Cofactor engineeringCofactor engineering
Microbiologia industriale IIMicrobiologia industriale IIMetabolic Engineering (2002), Metabolic Engineering (2002), 44: 182-192: 182-192
Metabolic Engineering (2002), Metabolic Engineering (2002), 44: 217-229: 217-229
Metabolic Engineering (2003), Metabolic Engineering (2003), 55: 49-55: 49-55
Approccio usuale ingegneria metabolica
• Ottenere l’aumento della produttività manipolando l’output di alcuni pathways metabolici
• Alterazione dei livelli enzimatici– amplificazione, delezione o introduzione di geni
• Tuttora difficile considerare le dinamiche integrate e le strutture di controllo globali
I.M.I.M.
Nutrienti per biosintesi
Anabolismo
Macromolecole
Energia perbiosintesi
Catabolismo
Energiaper trasportonutrienti
Sostanze di scarto, prodotti di fermentazioneaccettori di elettroni ridotti
Chemicals, energia luminosa
Catabolismo Anabolismo
substrato
CO2 Biomassa
ATPATP
Catabolismo Anabolismo
substrato
scarti biomassa
ADPADPATPATP
NAD*NAD*NADHNADH
intermediintermedi
Il catabolismo porta intermedi, equivalenti riducenti e energia all’anabolismo, che produce biomassa
Definizione di un cofattore:
• molecola che partecipa alla reazione
• la sua struttura non è direttamente coinvolta nella formazione del prodotto
• non viene consumata
• passa da uno stato all’altro.
La quantità di cofattore presente all’interno della cellula è limitata : l’esempio del NAD(H/+)
• il NAD(H/+) è coinvolto in più di 300 reazioni metaboliche di ossidoriduzione
• nel catabolismo, una fonte di carbonio viene ossidata e si produce NADH
• in Escherichia coli la quantità di NAD(H/+) si stima attorno alle 10 moli per grammo di peso secco
necessità di rigenerazione: mantenere il bilancio redox
Importanza del bilanciamento redox sul metabolismo globale
Per ottenere 100 g biomassa calcolo le necessità biosintetiche (lievito in Per ottenere 100 g biomassa calcolo le necessità biosintetiche (lievito in anaerobiosi):anaerobiosi):669 mmoli Glucosio, 648 NADPH 1102 NADH669 mmoli Glucosio, 648 NADPH 1102 NADH
648/12=54 Glu648/12=54 Glu Formazione di glicerolo:Formazione di glicerolo:551 Glu551 Glu
551/1274 mmoli di glucosio “anabolico” sono spese per bilanciamento redox:551/1274 mmoli di glucosio “anabolico” sono spese per bilanciamento redox:si tratta del 43%!!si tratta del 43%!!
Se una reazione richiede cofattori, il processo globale dovrebbe risentire della disponibilità e della proporzione in forma attiva del cofattore.
LA MANIPOLAZIONE DEI COFATTORI DIVENTA LA MANIPOLAZIONE DEI COFATTORI DIVENTA CRUCIALE PER INCREMENTARE IL PROCESSOCRUCIALE PER INCREMENTARE IL PROCESSO
Come manipolare i cofattori?
• Ci sono vari esempi di manipolazione dei cofattori
• in generale, due strategie– manipolazione delle condizioni di crescita
– modifiche genetiche
Metabolismo centrale anaerobico in E. coli
Influenza della fonte di carbonio
GluconatoGluconato (+1) GlucosioGlucosio Sorbitolo (-1)Sorbitolo (-1)
Gluconato-6-P Glucosio-6-P
Fruttosio-6-P
Fruttosio-1,6-diP
Gliceraldeide 3P
Sorbitolo-1-P
PiruvatoPiruvato
NAD+
NADHNADH
PEP
Piruvato
ATP
ADP
ATP
ADP
PEP
Piruvato
NAD+
NADHNADH
Gluconate(+1) Glucose(0) Sorbitol(-1)
Substrate uptake 6.61 5.10 6.47Succinate 0.45 0.50 0.41Lactate 2.35 0.39 0.15Formate 2.35 2.29 3.48Ethanol 2.08 3.93 8.31Acetate 7.28 3.93 2.29Et/Ac 0.29 1.00 3.62NADH 4.57 4.17 6.45NAD+ 8.94 5.53 6.88
NADH/NAD+ 0.51 0.75 0.94
Total NAD(H/+) 13.5 9.7 13.3
Chemostati anaerobici
cambiano rapporti NADH/NAD+ ; EtOH/acetato. Ridistribuzione metabolica
Modificazioni genetiche
RICICLORICICLO
SINTESI DE NOVO
-
DH10B DH10B DH10B(pBCSK) (pPNCBIN) (pPNCBIM)
OD 1.200 1.305 0.702NAD+(mol/g DW) 14.49 22.22 31.39NADH(mol/g DW) 17.57 18.26 37.85NADH/NAD+ratio 1.21 0.82 1.21Total NAD(H/+) 32.06 40.48 69.24% change in totalNAD(H/+)
— 26 116
Incremento quantità NAD(H/+)
multicopia mutato
Introduzione di una FDH NAD- dipendente (C. boidinii)
PiruvatoPiruvato
