1
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE TECNOLOGIA E GEOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE OCEANOGRAFIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM OCEANOGRAFIA
LABORATÓRIO DE CULTIVO E ECOTOXICOLOGIA
DELOAR DUDA DE OLIVEIRA
AVALIAÇÃO DA SENSIBILIDADE DO COPÉPODO TISBE
BIMINIENSIS PARA TESTES TOXICOLÓGICOS EM ÁGUA E
SEDIMENTOS ESTUARINOS.
Orientadora; Lília Pereira de Souza Santos
Co-orientador: Denis Moledo de Souza Abessa
Recife, 2011
2
MESTRADO EM OCEANOGRAFIA
AVALIAÇÃO DA SENSIBILIDADE DO COPÉPODO TISBE
BIMINIENSIS PARA TESTES TOXICOLÓGICOS EM ÁGUA E
SEDIMENTOS ESTUARINOS.
DELOAR DUDA DE OLIVEIRA
Orientadora: Lília Pereira de Souza Santos
Co-orientador: Denis Moledo de Souza Abessa
Recife, 2011
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Oceanografia da
Universidade Federal de Pernambuco,
como parte dos requisitos para
obtenção do título de Mestre em
Oceanografia.
Catalogação na fonte Bibliotecária Margareth Malta, CRB-4 / 1198
O48a Oliveira, Deloar Duda de. Avaliação da sensibilidade do copépodo Tisbe biminiensis para testes
toxicológicos em água e sedimentos estuarinos / Deloar Duda de Oliveira. - Recife: O Autor, 2011.
77 folhas, il., gráfs., tabs. Orientadora: Profª. Drª. Lília Pereira de Souza Santos. Co-Orientador: Prof. Dr. Denis Moledo de Souza Abessa. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CTG.
Programa de Pós-Graduação em Oceanografia, 2011. Inclui Referências Bibliográficas. 1. Oceanografia. 2. Ouriço. 3. Lytechinus variegatus. 4. Tisbe
biminiensis. 5. Nitokra sp. I. Santos, Lília Pereira de Souza (Orientadora). II. Abessa, Denis Moledo de Souza (Co-Orientador). III. Título.
UFPE 551.46 CDD (22. ed.) BCTG/2011-203
3
AVALIAÇÃO DA SENSIBILIDADE DO COPÉPODO TISBE BIMINIENSIS
PARA TESTES TOXICOLÓGICOS EM ÁGUA E SEDIMENTOS ESTUARINOS
Deloar Duda de Oliveira
Dissertação defendida e aprovada pela banca examinadora:
_______________________________________________
Profª. Drª. Lília Pereira de Souza Santos
(Orientadora Presidente da Banca)
_______________________________________________
Drª Cristiane Maria Varela de Araújo Castro
_______________________________________________
Profº. Drº. Paulo Sérgio Martins de Carvalho
(Universidade Federal de Pernambuco)
_______________________________________________
Profº. Drº. Mário Takayuki Kato
(Universidade Federal de Pernambuco)
_______________________________________________
Profª. Drª. Monica Ferreira Costa
(Universidade Federal de Pernambuco)
Recife, 2011
4
Let it be (John Lennon and Paul McCartney)
When I find myself in times of trouble
Mother Mary comes to me
Speaking words of wisdom, let it be...
And in my hours of darkness
She standing right in front of me
Speaking words of wisdom, let it be...
Let it be, let it be, let it be, let it be
Whisper words of wisdom, let it be...
And when the broken hearted people
Living in the world agree
There will be an answer, let it be...
For though they may be parted
There is still a chance that they will see
There will be an answer let it be...
Let it be, let it be, let it be, let it be
There will be an answer, let it be...
Let it be, let it be, let it be, let it be
Whisper words of wisdom, let it be...
Let it be, let it be, let it be, let it be
Whisper words of wisdom, let it be...
And when the night is cloudy
There's still a light that shines on me
Shine until tomorrow, let it be...
I wake up to the sound of music
Mother Mary comes to me
Speaking words of wisdom, let it be...
Let it be, let it be, let it be, let it be
There will be an answer, let it be...
Let it be, let it be, let it be, let it be
Whisper words of wisdom, let it be...
5
DEDICATÓRIA
Dedico esta dissertação a
minha avó Maria José, que
sempre me disse palavras doces
nos momentos de maior
aflição.
6
AGRADECIMENTOS
Bom gostaria de começar agradecendo a Deus por ter me concedido saúde e
força durante estes 24 meses para desenvolver esta Dissertação. Não foi fácil, e se
tivesse sido talvez não fosse tão importante.
À minha orientadora Lília que nos momentos mais difíceis soube me transmitir
palavras de carinho e conforto. E também me ajudou muito no meu amadurecimento
profissional e pessoal durante todo o processo.
Ao meu co-orientador Denis que me recebeu tão bem em seu laboratório e me
proporcionou aprendizado técnico e pessoal durante o período de estágio na UNESP/SV
– SP.
Ao Programa de Pós-Graduação em Oceanografia, que cedeu suas instalações
para que a dissertação fosse desenvolvida.
À FACEPE pelos 2 anos de bolsa concedidos e por também conceder o auxílio
para o estágio na UNESP/SV-SP.
À Jackson técnico que ajudou nas coletas em Santos e Carol por me deixar
realizar a coleta junto com as observações de quelônios na área portuária de Santos. Aos
alunos do professor Edimilson que ajudaram na coleta de sedimento em Suape.
À toda minha família pelo apoio, por saberem compreender os momentos de
ausência, por aturarem todos os momentos de stress e por me amarem. Afinal de contas,
não é fácil aguentar os altos níveis de stress proporcionado durante todo o processo.
Nossa família passou por algumas mudanças, no entanto, estas nos deixaram ainda mais
unidos. AMO vocês!!
À equipe de ecotoxicologia do LACE que me ajudou na realização dos
experimentos, bem como nas contagens e que viram de perto cada erro e cada acerto.
Bruno, Ari, Bia, Cris, sem a ajuda e a torcida de vocês não seria possível.
À todos os meus queridos integrantes do LACE, tenho orgulho de dizer que faço
parte de um laboratório onde as pessoas trabalham animadas.
7
À equipe de ecotox do NEPEA – UNESP/SV que me recebeu tão bem e que me
ajudou nos experimentos Tchuca (Marcela), Malária (Giuliana), Lucas, Daku (Renan),
Boto, Baiana (Tainá), Marina da Unisanta. Vocês fizeram meu estagio em São Viselva
ser bem alegre e divertido.
Às meninas da república Michele, Flora, Gabriela.
À Sarah que fez estágio comigo no NEPEA.
À Luciara da FURG que nos últimos 2 anos tem me ajudado a entender um
pouco mais sobre os Nitokras.
Aos meus amigos Debora, Rui, Rodrigo (Toquinho), Rafael Botelho, João
Raphael, Silvia, Felipe, Ana Virgínia, Danielle, Álvaro Rafael, Pedro Henrique,
Catarina, Adriana, Lucyana, Rogério que sempre estiveram dispostos a me ouvir mesmo
sem entender nada do que eu estava falando, afinal entender ecotox não é simples.
Agradeço de coração a cada um de vocês.
8
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Comparação da toxicidade entre Tisbe biminiensis e Nitokra sp nos
parâmetros analisados quando expostos aos sedimentos do complexo
Estuarino de Santos e São Vicente - SP........................................................64
Tabela 2: Comparação da toxicidade entre Tisbe biminiensis e Nitokra sp nos
parâmetros analisados quando expostos aos sedimentos do Sistema
Estuarino de Suape – PE...............................................................................65
Tabela 3: Comparação da toxicidade entre Tisbe biminiensis e Nitokra sp nos
parâmetros analisados quando expostos aos sedimentos da Ilha de Deus ,
Parque dos Manguezais - PE........................................................................65
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Localização dos pontos de amostragem de água superficial no Complexo
Estuarino de Suape - PE...............................................................................26
Figura 2: Sistema criado para eclosão de prole de copépodos.......................................28
Figura 3: Percentual de pluteus de Lytechinus variegatus bem formados em abril de
2009 quando expostos as amostras de água superficial do complexo
estuarino de Suape. As letras significam as diferenças estatísticas
encontradas pelo teste de Dunnett................................................................30
Figura 4: Percentual médio de náuplios, copepoditos e mortos respectivamente de
juvenis do copépodo Tisbe biminiesis ao término do experimento com as
amostras ambientais do Sistema Estuarino de Suape - PE. O asterisco
representa a diferença significativa encontrada pelo teste a posteriore de
Dunnett.........................................................................................................31
Figura 5: Percentual médio de pluteus bem formados de Lytechinus variegatus ao
término do experimento com as amostras ambientais do Sistema Estuarino
de Suape – PE de outubro de 2009. Os asteriscos mostram as diferenças
significativas encontradas pelo teste de Dunnet...........................................32
Figura 6: Percentual médio de náuplios, copepoditos e mortalidade de juvenis de Tisbe
biminiesis ao término do experimento com as amostras ambientais do
Sistema Estuarino de Suape – PE em outubro de 2009. Os asteriscos
representam a diferença significativa encontrada pelo teste a posteriore de
Dunnett.........................................................................................................33
Figura 7: Percentual médio de pluteus de Lytechinus variegatus bem formados ao
términodo teste com as amostras coletadas no Sistema Estuarino de Suape –
PE em dezembro de 2009. Os asteriscos indicam as diferenças significativas
encontradas pelo teste de Dunnett..........................................34
Figura 8: Percentual médio de náuplios, copepoditos e mortalidade de juvenis de Tisbe
biminiesis ao término do experimento com as amostras ambientais do
10
Sistema Estuarino de Suape – PE em dezembro de 2009. Os asteriscos
representam a diferença significativa encontrada pelo teste a posteriore de
Dunnett.........................................................................................................35
Figura 9: Percentual médio de náuplios, copepoditos e mortalidade de juvenis de Tisbe
biminiesis ao término do experimento com as amostras ambientais do
Sistema Estuarino de Suape – PE em fevereiro de 2010. Os asteriscos
representam a diferença significativa encontrada pelo teste a posteriore de
Dunnett.........................................................................................................36
Figura 10: Localização dos locais de coleta de sedimento no Sistema Estuarino de
Santos e São Vicente – SP............................................................................46
Figura 11: Localização dos pontos de amostragem de sedimento no Sistema Estuarino
de Suape – PE...............................................................................................47
Figura12:Localização do ponto de amostragem de sedimento no Parque dos
Manguezais...................................................................................................48
Figura 13: Localização do ponto de amostragem do sedimento controle no manguezal
da praia de Maracaípe, Ipojuca – PE.........................................................49
Figura 14:Percentual médio de Tiburonella viscana vivos ao término do
experimento..................................................................................................54
Figura 15:Percentual de fêmeas de Tisbe biminiensis vivas ao término do experimento
com os sedimentos do Sistema Estuarino de Santos e São Vicente - SP. O
asterisco representa a diferença encontrada pelo teste de Dunnett...............55
Figura 16: Fecundidade Total (náuplios + copepoditos) de Tisbe biminiensis ao término
do experimento com os sedimentos do Sistema Estuarino de Santos e São
Vicente - SP..................................................................................................56
Figura 17: Taxa de Eclosão (Fecundidade/sobrvivência) de Tisbe biminiensis ao
término do experimento com os sedimentos do Sistema Estuarino de Santos
e São Vicente - SP........................................................................................56
11
Figura18: Percentual de sobrevivência de fêmeas de Nitokra sp vivas ao término do
experimento com os sedimentos do Sistema Estuarino de Santos e São
Vicente – SP................................................................................................57
Figura 19: Fecundidade total (náuplios + copepoditos) de Nitokra sp ao término do
experimento com os sedimentos do Sistema Estuarino de Santos e São
Vicente - SP. Os asteriscos representam as diferenças significativas
encontradas pelo teste de Dunnett................................................................57
Figura 20: Taxa de eclosão (Fecundidade/sobrevivência) de Nitokra sp ao término do
experimento com os sedimentos do Sistema Estuarino de Santos e São
Vicente – S. Os asteriscos são as diferenças significativas econtradas pelo
teste de Dunnett............................................................................................58
Figura 21: Percentual de sobrevivência de fêmeas de Tisbe biminiensis ao término do
