Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
CULTIVO CELULAR CONTINUO AIREADO
I.- RESUMEN
Se desarrollo el Cultivo Celular Continuo Aireado de la Levadura Kluyveromyces
marxianus ATCC-16045, la cual se inicio desde la resiembra del medio de mantención
usando Extracto de Levadura 10 gr, Extracto de malta20 gr, Peptona 20 gr, Agar 20 gr
la cepa utilizada estaba refrigerada.
Se uso como sustrato limitante la sacarosa, siendo la concentración celular máxima final
esperada de 3g/l el pH es de 5.98. Se empezó con la preparación de los medios de
activación sacarosa 20 g/l, extracto de levadura 5 g/l y la solución de sales (K2HPO4 =
5g/l (NH4)2SO4 =5 g/l ; MgSO4.7H2O= 0.5 ;g/l )y HCl =0.57 g/l se llevo al shaker para
la fermentación obtener el cultivo por lote. Del cual se obtuvo la grafica de la cinética
de crecimiento microbiano, curva de calibrado de biomasa y azucares reductores
(sacarosa) por medio del método de DNS. La grafica de la cinética de crecimiento nos
sirvió para poder observar en que momento la levadura alcanzo los 2/3 de su
crecimiento exponencial, para este fin se prepararon dos medios de fermentación uno
que sirvió como control para el incremento de la biomasa y el otro para la experiencia
en el Quimiostato.
Luego se prosiguió con la puesta en marcha del Quimiostato, el cual se inicio con el
montaje e instalación de este sistema y su respectiva esterilización, luego se prosiguió
ala inoculación del medio liquido del Quimiostato y se controlo el lote hasta que este
alcanzara los 2/3 de crecimiento logarítmico el cual fue al cabo de 3 horas, dato que se
igual al obtenido en el cultivo celular por lote. Paralelo a esto se prepararon los medios
de alimentación para los estados estaciones a volumen ya calculado.
De aquí en adelante se prosiguió con el muestreo y análisis de X y S para los cinco
estados estacionarios, siendo estos tomados según los tiempos calculados 43h
(F=0,8ml/min), 29h (F=1,2ml/min), 19h (F=1,80ml/min) ,14h(F=2,5ml/min),
12h(F=3,0ml/min) para cada estado. Con estos datos se obtuvo la curva característica
del cultivo continuo con cinco estados estacionarios. Paralelo a la toma de muestras del
cuarto y quinto estado estacionario se prepararon los medios de fermentación bajo
limitación de nitrógeno reduciéndolo a la mitad (( NH4)2SO2 =1g/l) y perturbación del
1
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
estado estacionario por aumento de la concentración de sacarosa(15 g/l) en volúmenes
ya calculados.
La toma de la muestra bajo limitación de nitrógeno con un flujo de 2.5ml/min. Nos
sirvió para comprar este punto con el obtenido en la curva característica de la grafica de
los e. e. siendo el resultado que el hecho de limitar al microorganismo de la fuente de
nitrógeno no afecta considerablemente su crecimiento. La perturbación nos indica que a
niveles altos de la fuente de carbono el microorganismo mantiene un equilibrio en su
crecimiento.
Se preparo el medio para el método de lavado en volumen necesario dado por la
velocidad de dilución y el flujo requerido (F=12ml/min ) estos datos son un tiempo de
4 h. El método de lavado nos permitió determinar la velocidad específica de
crecimiento máximo, Finalmente se prosiguió con el desmontaje y lavado cuidadoso
del sistema continuo montado en el laboratorio de Bioprocesos.
II.- INTRODUCCIÓN
La vasta mayoría de las levaduras son mesófilas, con una temperatura máxima de
crecimiento entre 24 y 48ºC. Solo unas pocas (2%) son psicrófilas con una temperatura
máxima de crecimiento por debajo de 24ºC, pero mayor es el número de las levaduras
que tienen la temperatura óptima de crecimiento por debajo de 20ºC. No hay levaduras
que puedan crecer a 50ºC y solamente unas pocas pueden desarrollar cerca de 0ºC, entre
las que se encuentran Yarrowia lipolytica, Debaryomyces hansenii y Pichia
membranaefaciens. Por otra parte, Kluyveromyces marxianus crece a 48ºC. En
general, la presencia de etanol o bicarbonato aumenta la temperatura mínima de
crecimiento (Déak & Beuchat 1996).
La mayoría de las levaduras que causan deterioro de alimentos crece a una actividad de
agua mínima de 0,90-0,95. Sin embargo Zygosaccharomyces rouxii puede crecer sobre
substratos azucarados a una actividad de agua igual a 0,62, pero son pocas las levaduras
que desarrollan en presencia de altas concentraciones de azúcar o sal. En general las
2
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
levaduras toleran mejor altas concentraciones de azúcar que de sal.(Déak & Beuchat
1996).
La mayoría de las levaduras toleran un rango de pH entre 3 y 10, pero prefieren un
medio
ligeramente ácido con un pH de 4,5 a 6,5. las células son inactivadas a presiones entre 7
y 20 MPa, a 25-35°C (Déak & Beuchat 1996).
Las levaduras son organismos aerobios y aunque unas especies son fermentadoras otras
no lo son, como por ejemplo los géneros Cryptococcus y Rhodotorula. Saccharomyces
y unos pocos géneros más, son fermentadores enérgicos de los azúcares pero pronto
detienen su crecimiento y multiplicación por falta de oxígeno.
Solo unos pocos glúcidos, principalmente hexosas y oligosacáridos, pueden ser
fermentados por las levaduras, pero el rango de compuestos que pueden asimilar es
mucho más amplio incluyendo además, pentosas, alcoholes, ácidos orgánicos,
aminoácidos y glicósidos.
La utilización de nitratos está confinada a ciertas especies de levaduras, mientras que las
fuentes comunes de nitrógeno son amonio, urea y aminoácidos. Muchas especies
sintetizan todas las vitaminas necesarias pero otras requieren biotina y otros
compuestos.
Los aceites esenciales de ajedrea, ajo, canela, cebolla, clavo de olor, orégano, pimienta
de Jamaica y tomillo son inhibidores de varios géneros de levaduras. El aceite esencial
de ajo inhibe a una concentración de 25 mg/L y los de cebolla, orégano y tomillo a 100
mg/L. La cafeína presente en cacao, café, nuez de cola, yerba mate y té, inhibe el
crecimiento de las levaduras. Sin embargo, las levaduras casi no son afectadas por 20
mg de taninos/mL (Davidson 1997). El agua desionizada con 0,188 mg ozono/L causa
la reducción instantánea en 5 unidades logarítmicas del número de células vivas por mL,
de la levadura Z. bailii (Restaino et al. 1995)
3
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
III.- OBJETIVOS:
3.1 Objetivos generales:
Diseñar y realizar una experiencia de cultivo celular continuo en quimiostato
empleando una cepa de Kluyveromyces marxianus ATCC-16045
3.2 Objetivos específicos:
Diseñar medio de cultivo.
Activar células y desarrollar el inóculo.
Obtener la curva característica del cultivo continuo considerando al menos
cinco estados estacionarios.
Obtener y caracterizar un estado estacionario bajo limitación por nitrógeno.
Perturbar un estado estacionario mediante aumento de la concentración del
nutriente limitante en la alimentación y su seguimiento hasta el nuevo estado
estacionario.
Determinar la velocidad específica máxima de crecimiento mediante
operación de lavado.
IV.- FUNDAMENTO TEÓRICO
4.1 Las levaduras : Son los microorganismos más antiguamente conocidos,
mejor estudiados y generalmente mejor aceptados por los consumidores. Las
levaduras son raramente tóxicas o patogénicas y pueden ser utilizadas en la
alimentación humana. A pesar de que su contenido de proteínas no excede el 60%,
su concentración de aminoácidos esenciales tales como la lisina, el triptofano y la
treonina es satisfactoria, aunque tiene un bajo contenido de metionina y cisteina.
4
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
Las levaduras son muy ricas en vitaminas (grupo B) y su contenido en ácidos
nucleicos es bajo ya que está en el rango de 4 a 10%.
En cuanto a su tamaño las levaduras son más grandes que las bacterias, lo que
facilita la separación.
CUADRO DE CLASIFICACION
Género
Especies mas frecuentes
Características
LEVADURAS
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyce unisporus
Levaduras no fermentadoras de la
lactosa, que producen alcohol y
CO2 a partir de glucosa.
Candida kefir
Kluyveromyces marxianus var.
marxianus.
Levaduras fermentadoras de la
lactosa.
Responsables de formación de
CO2 y contribuyendo al
característico sabor y aroma.
Fuente : SCHENEIDER, A; MERKLE, R.; CARVALHO, M.; JONAS, R.;
BURLAN, S. Oxygen tranfer on b galactosidase production by Kluyveromyces
marxianus using Sugar Cane molasses as Carbon Source. Biotechnol. Letters. 23
(7):547-550. 2001
4.1.1 Levaduras (Kluyveromyces marxianus ATCC-16045)
Estas levaduras pertenecen a la división Ascomycotina. Las levaduras de este
género se reproducen por gemación multilateral, es una de las levaduras que más
abunda en los productos lácteos, son los microorganismos más antiguamente
conocidos, mejor estudiados y generalmente mejor aceptados por los
consumidores. Las levaduras son raramente tóxicas o patogénicas y pueden ser
utilizadas en la alimentación humana. A pesar de que su contenido de proteínas no
excede el 60%, su concentración de aminoácidos esenciales tales como la lisina, el
triptofano y la treonina es satisfactoria, aunque tiene un bajo contenido de
metionina y cisteina. Las levaduras son muy ricas en vitaminas (grupo B) y su
contenido en ácidos nucleicos es bajo ya que está en el rango de 4 a 10%. En
5
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
cuanto a su tamaño las levaduras son más grandes que las bacterias, lo que facilita
la separación.
Las levaduras son hongos unicelulares, con una morfología característica esférica
u ovalada.
Figura 4.1.A : células de levadura Kluyveromyces marxianus s de agar placas petri
usado para la inoculación de glucosa media
Figura 4.1.B: células de lavadura Kluyveromyces marxianus en medio de glucosa media
bajo condiciones aerobicas - shaker
Fuente : KINETIC ANALYSIS OF KLUYVEROMYCES MARXIANUS YEAST
STRAIN Erika Guimarães Madeira Reeves B.S., Louisiana State University, 2001 May
2004
6
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
Las levaduras se hallan ampliamente distribuidas en la naturaleza y se encuentran
frecuentemente en forma de polvillo blanco que cubre los frutos y las hojas.
4.1.2 Composición típica de las levaduras
Algunos de estos usos están basados en la composición de las levaduras.
Los componentes principales de la biomasa de levadura están presentados en la
siguiente tabla:
Componentes % Componentes %
Proteínas 45,0-55,0 Calcio 0,6-1,3
Hidratos de carbono 25,0-35,0 Fósforo 1,4-1,7
grasas 2,0-5,0 Potasio 1,2-1,9
Cenizas 6,0-8,0 Magnesio 0,1-0,2
Hierro 9,3-35,0 mg/% Cobre 2,0-13,4 mg/%
Molibdeno 1,3-12,3 mg/% Cinc 3,3-16,3 mg/%
Fuente: Departamento de Investigación Agosto 2005
Alrededor del 70% del nitrógeno total de las levaduras esta en forma de proteínas, el 8 -
10% como purina y el 4% como pirimidina. El resto esta en forma de aminoácidos y
nucleótidos. Por ejemplo, analizando el extracto de la levadura Saccharomyces
cerevisiae, que se usa en la industria alimentaria, se puede observar el alto contenido de
aminoácidos esenciales. Esta característica de la levadura S. cerevisiae se utiliza para la
producción del complemento dietario.