Acetil-CoAAcetil-CoA
FormicoFormicoCOCO22
COCO22
HH22
COCO22
NADHNADH
FDH1
PDHPFL
FDHF
NADHNADH
Pathway originale NAD indipendente (FDHF formico deidrogenasi, NAD indipendente)
Nuovo pathway NAD dipendente (FDH1 formico deidrogenasi, NAD dipendente)
Pathway aerobico NAD dipendente (PDH piruvato deidrogenasi)
Anaerobiosi
• Effetto della presenza di una nuova FDH– aumento OD, consumo glucosio, etanolo, succinato
– diminuiscono lattato e acetato: et/ac aumenta fino a 36 volte
• Differenze tra wt e nuova– aumentano consumo glucosio, OD, etanolo e succinato
– calano acetato e lattato
• La nuova sembra competere con la vecchia: comportamento simile se ha solo eterologa o entrambe
Drastico cambiamento metabolico
• Deciso aumento NADH disponibile (raddoppia)
• Sono favoriti i prodotti ridotti, specialmente quelli che richiedono 2 NADH
• Etanolo diviene il maggior prodotto, 91% dei metaboliti prodotti
• Risultati simili si sono ottenuti clonando i geni di Zymomonas mobilis, ma qui non si è overespresso nessun enzima del pathway per l’etanolo
Incremento disponibilità NADH:caratterizzazione in aerobiosi
• Si induce produzione di etanolo, lattato, succinato, a differenza che nel wild type
• Ambiente più riducente, per bilancio redox si producono anche prodotti di fermentazione.
• La quantità di prodotti non spiega tutto il formato che sparisce: parte del NADH viene respirato.
Addizione acido formico in lievito
• Aumenta la disponibilità di NADH citoplasmatico
• Incremento della biomassa ceppo dipendente
• Produzione di etanolo!
Incremento quantità NAD(H) in lievito
Aumento produzione riboflavina
• Energia di mantenimento: la quantità di ATP che un microorganismo consuma per rimanere vitale e attivo, senza crescere.
• Produzione di riboflavina in Bacillus subtilis:– il pathway biosintetico è stato oggetto di molti studi e migliorie
(operoni multipli derepressi)
– la produzione sembra associata all’efficiente produzione di energia e a un basso metabolismo di mantenimento.
La catena respiratoria ramificata di B. subtilis
Ramo del citocromo c
Ramo della quinolo ossidasi
NADH
Menaquinone
Citc
aa3 ossidasi(qoxA-D)
caa3 ossidasi(ctaC-F)
bc ossidasi(qcrABC)
YthAB(ythAB)
bd ossidasi(cydAB)
NDH-II(YilD)
O2
H2O2H+/e
2H+/e
1H+/e
?H+/e
2H+/e
0H+/e
Strategia
• In dipendenza dalla composizione della catena respiratoria, per ogni elettrone trasportato sono traslocati tra 1 e 4 protoni
• La composizione è modulata dalle condizioni colturali
• La catena dei Bacilli interessanti industrialmente opera ben al di sotto del massimo valore teorico
REINDIRIZZARE IL FLUSSO DI ELETTRONI REINDIRIZZARE IL FLUSSO DI ELETTRONI VERSO LA VIA PIU’ EFFICIENTEVERSO LA VIA PIU’ EFFICIENTE
Maintenance e produzione
0.67 mmol gluc/0.67 mmol gluc/gDW/hgDW/h
0.39 mmol gluc/0.39 mmol gluc/gDW/hgDW/h
Dopo 48 h: incremento del 30% nella Dopo 48 h: incremento del 30% nella produzione di riboflavinaproduzione di riboflavina
Produzione di Isoamil acetato:alterazioni nella disponibilità del CoA
• Sintesi non naturale per E. coli
• Trasformato con gene AAT: alcol acetiltrasferasi
• Aggiunta esterna di alcol isoamilico
• Competizione per acetilCoA con le produzioni naturali EtOH e AcOH
Biosintesi CoA
• Oversepressione di PanK (Pantotenato kinasi), enzima limitante: aumenta tra il 125 e il 150% la concentrazione di CoA
Produzione di isoamilacetato
I flussi metabolici restano I flussi metabolici restano essenzialmente imperturbati, essenzialmente imperturbati, ma aggiungendo isoamilico si ma aggiungendo isoamilico si ottiene un buon incremento ottiene un buon incremento nella produzione di di nella produzione di di isoamilacetatoisoamilacetato
Concludendo
Le manipolazioni dei pool/flussi dei cofattori sono possibili con mezzi fisiologici e genetici,
e possono fornire un ulteriore mezzo per ottimizzare le applicazioni di ingegneria metabolica, sia da soli che accoppiati a modificazioni metaboliche “classiche”