experimento com os sedimentos do Sistema Estuarino de Suape – PE........59
Figura 22: Fecundidade total (náuplios+copepoditos) de Tisbe biminiensis ao término
do experimento com os sedimentos do Sistema Estuarino de Suape. Os
asteriscos representam as diferenças significativas encontradas pelo teste de
Dunnett.........................................................................................................59
Figura 23: Taxa de eclosão (fecundidade/sobrevivência) de Tisbe biminiensis ao
término do experimento com os sedimentos do Sistema Estuarino de Suape -
PE. O asterisco representa a diferença encontrada pelo teste de Dunnett..60
Figura 24: Percentual de sorbevivência das fêmeas de Nitokra sp ao término do
experimento com os sedimentos do Sistema Estuarino de Suape - PE.......61
Figura 25: Fecundidade total (náuplios+copepoditos) de Nitokra sp ao término do
experiemnto com os sedimentos do Sistema Estuarino de Suape - PE. Os
asteriscos representam as diferenças encontradas pelo teste de Dunnett.....61
Figura 26: Taxa de eclosão (fecundidade/sobrevivência) de Nitokra sp ao término do
experimento com os sedimentos do Sistema Estuarino de Suape. Os
asteriscos representam as diferenças encontradas pelo teste de Dunnett....62
12
Figura 27: a – Percentual de fêmeas de vivas, b- Fecundidade total (náuplios +
copepoditos) e c- Taxa de eclosão (fecundidade/sobrevivência) de Tisbe
biminiensis ao término dos experimentos com os sedimentos do Sistema
Estuarino de Suape. Os asteriscos representam a diferença significativa
encontrada no teste ―t‖..................................................................................63
Figura 28: a – Percentual de fêmeas de vivas, b- Fecundidade total (náuplios +
copepoditos) média e c- Taxa de eclosão (fecundidade/sobrevivência) média
de Nitokra sp ao término do experimento com os sedimentos do Sistema
Estuarino de Suape - PE. Os asteriscos representam a diferença significativa
encontrada no teste ―t‖....................................................................................64
13
RESUMO GERAL
Testes de toxicidade são uma ferramenta efetiva na análise da qualidade de água e
sedimentos marinhos e estuarinos. O ouriço do mar Lytechinus variegatus é um dos
organismos mais utilizado de toxicidade da água, no entanto, ao longo da costa
nordestina as populações encontram-se reduzidas e o desenvolvimento de um modelo
biológico sensível para a avaliação ecotoxicológica da água faz-se necessário. O teste
crônico com náuplios de Tisbe biminiensis consiste na exposição dos náuplios durante
48h ou até que 50% dos indivíduos do controle sejam copepoditos. As amostras
ambientais utilizadas nos testes foram coletas no Complexo Estuarino de Suape em 5
diferentes pontos . Já para os testes com sedimentos com a finalidade de observar se há
diferença entre os copépodos T. biminiensis e Nitokra sp quando expostas aos mesmos
sedimentos, foram escolhidos 3 locais com toxicidade anteriormente comprovada, são
eles: os Complexos estuarinos de Santos e São Vicente (Alemoa, Cosipa/Usiminas,
Marina e Mariana), Suape e Parque dos Manguezais (Ilha de Deus).. De modo geral os
náuplios de T. biminiensis demonstraram o mesmo padrão de resposta dos ouriços e em
algumas ocasiões uma maior sensibilidade. Já para os testes com sedimento também foi
observado quem os copépodos apresentam padrão de sensibilidade semelhante e em
alguns experimentos Nitokra sp demonstrou maior sensibilidade ao sedimento exposto.
Logo, náuplios do copépodo T. biminiensis podem ser utilizados com sucesso na
avaliação da toxicidade de amostras ambientais de água do mar/estuarinas. E testes com
os copépodos T. biminiensis e Nitokra sp mostram um padrão de sensibilidade
relativamente semelhante
Palavras chave: ouriço, Lytechinus variegatus, Tisbe biminiensis, Nitokra sp
14
ABSTRACT
Toxicity tests are an effective tool in analyzing the water and sediment quality. The sea
urchin Lytechinus variegatus is one of the most used test organism of water toxicity,
however, along the northeastern coast populations are reduced and the development of a
sensitive biological model for ecotoxicological evaluation of water is necessary. The
chronic test with Tisbe biminiensis nauplii consist in the exposition of nauplii for 48
hours (or until 50% of control individuals are copepodites) to water samples.
Environmental samples used in this study were collected in the Estuarine Systems of
Suape in five different stations For the tests with sediment in order to observe if there is
any difference between the copepod T. biminiensis and Nitokra sp when exposed to the
same sediment, three locations were chosen where sediment toxicity was previously
detected, they are: estuarine systems of Santos and Sao Vicente (Alemoa, Cosipa /
Usiminas, Marina and Mariana), Suape and Parque dos Manguezais (Ilha de Deus,
Pina).. In general the nauplii of T.biminiensis demonstrated the same response patterns
of sea urchins and sometimes a higher sensitivity.For the tests with sediment was also
observed that copepods have similar pattern of sensitivity and in some experiments
Nitokra sp showed greater sensitivity to the exposed sediment . Thus, the copepod
nauplii T.biminiensis can be used successfully to evaluate the toxicity of environmental
samples of seawater. The copepods T.biminiensis and Nitokra sp show a quite similar
sensitivity.
Key words: sea urchin, Lytechinus variegatus, Tisbe biminiensis, Nitokra sp
15
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO GERAL: ........................................................................................... 17
CAPÍTULO I .............................................................................................................. 21
RESUMO ................................................................................................................... 23
1. 1INTRODUÇÃO .................................................................................................... 24
1.2 METODOLOGIA ......................................................................................................... 25
1.2.1 Área de Estudo ....................................................................................................... 25
1.2.2Coleta, armazenamento e desgelo das amostras: ....................................................... 26
1.2.3 Teste com o ouriço Lytechinus variegatus ............................................................... 27
1.2.4 Teste de toxicidade da água com náuplios de Tisbe Biminiensis em placa 96 poços . 28
1.2.5 Análise estatística ................................................................................................... 29
1.3. RESULTADOS ............................................................................................................ 30
1.3.1 Abril 2009 .............................................................................................................. 30
1.3.2 Outubro 2009 ......................................................................................................... 31
1.3.3 Dezembro 2009 ...................................................................................................... 33
1.3.4 Fevereiro 2010........................................................................................................ 35
1.4. DISCUSSÃO ............................................................................................................... 36
1.5. CONCLUSÃO ............................................................................................................. 39
CAPÍTULO II ............................................................................................................. 40
RESUMO ................................................................................................................... 42
2.1 INTRODUÇÃO .................................................................................................... 43
2.2 MATERIAIS E MÉTODOS .......................................................................................... 45
2.2.1Áreas de Estudo ....................................................................................................... 45
2.2.2 Coleta das amostras de sedimento ........................................................................... 48
2.2.3 Coleta do sedimento controle ............................................................................... 48
2.2.4 Testes de toxicidade com Tiburonella viscana ........................................................ 49
2.2.5 Teste de toxicidade com Tisbe biminiensis ............................................................. 51
2.2.6 Teste de toxicidade com Nitokra sp ......................................................................... 52
2.2.7 Teste com substância de referência ......................................................................... 53
2.2.9 Análise dos dados ................................................................................................... 53
2.3 RESULTADOS ............................................................................................................. 54
2.3.1 Sistema Estuarino de Santos e São Vicente ............................................................. 54
2.3.2 Sistema Estuarino de Suape .................................................................................... 58
2.3.3 Pina ........................................................................................................................ 62
16
2.4 DISCUSSÃO ................................................................................................................ 64
2.5 CONCLUSÃO .............................................................................................................. 70
2.6 REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA ............................................................................... 71
17
INTRODUÇÃO GERAL:
Nos dois últimos séculos um modelo de civilização foi imposto, com ele veio a
industrialização, e atrelado a ela uma grande diversidade de produtos químicos, estes
potencialmente tóxicos. A poluição só se tornou evidente com o aumento populacional,
no entanto, foi apenas em 1960 que a preocupação com a poluição passou a ser
internacionalmente reconhecida, devido aos problemas causados ao homem e ao
ambiente (Zagatto, 2006).
Os ambientes estuarinos e oceânicos estão sujeitos a uma ampla variedade
de impactos antropogênicos associados com o desenvolvimento da zona costeira,
a entrada de poluentes, a sobrexploração dos recursos marinhos, a geração de energia
elétrica, maricultura, transporte e muitas outras atividades (Goldberg, 1995; Kennish,
2007). Estes são responsáveis por impactos ecológicas importantes e prejuízos
econômicos em todo o mundo (Whitemarsh, 1999). Os estuários e águas marinhas
costeiras continuam a ser os sistemas mais ameaçados, devido em grande
parte ao crescimento da população humana residente nas bacias hidrográficas vizinhas e
o aumento da utilização dos recursos costeiros.
O interesse pelas questões ambientais vem aumentando gradativamente nas
últimas décadas, principalmente devido aos inúmeros acidentes com substâncias
químicas. Foi a partir desses acidentes que vários países começaram a monitorar e
avaliar o nível de contaminação dessas substâncias químicas no ambiente. Com a
ocorrência de todos esses fatos, foi possível constatar que o ambiente aquático não é um
compartimento de diluição infinita da poluição gerada (Zagatto, 2006).
A Ecotoxicologia é a integração da ecologia e da toxicologia (Chapman, 1995;
Baird et al., 1996) e seu objetivo é compreender e prever os efeitos biológicos de
18
substâncias químicas e/ou a exposição em condições reais nas comunidades naturais.
Desta forma, conhecimentos teóricos e métodos oriundos da ecologia são necessários
para alcançar este objetivo (Chapman, 2002).
Os primeiros registros de testes de toxicidade com organismos aquáticos datam
de 1920, sendo os peixes utilizados primeiramente. Nas décadas seguintes, 1940 e 1950,
os trabalhos na área foram aumentando e outros métodos foram surgindo e as diferenças
nas condições experimentais foram aparecendo, e com ela a constatação de que os testes
precisavam ser padronizados.
Atualmente, vários testes de toxicidade já se encontram padronizados nacional e
internacionalmente por associações ou organizações, como Associação Brasileira de
Normas técnicas (ABNT), Association Française de Normalisation (AFNOR),
American Society for Testing and Materials (ASTM), American Water Work
Association (AWWA), Deutsches Institut fur Normung (DIN), International
Organization for Standardization (ISO) e Organization for Economic Co-Operation and
Development (OECD) (Aragão & Araújo, 2006).