Aminoácidos % Aminoácidos %
Lisina 8.2 Valina 5.5
Histidina 4.0 Isoleusina 5.5
Arginina 5.0 tirosina 5.0
7
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
Leucina 7.9
Fuente: Departamento de Investigación Agosto 2005
4.1.3 Importancia de la levadura Kluyveromyces marxianus:
a) Obtención de la inulinasa , se sabe que la inulinasa es una enzima que es utilizada
para la hidrolisis de la inulina en una única etapa, obteniéndose productos con 95% de
frutosa esta puede ser obtenida de plantas o através de microrganismos como bactérias,
hongos o levaduras. Las levaduras Kluyveromyces marxianus ATCC 16045 e NRRL Y-
7571 es de gran interes industrial debido las características fisiológicas de accecibidad.
b) Obtención de la lactasa o b-galactosidasa es una enzima exclusivamente intracelular
en Kluyveromyces marxianus ATCC 8554, es una enzima que ha despertado gran interés
biotecnológico por razones básicamente nutricionales e industriales. La enzima causa la
hidrólisis del enlace b-1,4 de la lactosa hasta sus monómeros glucosa y galactosa,
originando un producto con mayor poder edulcorante. Los jarabes obtenidos de esta
hidrólisis sirven como sustituto del jarabe de maíz o sacarosa en las industrias de
heladerías, reposterías y panaderías; además su adición a productos lácteos como leche,
yogurt, crema agria y mantequilla mejora el sabor sin que ocurra un incremento calórico,
beneficiando el consumo en individuos con intolerancia a la lactosa. La hidrólisis
enzimática de la lactosa del suero permite el aprovechamiento de este subproducto de la
industria láctea, el cual se ha convertido en un grave problema de contaminación
ambiental, debido a que generalmente se descarga en cuerpos de aguas, esto ha
conllevado a que actualmente existe una amplia información sobre la b-galactosidasa
obtenida de diferentes fuentes y donde se han considerado aspectos como selección de
géneros, condiciones de cultivo, procedimientos de extracción, purificación, estabilidad,
obtención de plásmidos y mutantes, entre otras . Su aplicabilidad involucra
mayoritariamente sistemas alimenticios, por lo que resulta idóneo trabajar con enzimas
generalmente reconocidas como seguras (GRAS) y aceptadas por agencias de control de
alimentos y drogas como la Food and Drug Administration (FDA). Actualmente el estatus
GRAS es validado sólo para las lactasas de Aspergillus níger, Aspergillus orizae,
Kluyveromyces lactis y Kluyveromyces marxianus [9]. La lactasa más conveniente para
8
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
utilizar en leche, productos lácteos y sueros dulces es la proveniente del género
Kluyveromyces, donde representa un producto estrictamente intracelular .
Varios métodos han sido usados para solubilizar este tipo de enzimas, dependiendo de su
localización dentro de la célula, intenciones de uso y estabilidad; los métodos mecánicos
son predilectos en aplicaciones a gran escala, pero requieren alta inversión, costos
operacionales y además el extracto obtenido resulta cargado de fragmentos celulares,
sumando así mayor grado de dificultad al momento de purificar la enzima. La autólisis no
es un método apropiado, porque requiere de temperaturas que comprometen la estabilidad
de la enzima y los detergentes. son difíciles de remover de las preparaciones enzimáticas.
Uno de los métodos más utilizados para la extracción de la b-D-galactosidasa a partir de
levaduras es el uso de solventes orgánicos como el tolueno, cloroformo y alcohol
isoamílico. El análisis por MET de las células de K. marxianus reveló que el tolueno
ejerce un efecto permeabilizante, ya que ninguna célula mostró rompimiento de la pared
celular. En la FIG. 1 se observa el efecto plasmolizante producto del tratamiento con el
solvente, manifestado por la formación de pliegues de la membrana (_), vesícula en el
espacio intra y extracelular (➯), lo cual puede explicarse por la salida de compuestos
marcadores del espacio intracelular y corroborado por la valoración de la actividad de la
enzima. También se observa una desorganización de los organelos citoplasmáticos con
ausencia de núcleo y mitocondrias y la presencia de fragmentos de membrana (➤) que
podrían ser considerados como restos de organelos dentro de un citoplasma que se
observa muy denso.
Fig : Muestra de células de Kluyveromyces marxianus ATTC 8554 tratada con tolueno en la extracción
de enzimas
c) Obtención de concentrados proteicos: Se puede obtener un concentrado proteico a
partir de biomasa microbiana Kluyveromyces marxianus var. marxianus cultivada en suero
9
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
lácteo desproteinizado. El suero lacteo que se ha propuesto su empleo como sustrato de
fermentación para microorganismos capaces de asimilar la lactosa, tales como la levadura
Kluyveromyces marxianus var. marxianus, con el propósito de obtener biomasa
microbiana, también conocida como “proteína unicelular” . Esta tiene un contenido
proteico que oscila entre 40 y 80% en base seca y su calidad la asemeja más a la proteína
animal que a la vegetal . Sin embargo, el uso de proteína unicelular para consumo humano
presenta importantes limitaciones: la presencia de las paredes celulares, pues éstas reducen
la biodisponibilidad de las proteínas, además contienen factores antigénicos y alergénicos;
el alto contenido de ácidos nucleicos (básicamente ARN) los cuales pueden ocasionar
trastornos renales y gota, y por último las reducidas propiedades funcionales que exhibe la
biomasa celular deshidratada . Estas limitaciones pueden superarse mediante la elaboración
de concentrados proteicos, tal y como ha sido descrito para Candida tropicalis y para
Kluyveromyces marxianus var. marxianus utilizando la extracción alcalina y precipitación
isoeléctrica; sin embargo, esto no es suficiente, dado que los niveles de ácidos nucleicos
deben ser reducidos, bien sea por métodos químicos o métodos enzimáticos. Entre los
métodos químicos, uno de los más aceptados es la fosforilación con oxicloruro de fósforo
o alternativamente con trimetafostato de sodio, donde se han obtenido concentrados
proteicos a partir de Saccharomyces cerevisiae, los cuales han sido luego deshidratados a
través de métodos sofisticados, como la liofilización o el secado por aspersión,
respectivamente. La suplementación de productos cárnicos y de panadería con
concentrados proteicos bajos en ácidos nucleicos, mejora las propiedades funcionales de
dichos alimentos. Se ha ensayado la incorporación de harinas y autolizados obtenidos de
Candida utilis y Saccharomyces cerevisiae en la elaboración de los mencionados
productos con excelentes resultados .
d) Obtención de etanol :
10
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
Tabla: Resumen de artículos de trabajo para parámetros de crecimiento cinético con
especies de Kluyveromyces en la obtención de etanol:
11
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
Fuente : KINETIC ANALYSIS OF KLUYVEROMYCES MARXIANUS YEAST STRAIN Erika
Guimarães Madeira Reeves B.S., Louisiana State University, 2001 May
4.2 Sacarosa.
La sacarosa (azúcar de mesa) es un disacárido de glucosa y fructosa. Se sintetiza
en plantas pero no en animales superiores. No contiene ningún átomo de
carbono anomérico libre, puesto que los carbonos anoméricos de sus
dos unidades monosacáridos constituyentes se hallan unidos entre sí
12
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
covalentemente mediante un enlace O-glucosídico. Por esta razón, la sacarosa no
es un azúcar reductor y tampoco posee un extremo reductor.
4.3 Quimiostato:
El tipo más frecuente de cultivo continuo es el quimiostato en el que se introduce
medio fresco a un flujo constante denominado velocidad de dilución (D) a la vez
que se elimina cultivo viejo al mismo flujo. El medio de cultivo de un quimiostato
contiene un nutriente esencial en una cantidad limitante (nutriente limitante). Estos
parámetros se relacionan de acuerdo a la siguiente ecuación:
Donde f es la velocidad de flujo (ml h-1) y V el volumen del recipiente en ml. Por
consiguiente, las dimensiones de D son [h-1]. El valor D indica el número de
volúmenes de reactor (volúmenes de fermentador) que pasan a través el reactor
por unidad de tiempo. Este valor es el recíproco del tiempo de residencia o tiempo
que una unidad de substrato está dentro del reactor.
Tanto la tasa de crecimiento μ como el nivel de población microbiana están
relacionados con el valor de D.
13
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
Fuente: Microbiología General, Cultivo de microorganismos.
A velocidades de D muy bajas, pequeños incrementos de la velocidad de dilución
producen un cierto incremento de la densidad del cultivo debido a que se aportan
más nutrientes al medio y el microorganismo no ve limitada su tasa de crecimiento
(μ) según lo indicado en la ecuación de Monod.
La velocidad de crecimiento aumenta (μ aumenta y τ disminuye) cuando la
energía aportada por los nutrientes entrantes supera la energía de mantenimiento
de los microorganismos del cultivo.
A valores bajos de D la concentración de nutriente limitante (S) en el efluente es
baja porque es consumido casi completamente por los microorganismos del
cultivo que alcanzan unas poblaciones de gran tamaño creciendo a una tasa (μ)
baja porque se encuentran en condiciones de limitación de nutrientes (S<Ks). A
valores más altos de D no todo el nutriente es consumido por los microorganismos
del cultivo por lo que S en el efluente aumenta.
En una situación de equilibrio, velocidad de dilución D se iguala a la tasa de
crecimiento μ, de forma que el control de la tasa de dilución (control del flujo f)
permite regular la tasa de crecimiento y, de esa forma, la situación fisiológica del
organismo. A valores de D> μmax, el microorganismo no es capaz de crecer lo
suficiente como para evitar ser eliminado del cultivo por el rebosadero y, por
consiguiente S alcanza un valor máximo (el nutriente limitante no es consumido
en el cultivo y la concentración del substrato en el efluente es igual a la del
substrato en el medio inicial) y la tasa de crecimiento de microorganismos (μ)
dentro del cultivo se hace nula (el cultivo desaparece).
La evolución de la biomasa de un quimiostato se ajusta a la ecuación siguiente:
14
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
Microbiología General, Cultivo de microorganismos.
4.4.- Metabolismo:
4.5 Factores Fisicoquímicos que Afectan la Rapidez de Crecimiento.
Dentro de los factores ambientales que afectan el crecimiento de las levaduras
tenemos:
La temperatura puede, en parte, determinar la velocidad de crecimiento y el
grado total de desarrollo de los microorganismos, además las variaciones de
temperatura también pueden influir en los procesos metabólicos y en la
morfología celular. Pelczar et al. (1977) reportó, cada especie de levadura
crece a la temperatura que esta dentro de cierto límite de 28 a 48 °C ejemplo el
Kluyveromyces marxianus crece a 48 ° C. (www.unsa.edu.ar)
El pH es un parámetro crítico en el cultivo de microorganismos ya que estos
sólo pueden crecer en un rango estrecho de pH fuera del cual mueren
rápidamente. El pH intracelular es ligeramente superior al del medio que rodea
las células ya que, en muchos casos, la obtención de energía metabólica
depende de la existencia de una diferencia en la concentración de protones a
ambos lados de la membrana citoplásmica.
15
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
Hay que considerar que, como consecuencia del metabolismo, el pH del medio
de cultivo suele tender a bajar durante el cultivo. El decremento del pH se
puede deber a varios factores, uno de los cuales es la liberación de ácidos
orgánicos de cadena corta .Por consiguiente, es necesario controlar el pH de
los cultivos para evitar que un descenso excesivo pueda producir la auto
esterilización del cultivo. Por ejemplo el pH óptimo de crecimiento de las
levaduras esta en el rango de 3 a10. (www.unsa.edu.ar)
El potencial redox y el oxígeno son factores determinantes del crecimiento y del
metabolismo del cultivo. El potencial redox del medio de cultivo nos indica su
capacidad para aceptar o donar electrones, esto es: sus características oxidantes
o reductoras. Uno de los factores que intervienen en el potencial redox, aunque
no el único, es la concentración de oxígeno, O2. Hay microorganismos que
requieren ambientes oxidantes para crecer, mientras que otros necesitan
ambientes reductores. El requerimiento de condiciones oxidantes o reductoras
no debe confundirse con la necesidad de presencia o ausencia de oxígeno para
que se produzca el crecimiento.
Un microorganismo es aerobio cuando necesita oxígeno para vivir y es
anaerobio cuando o bien no lo necesita (anaerobios facultativos) o anaerobios
aerotolerantes como las bacterias lácticas o cuando muere en presencia de
oxígeno (anaerobios estrictos como los clostridios). El rendimiento Yx/s de los
procesos fermentativos es menor que el de los respiratorios: las levaduras
producen menos biomasa cuando crecen fermentando que cuando lo hacen
respirando.
