui propriedades fosforescentes. Não é por nada que o nome "fósforo", elemento químico de número atômico 15, vem do grego, phosphoros, que significa "aquele que brilha", ou "o que conduz, traz a luz".
Absorção de um fóton e excitação de um elétron .
Inicialmente, os elétrons em átomos ou moléculas estão energeticamente em um nível “normal” de energia denominado de estado básico ou estado fundamental (“ground state”). A absorção de um fóton por uma molécula de clorofila excita um elétron, levando ele de um estado de baixa energia (não excitado) para um estado excitado.
Fluorescência - bases
Fura-2 Indicador de Ca2+
Moléculas Fluorescentes
Iodeto de Propídio Marcador de DNA
Fluorescência - espectros
Mecanismo
• 1o passo : Absorção (ou excitação)• 2o passo: Dissipação (VR, ISC, CI, NRET,
Complexação)• 3o passo: Emissão
– Fluor ou Fosforescência• Estacionária• Resolvida no tempo
– Polarizada ou não
h
Molécula no estado
fundamentalExcitação
Molécula no estado
excitado Emissão
hh
h
h h
hh
h
10-15 s 10-12 a 102 sVR, ISC, CI, CE,
NRET, complexação
Luminescência
Características Instrumentais
Mecanismo
• O elétron excitado primeiramente relaxa ao menor nível do estado excitado, emitindo radiação infravermelha, isto é calor. Após ele retorna ao estado fundamental, podendo neste retorno acontecer três processos: a) perda de calor; B) emissão de um fóton (fluorescência) ou c) transferência de energia a uma molécula adjacente, onde outro elétron é excitado. Este processo é conhecido como transferência por ressonância, conforme. Esse é o mecanismo pelo qual a energia coletada por dezenas ou centenas de moléculas de pigmento podem ser canalizadas a um centro de reação.
Absorção de um fóton e excitação de um elétron, com liberação de calor
Retorno do elétron excitado ao estado fundamental e os três processos que
podem ocorrer neste retorno.
A transferência por ressonância pode ser demostrada através de um pêndulo.
250 300 350 400 450 500
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
emissão excitação
Antrac eno em Tolueno - Em is s ão e Ex c itaç ão
Inte
nsid
ad
e (
u.a
.)
Comprimento de Onda (nm)
Sobreposição de absorção e emissão - antraceno
340 360 380 400 420 440 460 480 500 520
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
10-5 mol.L
-1
10-4 mol.L
-1
10-3 mol.L
-1
Ant r aceno em Tolueno a 2 x 10- 3
, 10- 4
e 10- 5
M ( ANTO Ln)
Inte
nsid
ade (
u.a
.)
Comprimento de Onda (nm)
Auto-absorção – antraceno
Moléculas Fluorescentes
• Geralmente aromáticas polianelares(rígidas)
• Não possuem grupos muito móveis(dispersam energia)
• Vários rendimentos quânticos(eficiência na produção de luz)
Rendimento Quântico
• Ф = no de fótons emitidos
• Aumenta com o número de anéis (<rotação)
• Diminui com o aumento da T e com a diminuição da viscosidade (>no colisões)
no de fótons absorvidos
360 370 380 390
0
1000
2000
3000
4000
5000
Inte
nsi
dade (
u.a
.)
360 370 380 390
PA66PVAc
Temperaturas 020 K 120 K 220 K 280 K 300 K 320 K 410 K
360 370 380 390
PEAD
Comprimento de Onda (nm)
Picos do pireno
Anti--tubulina (Rabbit)
Tecido fixado
Anti-Rabbit IgG
Luz branca
Filtro de excitação
Microscópio de Fluorescência
Filtro de emissão
Molécula fluorescente
OHO
F F
O
OH
O
Método de “Polarização”Método de “Polarização”
• Lentes de um par de óculos polarizadores dão efeitos fantásticos a um microscópio básico
• Ex: Cristal entre o polarizador e o analisador. Gama de cores gravada rodando o polarizador.Técnica usada nas pesquisas mais caras
Outros métodos de melhoramento ópticoOutros métodos de melhoramento óptico
• Contraste diferencial
Organelos em 3D
Maior realidade
• Fluorescência (marcação de estruturas celulares e identificação de estruturas vivas)
Células endoteliais de artériaAC: anti--tubulinaAgente Fluorescente: Alexa Fluor 568exc: 500 - 600em: 580-660
Cromossomo humano em metáfaseIodeto de Propídio (complexado com o DNA)exc: 480 - 560em: 600-700
Quando o IP se interacala entre as bases do DNA a fluorescência aumente de 20 a 30 vezes e o pico de emissão é deslocado 40nm para o vermelho.
F-actina
em: 599
Mitocôndria
em: 520
Núcleo
em: 461
F-actina em: 520
Mitocôndria em: 599
Núcleo em: 461
Sobreposição micrótúbulos e mitocôndrias!
Vermelho: MicrotúbulosVerde: Fibras de actina
Mitochondrion-selective MitoTracker Red CMXRos Microtubules were labeled with mouse monoclonal anti–-tubulin antibody, biotin-XX goat anti–mouse IgG (H+L) antibody and Cascade Blue NeutrAvidin.
Bovine pulmonary arterial endothelial cells
Filamentous actin (F-actin) magenta.
Lipophilic regions of the cell, including intracellular membranes, were stained with green-fluorescent DiOC6(3).
Nuclei DAPI blue-fluorescent
0 30 90 210 s
Alexa Fluor
Fluorescein
Degradação foto-induzida (“Photobleaching”)
BCECF
Marcadores Funcionais - pH
O
O
O
OH
H OH
OH
O
OO
Incolor (pH<8,5) Violeta (pH>8,5)
Fenolftaleína
Fura-2
Marcadores Funcionais - Ca2+
GFP - Proteína Fluorescente VerdeViva as águas vivas!