Em ecotoxicologia várias espécies de organismos são utilizadas em testes de
toxicidade tais como as microalgas Pseudokirchneriella subcapta, Desmodesmus
subspicatus e Navicula pelliculosa (OECD, 2006); a macroalga Champia parvula
(Maurat, 1996), os moluscos como a ostra Crassotrea rhizophorae (Nascimento, 2002)
e Crassostrea gigas, o ouriço Lytechinus variegatus (Nipper et al., 1993; Zamboni,
1993; Rachid, 1996; Mastroti, 1997), os misidáceos Mysidopsis bahia (Weber et al.,
1988; Weber, 1991; Klemm et al., 1994), M. juniae (Prósperi et al., 1994,1998) e M.
elongata atlantica (Gama & Zamboni, 1999), o tanaidáceo Kalliapseudes schubarti
(Zamboni & Costa, 2002), os anfípodos Hyalella azteca (Zamboni, 2000), Tiburonella
viscana (Mello & Abessa, 2002), e os copépodos Tigriopus japonicus (Kwok et al.,
19
2008), Nitocra spinipis (Williams & Jones, 1994), Amphiascus tenuiremis (ASTM –
2004) , Tisbe battagliai (Williams, 1992; Williams et al., 1993; Bechmann, 1994, 1999;
Hutchinson et al., 1999a,b; Barata et al., 2002), Microarthridion littorale (Wulff, 1972),
entre outros.
O método mais utilizado na avaliação da toxicidade da água do mar é o teste
com embriões de ouriços-do-mar, pois este possui norma da CETESB desde 1992,
adotada nacionalmente e uma norma técnica da ABNT (2006). A espécie mais utilizada
no Brasil para o teste é o ouriço-roxo Lytechinus variegatus (Lamark 1816). Os ouriços
são organismos importantes, pois esta espécie tem grande importância ecológica, isso
devido a sua grande distribuição geográfica e abundância, tornando-a ideal para a
avaliação ecotoxicológica (Bötteger et al., 2001)
Segundo Coull & Chandler (1992) copépodos harpacticóides são bastante
sensíveis e adequados para testes de toxicidade. Eles têm uma importante e significativa
função na cadeia alimentar formando um elo indispensável entre os produtores
primários e os consumidores secundários em muitos ecossistemas aquáticos (Coull,
1990). O tamanho reduzido destes indivíduos facilita a realização dos testes, diminuindo
o custo, e seu hábito epibentônico possibilita testar poluentes tanto na fase aquosa
quanto aqueles ligados ao sedimento (Bengtsson, 1978; Hutchison et al., 1999; Silva et
al., 2000).
O uso potencial de copépodos como organismo modelo em ecotoxicologia tem
sido reconhecido há algum tempo. Em alguns países, vêm sendo utilizados regularmente
copépodos marinhos em bioensaios de toxicidade (por exemplo, Reino Unido;
EDMAR, 2002). A norma da International Standardization Organization - ISO 14669
(1999) apresenta um procedimento metodológico para determinação da toxicidade
aguda utilizando 3 diferentes espécies de copépodos marinhos em diferentes estágios do
20
ciclo de vida. Há também uma padronização recente que testa o ciclo de vida completo
do copépodo Amphiascus tenuiremis em microplaca (ASTM E-2317-04).
Os copépodos do gênero Tisbe (Copepoda: Harpacticoida) são organismos
adequados para avaliação do risco ambiental, pois são sensíveis a contaminantes,
apresentam ampla distribuição geográfica, importância ecológica elevada, ciclo de vida
curto, e animais com estágios de vida variados podem ser obtidos de cultivos a qualquer
época do ano. Além disso, requerem espaço mínimo e equipamentos para testes, e são
fáceis de cultivar em laboratório (Williams, 1992; Williams & Jones, 1994; Kusk &
Wollenberger, 2007).
O copépodo Tisbe biminiensis Volkman-Rocco 1973 vem sendo cultivado desde
1998 no Departamento de Oceanografia, e, desde 2003, esta espécie tem sido usada com
sucesso na avaliação da toxicidade de sedimentos (Araújo-Castro, 2008). Já uma
espécie nova do gênero Nitokra foi avaliada pelo grupo de pesquisa de ecotoxicologia
do Instituto Oceanográfico da Universidade de São Paulo (Lotufo & Abessa, 2002) e
vem sendo usada na avaliação da toxicidade de sedimentos estuarinos, não só por esse
grupo, mas também por pesquisadores de outros centros de pesquisa de São Paulo
(UNESP) e de outros estados (CEM-UFPR, FURG-RS, e LABOMAR-UFC, entre
outros).
Os objetivos deste trabalho são 1- testar a sensibilidade dos náuplios de T.
biminiensis quando expostos a amostras ambientais, comparando os resultados obtidos
com aqueles observados no teste embriolarval com L. variegatus e 2- comparar a
sensibilidade de fêmeas de Tisbe biminiensis e Nitokra sp. expostas a sedimentos
estuarinos com toxicidade anteriormente observada.
21
CAPÍTULO I
22
Desenvolvimento de protocolo para utilização de
náuplios do copépodo Tisbe biminiensis em testes de
toxicidade de água marinha e estuarina
23
RESUMO
Os testes de avaliação da toxicidade da água são utilizados mundialmente como uma
ferramenta de monitoramento ambiental. O ouriço do mar Lytechinus variegatus é um
dos organismos mais utilizados, pois são sensíveis, fáceis de coletar e os resultados
obtidos são facilmente observáveis. No entanto, ao longo da costa nordestina L.
variegatus encontra-se com populações reduzidas e o desenvolvimento de um modelo
biológico sensível para a avaliação ecotoxicológica da água faz-se necessário. O teste
crônico aqui proposto consiste na exposição de náuplios de Tisbe biminiensis com 24h
de eclosão em placas de 96 poços até o estágio de copepoditos. Para cada amostra e
controle são feitas 3 réplicas, cada uma contendo 30 náuplios. A duração do teste é de
48h ou até a formação de 50% de copepoditos no controle. As amostras utilizadas nos
testes foram coletas no Complexo Estuarino de Suape em 5 diferentes pontos .Para
avaliação deste teste foi aplicado em paralelo o teste embrio-larval com L. variegatus.
Em abril de 2009 os náuplios de T. biminiensis foram tão sensíveis quanto os ouriços,
apenas o P2 não apresentou toxicidade. Já em outubro de 2009, P3 e P6 foram tóxicos
para os embriões do ouriço L. variegatus, enquanto que todos os pontos foram tóxicos
para os juvenis de T. biminiensis. No mês de dezembro de 2009, P2, P5 e P6 foram
tóxicos para os embriões de ouriço, para os juvenis de copépodo apenas o P2 não foi
tóxico. E por fim em fevereiro de 2010, devido ao desenvolvimento insatisfatório dos
embriões de L. variegatus em 28 horas o teste não foi considerado válido. Os resultados
obtidos com os náuplios de copépodo mostram P3 e P4 como tóxicos. Os náuplios de T.
biminiensis podem ser usados sim na avaliação da toxicidade da água, pois não apenas
demonstram sensibilidade semelhante à observada no teste com embriões de L.
variegatus, como em algumas campanhas apresentaram mais sensibilidade. Recomenda-
se continuar desenvolvendo o protocolo para que o teste se torne tão simples quanto o
do ouriço, porque o tempo gasto na realização do modelo apresentado neste capítulo é
muito dispendioso e exige pessoal treinado com bastante destreza.
24
1. 1INTRODUÇÃO
Testes de toxicidade utilizando embriões e larvas de ouriço-do-mar são
amplamente utilizados em avaliações ambientais. Estes podem ser empregados na
caracterização de amostras de efluentes, águas e sedimentos, dentre elas o elutriato, a
água intersticial, a interface sedimento – água (Cesar et al., 2004). Os experimentos
realizados com ovos e embriões de equinodermos são aceitos internacionalmente, sendo
considerados adequados para avaliar a toxicidade de água do mar (USEPA, 1995;
Environment Canada, 1992; CETESB, 1999; Cesar, 2003; ABNT, 2006). Os ouriços
são organismos que apresentam grande importância ecológica, além de ampla
distribuição geográfica e abundância, tornando-se organismos importantes para a
avaliação ecotoxicológica (Böttger & McClintock, 2001). Kobayashi em (1984) já
constatava que testes com ouriços são adequados para testes de toxicidade, pois são de
fácil realização, curta duração, o teste é sensível, padronizado e preciso.
No entanto, as populações de ouriço da espécie Lytechinus variegatus encontra-
se em declínio ao longo da costa litorânea brasileira. Tal declínio populacional foi
observado primeiramente no Ceará e atualmente acredita-se que já tenha chegado ao
litoral Fluminense. Devido a esse desequilíbrio populacional, surgiu a necessidade de
desenvolvimento de um novo teste de toxicidade que apresente a mesma eficiência e
praticidade observada nos testes com embriões de ouriço.
Copépodos marinhos com hábito bentônico tem sido utilizados com sucesso em
testes de ecotoxicidade (Williams, 1992; Chandler & Scott, 1991; Chandler & Green,
2001; Chandler et al., 2004). Os indivíduos do gênero Tisbe (Copepoda: Harpacticoida)
são organismos adequados na avaliação de risco ambiental, pois eles apresentam ampla
distribuição geográfica, tem elevada importância ecológica, seu ciclo de vida é curto, e
25
os animais em qualquer uma das fases de desenvolvimento podem ser coletados a partir
de cultivos, em qualquer época do ano, eles exigem o mínimo de espaço e
equipamentos, e estes organismos são fáceis de manter em condições de laboratório
(Williams, 1992; Williams & Jones, 1994; Kusk & Wollenberger, 2007). Assim, desde
o final da década de 70 os copépodos marinhos são utilizados com sucesso em testes de
toxicidade (Kusk & Wollenberger, 2007).
A norma da International Standardization Organization - ISO 14669 (1999)
apresenta um protocolo para determinação da toxicidade aguda utilizando 3 diferentes
espécies de copépodos marinhos em diferentes estágios do seu ciclo de vida. Há
também o protocolo que foi desenvolvido recentemente, o qual testa o ciclo de vida
completo do copépodo Amphiascus tenuiremis em microplaca de 96 poços (ASTM E-
2317-04, 2004).
O copépodo harpacticóide Tisbe biminiensis (Volkman-Rocco, 1973) vem sendo
cultivado desde 1998 no Laboratório de Cultivo e Ecotoxicologia do Departamento de
Oceanografia, e, desde 2003, esta espécie é empregada em testes de toxicidade com
sucesso na avaliação de sedimentos (Araújo-Castro, 2008). Logo, o objetivo deste
capítulo é avaliar a sensibilidade dos náuplios de T. biminiensis quando expostos a
amostras de água superficial, comparando com os resultados obtidos nos teses
embriolarvais com L. variegatus.
1.2 METODOLOGIA
1.2.1 Área de Estudo
O Sistema Estuarino de Suape está localizado no litoral sul do estado de
Pernambuco, é neste sistema que está localizado o Porto de Suape. Este se situa entre
os municípios de Ipojuca e Cabo de Santo Agostinho, mais exatamente na Foz do rio
26
Ipojuca. A construção do Porto de Suape foi prevista para operar produtos combustíveis
e cereais a granel, substituindo o Porto do Recife. Hoje o porto é um dos maiores do
Brasil e sua área de influência abrange todo o estado de Pernambuco bem como parte
dos estados de Alagoas e da Paraíba.
As amostras de água superficial foram coletadas a cada 2 meses no complexo
estuarino de Suape entre os anos de 2009 e 2010 em 5 pontos de amostragem: (S 8º
22’55‖ – W 46º 58’38‖), P3 (S 8º 22’ 50‖ – W 46º 57’ 59‖), P4 (S 8º 22’ 30‖ – W 46º
57’ 59‖), P5 (S 8º 22’ 22‖ – W 46º 57’ 51‖) e P6 (S 8º 21’ 36‖ – W 46º 57’ 45‖). As
coletas foram realizadas preferencialmente nas marés baixas de sizígia, em cinco pontos
distintos localizados na área de influência do estaleiro Atlântico Sul (Figura1).
Figura 1: Localização dos pontos de amostragem de água superficial no Complexo Estuarino de Suape
- PE.