Actividad de agua: Se denomina actividad de agua a la relación entre la presión
de vapor de agua del substrato de cultivo (P) y la presión de vapor de agua del
agua pura (P0). El valor de la actividad de agua está relacionado con el de la
humedad relativa (HR).
El valor de la actividad de agua nos da una idea de la cantidad de agua
disponible metabólicamente. Por ejemplo: comparemos el agua pura donde
todas las moléculas de agua están libremente disponibles para reacciones
químicas con el agua presente en una disolución saturada de sal común (NaCl)
donde una parte importante de las moléculas de agua participa en la
16
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
solvatación de los iones de la sal disuelta. En este último caso, la actividad de
agua es mucho menor que en el primero. Conforme aumenta la cantidad de
solutos en el medio, disminuye su actividad de agua.
Cuando un microorganismo se encuentra en un substrato con una actividad de
agua demasiado baja, su crecimiento se detiene. Esta detención del
crecimiento no suele llevar asociada la muerte del microorganismo, sino que
éste se mantiene en condiciones de resistencia durante un tiempo más o menos
largo. En el caso de las esporas, la fase de resistencia puede ser considerada
prácticamente ilimitada.
La gran mayoría de los microorganismos requiere unos valores de actividad de
agua muy altos para poder crecer. De hecho, los valores mínimos de actividad
para diferentes tipos de microorganismos son, a título orientativo, los
siguientes: bacterias aw >0.90, levaduras aw>0.85, hongos filamentosos aw
>0.80.
La concentración de los compuestos que se necesitan para el crecimiento es
importante porque puede provocar una disminución de la tasa de crecimiento a
causa de la alta presión osmótica del medio.
4.6 Extracto de Levadura
Los extractos de levadura son excelentes para muchos microorganismos. Son
producidos a partir de la levadura de panadería mediante autólisis a 50 – 55 ºC o
mediante plasmólisis en presencia de altas concentraciones de NaCl. El extracto
de levadura contiene aminoácidos, péptidos, vitaminas solubles en agua y
carbohidratos. Muestra algunos análisis típicos, la composición del extracto varía
parcialmente debido a que los substratos utilizados para el cultivo de las levaduras
afectan la calidad del extracto de levadura.
17
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
Tabla N° xxxx. Composición del Extracto de Levadura.
Extracto de Levadura producido mediante
Autólisis Plasmólisis con NaCl
Composición (%)
Materia seca
Nitrógeno total
Proteína (N*6.25)
NaCl
70
8.8
55
< 1
80
7.4
46
18
Aminoácidos (%)
Alanina
Ácido aminobutírico
Arginina
Asparagina
Cistina
Ácido glutámico
Glicina
Histidina
Isoleucina
Leucina
Lisina
Metionina
Ornitina
Fenilalanina
Prolina
Serina
Treonina
Tirosina
Valina
3.4
0.1
2.1
3.8
0.3
7.2
1.6
0.9
2.0
2.9
3.2
0.5
0.3
1.6
1.6
1.9
1.9
0.8
2.3
2.3
0.1
1.1
3.1
0.2
5.1
1.6
0.8
1.6
2.3
2.9
0.5
0.9
1.6
1.5
1.5
1.4
0.5
1.9
Contenido en vitaminas (ppm)
Tiamina
Riboflavina
Piridoxina
Niacinamida
Ac. Pantoténico
20-30
50-70
25-35
600
200
10-15
50-70
20-30
100
350Fuente: Ohly Gmbh y Hamburg, citado en Wulf C., 1989.
18
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
4.7 Antiespumantes:
4.7.1 Silicona liquida: El Dimetilpolisiloxano (Simeticona), es una silicona inerte
derivada del silicio desprovista de acción sistémica que desarrolla un efecto
espumolítico-antiflatulento. Químicamente es un polímero linear de siloxanos
metilados, con un número de unidades entre 200 y 350 dependiendo de su viscosidad.
4.8 Crecimiento microbiano en medio líquido
Si la bacteria crece en un medio líquido, en la mayoría de los casos las células que
se producen en cada división continúan su vida independientemente formándose
una suspensión de células libres.
En un cultivo discontinuo de bacterias en medio líquido, se pueden diferenciar
cuatro fases en la evolución de los parámetros que miden el crecimiento
microbiano:
19
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
Fase lag o de adaptación durante la que los microorganismos adaptan su
metabolismo a las nuevas condiciones ambientales (abundancia de nutrientes y
condiciones de cultivo) para iniciar la fase de crecimiento exponencial.
Fase exponencial o logarítmica: en ella la velocidad de crecimiento es máxima
y el tiempo de generación es mínimo. Durante esta fase las bacterias consumen
a velocidad máxima los nutrientes del medio. La evolución del número de
células durante esta fase se explica con los modelos matemáticos que
describiremos a continuación.
Fase estacionaria: en ella no se incrementa el número de bacterias (ni la masa u
otros parámetros del cultivo). Las células en fase estacionaria desarrollan un
metabolismo diferente al de la fase exponencial y durante ella se produce una
acumulación y liberación de metabolitos secundarios que pueden tener
importancia industrial.
Los microorganismos entran en fase estacionaria porque se agota algún
nutriente esencial del medio o porque los productos de desecho que han
liberado durante la fase exponencial hacen que el medio sea inhóspito para el
crecimiento microbiano.
20
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
La fase estacionaria tiene gran importancia porque probablemente represente
con mayor fidelidad el estado metabólico real de los microorganismos en los
ambientes naturales.
Fase de muerte: se produce una reducción del número de bacterias viables del
cultivo.
4.9 Cultivo por Lotes
La fermentación por lotes se refiere a un sistema completamente cerrado donde
todos los materiales requeridos están cargados en el fermentador, previamente
desinfectados antes del proceso de fermentación y los residuos removidos al final.
Los únicos materiales extraídos y agregados durante el curso de una fermentación
por lotes son el intercambio de gases y las soluciones de control de pH,
respectivamente. En este modo de funcionamiento, las condiciones están
cambiando continuamente con el tiempo, y el fermentador es un sistema de estado
inestable.
La ventaja principal es el menor riesgo de contaminación con respecto a otros
procesos de fermentación (cultivo continuo y cultivo por lote alimentado)
La desventaja principal del cultivo por lotes es el alto tiempo improductivo entre
lotes, comprendiendo la carga y descarga del fermentador, la limpieza,
esterilización y procesos de salida. Otra desventaja es la inhibición del
crecimiento por metabolitos primarios, secundarios y por la ausencia de
nutrientes.
4.10 Cultivo por Lote Alimentado
En el cultivo por lote alimentado, el inicio es una fermentación por lotes y
posteriormente se alimenta con un nutriente limitante o un precursor
continuamente o intermitentemente, durante el curso de la fermentación, a modo
de controlar la cantidad disponible del mismo en el medio. Al final del ciclo el
fermentador puede vaciarse parcialmente y repetir un nuevo ciclo.
Básicamente, el crecimiento de las células se da bajo un cultivo por lotes durante
algún tiempo, normalmente hasta cerca del extremo de la fase de crecimiento
exponencial. A estas alturas, el biorreactor se alimenta con una solución de
21
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
nutrientes. Este alimento debe ser bastante equilibrado para persistir el crecimiento
de los microorganismos en una proporción de crecimiento específica deseada y
reduciendo la producción de derivados simultáneamente (ése puede ser
crecimiento o producción del producto inhibitorio). Es el proceso más usado en la
producción de metabolitos complejos.
La ventaja de esta técnica es la producción de densidades celulares altas debido a
la extensión de tiempo (particularmente importante en la producción de productos
crecimiento-asociados) por lo que existe un mayor rendimiento y productividad.
Otra ventaja es reducir la formación de productos secundarios formados cuando
hay exceso de nutrientes (sobrealimentación).
La desventaja es que requiere instrumentación adicional para el control, operarios
entrenados para operar el biorreactor y la toma de decisiones, especialmente
cuando no se dispone de elementos de control automático. Otra desventaja es que
existen riesgos de contaminación del medio de cultivo.
V.- MATERIALES Y METODOS EXPERIMENTALES:
5.1 Diseño del medio de cultivo y preparación de los medios.
5.1.1 Medio de mantención y resiembra del microorganismo.
5.1.1.1 Materiales y equipos
Balanza analítica
Olla a presión
Mechero Bunsen
Pipetas de 10 ml.
Aza bacteriológica
Tubos de ensayo con tapas (8 tubos)
Varilla de vidrio
Matraz erlenmeyer (250ml)
Guantes.
Espátula
Probeta graduada
Capachos de papel
22
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
5.1.1.2 Reactivos
Muestra: Kluyveromyces marxianus ATCC-16045
Sustrato: sacarosa
Agua destilada.
Extracto de levadura.
Peptona.
Agar.
5.1.1.3Procedimiento
Se iniciara teniendo en cuenta la referencia de
composición de medios de cultivo de mantención para
Kluyveromyces marxianus ATCC-16045. (Tabla Nº 1 de anexos)
Luego de acuerdo a la tabla Nº 1 de anexos se pesan las
cantidades requeridas de cada compuesto, con mucho cuidado.
Medir en una probeta graduada 50 ml de agua destilada.
Mezclar todos los compuestos en un matraz Erlenmeyer
adicionando el agua destilada.
Calentar con el mechero Bunsen la mezcla disuelta en el
matraz; agitando constantemente con la ayuda de una varilla de
vidrio, hasta la aparición de la primera burbuja, a partir de lo cual se
controla de 1 a 2 minutos.
Preparar 8 tubos de ensayo con tapa, y en caliente
adicionar 6ml de la mezcla a cada tubo, e inmediatamente taparlos.
Colocar los tubos en un vaso de precipitado, y llevarlos a
la olla a presión, previamente aflojar las tapas, para permitir el
intercambio de gases.
Calentar hasta que la temperatura alcance los 121ºC y a
partir de ello controlar de 15 a 20 minutos, finalizando la
esterilización.
23
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
Ajustar las tapas de los tubos estando estos aun dentro de
la olla, luego colocarlos en posición inclinada y dejarlos a
temperatura ambiente.
Luego preparamos nuestra área de trabajo, desinfectando
con alcohol. para tener una área estéril prendemos el mechero cinco
minutos antes de realizar el resiembro con el Kluyveromyces
marxianus
Abrimos los tubos de ensayo cerca al mechero bunsen ,
flameando para evitar la contaminación , teni8endo el aza
bacteriológica calentado al rojo vivo esperamos un momento que se
enfríe .
Sacamos 2 a 3 azadas y colocamos en el tubo con agar ,
flameamos y cerramos el tuvo y así en los 8 tubos con agar
5.1.2 Medio de activación
5.1.2.1 Materiales y equipos
Matraz de 250ml.
Matraz de 125 ml
tubos de ensayo con tapa
Algodón
Gasa
Varilla de vidrio
Balanza analítica
Espátula
Agua destilada
Pinzas
Guantes
Shaker
Mechero Bunsen, trípode y rejilla.
Olla a presión
Pipetas
Capachos de papel
24
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
PHmetro
5.1.2.2 Reactivos
Componentes según Tabla Nº 2
Alcohol
HCl cc.
5.1.2.3 Procedimiento
Pesar los componentes descritos en la tabla Nº 2 de anexos.
Se esterilizan: la mezcla de extracto de levadura y sales en un
tubo de ensayo (enrazar hasta 14 ml con agua destilada), la
sacarosa en un matraz de 125 ml (14 ml con agua destilada).
Previamente a la esterilización utilizar NaOH y acido
ortofosforico para ajustar el pH a 5.0 de la solución que contiene
sacarosa.
Mezclar estos componentes para el medio de activación “bajo
mechero” para evitar la contaminación.
Tener el resiembro activado en una estufa por un promedio de 1.5
a 2 horas.
Sacamos tres azadas y colocamos en el medio de activación.
Colocar en el shaker hasta que la concentración sea de 3gr/l para
un tiempo de 12h.
Luego se inocula en un matraz de 250 ml con un medio liquido
de 136 ml que contiene sacarosa, sales y extracto de levadura.
5.1.3 Medio de fermentación y proliferación
5.1.3.1 Materiales y equipos
25
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
Matraz de 1 L
Matraces de 125 ml
Varilla de vidrio
Capachos de papel
Balanza analítica
pHmetro
5.1.3.2 Reactivos
Según la tabla Nº 3 de anexos
Agua destilada
Alcohol
5.1.3.3 Procedimiento
Pesar los componentes descritos en la tabla Nº 3 de anexos.
Se diluye completamente cada compuesto con agua destilada de
la siguiente manera:
Sacarosa en un matraz de 1 L con 400 ml de agua
destilada
Extracto de levadura y el sulfato de amonio en un matraz
con 212 ml. de agua destilada
Las sales, K2HPO4, MgSO4. 7H2O
Regular el þH de la solución de sales con acido ortofosforico e
hidróxido de sodio hasta un pH de 5.0
Esterilizar las diluciones por separado.
Dejar enfriar
Mezclar el extracto con el azúcar (sacarosa) y adicionar el
inoculo.
Colocar en Baño Maria con el agitador magnético e iniciar el
cultivo continuo con adición de nutrientes
26
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
5.1.4 Medio para el quimiostato V= 680 (viernes 29/02/08 8:00m.)
Se mezclaron los componentes de la siguiente manera (tabla 4 de anexos):
sacarosa, 220 ml de agua destilada en el quimiostato
Solución de sales MgSO4.7H2O y K2HPO4 (NH4)2SO2 en un matraz de
250 ml con 100 ml de agua destilada
Extracto de levadura y sulfato de amonio en un matraz de 125 ml con
100 ml de agua destilada
Se taparon, esterilizaron 121 °C tiempo 20 minutos y se dejo enfriar
hasta su posterior uso.
5.1.5 Medios para el flujo de alimentación de los estados estacionarios
V=2.4 L (viernes 31/02/08 9:00 am)
Se mezclaron los componentes de la siguiente manera (tabla 5 de anexos):
Sacarosa,220 ml de agua destilada en un botellón ámbar de 2.5 L
Solución de sales 11.5 ml, 100 ml de tampón, MgSO4.7H2O y K2HPO4 c
en un matraz de 125 ml
Extracto de levadura y sulfato de amonio en un matraz de 125 ml con
100 ml de agua destilada.
Se taparon, esterilizaron 121 °C tiempo 20 minutos y se dejo enfriar
hasta su posterior uso.
5.2 Medio bajo limitación por nitrógeno:
Se mezclaron los componentes de la siguiente manera (tabla de anexos 7):
sacarosa, y agua destilada en un botellón ámbar de 2.4 L
27
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
Solución de sales, tampón, MgSO4.7H2O y K2HPO4 (NH4)2SO2 en un
matraz de 125 ml
Sulfato de amonio en un matraz de 125 ml con 100 ml de agua destilada
Se taparon, esterilizaron y se dejo enfriar hasta su posterior uso.
5.3 Medio para perturbación con alta concentración de sacarosa:
Se mezclaron los componentes de la siguiente manera (tabla 8 de anexos):
sacarosa, 220ml de agua destilada en un botellón ámbar de 2.4 L
Solución de sales ml, tampón, MgSO4.7H2O y K2HPO4 (NH4)2SO2 en un
matraz de 125 ml
Extracto de levadura y sulfato de amonio en un matraz de 125 ml con
100 ml de agua destilada
Se taparon, esterilizaron y se dejo enfriar hasta su posterior uso.
5.4 Medio para el lavado
Se mezclaron los componentes de la siguiente manera (tabla 9 de anexos):
sacarosa, tampón y ml de agua destilada en un botellón ámbar de 2.4L
Solución de sales ml, ml de tampón, MgSO4.7H2O y K2HPO4 (NH4)2SO2
en un matraz de 125 ml
Extracto de levadura y sulfato de amonio en un matraz de 125 ml con
100 ml de agua destilada
Se taparon, esterilizaron y se dejo enfriar hasta su posterior uso.
5.5 Puesta en marcha del quimiostato
De la cinética seguida en los matraces se determino el tiempo para las 2/3 partes
del crecimiento logarítmico para dar inicio al cultivo continuo
5.6 Obtención de la curva característica de crecimiento de una levadura
28
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
Se trabajo con 5 e.e. para la obtención de esta curva, es haciendo variar la
velocidad de dilución de acuerdo al tiempo calculado en el Anexo Nº...
Estados estacionarios:
; ;
Considerando que en estado estacionario se cumple que:
µ=D
5.7 Obtención y caracterización de un estado estacionario bajo limitación por
nitrógeno.
Nutriente limitante: nitrógeno
Concentración celular final de 3g/l
Para este estado estacionario consideraremos los siguientes datos: con la
experiencia 4
= 0.2206 h-1
F = 2.5 ml/min
t = 14 h
*V = 2.4 L
*Este volumen es la cantidad de medio a preparar para la alimentación.
5.8 Perturbación de un estado estacionario mediante aumento de la
concentración del nutriente limitante en la alimentación.
Habiéndose obtenido los 5 estados estacionarios en el crecimiento de la
levadura, se perturba este estado aumentando la concentración de sacarosa
(Nutriente limitante) en la alimentación.
29
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
Este nuevo flujo trabajo una concentración de sacarosa = 15 g/l. Para este estado
estacionario consideraremos los siguientes datos:
= 0.2650 h-1
F = 3.00 ml/min
t = 12 h
*V = 2.4 L
*Este volumen es la cantidad de medio a preparar para la alimentación.
Se tomaron 11 muestras cada hora
5.9 método de lavado
Se aumento el flujo para determinar el max
D = 1.0588 h-1
F = 12 ml/min
t = 3 h
VL = 680 ml
Donde VL = Volumen del Quimiostato
*V = 2.4 L
*Este volumen es la cantidad de medio a preparar para la alimentación.
Se tomaron 11 muestras cada hora
VI.- RESULTADOS Y DISCUSION:
30
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
La Inoculación Kluyveromyces Marxianus Del Fue De La Siguiente Manera
31
Muestreo para seguimiento de la
cinética del cultivo por lote
22
Muestreo para obtención de la Curva
de calibrado de biomasa y sustrato
3
11
CULTIVO POR LOTE CULTIVO CONTINUO
SHAKER SHAKER
SHAKER
SHAKER
SHAKER
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
1.- EL CULTIVO POR LOTE
Del matraz N° 3 se extrajo las muestras para realizar la curva de calibrado o curva
patrón para biomasa que nos fue proporcionado por el profesor del curso y azucares
reductores por método rápido DNS presentamos los datos en el cuadro Nº 2 ,
obteniéndose así los resultados :
Se tomaron 20 ml, cada muestra de 5 ml, se midió absorbancia 540 nm y para la
biomasa de 640 nm se centrifugo para hallar peso seco.
METODO D.O (Datos para la curva de calibrado para la concentracion celular
Biomasa):
CUADRO Nº 1: DATOS PARA LA CURVA DE CALIBRADO DE BIOMASA
N°
Capacho Dilución
ml
Caldo
ml de
H2O
Absorbancia
(640nm)
Capachos
(gr)
Capachos
+ Celulas
Celulas
secas (g)
X
(g/L)
1 01:01 5 0 1.23 0.2156 0.2244 0.0088 1.76
2 01:02 2.5 2.5 0.9 0.2126 0.2191 0.0065 1.3
3 01:05 1 4 0.487 0.2046 0.2072 0.0026 0.52
4 01:10 0.5 4.5 0.272 0.2082 0.2094 0.0012 0.24
GRAFICA Nº1: CURVA DE CALIBRADO DE BIOMASA
32
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
Curva de Calibrado de Biomasa (Kluyveromyces marxianus ATCC-16045)
y = 0.6094x + 0.1403
R2 = 0.9955
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8
CC de Biomasa (G/L)
Ab
sorb
anci
a (6
40n
m)
Obteniéndose un
m =0.452 h-
y = 0.6094x + 0.1403 R2 = 0.9955
El tiempo de muestreo para la fermentación del cultivo por lotes fue de 10 hr y se ha
considerado los 2/3 del crecimiento logarítmico, porque a este tiempo las células son
más viables y están en pleno crecimiento exponencial, pues es en ese momento en la
que se puede dar inicio al cultivo continuo. La inoculación al quimiostato es la primera
etapa para dar inicio a este cultivo, a esta etapa se le llama puesta en marcha y con ella
empezara el conteo hasta luego de las 4h Como se muestra a continuación para un m
=0.452h-1 obtenido por el profesor.
C1V1 = C2V2
2 (g/l)*20(ml)= X0*680(ml)
0.0588 g/l= X0
Ln(X / X0) = m t
33
m =0.452 h-
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
Ln((3g/l)/(0.0588g/l)) = 0.452h-1 t
3.777=t
T=4h
En las que las células se encuentren en pleno crecimiento. En la experiencia las células
inoculadas tuvieron una absorbancia de 0.206 y luego en el quimiostato tardaron 4
horas hasta alcanzar los dos tercios de su crecimiento logarítmico pues durante este
lapso de tiempo las células se adaptan al nuevo medio siendo este el momento ideal
para iniciar el cultivo continuo
La determinación experimental de este momento se logro gracias a la medición de la
absorbancia, cuyo valor al cabo de las 4 horas fue de 0.830 , que al comprobarla con la
absorbancia del cultivo por lote existe una semejanza significativa con lo obtenido en la
cinética de crecimiento en el cultivo por lotes.
Fuente : instituto Tecnológico y de Estudios Superiores de Occidente.
A. METODO DNS (Datos para la curva de calibrado de sacarosa (6 g/L) )
34
2/3 T
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
CUADRO Nº 2: DATOS PARA LA CURVA PATRON DE SACAROSA
N°
TUBOS
ml de caldo
V1 ml de H2O
C2 de Sacarosa
(g/L) ABSORBANCIA
1 2 0 6 0.951
2 1.6 0.4 4.8 0.646
3 1.2 0.8 3.6 0.597
4 1 1 3 0.488
5 0.8 1.2 2.4 0.317
6 0.4 1.6 1.2 0.21
7 0.2 1.8 0.6 0.07
8 0 2 0 0
GRAFICA Nº2: CURVA PATRON DE LA SACAROSA
Curva de Calibrado de Sacarosa
y = 0.1528x - 0.0028
R2 = 0.9785
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5
CC de Sacarosa (g/L)
Ab
sorb
anci
a (5
40 n
m)
2.- CULTIVO CELULAR CONTINUO AIREADO:
2.1PUESTA EN MARCHA DEL QUIMIOSTATO
La puesta en marcha se realiza luego de montaje del quimiostato. Tal como se muestra
en la figura
35
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
Siendo las 8: 00 am del día viernes se inoculo el matraz N° 3 en el quimiostato se saco
una muestra y se leyó la absorbancia dando ABS = 0.206, lo cual indica que el inicio del
cultivo continuo aun no debe empezar.
36
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
Toma de muestra para la lectura de la absorbancia.
Por lo que luego de aproximadamente 4 horas se toma una muestra mas dando la ABS.=
0.830 esto indica que se debe dar inicio al cultivo continuo.
2.1 parámetros para cultivo continuo.
Las variables que comúnmente se controlan en un cultivo continuo son: el pH, la
temperatura, la cantidad de espuma formada, la velocidad de agitación, etc( Instituto
Tecnológico y de Estudios Superiores de Occidente, A)
pH.- En trabajo realizado en el laboratorio se trabajo con un pH inicial de 5.88 y se
termino con un pH de 5.5 contrastando de acuerdo a la teoría las levaduras como
Kluyveromyces marxianus toleran mejor altas concentraciones de azúcar que de sal,
pero toleran un rango de entre 3 y 10, pero prefieren un medio ligeramente ácido con
un pH de 4,5 a 6,5.Kluyveromyces marxianus (1)
La temperatura. En trabajo realizado en el laboratorio se trabajo con una temperatura
de baño Maria de 30 ºC; La vasta mayoría de las levaduras son mesófilas, pero en el
caso de Kluyveromyces marxianus es aerobia porque es una especie fermentadora así
mismo la mayoría de las levaduras tienen una temperatura máxima de crecimiento entre
24 y 48ºC. La temperatura optima se encuentra por lo general entre 30 – 45 ° C,
(Elsevier, 1990).