1.2.2Coleta, armazenamento e desgelo das amostras:
27
As amostras de água superficial do Complexo Estuarino de Suape foram
coletadas em garrafas de polietileno de 100 mL.De acordo com a ABNT (2006), os
recipientes de coleta devem ser totalmente preenchidos, a fim de minimizar a presença
de ar nas amostras. Para cada ponto de coleta foram feitas 5 réplicas, após a coleta as
amostras foram armazenadas em caixa térmica com gelo para posterior transporte ao
laboratório.
Os ensaios de toxicidade devem ser iniciados o mais rápido possível, no entanto,
na impossibilidade realização dos ensaios em até 48h, as amostras foram congeladas em
frezeer abaixo de -10ºC por um período que não excedeu 60 dias. Nesta situação, foi
preciso desprezar uma pequena alíquota da amostra para que o recipiente não se
rompesse durante o congelamento (ABNT, 2006).
Para a utilização das amostras, o descongelamento das mesmas foi feito em
temperatura ambiente ou em geladeira.
1.2.3 Teste com o ouriço Lytechinus variegatus
Os testes de toxicidade da água realizados com ovos recém fecundados do
ouriço Lytechinus variegatus foram realizados de acordo com as normas ABNT
NBR15350 (2006) e da CETESB (1999). Este é um bioensaio de desenvolvimento
embriolarval, onde o parâmetro do teste é o desenvolvimento do ovo para o estágio
larval de pluteus. O ensaio é considerado válido quando há formação de pelo menos
80% de pluteus bem formados no controle.
28
1.2.4 Teste de toxicidade da água com náuplios de Tisbe Biminiensis em placa 96 poços
Os testes de toxicidade realizados com náuplios de Tisbe biminiensis seguiram a
metodologia proposta pela ASTM (American Society for Testing and Materials) (2004)
com modificações metodológicas para a espécie testada. Um dia antes do início do teste,
fêmeas de T. biminiensis foram submetidas a uma estrutura de eclosão de náuplios
(Figura 2). Esta é composta por, duas caixas de mesmo tamanho, sendo a caixa superior
com a parte inferior substituída por uma malha 120µm de abertura, tamanho suficiente
para a passagem dos náuplios recém eclodidos. Já a caixa inferior permaneceu intacta,
dentro do sistema e recebeu 30mL de microalga e 4L de água do mar, o sistema
permaneceu estagnado até que a microalga adicionada decantasse. Após a decantação da
microalga, as fêmeas ovígeras foram adicionadas na caixa superior, permanecendo na
estrutura por pelo menos 12h. À medida que os náuplios iam eclodindo, os mesmos
passavam pela malha de e ficavam armazenados no fundo, ficando assim separados das
fêmeas. Os indivíduos utilizados no teste tinham no máximo 26 horas de eclosão.
Figura 2: Sistema criado para eclosão de prole de copépodos.
Cada amostra ambiental de água foi descongelada em refrigerador, a salinidade
foi ajustada quando necessário com salmoura de acordo com a faixa de tolerância do
Caixa menor sem o fundo
Caixa maior com o fundo
Malha de 120 m colocada na caixa
sem a parte inferior.
29
copépodo. A solução a ser testada foi preparada com a amostra em temperatura
ambiente e a microalga Thalassiosira fluviatilis (diatomácea) com concentração de 0,2
µg Chl-a/mL.
Todas as amostras testadas e controle tiveram 3 réplicas, cada uma delas
contendo 30 náuplios. Estes foram colocados individualmente em placas 96 poços com
auxílio de uma pipeta Pasteur e a amostra a serem testados, os poços vazios foram
preenchidos com água destilada para minimizar a evaporação e evitar que as condições
estabelecidas inicialmente variassem. A observação do teste foi realizada a cada 12
horas com estereomicroscópio durante no mínimo por 48 horas, que é o tempo médio de
passagem do estágio naupliar para o estágio de copepodito, ou até a formação de pelo
menos 50% de copepoditos no controle, aproximadamente 72h. Os parâmetros
observados no teste foram: mortalidade, percentual de náuplios e copepoditos.
1.2.5 Análise estatística
O tratamento dos dados obtidos foi realizado primeiramente com a aplicação do
teste de normalidade e para testar a homocedasticidade dos dados obtidos com auxilio
do teste de Kolmogorov-Sminnov. Sendo os dados normais, foi realizado a Análise de
Variância (ANOVA) com nível de significância de 95%. Para o teste com os as larvas
de Lytechinus variegatus e náuplios de Tisbe biminiensis o teste a posteriore de Dunnett
foi realizado para encontrar onde ocorreram as diferenças significativas em relação ao
controle.
30
1.3. RESULTADOS
1.3.1 Abril 2009
Com base nos dados analisados em abril de 2009 a média de pluteus bem
formados foi de 94,4% no controle, e todas as amostras ambientais testadas foram
significativamente diferentes e inferiores (ANOVA= 12,78; p< 0, 0001) (Figura 3).
Figura 3: Percentual de pluteus de Lytechinus variegatus bem formados em abril de 2009 quando
expostos as amostras de água superficial do complexo estuarino de Suape. As letras significam as
diferenças estatísticas encontradas pelo teste de Dunnett.
Com relação ao desenvolvimento dos náuplios houve diferença significativa em
relação ao controle (ANOVA F= 4, 282; p= 0, 013). Os pontos P3, P4, P5 e P6
apresentaram percentual médio de náuplios significativamente superior em relação ao
controle. O que caracteriza um retardo no desenvolvimento dos indivíduos. Já para o
percentual de copepoditos houve diferença significativa em relação ao controle
(ANOVA F= 5, 778; p= 0, 004). Os pontos P3, P4, P5 e P6 apresentaram percentual
médio inferior quando comparados com o controle. Já para a mortalidade no mesmo
0
20
40
60
80
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120
controle 2 3 4 5 6
Perc
en
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lute
us b
em
fo
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estações
* * * *
*
31
período, não houve diferença significativa em relação ao controle (ANOVA F= 0, 618;
p= 0,688) (Figura 4).
Figura 4: Percentual médio de náuplios, copepoditos e mortos respectivamente de juvenis do copépodo
Tisbe biminiesis ao término do experimento com as amostras ambientais do Sistema Estuarino de Suape -
PE. O asterisco representa a diferença significativa encontrada pelo teste a posteriore de Dunnett.
1.3.2 Outubro 2009
Nas amostras de outubro de 2009, o percentual de pluteus bem formados foi
88,8% no controle. Neste período apenas as amostras P3 e P6 foram significativamente
diferentes e inferiores ao controle (ANOVA F=6,73; p= <0, 001 (Figura 5).
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Controle P2 P3 P4 P5 P6
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Estações de Coleta
Náuplio
Copepodito
Mortalidade
* * *
*
* * *
*
32
Figura 5: Percentual médio de pluteus bem formados de Lytechinus variegatus ao término do
experimento com as amostras ambientais do Sistema Estuarino de Suape – PE de outubro de 2009. Os
asteriscos mostram as diferenças significativas encontradas pelo teste de Dunnet.
O percentual médio de náuplios ao término do teste apresentou diferença
significativa do controle (ANOVA F= 9, 854; p< 0, 001). Os pontos P2 e P3 foram
significativamente inferiores do controle, segundo o teste de Dunnett. Quanto ao
percentual médio de copepoditos houve diferença significativa em relação ao controle
(ANOVA F= 60,03; p< 0, 001), todos os pontos foram inferiores ao controle. Já o
percentual de mortalidade houve diferença significativa em relação ao controle
(ANOVA F= 7, 984; p= 0, 002), São diferentes e inferiores ao controle P3, P4, P5 e P6
(Figura 6).
0
10
20
30
40
50
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70
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100
Controle P2 P3 P4 P5 P6
Pe
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us
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orm
ado
s
Estações de Coleta
* *
33
Figura 6: Percentual médio de náuplios, copepoditos e mortalidade de juvenis de Tisbe biminiesis ao
término do experimento com as amostras ambientais do Sistema Estuarino de Suape – PE em outubro de
2009. Os asteriscos representam a diferença significativa encontrada pelo teste a posteriore de Dunnett.
1.3.3 Dezembro 2009
Em dezembro de 2009, o percentual de pluteus bem formados foi de 81,8% no
controle. Nesta campanha apenas as amostras P2, P5 e P6 diferiram significativamente
do controle (ANOVA F= 25,55; p< 0, 001) (Figura 7).
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Controle P2 P3 P4 P5 P6
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Estações de Coleta
Náuplios
Copepoditos
Mortos
* * *
*
* * * * *
34
Figura 7: Percentual médio de pluteus de Lytechinus variegatus bem formados ao términodo teste com
as amostras coletadas no Sistema Estuarino de Suape – PE em dezembro de 2009. Os asteriscos indicam
as diferenças significativas encontradas pelo teste de Dunnett.
O percentual médio de náuplios para o mesmo período observou-se que não
houve diferença significativa em relação ao controle (ANOVA F= 2, 438; p= 0, 096) .
No entanto, para o percentual de copepoditos houve diferença significativa (ANOVA
F= 11, 613; p= 0, 0004), de acordo com o teste de Dunnett apenas o P2 não diferiu
significativamente do controle. Quanto à mortalidade, houve diferença significativa em
relação ao controle (ANOVA F= 6, 406; p= 0, 005), sendo P3 e P5 diferentes (Figura
8).
0
10
20
30
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70
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controle P2 P3 P4 P5 P6
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lute
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be
m f
orm
ado
s
Estações de coleta
*
* *
35
Figura 8: Percentual médio de náuplios, copepoditos e mortalidade de juvenis de Tisbe biminiesis ao
término do experimento com as amostras ambientais do Sistema Estuarino de Suape – PE em dezembro
de 2009. Os asteriscos representam a diferença significativa encontrada pelo teste a posteriore de Dunnett.
1.3.4 Fevereiro 2010
Devido ao percentual de desenvolvimento insatisfatório dos embriões de L.
variegatus, o teste realizado em fevereiro de 2010 não foi considerado válido. O
percentual de náuplios observados no controle variou significativamente (ANOVA F=
9, 184; p< 0, 001), sendo P3 diferente do controle de acordo com o teste de Dunnet. No
entanto, observando o gráfico fica perceptível que P2 e P5 têm uma forte tendência de
aumento em relação ao controle. Quanto ao percentual de copepoditos, os resultados
observados mostraram que houve diferenças significativas (ANOVA F= 11,48; p <0,
001), sendo esta diferença apenas em P3, que apresentou o menor desenvolvimento para
fase de copepodito. No que se refere à mortalidade, contatou-se que há diferença
significativa em relação ao controle (ANOVA F= 4, 58; p= 0, 017), sendo o ponto P4
diferente do controle (Figura 9).
0%
10%
20%
30%
40%
50%
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70%
80%
90%
Controle P2 P3 P4 P5 P6
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Estações de coleta
Náuplios
Copepodito
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* *
*
*
* *
36
Figura 9: Percentual médio de náuplios, copepoditos e mortalidade de juvenis de Tisbe biminiesis ao
término do experimento com as amostras ambientais do Sistema Estuarino de Suape – PE em fevereiro de
2010. Os asteriscos representam a diferença significativa encontrada pelo teste a posteriore de Dunnett.
1.4. DISCUSSÃO
Os experimentos realizados com náuplios de T. biminiensis comprovam que, a
fase naupliar é sensível aos poluentes presentes na água superficial do Complexo
Estuarino de Suape. Isso considerando a semelhança no padrão dos resultados
observados com L. variegatus.
Os dados de abril sugerem que para os parâmetros subletais apenas em um ponto
os resultados divergiram entre os juvenis de T. biminiensis e L. variegatus. Com base no
observado para esta campanha, os embriões de ouriço foram um pouco mais sensíveis.