37
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
La filtración.- En la practica de laboratorio se utilizo el sulfato de cobre como un
filtrador que permite eliminar las partículas en suspensión en el aire y así eliminar a los
microbios que son, generalmente, adsorbidos .La gran mayoría de partículas tienen un
diámetro comprendido entre un décimo y algunos micrones .En el aire seco, están
animadas de un movimiento browniano que les da una talla aparente diez veces superior
a su tamaño real .Es posible eliminar las gracias a dos formas diferentes de filtración.
(Scriban, R. (1984).
La agitación.- en la práctica realizada se utilizo un agitador magnético para que acelere
el contacto entre dos o varias fases. En la fermentación, la fase soporte es con
frecuencia el medio cultivo .La agitación tiene por objeto mezclar con esta base soporte
varias fases que se adicionan .Una fase sólida (especial) constituida por las células
microbianas, la operación mezcla consiste en llevar a cabo una suspensión que debe ser
lo mas homogénea posible, pero conservando la integridad de las células , en la practica
se utilizo para tener en suspensión a las células y tener una mejor distribución de los
nutrientes agregados al medio.
Una segunda fase gaseosa constituida por el gas de oxigenación para los procedimientos
aerobios .La operación en este caso es una emulsión. (Scriban, R. (1984).
Una fase liquida constituida por los reactivos que se adicionan en el curso de la
fermentación: silicona liquida, nutrimentos, soluciones para corregir el pH. La
operación que se realiza es una mezcla.
La agitación mecánica, además de realizar las operaciones de mezcla y de suspensión,
mejora la emulsión dividiéndolo las burbujas de gas introducidas haciéndolas circular
en el líquido (Scriban, R. (1984).
La producción de espumas: la formación espuma puede ser un problema serio en la
fermentación. Si se permite su formación puede bloquear los filtros de salida, estimular
la contaminación o reducir el rendimiento. Lamentablemente la mayor parte de los
medios de fermentación facilitan la formación de espuma y su reducción puede
conseguirse mecánica o químicamente.
Existen un conjunto de antiespumantes en el mercado que incluyen aceites naturales ,
alcoholes superiores,, siliconas , n- parafinas. Algunos antiespumantes son
metabolisados por los microorganismos y es necesaria la dicción regular al
fermentador ; en efecto , por diseño cuidadoso del medio el antiespumante puede ser
38
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
utilizado como una fuente adicional de carbono, frecuentemente mas eficientemente que
la principal fuente de carbono. (J BULOCK; B.KRISTIANSEN. 1991)
Durante el proceso de fermentación, puede ser tolerable en cierta cantidad, pero este
llega a un punto que es necesario reducirlas para evitar que se desborden dado los
inconvenientes y los riesgos que esto entraña.
La espuma aparece cuando la dispersión de gas en la fase liquida se estabiliza a causa de
películas liquidas resistentes que envuelven las burbujas de gas .Aparece tanto mas
fácilmente y con mayor abundancia cuando mas débil es la tensión superficial. La
temperatura, el pH y la viscosidad del fluido de fermentación juegan también un papel
importante en la formación y persistencia de espumas.
Las sustancias antiespumas como los productos a base de silicones , recurre a la acción
global sobre la tensión superficial , además su elección de producto para contrarrestar en
el problema de las espumas , es debido a que este producto presenta un poder inhibidor
mínimo o nulo sobre el microorganismo que se cultiva, a comparación de medio
químicos ( sustancias iónicas) .Las espumas pueden disminuir la capacidad de
transferencia de oxigeno de la instalación .Así mismo pueden provocar una especie de
envenenamiento de las interfases de intercambio gas liquido .Asimismo pueden
perturbar los intercambios celulares por envenenamiento , en este caso , de las
envolturas de la célula .Se les puede imputar un aumento del tamaño medio de las
burbujas de gas en el seno del liquido , de donde resulta un aumento de la velocidad
media ascensional del gas y por consecuencia una disminución de la retención gaseosa y
del aire interfacial especifico que puede llegar hasta el 25%.La transferencia de oxigeno
es globalmente disminuida hasta el 60% , con la consecuente e inevitable baja de
productividad (Scriban, R. (1984).
Otro de los motivos de la formación de espuma es a causa de las proteínas que contiene
el extracto de levadura y los metabolitos que se van formando durante la fermentación.
39
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
Formación de espumas en el bioreactor
La transferencia de oxigeno.- De las burbujas gaseosas hacia los sitios de su
utilización en las células se hace en varias etapas, representa una transferencia
unidireccional. Esta transferencia se efectúa a través de varias películas, cada una de
ellas ejerce cierta resistencia .Se considera que en la interfase gas-liquido del lado
gaseoso esta recubierta de una película gaseosa ( etapa 1) y del lado liquido , de una
película liquida (etapa 2), esta ultima ejerciendo una gran influencia sobre la
transferencia. El oxigeno disuelto difunde entonces hacia las células (etapa 3 ) , al
contacto de las cuales se encuentra de nuevo a una película liquida (etapa 4 ).Finalmente
el oxigeno debe penetrar a la célula ( etapa 5)se puede considerar lo que paso dentro de
la célula en donde el oxigeno debe difundir hacia el sitio donde es efectivamente
utilizado para el metabolismo .En las levaduras las enzimas respiratorias están
localizadas dentro del mitocondrias. El oxigeno debe entonces difundir en el citoplasma
y atravesar la pared mitocondrial. A esto se le agrega , el fenómeno ya considerado de la
formación del micelio en pelota que hace mas difícil aun la transferencia del oxigeno al
seno del amontonamiento microbiano. El oxigeno juega un papel fundamental en el
metabolismo aerobio productor de energía, como receptor final de los electrones y de
los protones producidos en las reacciones de oxidación. El oxigeno interviene en ciertos
mecanismos de regulación del metabolismo en forma directa, como inductor o como
represor de la síntesis de enzimas respiratorias, pero también en forma indirecta en su
papel en el metabolismo energético
La instalación debe concebirse en su conjunto en forma que permita: La esterilización y
el mantenimiento de asepsia, la distribución de aire, en procesos aerobios, la reducción
o eliminación de espumas, la transferencia de fluidos y de suspensión de una cuba a
otra. . (Scriban, R. (1984).
Para que un microorganismo se multiplique, es necesario que se desarrolle en un medio
donde haya oxígeno, ya que este le sirve para producir energía e incrementar la
40
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
oxidación (que es una de las causas por las cuales crece). Los requerimientos de
oxígeno pueden ser expresados en términos de qo2, esta es la cantidad de oxígeno
consumido por unidad de tiempo y por unidad de biomasa, esta varia de acuerdo al
microorganismo y del estado fisiológico de las células, substratos de carbono y los
parámetros fisicoquímicos. (Instituto Tecnológico y de Estudios Superiores de
Occidente, A)
Medidor de oxigeno.
DATOS EXPERIMENTALES OBTENIDOS.
CUADRO Nº 3: DATOS EXPERIMENTALES DE LOS 5 ESTADOS
ESTACIONARIOS OBTENIDOS EN LA PRACTICA
Fecha Hora Absorbancia pH Responsable Observaciones
d/m/a (h) 640 nm N° Experiencia Cambio
41
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
29/02/200
8 07:30 a.m. 0.206 (Xi) 5.88 Grupo D1,2 OK
29/02/200
8 11:30 a.m. 0.83 (X2/3) 4.492 Grupo D1,2 OK
01/03/200
8 07:00 a.m. 0.928 5 Grupo A1
Experiencia N°3 (19
h) Cambio de F=3 ml/min
01/03/200
8 08:00 a.m. 0.817 F= 1.8 ml/min Hora: 8:15 am
01/03/200
8 07:00 p.m. 0.922 5.5
Cesar
Moreno
Experiencia N°5 (12
h)
Cambio de F=0.8
ml/min
01/03/200
8 08:00 p.m. 0.785 F= 3 ml/min Hora: 8:15 pm
03/03/200
8 01:00 p.m. Augusto
Experiencia N°1 (43
h) 1:00 pm se observa
03/03/200
8 02:00 p.m. 0.975 B1 no se F= 0.8 ml/min en el frasco de alim.
03/03/200
8 03:00 p.m. 0.896 presento solidos en suspension.
04/03/200
8 07:00 p.m. 0.866 5.5
Experiencia N°2 (29
h) Cambio de F=3 ml/min
04/03/200
8 08:00 p.m. 0.848 F= 1.20 ml/min
Hora 8:00 pm (Exp.
N°5)
05/03/200
8 07:00 a.m. 0.937
05/03/200
8 08:00 a.m.
42
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
1. CULTIVO CELULAR CONTINUO AIREADO: ESTADOS ESTACIONARIOS
Para alcanzar los estados estacionarios se tiene en cuenta que deben pasar 3 tiempos de
residencia (siendo 3: tiempo de residencia y = D-1, donde se ha alcanzado
aproximadamente el 90% de equilibrio celular, por este motivo la toma de la
absorbancia de realiza una hora antes y una hora después para verificar que la célula
esta llegando o se encuentra en su estado estacionario. En la experiencia se tomaron tres
muestras siendo la segunda muestra la que corresponde a la hora central; para afirmar
que se ha alcanzado el estado estacionario se comprobaron con las lecturas del
espectrofotómetro no habiendo mucha diferencia, +/- 5% entre cada dato. En general
los cálculos para los tiempos de fermentación son casi exactos, pues luego de este
tiempo la células se encontraban en su estado estacionario.
Cerca de las 12:00 pm. se da inicio al cultivo continuo la toma de muestras se realizo de
acuerdo a los cálculos realizados; los muestreos obtenidos se presentan en la siguiente
tabla. Sabiendo que en los estados estacionarios D = μ se opta por dar las velocidades de
dilución que se presentan; con sus respectivos flujos. Los sobrenadantes guardados en
los viales, sirvieron para la evaluación del consumo de sustrato según el método DNS y
utilizando la curva de calibrado para azucares reductores hallamos la variación de
concentración del sustrato, lo obtenido se presenta en la siguientes tabla.
En este tipo de cultivo continuo hay una aportación continua de los substratos para la
alimentación de los microorganismos, el propósito de el estado estacionario es mantener
constante la producción de biomasa. Esto se logra alimentando al quimiostato a un ritmo
estable, el volumen es mantenido constante quitando la misma cantidad que se (3).
La adición de nutrientes al medio como, como sales de amonio y extracto de lavadura
puede tener un efecto beneficioso
43
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
CUADRO Nº 4: DATOS OBTENIDOS DE LOS 5 ESTADOS ESTACIONARIOS
F
(ml/min) Absorbancia X (g/L) Absorbancia S (g/L)
0.80.975 1.3697 0.007 0.1099
0.896 1.2401 0.009 0.1361
1.20.866 1.1908 0.01 0.1492
0.848 1.1613 0.005 0.0838
*1.80.928 1.2926 0.04 0.5419
0.817 1.1104 0.011 0.1623
2.50.778 1.0464 0.006 0.0969
0.723 0.9562 0.009 0.1361
3
0.922 1.2827 0.09 1.1963
0.785 1.0579 0.01 0.1492
0.686 0.8955 0.01 0.1492
* Para el flujo de 1.8 ml/min tuvimos que hacer un promedio de los dos valores de
absorbancia y tomar este promedio para hallar el X (g/L) (1.2015) como valor para
nuestro grafico Nº 3 y Nº 4.
* Los valores que se encuentran de color rojo, son los valores que se han tomado en
cuenta para el grafico Nº 3 y Nº 4.
CUADRO Nº 5: VALORES TOMADOS DE X y S PARA LAS GRAFICAS Nº 3 y
Nº4.