Já para os dados de outubro, o percentual de náuplios foi diferente em relação ao
controle nas amostras P2 e P3. Já para o percentual de copepoditos, todas as amostras
foram significativamente diferentes do controle. As amostras P3, P4, P5 e P6 não
0
10
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Controle P2 P3 P4 P5 P6
Pe
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inal
do
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Estações de Coleta
Náuplios
Copepodito
mortos
*
*
*
37
apresentaram desenvolvimento da fase juvenil, logo foram consideradas tóxicas. No
teste com L. variegatus apenas as amostras P3 e P6 foram consideradas tóxicas, nesta
campanha os náuplios foram mais sensíveis que os embriões de ouriço.
Em dezembro do mesmo ano, no que se refere aos parâmetros subletais, o
percentual médio de copepoditos apenas o ponto P2 foi semelhante ao controle. Já para
o percentual de pluteus de L. variegatus formados P2, P5 e P6 foram considerados
tóxicos, nos demais prontos os embriões não tiveram seu desenvolvimento prejudicado.
Novamente nesta campanha os náuplios foram mais sensíveis que os embriões de
ouriço.
Para janeiro de 2010, os dados subletais sugerem que apenas P3 apresenta
toxicidade para os náuplios de T. biminiensis. Nesta campanha não foi possível uma
comparação com o teste com os pluteus de L. variegatus, pois como não houve
desenvolvimento satisfatório no controle em 28h, o teste foi descartado.
De acordo com Ihara et al., (2010), nos últimos anos vem se observando no uma
redução drástica nas populações de Lytechinus variegatus, espécie esta padronizada pela
ABNT para ensaios de toxicidade crônica. Essa redução na população ocorre
principalmente ao longo da costa Nordeste do Brasil, o que vem restringindo a sua
utilização em ensaios ecotoxicológicos. O mesmo ocorre nas regiões de clima
temperado, a abundância de L. variegatus diminui consideravelmente nos meses de
inverno, em decorrência da redução da temperatura da água (Lotufo, 2008).
Os testes com copépodos foram padronizados pela ISO (14669-99), esta
descreve métodos de determinação da toxicidade aguda da água do mar. A norma
recomenda testes com copepoditos no estágio 5 ou adultos de Acartia tonsa, Tisbe
battagliai copepoditos no estágio 1 o que corresponde a aproximadamente 2 dias de
38
vida e com Nitocra spinipes utilizando adultos com 3 ou 4 semanas de idade. A ASTM
(E2317- 04) padronizou os testes de toxicidade de água do mar usando náuplios de
Amphiascus tenuiremis com 24h de idade em placas de 96 poços e com duração de
48horas. Todos os testes realizados foram fundamentados no protocolo proposto pela
ASTM e na ISO.
Num estudo realizado por Forget et al., (1998) sobre a mortalidade da CL50 para
os diferentes estágios do ciclo de vida do copépodo Tigriopus brevicornis, constatou-se
que os náuplios foram de 2 a 4 vezes mais sensíveis que os estágios de juvenil e adulto.
Segundo Bechman (1999), a metamorfose que ocorre na passagem do estagio naupliar
para o estágio de copepodito é o evento mais importante no ciclo de vida dos
copépodos.
Nos copépodos, o desenvolvimento larval do estágio de náuplios para
copepodito incluem 11 mudas de ecdise e 1 metamorfose, esta caracteriza o estágio
juvenil. Tanto as mudas quanto a metamorfose são reguladas por hormônios (Andersen
et al., 2001; Forget-Leray et al., 2005; Dahl et al., 2006). Para Lee et al. (2008), os teste
com náuplios são muito úteis, pois o não desenvolvimento dos indivíduos em questão
pode estar diretamente relacionado com a inibição dos hormônios responsáveis pela
troca das ecdises e pela metamorfose do copépodo.
De acordo com estudo realizado por Huang et al., (2006), os náuplios do
copeópodo Pseudodiaptomus marianus demonstraram maior sensibilidade do que os
copepoditos quando expostos a baixas concentrações de TBTO (Óxido de
Tributilestanho). A taxa de desenvolvimento larval é uma indicação de como o
poluente age nas fases juvenis, podendo ser um desregulador endócrino, e que
provavelmente aparecerá em concentrações muito baixas se compararmos com as
39
concentrações letais (Breitholtz &Bengtsson, 2001; Breitholtz et al., 2003;Forget- Leray
et al., 2005).
Segundo Templeton et al. (2006) num estudo de ciclo de vida com o copépodo
Amphiascus tenuiremis mostraram que na mais alta concentração do composto testado o
número copepoditos foi inferior, bem como, o número de adultos. O tratamento com a
concentração mais elevada, ainda teve um atrasado de desenvolvimento de 6 dias em
relação ao controle. Diz et al. (2009) comprovaram que os testes com náuplios de
Tisbe battagliai foram mais sensíveis ao cobre e ao LAS (Alquibenzeno Linear) que os
testes realizados com copépodos na fase adulta.
1.5. CONCLUSÃO
Os dados apresentados mostram que os náuplios do copépodo harpactióide Tisbe
biminiensis podem ser utilizados em testes de toxicidade de água do mar com sucesso.
Pois, apresentaram um padrão bem semelhante de toxicidade observa no teste com
embriões do ouriço Lytechinus variegatus. Ainda de acordo com os resultados obtidos o
desenvolvimento da fase naupliar apresentou em alguns momentos sensibilidade maior
que o teste feito com embriões de ouriço. E diante da escassez de indivíduos de L.
variegatus em nossa região, o teste com náuplios de copépodos pode e deve ser
utilizado como uma alternativa na avaliação da toxicidade da água.
40
CAPÍTULO II
41
COMPARAÇÃO DAS SENSIBILIDADES DOS COPÉPODOS TISBE
BIMINIENSIS E NITOKRA SP. EM TESTES COM SEDIMENTOS
ESTUARINOS
42
RESUMO
Os testes de toxicidade são utilizados como uma ferramenta de monitoramento ambiental. Os
bioensaios de toxicidade de sedimento com copépodos são usados mundialmente e no Brasil a
espécie marinha de copépodo harpacticóide Tisbe biminiensis vem sendo usada desde 2003. O
objetivo deste estudo foi comparar a resposta de T. biminiensis àquelas do copépodo estuarino
Nitokra sp. e do anfípodo Tiburonella viscana, também usados na avaliação de sedimentos. As
amostras de sedimento foram coletadas no Sistema estuarino de Santos e São Vicente – SP são
elas: Alemoa, Cosipa/Usiminas, Marina e Mariana; Complexo Estuarino de Suape P1, P2, P3,
P4, P5 e P6; Parque dos Manguezais, Pina. Os sedimentos usados como controles foram
coletados na praia do Engenho D’água em Ilhabela-SP e no Estuário do rio Maracaípe, Ipojuca-
PE. Para os testes com T. biminiensis e Nitokra sp cada recipiente recebeu aproximadamente 2g
de sedimento peneirado e 20 mL de suspensão de diatomácea na concentração de 0,2μg Chl-
a/mL para o Tisbe e apenas 20m L de água do mar para Nitokra. No dia seguinte, dez fêmeas
ovígeras foram adicionadas e mantidas em incubadora a 25ºC, 12/12h durante 7 e 10 dias
respectivamente. Ao término da duração dos testes, as amostras foram coradas com rosa de
bengala e fixadas com formol a 4%. Já para o teste com anfípodo foram feitas 3 réplicas de
sedimento integral para cada amostra contendo 200mL e adicionado 600mL de água do mar,
24h depois foram adicionados 10 adultos de T. viscana por recipiente. A duração do teste foi de
10 dias e ao término a sobrevivência foi observada. Os dados obtidos nos três experimentos
foram submetidos a ANOVA. , Nitokra sp, foi mais sensível comos ―endpoints‖ subletais.
Quando expostos aos sedimentos de Suape e do Pina os copépodos mostraram o mesmo padrão
de resposta ecotoxicológica, no entanto, Nitokra demonstra maior sensibilidade. Logo, ambos os
organismos podem ser utilizados, recomenda-se a utlização dos dois testes em paralelo quando
possível, a fim de obter uma resposta ecotoxicológica da amostra ambiental mais conclusiva,
bem como realizar testes com organismos de outros níveis tróficos.
Palavras chave: Sedimento , Tisbe biminiensis, Nitokra sp
43
2.1 INTRODUÇÃO
Alguns dos lugares com maior densidade populacional e industrialização no
Brasil estão localizados na zona costeira, próximos a baías e estuários, contribuindo
para a poluição destes ambientes (Melo & Nipper, 2007). A qualidade dos ambientes
marinhos nos últimos anos vem ganhando destaque mundialmente, hoje existe um
enorme interesse na preservação desses ambientes e na recuperação daqueles que já
foram impactados (Adams et al., 1992; DeWitt et al., 1989)
Os sedimentos são um compartimento importante na deposição de
contaminantes e substrato para diversos organismos, uma resolução do CONAMA
(2004) recomenda a realização de testes de toxicidade para avaliação dos sedimentos
dragados, bem como, a caracterização química dos mesmos, cujo objetivo é avaliar os
impactos a biota e o local de disposição dos mesmos (Araújo-Castro, 2008). Segundo
Abessa et al., (2006) grande parte dos contaminantes, lançados no mar depositam-se nos
sedimentos, produzem efeitos tóxicos sobre a fauna e acabam afetando o equilíbrio
ambiental.
Os testes de toxicidade são ferramentas efetivas na avaliação da qualidade dos
sedimentos, estes consistem na exposição de um organismo pré-selecionado a uma
substância biologicamente ativa (no caso de sedimentos, amostras coletadas em campo,
fases líquidas obtidas a partir desta, ou ainda, sedimento limpo contaminado por um ou
mais poluentes), e determinação de efeitos letais e subletais (Chapman & Long, 1983;
Lamberson et al., 1992).
Os anfípodos, bem como os copépodos são organismos importantes na cadeia
alimentar aquática, servindo de alimento para crustáceos maiores e aves. Atualmente as
espécies de crustáceos usadas em testes de avaliação de toxicidade em sedimentos
44
marinhos e estuarinos no Brasil incluem os copépodos Tisbe biminiensis (Araújo-Castro
et al, 2009) e Nitokra sp (Lotufo & Abessa, 2002), o anfípodo Tiburonella viscana
(Abessa et al., 1998; Melo, 1993; Melo & Abessa, 2002), o tanaidáceo Kalliapseudis
schubartii (Zamboni, 2000; Zamboni & Costa, 2002) e pós-larva dos camarões
Litopenaeus sp. (Nascimento & Evangelista, 2002) e Penaeus paulensis e P. schmitti
(Moraes et al., 1996).
O copépodo bentônico T. biminiensis é utilizado com sucesso em testes de
toxicidade desde 2003. Estes foram usados por Araújo-Castro (2008) para avaliação da
toxicidade dos sedimentos do Complexo Estuarino de Suape – PE e Baía de Todos os
Santos – BA e por Oliveira (2008), avaliando a toxicidade dos sedimentos do Parque
dos Manguezais. Já uma espécie nova do gênero Nitokra foi avaliada pelo grupo de
pesquisa de ecotoxicologia do Instituto Oceanográfico da Universidade de São Paulo
(Lotufo & Abessa, 2002) e vem sendo usada na avaliação da toxicidade de sedimentos
estuarinos, não só por esse grupo, mas também por pesquisadores de outros centros de
pesquisa de São Paulo (UNESP) e de outros estados (CEM-UFPR, FURG-RS, e
LABOMAR-UFC, entre outros).
O objetivo deste capítulo foi comparar a sensibilidade dos organismos teste
Tisbe biminiensis, Nitokra sp e Tiburonella viscana a sedimentos com toxicidade
anteriormente observada, através dos ―endpoints‖ letalidade (sobrevivência) e
subletalidade (fecundidade e taxa de eclosão).
45
2.2 MATERIAIS E MÉTODOS
2.2.1Áreas de Estudo
Três áreas em manguezais com toxicidade observada em estudos pretéritos foram
escolhidas para a realização dos testes comparativos entre os copépodos Tisbe
biminiensis, Nitokra sp. O bioensaio com o anfípodo Tiburonella viscana foi realizado
para complementar os resultados. As coletas foram realizadas entre os meses de abril de
2010 a setembro de 2010.
2.2.1.1 Sistema Estuarino de Santos e São Vicente – SP
O Sistema Estuarino de Santos e São Vicente na baixada santista em São Paulo.
foi escolhido devido a contaminação histórica de seus sedimentos e por possuirem o
maior Complexo Portuário da América do Sul. Os quatro pontos de amostragem
determinados foram Alemoa (S 23º 54 753’- W 46º 21 506’), Cosipa/Usiminas (S 23º
52 817’ – W 46º 22 611’), Marina (S 23º 58 946’- W 46º 23 819’) e Mariana (S 23º 56
951’ – W 46º 25 778’) (Figura 10).
A Alemoa é considerado o bairro mais antigo de Santos, este surgiu sobre um
extenso manguezal e atualmente abriga um complexo industrial, com pátios e depósitos
de contêineres utilizados no transporte de cargas para o Porto de Santos. É na Alemoa
que esta localizado um dos lixões mais antigos do Estado de São Paulo era neste local
que durante muitos anos os resíduos tóxicos do Porto de Santos foram descartados. O
ponto onde o sedimento foi coletado fica próximo a uma torre de observação.
Já o ponto Cosipa/Usiminas está localizado próximo a Companhia Siderúrgica
Paulista ou ainda Usina José Bonifácio de Andrade e Silva, localiza-se no município
46
paulista de Cubatão no litoral do Estado de São Paulo e após a privatização passou a ser
controlada pela Usiminas. A siderúrgica esta instalada numa área de mangue denso
próximo ao terminal da Alemoa. Próximos ao ponto de coleta estão 23 empresas
químicas com alto potencial poluidor, o que compromete muito a qualidade ambiental.
E devido à presença histórica de vários contaminantes neste local optamos pela
utilização destas amostras para os testes de comparação.
O ponto de amostragem Mariana esta localizado no rio que dá nome ao local de
coleta, e foi escolhido por receber contribuição de poluentes oriundos de áreas
contaminadas por organoclorados e metais pesados, é receptor de esgoto in natura e
chorume do lixo de Sambaiatuba (Lamparelli et al, 2001).
Por fim, o ponto Marina situado em frente a algumas marinas de São Vicente e
próximo a um bairro residencial, este foi local escolhido devido ao fluxo intenso de
embarcações no local e descarga antropogênica e por haver histórico de contaminação
por detergentes e PCB’s. (Abessa et al., 2001).
Figura 10: Localização dos locais de coleta de sedimento no Sistema Estuarino de Santos e São Vicente
– SP.
47
2.2.1.2 Sistema Estuarino de Suape
As seis amostras de sedimentos coletadas no Complexo Estuarino de Suape
foram nomeadas e georeferenciadas são elas: P1(S 8º 23’ 00‖ – W 46º 59’ 07’’) P2 (S 8º
22’55‖ – W 46º 58’38‖), P3 (S 8º 22’ 50‖ – W 46º 57’ 59‖), P4 (S 8º 22’ 30‖ – W 46º
57’ 59‖), P5 (S 8º 22’ 22‖ – W 46º 57’ 51‖) e P6 (S 8º 21’ 36‖ – W 46º 57’ 45‖).
Abaixo uma figura que mostra a localização no mapa dos locais de coleta (Figura 11). A
área de coleta de sedimento é a mesma onde foram realizadas as coletas das amostras
ambientais de água no capítulo 1.
Figura 11: Localização dos pontos de amostragem de sedimento no Sistema Estuarino de Suape – PE.
2.2.1.3 Bacia do Pina
Por fim a amostra de sedimento coletada nas proximidades da Ilha de Deus, num
banco de lama exposto durante a maré baixa, a amostra foi denominada de Pina Este
local de coleta foi escolhido com base nos dados obtidos por Oliveira (2008) e Silva et
al. (2011) para a região conhecida como Parque dos Manguezais (Figura 12). O local
em questão esta situado numa área urbana densamente povoada, que tem muitos
48
viveiros de camarão, sofre com o desmatamento do mangue e recebe esgoto in natura
de muitas residências próximas.
Figura 12: Localização do ponto de amostragem de sedimento no Parque dos Manguezais.
2.2.2 Coleta das amostras de sedimento
O método de amostragem de sedimento foi semelhante em cada uma das 3
diferentes localidades,. As amostras foram coletadas com auxílio de uma draga do tipo
van Veen, sendo esta lançada 3 vezes por ponto de coleta. Cada amostra de sedimento
coletado foi homogeneizada e armazenada em sacos plásticos e ou recipientes de vidro
descontaminados.
2.2.3 Coleta do sedimento controle
O sedimento utilizado como controle em todos os testes de toxicidade realizados
com os sedimentos de Santos e São Vicente foi coletado na praia do Engenho D’água
em Ilhabela, litoral norte do estado de São Paulo. Já o sedimento utilizado como
49
controle em todos os testes de toxicidade com os sedimentos coletados em Suape e no
Pina foi coletado no estuário do rio Maracaípe – PE, que fica no litoral sul do estado de
Pernambuco (Figura 13).
Figura 13: Localização do ponto de amostragem do sedimento controle no manguezal da praia de
Maracaípe, Ipojuca – PE.
2.2.4 Testes de toxicidade com Tiburonella viscana
2.2.4.1 Coleta e aclimatação dos organismos
Os anfípodos da espécie Tiburonella viscana foram coletados na porção inferior
da zona entre-marés da praia do Engenho D’água, localizada em Ilhabela, na região
central do Canal de São Sebastião, SP, com auxílio de uma draga de arrasto conectada a
uma malha de 0,5mm de abertura (Melo & Nipper, 2007). da Foram realizados alguns
arrastos e em seguida o peneiramento do material coletado. Os anfípodos encontrados
50
na superfície da água remanescente da draga são retirados com auxílio de uma peneira
com abertura de malha de 1,0mm e acondicionados em potes de polietileno de 1L
contendo água do mar e sedimento do local (Melo & Abessa, 2002).
Após a identificação, os organismos foram transferidos para uma bacia plástica
contendo sedimento do local de coleta peneirado e água do mar com salinidade 34 ± 1 e
temperatura de 25 ± 2 ºC. Os indivíduos foram mantidos com temperatura controlada
em 25 ± 2 Cº e iluminação constante como são sugeridos pela ASTM (1993) na
tentativa de reduzir a atividade dos organismos na superfície. A aeração foi introduzida
no sistema e o período de aclimatação dos organismos durou 3 dias (Melo & Abessa,
2002).
2.2.4.2 Bioensaio
Um dia antes do início do teste, os sedimentos coletados foram homogeneizados
e três sub-amostras de aproximadamente 200 mL de sedimento integral de cada ponto
foram distribuídas em recipientes plásticos de aproximadamente 1L. Caso houvesse
presença de possíveis predadores, seria feito o procedimento padrão recomendado pela
ASTM (1993), que consiste no peneiramento da amostra por malha de 2 mm e sendo o
predador visível retirada do indivíduo com pinça.
Após a distribuição dos sedimentos, cada recipiente recebeu 600 mL de água do
mar filtrada para recobrir o sedimento, esta foi introduzida com auxílio de Placa de Petri
para reduzir a ressuspensão dos mesmos. O sistema de aeração foi colocado, para
assegurar as concentrações ideais de oxigênio dissolvido tanto na água como na
superfície do sedimento.
51
No dia seguinte, 10 anfípodos foram colocados em cada recipiente com auxilio
de uma pipeta Pasteur de boca larga. O teste teve duração de 10 dias. Os parâmetros
físico químicos (OD, salinidade, pH e NH3) foram medidos no início e no término do
teste. A metodologia acima descrita foi proposta por Melo & Abessa (2002).
2.2.5 Teste de toxicidade com Tisbe biminiensis
O teste com os sedimentos tóxicos coletados no Sistema Estuarino de Santos e
São Vicente, Sistema Estuarino de Suape e Pina utilizando fêmeas de Tisbe biminiensis
seguiram a metodologia proposta por Araújo-Castro et al. (2009).
As amostras de sedimento foram passadas por uma peneira com malha de
abertura de 64 µm e água do local de coleta, por fim refrigerado a 4ºC, por cerca de 24
horas. Posteriormente, o sobrenadante foi desprezado e o sedimento distribuído em
recipientes de vidro descontaminados, contendo aproximadamente 2g de sedimento
cada um. Para cada ponto, foram feitas quatro sub-amostras, a fim de avaliar a
variabilidade entre os grupos de organismos testados. Cada um dos recipientes recebeu
20 mL de suspensão algal com concentração de 0,2 µg Chl-a/mL de diatomácea
Thalassiosira fluviatis e posteriormente foi levado à estufa incubadora a 25ºC e
fotoperíodo de 12/12 horas claro/escuro durante 24 horas. Após este intervalo, 10
fêmeas ovígeras com idade controlada (12 dias aproximadamente) foram adicionadas
em cada recipiente. A duração do teste de toxicidade foi de sete dias, a cada dois dias
foi adicionado 1mL de diatomácea concentrada para alimentação dos indivíduos.
Os parâmetros físico-químicos pH, Oxigênio Dissolvido (O.D) e Salinidade
foram observados no início, no quarto dia e ao término do experimento. Após a
52
medição dos parâmetros, o conteúdo presente em cada recipiente foi transferido para
potes plásticos, corados com rosa de bengala e fixados com formol a 4% para posterior
contagem dos indivíduos. A determinação do efeito letal, morte das fêmeas adultas foi
realizada pela observação de fêmeas não coradas em rosa. Os efeitos subletais
observados no presente estudo foram a fecundidade total (náuplios + copepoditos) e a
taxa de eclosão, que é o número de indivíduos produzidos por fêmeas durante o teste.
2.2.6 Teste de toxicidade com Nitokra sp
O teste toxicológico com Nitokra sp seguiu a metodologia proposta por Lotufo
& Abessa (2002), este teve substituição do sedimento integral por sedimento peneirado
foi modificado do procedimento adotado.
As amostras de sedimento foram distribuídas em recipientes de vidro contendo
aproximadamente 2g de sedimento peneirado e 10 mL de água do mar filtrada com
salinidade entre 20 ± 2. Para cada amostra, foram feitas três sub-amostras, a fim de
avaliar a variabilidade entre os grupos de organismos testados. Posteriormente os
recipientes foram levados a estufa incubadora a 25ºC durante 24 horas. Após este
intervalo, 10 fêmeas ovígeras de Nitokra sp foram adicionadas em cada recipiente. O
fotoperíodo estabelecido pro teste foi de 24 horas de claro, para aumentar a exposição
das fêmeas ao sedimento. A duração do teste de toxicidade foi de dez dias.
No décimo dia de teste os parâmetros físico-químicos foram medidos
novamente. Após a medição dos parâmetros, o conteúdo presente em cada recipiente
foi transferido para potes plásticos, corados com rosa de bengala e fixados com formol a
4% para posterior contagem dos indivíduos. A do efeito letal, morte das fêmeas adultas
53
foi realizada pela observação de fêmeas não coradas em rosa. Os efeitos subletais
observados no presente estudo foram a fecundidade total (náuplios + copepoditos) e a
taxa de eclosão, que é o número de indivíduos produzidos por fêmeas durante o teste.