µ=D (h-1) X (g/L) S (g/L)
0.0706 1.2401 0.1361
0.1059 1.1908 0.1492
0.1588 1.2015 0.5419
0.2206 1.0464 0.1361
0.2647 1.0579 1.1963
0.4520 0 5.93
44
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
GRAFICA Nº3: CULTIVO CONTINUO AIREADO
CULTIVO CONTINUO AIREADO
0.0000
0.2000
0.4000
0.6000
0.8000
1.0000
1.2000
1.4000
0.0706 0.1059 0.1588 0.2206 0.2647 0.452
D (h-1)
Bio
mas
a X
(g
/L)
0.0000
1.0000
2.0000
3.0000
4.0000
5.0000
6.0000
Su
stra
to S
(g
/L)
X (g/L)
S (g/L)
GRAFICA Nº 4: CULTIVO CONTINUO AIREADO CON LINEA DE
TENDENCIA
Cultivo Continuo Aireado
0.0000
0.2000
0.4000
0.6000
0.8000
1.0000
1.2000
1.4000
0.0706 0.1059 0.1588 0.2206 0.2647 0.452
D (h-1)
Bio
mas
a X
(g
/L)
0.0000
1.0000
2.0000
3.0000
4.0000
5.0000
6.0000
Su
stra
to S
(g
/L)
X (g/L)
Linea Tendencia
S (g/L)
Linea Tendencia
45
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
Los valores tomados en el laboratorio se supone que sebe ser el mismo para cada estado
estacionario por tener una alimentación constante de sustrato; se tomaron para el grafico
Nº3 y Nº4 se encuentran en el cuadro Nº 4, y el criterio que tuvo el grupo para escoger
estos valores fue por lo siguiente; inicialmente tomamos el promedio de estos valores
pero al ver que no nos proporcionaba una grafica adecuada ni dada por referencias
bibliografícas; decidimos en el caso de sustrato que tenia que ir aumentado la
concentración y en el caso de biomasa disminuir tomando valores que se ajusten a la
curva dada por referencias bibliograficas.
Si observamos el grafico anterior Nº 3 y Nº 4 podemos comprobar que en los resultados
si hay un aumento de la velocidad de dilución (D), entonces menor será la
concentración de biomasa, por consiguiente tendremos una mayor concentración de
sacarosa cuando aumentemos la velocidad de dilución ya que al formase menos biomasa
consumirán menos sacarosa. Esto se puede contrastar con las siguientes bibliografías:
“La productividad de biomasa de 1,61 g / L • h en estado puro
hidrolizado a pH 4 y 38 ° C, a una tasa de dilución de 0,1 h -1, fue
mayor que el valor de 1,13 g / L • h obtenido en el 50% diluido en el
hidrolizado El mismo pH y la temperatura, pero a una tasa de dilución
de 0,15 h-1. No substrato de carbono residual fue detectado en
ninguna de las anteriores condiciones de cultivo”. (Cultivo en
Quimiostato de Candida blankii en Bagazo de la caña de azúcar
hemicelulosa hidrolizado P.S. Meyer, J.C. du Preez, * y S.G. Filian).
Otro autor nos menciona:
46
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
“En la Figura se aprecia la disminución en la concentración de
biomasa conforme aumenta el valor de la tasa de dilución, pasando
de un valor inicial de 3,3 g/L para una tasa de dilución de cero, que
corresponde a una operación del sistema en forma “batch”, hasta una
concentración de 0,2 g/L para una tasa de dilución igual a 0,5 h-1.
Para la última tasa de dilución (0,5 h-1), la concentración de azúcares
totales en el medio de cultivo se mantuvo aproximadamente igual a
la concentración del medio de cultivo fresco con que se alimenta el
proceso, indicando que la operación del sistema continuo tuvo lugar
con una tasa de dilución lo suficientemente alta que provocó el
lavado de células o producto, lo cual se debe evitar.
La tasa máxima de dilución, Dmax, con un valor de 0,19 h–1, se obtuvo gráficamente
donde las curvas de concentración de biomasa y sustrato en la Figura 5, se interceptan.
De igual forma, la tasa de dilución crítica, Dcri, corresponde al valor aproximado de
0,30 h-1, este valor tiene lugar donde la concentración de azúcares totales en el medio
de cultivo comienza a mantener un valor constante y similar a la concentración de
azúcares totales del medio de cultivo fresco, además, se da inicio al lavado de células.
Ambos parámetros son posibles de conocer a partir de los resultados cinéticos
obtenidos previamente”. (Evaluación de parámetros cinéticos para la
Sacharomyces cerevisiae utilizando agua de coco como sustrato. Oscar
Ramírez Sánchez).
DETERMINACION DE μmax Y Ks EN LOS ESTADOS ESTACIONARIOS:
CUADRO 6: DATOS PARA LA DETERMINACION DE μmax Y Ks
S (g/L) 1/S D(h-1) 1/D
0.1361 7.3475 0.0706 14.1643
47
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
0.1492 6.7024 0.1059 9.4429
0.5419 1.8454 0.1588 6.2972
1.1963 0.5895 0.2647 3.7779
GRAFICO Nº 5: CURVA DE μmax Y Ks EN LOS ESTADOS ESTACIONARIOS
Para determinar m y Ks se deben obtener datos de varios estados estacionarios, lo que
permite construir experimentalmente un grafico tipo Monod. En principio, de este
grafico se podría calcular Ks como el valore de S al cual = m/2 ya que:
m/2 = m*(S/(Ks+S) y
S = Ks
Por otra parte m se podría calcular del grafico como el mayor valor de , lo que
equivale a su valor asintótico. Sin embargo el valor así estimado resulta muy impreciso,
lo cual repercute en el calculo de Ks, que es un numero sensible a pequeñas variaciones,
por lo que esta forma de calculo no es recomendable.
Una mejor forma de determinar m y Ks es graficando los valores recíprocos de = D y
S, obteniendo un m del intercepto de la recta con el eje de 1/ y Ks del intercepto con
el eje de 1/S o de la pendiente Ks/m. este método es formalmente inobjetable, pero aun
asi los valores obtenidos pueden presentar variaciones apreciables. Ello es debido a que
48
DETERMINACIÓN DE µm Y Ks EN LOS ESTADOS ESTACIONARIOS
y = 1.221x + 3.3885
0.0000
2.0000
4.0000
6.0000
8.0000
10.0000
12.0000
14.0000
16.0000
0 1 2 3 4 5 6 7 8
1/S
1/D Datos dispersos
Lineal (Datosdispersos)
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
los datos experimentales se ubican relativamente alejados de los ejes, por ser ellos
valores recíprocos. Por lo tanto pequeñas diferencias en la pendiente de la recta trazada
se amplifica notoriamente en la intersección y afecta de m. también es importante el
hecho que obtener 5 o 6 estados estacionarios requiere de una semana o más de trabajo.
(copias de ingeniería de fermentación y enzimas – Ing Augusto Castillo)
Ecuación para determinar el m y el Ks:
y = 1.221x + 3.3885
El m se calcula intersectando la recta con el eje Y(1/D):
1/m = 3.3885
Entonces:
m = 0.295 h-1
El Ks se calcula de la pendiente de la recta:
Pendiente = Ks/m
Entonces:
Ks = m * 1.221
Ks = 0.36h-1
La velocidad de crecimiento en los microorganismos es función del nutriente limitante,
la velocidad de adición de medio determina la velocidad de crecimiento del
microorganismo y el sistema está autorregulado.
De acuerdo al trabajo de investigación de otro autor. “el crecimiento de Kluyveromyces
marxianus en lactosuero, dicho medio estuvo caracterizado por una fase exponencial
con una duración de 6 a 7 horas aproximadamente .El valor de la velocidad máxima de
crecimiento específico (μmax) fue de 0,42 h–1 (promedio de 5 procesos fermentativos
independientes) lo que corresponde a un tiempo de generación de 1,65 h ”. (5)
“La concentración de biomasa alcanzada al final del crecimiento osciló entre 3,67 y
4,65 g/L, consumiéndose casi la totalidad de la lactosa, con un valor promedio de
93,21%, correspondiente a 14,6 g/L. Estos datos permitieron calcular el rendimiento en
biomasa referido a lactosa consumida, el cual osciló entre 0,28 y 0,33 g/g. Es
importante destacar que los valores de los distintos parámetros de cultivo determinados
en el presente estudio guardan cierta similitud con los reportados por otros autores a
49
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
pesar de que en algunos casos las condiciones de operación fueron marcadamente
diferentes. Así, Vananuvat y Kinsella [36], utilizando tanques agitados reportan valores
de μmax en el rango de 0,35 h–1 y 0,44 h–1 para velocidades de agitación de 300 rpm y
700 rpm respectivamente; Castillo y Sánchez [3], empleando fiolas agitadas obtienen
valores de μmax de 0,41 h–1 a 35°C, y Chinappi y Sánchez [5] hicieron
determinaciones de μmax entre 0,34 y 0,62 h–1, al emplear diversos tipos de
biorreactores operados a altas tasas de aireación y agitación.” (5)
En nuestra investigación obtuvimos un m = 0.295 h-1 a una agitación de 200rpm.
DETERMINACIÓN DEL COEFICIENTE DE MANTENCIÓN REAL:
CUADRO 7:
D(h-1) y(x/y) qs
0.0706 0.2098 0.3365
0.1059 0.2057 0.5149
0.1588 0.2112 0.7520
0.2206 0.1910 1.1552
0.2647 0.2335 1.1334
GRAFICO 6: CURVA DEL COEFICIENTE DE MANTENCION REAL
50
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
DETERMINACION DEL COEFICIENTE DE MANTENCIÓN REAL
y = 4.4681x + 0.0451
R2 = 0.9531
0.0000
0.2000
0.4000
0.6000
0.8000
1.0000
1.2000
1.4000
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3
D(h-1)
qs(
g/g
*h)
qs
Lineal (qs)
Ecuación para determinar el coeficiente de mantencion:
y = 4.4681x + 0.0451
El coeficiente de mantencion se calcula del intercepto de la recta con el eje qs.
m = 0.0451
m = coeficiente de mantencion.
DETERMINACION DE µm POR LAVADO (F = 12 g/L)
CUADRO Nº 8: DATOS PARA EL µm POR LAVADO
Fecha Hora Absorbancia X LNX Tiempo
d/m/a (h) (640 nm) (g/L)
07/03/2008 08:00 a.m. 0.723 0.9562 -0.044802392 0
07/03/2008 08:30 a.m. 0.643 0.8249 -0.192481296 0.5
07/03/2008 09:00 a.m. 0.553 0.6772 -0.38975393 1
07/03/2008 09:30 a.m. 0.407 0.4376 -0.826350435 1.5
07/03/2008 10:00 a.m. 0.301 0.2637 -1.332935594 2
07/03/2008 10:30 a.m. 0.236 0.1570 -1.851256568 2.5
07/03/2008 11:00 a.m. 0.181 0.0668 -2.706246774 3
GRAFICA Nº7: CURVA DE µm POR LAVADO X(g/L) vs T (h)
51
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
DETERMINACION DE µm POR LAVADO
0.0000
0.2000
0.4000
0.6000
0.8000
1.0000
1.2000
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
TIEMPO (h)
[ ]
BIO
MA
SA
(g
/L)
GRAFICA Nº 8: CURVA DE µm POR LAVADO LnX vs T (h)
DETERMINACION DE µm POR LAVADO (F = 12 g/L)
-3
-2.5
-2
-1.5
-1
-0.5
0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
Tiempo (h)
Ln
X
GRAFICA Nº 9: DETERMINACION DE µm POR LAVADO; POR LA
PENDIENTE
52
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
DETERMINACION DE µm POR LAVADO
y = -0.8521x + 0.3597
R2 = 0.9776
-2
-1.8
-1.6
-1.4
-1.2
-1
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
TIEMPO (h)
Ln
(X)
Serie1
Lineal (Serie1)
Así como se calcula el m por el método de los estados estacionarios, otra alternativa es
el denominado método del lavado, que consiste en aumentar el valor de D de un cultivo
en estado estacionario sobre el Dc, de forma de producir intencionalmente l lavado y
graficar los datos obtenidos en la forma de LnX vs tiempo.