2.2.7 Teste com substância de referência
Cada uma das espécies utilizada nos testes de toxicidade teve sua sensibilidade
testada através de testes com substância de referência, o Dicromato de Potássio
(K2Cr2O7). As concentrações utilizadas para o teste com anfípodo foram (50, 25, 12,5,
6,25 e 3,12 ppm). Já para os testes realizados com os copépodos as concentrações foram
(50, 25, 10, 5 e 1 ppm).
2.2.9 Análise dos dados
Para a avaliação dos efeitos letais obtidos no teste com o anfípodo Tiburonella
viscana os resultados para a sobrevivência foram submetidos ao teste Shapiro-Wilk para
testar a normalidade. Após testar a normalidade, os resultados foram comparados
através da Análise de Variância (ANOVA), havendo diferenças significativas em
relação ao controle o teste de Dunnett foi aplicado a fim de localizar onde ocorrem tais
diferenças.
O tratamento estatísticos dos dados para os experimentos de sedimento
realizados com os copépodos T. biminiensis e Nitokra sp o teste de Kolmogorov-
Smirnov foi utilizado para testar a homocedasticidade dos dados. Sendo os dados
54
normais e homocedásticos, foi aplicada uma ANOVA com 95% de significância e o
teste a posteriori de Dunnett a fim de, detectar onde ocorrem as diferenças significativas
em relação ao controle.
2.3 RESULTADOS
2.3.1 Sistema Estuarino de Santos e São Vicente
2.3.1.1 Tiburonella viscana
A análise do percentual de sobrevivência ao final dos 10 dias do teste com o anfípodo T.
viscana, não indicou diferença significativa em relação ao controle (ANOVA, F= 1,052;
p= 0,421) (Figura 14)
Figura 14: Percentual médio de Tiburonella viscanavivos ao término do experimento.
2.3.1.2 Tisbe biminiensis
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
140%
Controle Alemoa Cosipa/Uniminas Marina Mariana
Per
cen
tual
de
sob
revi
vên
cia
em 1
0 d
ias
estações
55
Já para os testes com o copépodo Tisbe biminiensis, quanto ao parâmetro
sobrevivência houve diferença significativa em relação ao controle (ANOVA F=6; p= 0,
004), sendo os pontos Cosipa/Usiminas e Marina diferentes (Figura 15).
Figura 15: Percentual de fêmeas de Tisbe biminiensis vivas ao término do experimento com os
sedimentos do Sistema Estuarino de Santos e São Vicente - SP. O asterisco representa a diferença
encontrada pelo teste de Dunnett.
Para o parâmetro fecundidade (náuplios+copepoditos) de T. biminiensis não houve
diferença significativa em relação ao controle (ANOVA F=2; p= 0, 146) (Figura 16).
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
Controle Alemoa Cosipa/Usiminas Marina Mariana
Perc
en
tual d
e s
ob
reviv
ên
cia
em
7 d
ias
estações
* *
56
Figura 16: Fedundidade Total (náuplios + copepoditos) de Tisbe biminiensis ao término do experimento
com os sedimentos do Sistema Estuarino de Santos e São Vicente - SP.
No que se refere à taxa de eclosão (fecundidade/sobrevivência) não houve diferença
significativa em relação ao controle (ANOVA F= 0, 646; p= 0,638) (Figura 17).
Figura 17: Taxa de Eclosão (Fecundidade/sobrvivência) de Tisbe biminiensis ao término do experimento
com os sedimentos do Sistema Estuarino de Santos e São Vicente - SP.
2.3.1.3 Nitokra sp
0
100
200
300
400
500
600
700
Controle Alemoa Cosipa/Usiminas Marina Mariana
Fecu
nd
idad
e m
éd
ia e
m 7
dia
s
estações
0
10
20
30
40
50
60
70
Controle Alemoa Cosipa/Usiminas Marina Mariana
Taxa
de
ecl
osã
o m
édia
em
7 d
ias
estação
57
Nos testes realizados com Nitokra sp observou-se que não houve diferença
significativa quanto a sobrevivência em relação ao controle (ANOVA F= 1,301; p=
0,314) (Figura 18).
Figura 18: Percentual de sobrevivência de fêmeas de Nitokra sp vivas ao término do experimento com
os sedimentos do Sistema Estuarino de Santos e São Vicente - SP.
Já a fecundidade (náuplios + copepoditos) foi significativamente diferente do
controle (ANOVA F= 35,44; p <0, 001). Todas as amostras testadas foram diferentes do
controle (Figura 19).
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
Controle Alemoa Cosipa/Usiminas Marina Mariana
(%)
sobre
viv
ência
em
10 d
ias
estações
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Controle Alemoa Cosipa/Usiminas Marina Mariana
Fecu
nd
idad
e m
éd
ia e
m 1
0 d
ias
Estações de coleta
* * * *
58
Figura 19: Fecundidade total (náuplios + copepoditos) de Nitokra sp ao término do experimento com os
sedimentos do Sistema Estuarino de Santos e São Vicente - SP. Os asteriscos representam as diferenças
significativas encontradas pelo teste de Dunnett.
Para a taxa de eclosão, houve diferença significativa em relação ao controle
(ANOVA F= 24,39; p< 0, 001) todos os pontos foram diferentes do controle, bem como
na fecundidade (Figura 20).
Figura 20: Taxa de eclosão (Fecundidade/sobrevivência) de Nitokra sp ao término do experimento com
os sedimentos do Sistema Estuarino de Santos e São Vicente – S. Os asteriscos são as diferenças
significativas econtradas pelo teste de Dunnett.
2.3.2 Sistema Estuarino de Suape
2.3.2.1Tisbe biminiensis
Os resultados de sobrevivência das fêmeas de T. biminiensis mostraram que não houve
diferença significativa em relação ao controle (ANOVA F= 0 ,531; p= 0,779) (Figura 21X).
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Controle Alemoa Cosipa/Usiminas Marina Mariana
Taxa
de
eclo
são
mé
dia
em
10
dia
s
Estações de Coleta
* *
* *
59
Figura 21: Percentual de sobrevivência de fêmeas de Tisbe biminiensis ao término do experimento com
os sedimentos do Sistema Estuarino de Suape – PE.
No que se refere à fecundidade, houve diferença significativa em relação ao
controle (ANOVA F= 10,78; p< 0,001). O teste a posteriore de Dunnett mostrou que os
pontos P1, P4, P5 e P6 são significativamente diferentes do controle (Figura 22).
Figura 22: Fecundidade total (náuplios+copepoditos) de Tisbe biminiensis ao término do experimento
com os sedimentos do Sistema Estuarino de Suape. Os asteriscos representam as diferenças significativas
encontradas pelo teste de Dunnett.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
controle P1 P2 P3 P4 P5 P6
Perc
en
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ias
estações
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controle P1 P2 P3 P4 P5 P6
Fecu
nd
idad
e to
tal m
éd
ia e
m 7
dia
s
estações
*
*
* *
60
Para a taxa de eclosão, houve diferença significativa em relação ao controle
(ANOVA F= 6, 328; p= 0, 001). O teste a posteriori de Dunnet mostrou que a única
amostra diferente do controle foi a P5 (Figura 23).
Figura 23: Taxa de eclosão (fecundidade/sobrevivência) de Tisbe biminiensis ao término do
experimento com os sedimentos do Sistema Estuarino de Suape - PE. O asterisco representa a diferença
encontrada pelo teste de Dunnett.
2.3.2.2 Nitokra sp
No teste realizado em paralelo com o copépodo Nitokra sp observou-se que a
sobrevivência foi significativamente diferente do controle (ANOVA F= 13,75; p<
0,001). Os pontos P3 e P4 foram superiores ao controle (Figura 24).
0
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controle P1 P2 P3 P4 P5 P6
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clo
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ia e
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dia
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*
61
Figura 24: Percentual de sorbevivência das fêmeas de Nitokra sp ao término do experimento com os
sedimentos do Sistema Estuarino de Suape - PE.
Quando analisada a fecundidade, foi detectada diferença significativa (ANOVA
F= 10,46; p< 0, 001), onde apenas a estação P4 foi semelhante quando comparada com
o controle (Figura 25).
Figura 25: Fecundidade total (náuplios+copepoditos) de Nitokra sp ao término do experiemento com
os sedimentos do Sistema Estuarino de Suape - PE. Os asteriscos representam as diferenças encontradas
pelo teste de Dunnett.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
Controle P1 P2 P3 P4 P5 P6
Perc
en
tual
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ob
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ivên
cia
em
10 d
ias
estações
0
20
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180
Controle P1 P2 P3 P4 P5 P6
Fecu
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tal m
éd
ia e
m 1
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ias
estações
* *
*
*
*
62
No que se refere à taxa de eclosão diferenças significativa foram encontradas
(ANOVA F= 13,75; p< 0,001), todos os pontos amostrados apresentaram taxas
inferiores a aquelas observadas no controle (Figura 26).
Figura 26: Taxa de eclosão (fecundidade/sobrevivência) de Nitokra sp ao término do experimento com
os sedimentos do Sistema Estuarino de Suape. Os asteriscos representam as diferenças encontradas pelo
teste de Dunnett.
2.3.3 Pina
2.3.3.1 Tisbe bimininsis
Nos testes realizados com T. biminiensis não houve variação na sobrevivência,
ou seja, ao término do testes todas as fêmeas estavam vivas (Figura 27a). O parâmetros
de fecundidade foi significativamente diferente do controle (t= 3,492; p= 0,039), já taxa
de eclosão também foi diferente do controle (t= 3, 492; p= 0,039) (Figura 27b e 27c
respectivamente).
0
2
4
6
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10
12
14
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20
Controle P1 P2 P3 P4 P5 P6
Taxa d
e e
clo
são
méd
ia e
m 1
0 d
ias
estações
* *
*
*
*
*
63
Figura 27: a – Percentual de fêmeas de vivas, b- Fecundidade total (náuplios + copepoditos) e c- Taxa
de eclosão (fecundidade/sobrevivência) de Tisbe biminiensis ao término dos experimentos com os
sedimentos do Sistema Estuarino de Suape. Os asteriscos representam a diferença significativa encontrada
no teste ―t‖
2.3.3.2 Nitokra sp
Os resultados do teste realizado com Nitokra sp mostram que para a
sobrevivência não foi diferente do controle (t= 0,676; p= 0,547) (Figura 28a). No que se
refere à fecundidade houve diferença significativa em relação ao controle (t= 5,615; p=
0,011) e para a taxa de eclosão, também observou-se diferença significativa (t= 36,459;
p< 0,001) (Figura 28b, c respectivamente).
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Controle Pina
Pe
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ob
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ia e
m 7
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ias
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0
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Controle Pina
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nd
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em
7 d
ias
*
b
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Controle Pina
Ta
xa
de
ec
los
ão
em
7 d
ias
*
c
64
Figura 28: a – Percentual de fêmeas de vivas, b- Fecundidade total (náuplios + copepoditos) média e c-
Taxa de eclosão (fecundidade/sobrevivência) média de Nitokra sp ao término do experimento com os
sedimentos do Sistema Estuarino de Suape - PE. Os asteriscos representam a diferença significativa
encontrada no teste ―t‖
2.4 DISCUSSÃO
Segundo Melo & Nipper, (2007) a resolução do CONAMA nº344 (2004) para
sedimentos provenientes de dragagem, recomenda que estes sejam submetidos a testes
de toxicidade. A mesma resolução ainda sugere que os critérios para avaliação dos
resultados sejam baseados na DQS (Diretrizes de Qualidade de Sedimento)
desenvolvida pelos Estados Unidos e Canadá. A avaliação química feita nos sedimentos
também deve ser baseada nos SQGs. Como o sistema estuarino de Santos é um local
que passa por dragagens periódicas, a realização do teste com anfípodos como meio de
0%
20%
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s
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65
comparação entre os testes com copépodos foi importante para uma melhor observação
dos resultados obtidos.