En la situación de lavado rige la ecuación diferencial:
m = D + ((1/X)*(dX/dt)) = D + (dLnX/dt)
Y dado que D es mayor al Dc las células crecerán a su máxima velocidad m.
Por lo tanto m se calcula determinando la pendiente de un grafico LnX vs tiempo,
restándola (la pendiente es negativa) del valor de D escogido para producir el lavado. El
experimento debe prolongarse lo suficiente para obtener una buena recta dejando de
lado los primeros puntos que corresponden a un periodo transitorio de ajuste a las
nuevas condiciones. El valor de m obtenido del lavado es tan bueno como lo es su
determinación a partir de la fase de crecimiento exponencial de un cultivo por lotes. En
ambos casos se trata solo de una aproximación, ya que m es un límite teórico ( a
infinita concentración de sustrato) y no se la puede medir directamente, sino que
aproximar u obtener por extrapolación, como en el método de los recíprocos. El valor
obtenido por el método e lavado más bien es Dc que m.
53
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
Ecuación para determinar el μmax por el lavado:
y = -0.8521x + 0.3597
μmax = D – pendiente
μmax = 1.0588 + (-0.8521)
μmax = 0.2067 h-1
Teóricamente, el kluyveromyces marxianus presenta un µ =0.48 h-1 pero como se puede
notar el µ calculado prácticamente, es mucho menor que el teórico, esto debido a que la
excesiva fase de latencia por las condiciones que no fueron las favorables, ya que el
volumen del matraz empleado ha sido muy pequeño, el cual no permitió una aireación
correcta por el área de contacto de la muestra con el aire, todos estos propiciaron que el
tiempo de fermentación se incrementara de forma notable, y con estos resultados el µ
=0.55 h-1 . Una consecuencia de las ecuaciones que describen el quimiostato simple es
que la velocidad máxima de dilución esta limitada a un valor ligeramente menor que la
velocidad máxima de crecimiento especifico um .Esta se denomina velocidad de dilución
critica para el lavado ,Dc. El lavado tiene lugar cuando las celulas estan siendo sacadas del
fermentador a una velocidad Dc.xvo que es igual a la velocidad maxima uxvo-dc xvo a la que
pueden crecer en el fermentador, de forma que el unico valor estable para la
concentración de celulas es cero. En el lavado el estado de equilibrio es aquel en el que no
existen celulas o crecimiento y el substrato pasa sin cambio por el fermentador.
Para poder determinar el F =12 ml/min tomamos como referencia la grafica:
54
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
Determinando el Dc= µm = 0.452 y con este valor podemos calcular el F de lavado
F = V*Dc
F = 680ml*0.452h-1*1/60
F = 5.12 ml/min, este seria el flujo de lavado a utilizar porque si observamos en el
grafico a un Dc la concentración de biomasa se hace cero con lo cual realizamos el
lavado, pero para poder garantizar el verdadero lavado en la practica tomamos un F
mucho mayor que el teórico y este F = 12 ml/min
Comparando los m del cultivo por lote, m de los estados estacionarios y el m del
lavado podemos ver que este ultimo es mucho menor que los otros esto debido
justamente que en el lavado el crecimiento es mas lento porque se esta sometiendo a una
velocidad de dilución mas grande en comparación a los otros.
El μma en los estados estacionarios es menor que en el por lote debido a la existencia del
Ks, y mientras sea mayor el valor de μ será menor.
PERTURBACION DE E.E (Incremento) [Sacarosa] = 15g/L
CUADRO Nº 9 perturbación por sacarosa en el experimento nº 5.
F (ml/min)
Tiempo
(h) Absorbancia X (g/L) X (g/L) Absorbancia S (g/L)
Experiencia 0 0.686 0.8955 0.8955 0.18 1.19634
N° 5 2 0.806 1.0924 1.0924 0.102 0.68586
F = 3 4 0.93 1.2959 1.2959 0.013 0.10340
6 0.961 1.3467 1.3467 0.015 0.11649
8 0.71 0.9349 1.8697 0.005 0.05105
10 0.641 0.8216 1.6433 0.006 0.05759
12 0.721 0.9529 1.9058 0.009 0.07723
............. Dilución: 1:2
CUADRO Nº 10
Tiempo (h) X (g/L) S (g/L)
0 1.2827 0.6073
55
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
2 0.8955 1.1963
4 1.0924 0.6859
6 1.2959 0.1034
8 1.3467 0.1165
10 1.8697 0.051
12 1.6433 0.0576
14 1.9058 0.0772
GRAFICA Nº10 perturbación por sacarosa
PERTURBACIÓN POR [ ] SACAROSA [ ] BIOMASA VS [ ] SACAROSA
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
0 2 4 6 8 10 12 14
TIEMPO (h)
[ ]
SA
CA
RO
SA
(g
/L)
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
[ ]
BIO
MA
SA
(g
/L)
S (g/L)
X (g/L)
De acuerdo al gráfico Nº 10 observamos que la sacarosa es el nutriente limitante. Donde
en las dos primeras horas la sacarosa actúa inhibiendo ala producción de biomasa
(inhibición por sustrato), demorando un tiempo de 2 horas para adecuarse al medio con
alta concentración de sustrato, después de 4 horas la biomasa empezó a aumentar
56
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
consumiendo el sustrato agregado, siendo el sustrato a partir de la 4 y 5 hora inverso
ala producción de biomasa.
PERTURBACION DE E.E (Disminución) [(NH4)2SO4] = 1g/L
CUADRO Nº 11
F (ml/min) Absorbancia X (g/L) Absorbancia S (g/L)
Experiencia 0.856 1.1744 0.02 0.149215
N° 4 0.882 1.2171 0.04 0.280105
F = 2.5 0.852 1.1679 0 0.018325
Ecuación para determinar la biomasa:
Y= 0.6094X + 0.1403
Ecuación para determinar la [ ] de sacarosa:
Y= 0.1528X - 0.0028
GRÁFICO Nº 11
57
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
PERTURBACION DE E.E POR NITROGENO
0.0000
0.2000
0.4000
0.6000
0.8000
1.0000
1.2000
1.4000
0.0706 0.1059 0.1588 0.2206 0.2647 0.452
D (h-1)
X (
g/L
)
0.0000
1.0000
2.0000
3.0000
4.0000
5.0000
6.0000
7.0000
S (
g/L
)
X (g/L)
Linea tendencia
S (g/L)
Linea tendencia
En el grafico Nº 11 se observa que el nitrogeno no es sustrato limitante, cuando se
disminuyo el nitrógeno en el medio, la concentración de biomasa no se vio afectada
porque aumento de 1.0497g/l a 1.2171 g/l, pero según las bibliografías es importante
la agregación de nitrógeno al medio, esto no se vio afectado porque en el extracto de
levadura contiene nitrógeno con 7 aminoácidos esenciales. (6). Ya vez el extracto de
levadura es precursor en el crecimiento de levaduras.
Hablar del ph
CUADRO Nº 12
F
(ml/min) Absorbancia X (g/L) Absorbancia S (g/L)
2.50.778 1.0464 0.006 0.0576
0.723 0.9562 0.009 0.0772
58
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
CONCLUSIÓN
Kluyveromyces marxianus ATCC-16045, es una levadura fermentativa que
necesitan los azúcares para su catabolismo, es decir para obtener la energía
necesaria para sus procesos vitales, pero además necesitan otros substratos para
su anabolismo como son nitrógeno, fósforo, carbono, azufre, potasio y
magnesio ; además de las vitaminas, proteínas y aminoácidos ( proporcionadas
por el extracto de levadura ), además de sales .Por ello es de vital importancia
que el medio disponga de una base nutricional adecuada.
Para el crecimiento celular aireado en quimiostato para una cepa de
Kluyveromyces marxianus ATCC-16045, la sacarosa es un nutriente limitante.
Para el crecimiento celular aireado en quimiostato para una cepa de
Kluyveromyces marxianus ATCC-16045, el nitrógeno no es un nutriente
limitante.
Los parámetros obtenidos experimentalmente para nuestra cinética de
crecimiento son : μmax = 0.2067 h-1(Operación en condición de lavado),
m = 0.295 h-1 y Ks = 0.36h-1(Operación en los 5 estados estacionarios), qs =
0.0451
Los parámetros óptimos para la fermentación de la sacarosa en quimiostato con
Kluyveromyces marxianus ATCC-16045 son a una a una temperatura de 30ºC
en baño María, además de un pH entre 5.5 y 6, y utilizando un VVM de 200
ml/min para un volumen de 680 ml del fermentador, Además el rango de la
velocidad de dilución debe encontrarse entre 0.0452 h-1 < D < 0.3616 h-1 (Para
un μmax=Dc=0.452 h-1).
59
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
El tiempo de muestreo para la fermentación del cultivo por lotes fue de 10 hr y
se ha considerado los 2/3 del crecimiento logarítmico igual a 4h
RECOMENDACIÓN
Es necesario controlar las variables más importantes del medio de cultivo, por
medio de controladores que permitan que las condiciones del medio de cultivo
se mantengan estables. Al igual que el control, la instrumentación es importante
para conocer los valores de las variables que se requieren controla.
El birreactor debe tener los siguientes controladores como ,Controladores PID
lazos simples de realimentación, Control de Producto, Control de Sustrato,
Control de Biomasa:
Bibliografia
http://www.monografias.com/trabajos11/sara/sara.shtml
http://www.unsa.edu.ar/matbib/hongos/09htextolevaduras.pdf
(1)OPTIMIZACIÓN DEL PROCESO DE EXTRACCIÓN DE LA
LACTASA DE Kluyveromyces marxianus ATTC 8554, PARA SU
APLICABILIDAD EN LA INDUSTRIA LÁCTEA Departamento
de Biología, Facultad Experimental de Ciencias, Universidad del
Zulia, Apartado 526. Maracaibo, Estado Zulia, Venezuela. E-mail:
[email protected]; [email protected].
(2)OBTENCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE DOS
CONCENTRADORES PROTEICOS A PARTIR DE BIOMASA
DE KLUYVEROMYCES MARXIANUS VAR. MARXIANUS
CULTIVADA EN SUERO LÁCTEO DESPROTEINIZADO
Marta Elena Cori de Mendoza1, Nilo Rivas2, Blas Dorta3,
60
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
Emperatriz Pacheco de Delahaye4 y Antonio Bertsch51,2,4,5Instituto
de Química y Tecnología, Facultad de Agronomía, Universidad
Central de Venezuela, Apdo. 4579. Maracay, 2101, Venezuela. E-
mail: [email protected] . Telf: (0243)-2465360,5507304. 3Instituto de Biología Experimental, Facultad de Ciencias, UCV.
Scriban, R. (1984). Biotecnología. Segunda edición. Editorial El
Manual Moderno, S.A. México.
(3)Instituto Tecnológico y de Estudios Superiores de Occidente, A
J BULOCK; B.KRISTIANSEN. biotecnologia básica.
1991.primera edición .editorial acriba S.A, zaragoza españa.
(4) Paper Agronomía sudamericana universidad de costa rica,
selección de una levadura para la producción de
biomasa ,crecimiento en suero de leche. 2006
(5) Revista Científica, FCV-LUZ / Vol. XVI, Nº 3, 315 - 324, 2006
OBTENCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE DOS
CONCENTRADOSPROTEICOS A PARTIR DE BIOMASA
DE Kluyveromyces marxianus var. marxianus CULTIVADA EN
SUERO LÁCTEO DESPROTEINIZADO.
P.S. Meyer, J.C. du Preez, * y S.G. KilianCultivo en Quimiostato
de Candida blankii en Bagazo de la caña de azúcar hemicelulosa
hidrolizado
(6) Las tesinas Belgrano UNIVERSIDAD DE BELGRA ,Facultad
de Ciencias Exactas y Naturales, Carrera de Licenciatura en Farmacia
61
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
Estudio de algunas características de las cepas de levaduras y de su
rendimiento celular utilizando un medio de cultivo a base de suero lácteo
62
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
Diseño del medio de cultivo
63
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
Tabla Nº 1: Composición de medio sólido de mantención (para 50 ml de solución)
NutrientesSo
(g/l)
So
(g/50ml)
Extracto de Levadura 10 0.50
Extracto de malta 20 1.00
Peptona 20 1.00
Agar 20 1.00
Tabla Nº 2: Composición de medio de Activación (para 20 ml de solución)
Elemento Nutriente %Célula %Nutriente Yx/s So(g/L) So(g/20ml)
C Sacarosa
C12H22O11
52 42.10 0.505 5.94 0.1188
N Extracto de
Levadura------ ------ ------ 2.50 0.0500
Mg Sulfato de
magnesio
heptahidratado
MgSO4.7H2O
0.4 9.756 24.39 0.1845 0.0037
N Sulfato de amonio
(NH4)2SO4
9.0 21.212 2.3567 1.9095 0.0382
P Fosfato diacido de
potasio
KH2PO4
0.8 22.794 28.4925 0.1579 0.0032
K Fosfato diacido de
potasio
KH2PO4
2.52 28.676 11.38 0.3954 0.0079
Tabla Nº 3: composición del medio de fermentación y proliferación (para 68 ml de
solución)
64
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
Elemento Nutriente %Célula %Nutrient
e
Yx/s So(g/L) So(g/68ml)
C
Sacarosa
C12H22O1152 42.10 0.505 5.94 0.404
N
Extracto de Levadura------ ------ ------ 2.50 0.17
Mg
Sulfato de magnesio
heptahidratado
MgSO4.7H2O
0.4 9.756 24.39 0.1845 0.0125
N
Sulfato de amonio
(NH4)2SO49.0 21.212 2.3567 1.9095 0.1298
P
Fosfato diacido de potasio
KH2PO40.8 22.794 28.4925 0.1579 0.0107
K
Fosfato diacido de potasio
KH2PO42.52 28.676 11.38 0.3954 0.0269
Tabla N° 4: composición del medio de fermentación en el Quimiostato (para 680 ml de
solución)
Elemento Nutriente %Célula %Nutrient
e
Yx/s So(g/L) So(g/680ml)
C Sacarosa
C12H22O1152 42.10 0.505 5.94 4.0392
N Extracto de Levadura------ ------ ------ 2.50 1.70
Mg Sulfato de magnesio
heptahidratado
MgSO4.7H2O
0.4 9.756 24.39 0.1845 0.1255
N Sulfato de amonio
(NH4)2SO49.0 21.212 2.3567 1.9095 1.2985
P Fosfato diacido de potasio
KH2PO40.8 22.794 28.4925 0.1579 0.1074
K Fosfato diacido de potasio
KH2PO42.52 28.676 11.38 0.3954 0.2689
65
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
Tabla N° 5: composición del medio de alimentación en el Quimiostato (para 2.4 L
de solución)
Elemento Nutriente %Célula %Nutriente Yx/s So(g/L) So(g/2.4L)
C Sacarosa
C12H22O11
52 42.10 0.505 5.94 14.256
N Extracto de
Levadura------ ------ ------ 2.50
6
Mg Sulfato de
magnesio
heptahidratado
MgSO4.7H2O
0.4 9.756 24.39 0.1845
0.4428
N Sulfato de amonio
(NH4)2SO4
9.0 21.212 2.3567 1.9095 4.5828
P Fosfato diacido de
potasio
KH2PO4
0.8 22.794 28.4925 0.15790.37896
K Fosfato diacido de
potasio
KH2PO4
2.52 28.676 11.38 0.39540.94896
Aireación: Estando el cultivo ya en el quimiostato, se tienen que tomar en
cuenta consideraciones tales como la velocidad del flujo de aire que ingresa. El
flujo de aire para una concentración de 3 g/ L. se tiene que:
Yo2 = Rendimiento de oxígeno en célula (0.5 – 2.0 g cel/ g O2)
Consideramos: Yo2 = 1.14 g cel/g O2 , ε = 0.25 (Eficiencia de
absorción)
y m = 0.452 h-1
66
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
Entonces reemplazamos datos:
NA = 1.192 g/ L. h
Por lo tanto la demanda de oxígeno para un crecimiento de X = 3 g/ l
; T = 30 ºC = 303 º K
VVM = 0.294 L/L.min.
Como el caudal del aire es: Qaire = VVM*Vmedio
Qaire = (0.3344L/Lmin)(0.680L)
Qaire = 0.2 L/min = 200 ml/min
Este último valor es la velocidad de aireación específica con la que se trabajara
para alcanzar la concentración deseada.
Obtención de la curva característica de crecimiento de una levadura
Para la obtención de esta curva, es necesario considerar 5 estados estacionaros.
Estados estacionarios:
Considerando que en estado estacionario se cumple que: µ=D
Calculo de parámetros de fermentación
67
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
Consideramos que para valores de D en un proceso de cultivo continuo
tenemos:
0.1Dcritico < D < 0.8 Dcritico
El valor de Dcritico = m obtenido en el cultivo por lote, entonces el intervalo
de D para el trabajo en el laboratorio es:
0.0452 h-1 < D < 0.3616 h-1
Por lo tanto los valores de F, para los siguientes estados estacionarios se
presenta en la siguiente tabla. Además tenemos un VL=680 ml.
Calculo del los tiempos de residencias mediante la siguiente formula:
= 1 / D , µ = D
Tiempo en que se logra el estado estacionario: t = 3 x
Para la estimación del gasto en alimentación hacia el quimiostato se
considera la siguiente formula, para los 5 e.e.:
Gi = Fi x Ti
Donde:
Gi: gasto
Fi: flujo
Ti: tiempo de fermentación.
Tabla Nº 6: Flujos para los 5 estados estacionarios
68
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
Nº e.e D (h-1) 3τ(h)F ( ml/
min)
Gasto
medio (ml)
1 0.0706 43 0.80 2064
2 0.1060 29 1.20 2088
3 0.1588 19 1.80 2052
4 0.2206 14 2.50 2100
5 0.2650 12 3.00 2160
Total 117 10464
Alcanzando un gasto total de alimentación para los 5 e.e. de 10.464 litros
que es equivalente a 10.5 litros.
Este último valor es la velocidad de aireación específica con la que se
trabajara para alcanzar la concentración deseada.
Obtención y caracterización de un estado estacionario bajo limitación por
nitrógeno.
Nutriente limitante: nitrógeno
Concentración celular final de 3 g/l
Control de pH a 6.
Para este estado estacionario consideraremos los siguientes datos:
D = 0.2206
Tabla Nº 7: Composición de alimentación para obtención de estado estacionario
por limitación de nitrógeno.
69
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
Element
oNutriente
%
célul
a
%
nutrient
e
Y x/s
(g/g)
So
(g/l)
So
(g/2.4l)
C Sacarosa
C12H22O11
52 42.10 0.505 8.91 21.38
N Extracto de Levadura------ ------ ------ 2.50 6
Mg Sulfato de magnesio
heptahidratado
MgSO4.7H2O
0.4 9.756 24.39 0.184
5
0.4428
N Sulfato de amonio
(NH4)2SO4
9.0 21.212 2.3567 1.0 2.4
P Fosfato diacido de
potasio
KH2PO4
0.8 22.794 28.4925 0.157
9
0.3789
6
K Fosfato diacido de
potasio
KH2PO4
2.52 28.676 11.38 0.395
4
0.9489
6
Antes de ingresar al flujo esterilizar el medio a 121ºC por 15 min.
51.1 Perturbación de un estado estacionario mediante aumento de la
concentración del nutriente limitante en la alimentación.
Habiéndose obtenido los cinco estados estacionarios en el crecimiento de la
levadura, se perturbara este estado aumentando la concentración de sacarosa
(Nutriente limitante) en la alimentación, con el cual el estado estacionario en
el que se encontraba terminará, dando lugar a un comportamiento logarítmico.
70
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
Tabla Nº 8: Composición de alimentación para la perturbación del medio por
sacarosa.
Este nuevo flujo tendrá una concentración de Sacarosa = 15.0 g/l. Para este
estado estacionario consideraremos los siguientes datos:
Elemento Nutriente %Célula %Nutriente Yx/s So(g/L) So(g/2.4l)
C Sacarosa
C12H22O11
52 42.10 0.505 15 36
N Extracto de
Levadura------ ------ ------ 2.50
6
Mg Sulfato de
magnesio
heptahidratado
MgSO47H2O
0.4 9.756 24.39 0.1845 0.4428
N Sulfato de amonio
(NH4)2SO4
9.0 21.212 2.3567 1.9095 4.5828
P Fosfato diacido de
potasio
KH2PO4
0.8 22.794 28.4925 0.15790.37896
K Fosfato diacido de
potasio
KH2PO4
2.52 28.676 11.38 0.39540.94896
Antes de ingresar al flujo esterilizar el medio a 121ºC por 15 min.
1. Determinación del contenido de azúcares reductores mediante el método del DNS.
La preparación del reactivo DNS se requiere de lo siguiente: 10 g /L de ácido 3,5 dinitrosalicilico (DNS) 200 mL / L de NaOH 2N 300 g/L de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado
71
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
Para la preparación de este reactivo, se disuelve el tartrato en aproximadamente 500 ó 600 mI de agua, paralelamente se disuelve el ácido DNS. Ambas soluciones se mezclan en un matraz aforado de 1 litro y se agita hasta la completa disolución de todos los componentes, para posteriormente aforar hasta un litro.
Se precisa realizar los siguientes pasos para el análisis de la muestra: Se añade un volumen del reactivo DNS a un volumen de muestra a
analizar. Se mantiene la mezcla en un baño de agua a ebullición durante 5
minutos para luego dejar enfriar. Se añaden 10 volúmenes de agua destilada. Se lee la absorbancia a 540 nm, utilizando agua como blanco.
La concentración se obtiene interceptando la medida de absorbancia en la curva de calibrado.La curva de calibrado para el azúcar se obtiene a partir de muestras de concentración conocida y analizadas según este procedimiento.
2. Determinación de la concentración celular por densidad óptica.
El método se basa en el aumentó de la turbidez del medio, al incrementarse la concentración de microorganismo s, esto puede ser detectado fácilmente por espectrofotometría a 640 nm. Para ésta determinación es necesario que previamente' se elabore una curva de calibrado, para lo cual las concentraciones de microorganismos en el medio son determinadas por peso seco de acuerdo al siguiente procedimiento:
1. Se toma una muestra de volumen conocido, y se centrifuga a 1200 rpm durante 20 minutos.
2. Se elimina el sobrenadante y se resuspende el centrifugado con agua destilada. 3.- Se vuelve a centrifugar en las mismas condiciones a fin de eliminar restos de sustrato que pudieran alterar la determinación.
3. Se elimina el sobrenadante, se redisueIve el precipitado y se seca en la estufa a 80°C hasta peso constante.
Hidrólisis de la sacarosa
La hidrólisis se realiza con la finalidad de liberar los extremos carbonilos del azúcar, para que estos puedan reducir al DNS y así cambiar su color y este cambio pueda ser medido con el espectrofotómetro:
1. Agregar 0.5mL de HCl concentrado a la muestra y agitar.2. Mantener la solución restante en baño maria a 60º por 10min.3. Enfriar la solución con hielo por 3 min.4. Neutralizar el acido agregando 3.5mL de NaOH 1.70N y agitar.5. Tomar 1 mL de la solución resultante y trabajar con DNS.
72
Laboratorio de Bioprocesos Ing.Agroindustrial - UNS
52.1 Determinación de la velocidad específica máxima de crecimiento mediante
lavado
Para poner en marcha esta actividad, comenzamos realizando los siguientes
pasos:
Cortar el flujo de alimentación, después de haber transcurrido el tiempo de
fermentación; en donde se alcanza una reducción de X y µ = µmax.= 0.452h-1
Utilizando la ecuación de balance general de células:
Obtenemos la gráfica Ln X vs. t.
Utilizando la siguiente fórmula: Ln(X/Xo) = (µ-D)t,
Luego trazamos una recta tangente a la curva, considerando un D >> µmax,
entonces D = 1, y obtenemos el µmax a través de la función tangente.
73