De acordo com o trabalho de Torres et al., (2009), foi constatado que os
sedimentos dragados do porto de Santos não causam toxicidade ao anfípodo Tiburonella
viscana. O que corrobora os dados obtidos no presente estudo.
O teste de toxicidade expondo, o copépodo T. biminiensis aos sedimentos
coletados no Complexo estuarino de Santos e São Vicente mostrou que, os resultados
obtidos não foram semelhantes àqueles observados com o anfípodo T. viscana. O
parâmetro sobrevivência foi o único que se apresentou diferente significativamente em
relação ao controle, o sedimento coletado nos pontos Cosipa/Usiminas e Marina
localizados no estuário de Santos e São Vicente – SP, respectivamente, foram distintos
estatisticamente. Os demais parâmetros estabelecidos (Fecundidade e taxa de eclosão)
não apresentaram diferenças significativas em relação ao controle.
Já na exposição do copépodo Nitokra sp, os parâmetros fecundidade e taxa de
eclosão foram diferentes do controle em todas as amostras coletadas. O organismo em
questão apresentou sensibilidade a todos os sedimentos aos quais foi exposto,
demostrando maior sensibilidade aos sedimentos que os demais organismos testados.
Segundo Abessa (2003), a contaminação por metais na área interna do canal de
Santos pode ser considerada crítica, as concentrações de Cd, Cr, Hg e Ni estavam acima
dos níveis potencialmente tóxicos. Os níveis de Hidrocarbonetos Policíclicos
Aromáticos (PHA’s) de acordo com os dados obtidos por (Abessa, 2002; Lamparelli et
al., 2001; Bonetti, 2000; Prósperi et al. 1988; Medeiros, 2000) foram muito elevados,
PCB’s, dioxinas e furanos também foram encontradas (Lamparelli et al., 2001; Bonetti,
2000). Para o canal de São Vicente não foi possível comparação por não haver uma base
66
de dados da qualidade dos sedimentos. Os elevados níveis de mercúrio foram
relacionados com a atividade industrial, operação dos terminais e o aporte vindo dos
rios (Lamparelli et al., 2001). Os sedimentos de São Vicente apresentam altos níveis de
hidrocarbonetos alifáticos (Abessa, 2002; Bonetti, 2000; Medeiros, 2000),
hidrocarbonetos halogenados como clorofórmio, tricloroetileno e hexaclorobenzeno
(Lamparelli et al., 2001), detergentes (Abessa, 2002; Medeiros, 2000).
Abessa et al., (2001) numa avaliação preliminar da toxicidade dos sedimentos do
Sistema Estuarino de Santos e São Vicente observou que os sedimentos apresentaram
toxicidade ao anfípodo T. viscana. No mesmo estudo observou-se também, que dos
contaminantes avaliados DDT, Dieldrin, Hg, Pb, Zn e Cu todos excederam os limites
estabelecidos pelos critérios internacionais de referência. De acordo com Cesar et al
(2007) que comparou a toxicidade dos estuários de Santos e São Vicente com estuários
de Cádiz na Espanha, os sedimentos coletados em 2 pontos da baixada santista
apresentaram alta toxicidade aos anfípodos.
Torres et al., (2009), observaram que os sedimentos do porto de Santos
apresentam concentrações elevadas de alguns contaminantes, excedendo os níveis 1 e 2
do CONAMA 344/04. O mesmo estudo classifica os sedimentos do Ponto Alemoa
como de classe D, baseado no organograma proposto por Mozeto et al.,(2006), este
utiliza-se de dados químicos e ecotoxicológicos na classificação dos sedimentos.
Ao longo do tempo a qualidade dos sedimentos do complexo portuário de Santos
foi melhorando, devido à fiscalização da CETESB, no entanto, os sedimentos devem
apresentar algum contaminante dos mencionados anteriormente com concentração
elevada. Pois, afetaram significativamente a sobrevivência de T. biminiensis e a
fecundidade e taxa de eclosão de Nitokra sp (Tabela 1).
67
Tabela 1: Comparação da toxicidade entre Tisbe biminiensis e Nitokra sp nos parâmetros analisados
quando expostos aos sedimentos do complexo Estuarino de Santos e São Vicente - SP.
Sistema Estuarino de Santos e São Vicente
Sobrevivência
Organismos Alemoa Cosipa/Usiminas Marina Mariana
Tiburonella viscana NT NT NT NT
Tisbe biminiensis NT TA TA NT
Nitokra sp NT NT NT NT
Fecundidade
Tisbe biminiensis NT NT NT NT
Nitokra sp TC TC TC TC
Taxa de Eclosão
Tisbe biminiensis NT NT NT NT
Nitokra SP TC TC TC
TC
NT- não tóxico; TA- toxicidade aguda; TC – toxicidade crônica
Na exposição dos copépodos aos sedimentos contaminados coletados no
Complexo Estuarino de Suape, observamos que há um padrão nos resultados
observados. Não foi observada diferença significativa em relação ao controle, quanto à
sobrevivência, os organismos não apresentaram sensibilidade letal aos sedimentos. No
entanto, para a fecundidade, houve toxicidade em 2 amostras para o copépodo T.
biminiensis, já para Nitokra sp, houve toxicidade em 5 amostras. Quando observamos a
taxa de eclosão, que é a relação entre a fecundidade total e o número de fêmeas ao final
do teste observa-se que para o Tisbe houve toxicidade em apenas uma amostra, para
Nitokra todas as amostras testadas foram diferentes do controle (Tabela 2). A taxa de
eclosão é um dado preocupante, pois os contaminantes presentes nos sedimentos
interferem diretamente na produção de prole.
68
Tabela 2: Comparação da toxicidade entre Tisbe biminiensis e Nitokra sp nos parâmetros analisados
quando expostos aos sedimentos do complexo Estuarino de Suape - PE.
Sistema Estuarino de Suape
Sobrevivência
Organismos P1 P2 P3 P4 P5 P6
Tisbe biminiensis NT NT NT NT NT NT
Nitokra sp NT NT NT NT NT NT
Fecundidade
Tisbe biminiensis TC NT NT TC TC TC
Nitokra sp TC TC TC NT TC TC
Taxa de Eclosão
Tisbe biminiensis NT NT NT NT TC NT
Nitokra sp TC TC TC TC TC TC
NT – não tóxico; TC – toxicidade crônica; TA – toxicidade aguda.
Estudos recentes realizados na área do Complexo Portuário de Suape mostraram que os
compartimentos água e sedimento encontram-se comprometidos (Araújo, 2008; Araujo-
Castro, 2008; Chagas, 2003). Desde o ano de 2003 testes de toxicidade vem sendo
realizados com os sedimentos do Sistema Estuarino de Suape, ao longo dos anos a
subletalidade nos testes de toxicidade sempre foi observada. Araújo-Castro em (2008)
comparou os níveis de metais e HPA’s encontrados no Porto de Suape em relação a
outras localidades no Brasil e no mundo. As concentrações de metais encontradas para
em Suape foram inferiores as observadas em outras localidades, de modo geral os
efeitos tóxicos são ocasionalmente ou raramente esperados tanto para metais quanto pra
HPA’s. Para os sedimentos estuarinos de Suape, Nitokra sp demonstrou ser mais
sensível que T. biminiensis. Apenas o ponto P4 não foi diferente do controle
significativamente quanto à fecundidade, no entanto, na relação fecundidade/fêmea
houve diferença.
69
Por fim, a exposição dos copépodos ao sedimento coletados nas proximidades
da Ilha de Deus mostrou que ambos foram sensíveis a amostra testada. Sendo assim,
para este sedimento em questão não houve diferenças nos resultados observados entre
os copépodos (Tabela 3). Oliveira (2008) avaliou a toxicidade dos sedimentos do
Parque dos Manguezais, e observou que as amostras de sedimentos coletadas no rio
Jordão, apresentaram toxicidade letal e subletal ao copépodo Tisbe biminiensis.
Segundo trabalho publicado por Silva et al., (2010), os níveis dos metais traços Zn, Mn
e Cr na área é mais elevado que os valores de referência estabelecidos.
Tabela 3: Comparação da toxicidade entre Tisbe biminiensis e Nitokra sp nos parâmetros analisados
quando expostos aos sedimentos da Ilha de Deus , Parque dos Manguezais - PE.
Pina
Organismos Sobrevivência
Tisbe biminiensis NT
Nitokra SP NT
Fecundidade
Tisbe biminiensis TC
Nitokra SP TC
Taxa de Eclosão
Tisbe biminiensis TC
Nitokra SP TC
NT – não tóxico; TA – toxicidade aguda; TC – toxicidade crônica
Araújo-Castro (2008) realizou um estudo comparativo entre a sensibilidade do
copépodo T. biminiensis e da pós-larva do camarão Litopenaeus vannamei aos
sedimentos da Baía de Todos os Santos, e observou que o camarão não apresentou
70
sensibilidade aos sedimentos testados, enquanto o copépodo apresentou toxicidade
subletal.
Os testes de referência são imprescindíveis na realização dos testes e toxicidade,
Araujo- Castro et al., (2009) observaram que a CL50-96h de T. biminiensis para o
K2Cr2O7 foi 9,45 mg.L-1
e DSS (Dodecil Sulfato de Sódio) 8,70 mg.L-1
(Araújo et al,
2006) . Já para Nitokra sp, a CL50 do K2Cr2O7 segundo Bergmann Fillho, 2006 foi em
torno de 21 mg.L-1
, para DSS 7,24 mg.L-1
e Sulfato de Zinco 3,26 mg.L-1
(Machado,
2010).
Em ecotoxicologia o ideal para a avaliação de um local impactado é fazer pelo
menos três diferentes testes, estes utilizando indivíduos de diferentes níveis tróficos. No
entanto, não é necessário utilizar uma espécie de um mesmo grupo de organismos,
espécies do mesmo grupo geralmente apresentam sensibilidade semelhante, e,
organismos de níveis tróficos distintos podem apresentar sensibilidades diferentes
(Aragão & Araújo, 2006).
Os testes realizados mostram a importância na utilização de organismos como os
copépodos, pois são de fácil obtenção em cultivos, os bioensaios são rápidos e nos dão
resultados coerentes e semelhantes a outros testes de toxicidade.
2.5 CONCLUSÃO
Os testes realizados com os sedimentos do Sistema Estuarino de Santos e São
Vicente, Sistema Estuarino de Suape e Pina demonstraram que ambos os copépodos
foram sensíveis a contaminação histórica de seus sedimentos. Os copépodo Tisbe
biminiensis e Nitokra sp foram sensíveis ao endpoint subletal. Os resultados obtidos
corroboram a hipótese proposta de que os dois copépodos testados são sensíveis e
71
mostram um padrão semelhante na resposta ecotoxicológica. No entanto, Nitokra
apresenta uma maior sensibilidade. O copépodo Nitokra sp é uma espécie estuarina, já
Tisbe biminiensis é uma espécie marinha, portanto, são organismos complementares,
cada uma das espécies deve ser utilizada de acordo com a origem da amostra ambiental
a ser testada.
Logo, ambos os organismos podem ser utilizados, recomenda-se a utlização dos
dois testes em paralelo quando possível, a fim de obter uma resposta ecotoxicológica da
amostra ambiental mais conclusiva, bem como realizar testes com organismos de outros
níveis tróficos.
2.6 REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA
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