Automatisation du marquage des ADN pour l’Analyse Chromosomique sur Puces à ADN
(ACPA): validation de la station BRAVO au CHU de Lyon.
Lyon le 10 Septembre 2014 1
Jessica MICHEL Laboratoire de Cytogénétique Constitutionnelle
Groupement Hospitalier Est du CHU de Lyon
2
La plateforme ACPA de Lyon
Lyon le 10 Septembre 2014
• Depuis 2007Déficiences intellectuelles isolées/syndromiques et syndromes malformatifs
• Depuis 2011Troubles du spectre autistique
• Depuis 2013Syndromes polymalformatifs en prénatal
3
CGH array0
200
400
600
800
1000
1200
172
382
499
589645
753
1034
ACPA : bilan CHU Lyon
2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013
Lyon le 10 Septembre 2014
La plateforme ACPA de Lyon
Nécessité d’automatisation
• Extraction ADN: Hamilton (en cours de validation) -> utilisation début 2015
• Technique ACPA : BRAVO Agilent
• Interprétation résultats: - Agilent Cytogenomics- Cartagenia
4Lyon le 10 Septembre 2014
La plateforme ACPA de Lyon
Préparation des ADN et pipetage Peut traiter 48 patients en simultané
Améliorations attendues:Gain de temps.Reproductibilité de la
technique.Qualité des résultats.Risque d’erreur réduit. Traçabilité.
6Lyon le 10 Septembre 2014
Agilent Bravo Automated Liquid Handling Platform
Douchette codes à barres
ThermocycleurScelleuse Thermique
( + films thermosensibles)
Centrifugeuse compatible avec les plaques PCR 96 puits
Lyon le 10 Septembre 2014 7
Appareillages spécifiques
2 « Racks » pour
microtubes 1.5mL
Pour une série de 48 patients
8
Consommables spécifiques
1 plaquepurification
5 Boites 96 pointes 250µL (Tips) 1 plaque
« deep well 384 puits» réutilisable 1 seule fois
1 plaque « réservoir » réutilisable
1 plaque « poubelle » réutilisable
Films protecteurs
3 Plaques PCR 96 puits
Avant passage sur le BRAVO
Lyon le 10 Septembre 2014 9
Préparation d’une technique
Nous indiquons le nom, le prénom, notre n° SGL, concentration ADN
Lyon le 10 Septembre 2014 10
Création automatique des plans de dépôt
Lyon le 10 Septembre 2014 11
Création automatique du fichier pour le BRAVO
Format csv
Lyon le 10 Septembre 2014 12
Création automatique des étiquettes pour les tubes « finaux » (ADN marqués et combinés en « dye-swap »)
Lyon le 10 Septembre 2014 13
Création automatique de l’attributefile pour Cytogenomics
Lyon le 10 Septembre 2014 14
Patient A
Patient BPatient D
Patient C
Cy5
Cy5
Cy5
Cy5
Cy3
Cy3
Cy3
Cy3
Image en miroir
Quatuor
Adaptation du protocole BRAVO.
del(13)(q33.1) et dup(13)(q33.1q34)
15Lyon le 10 Septembre 2014
ACPA : Technique en « Dye-Swap »
• Etape 1 : Dilution des ADN (1µg d’ADN/par patient/couleur) • Etape 2 : Digestion des ADN (enzymes de restriction)
• Etape 3 : Marquage des ADN (Cyanine 5 / Cyanine 3)
• Etape 4 : Purification des ADN marqués sur plaques
• Etape 5 : Combinaison des ADN / Re-tube
• Etape 6 : Dosage des fluorochromes
• Etape 7 : Hybridation des ADN combinés sur lame
• Etape 8 : Lavage des lames – lecture scanner
• Etape 9 : Traitement informatique des données.
Etapes automatiséespar le BRAVO
Lyon le 10 Septembre 2014 16
Application du protocole Bravo à l’ACPA pour Lyon
Lyon le 10 Septembre 2014 17
Adaptation du protocole Bravo à l’ACPA pour Lyon
• Etape 1 : Dilution des ADN (1µg d’ADN/par patient/couleur) • Etape 2 : Digestion des ADN (enzymes de restriction)
• Etape 3 : Marquage des ADN (Cyanine 5 / Cyanine 3)
• Etape 4 : Purification des ADN marqués sur plaques
• Etape 5 : Combinaison des ADN / Re-tube
• Etape 6 : Dosage des fluorochromes
• Etape 7 : Hybridation des ADN combinés sur lame
• Etape 8 : Lavage des lames – lecture scanner
• Etape 9 : Traitement informatique des données.
Etapes automatisées par le BRAVO
Etapes manuelles
Essais sur 24 patients (soit 6 Quatuors):Test 1 : Vérifications d’anomalies connuesTest 2 : Technique automatisée VS Technique manuelleTest 3: Patient commun à trois quatuors ->
reproductibilité des résultats.Test 4: Self-Self.Test 5: ADN issus de 4 tissus de types différents.
Problèmes initiaux rencontrés:Programmation : plan de dépôt Normalisation : volume d’eau prévu erroné -> rajout d’eau au
cours de processusMix marquage : protocole « CGH/SNP enzymatic » -> rajout de
mix manuellement en cours de processusRe-tube : tout l’ADN marqué n’est pas récupéré à la fin de la
technique (1/3)Lyon le 10 Septembre 2014 18
Validation : Premiers essais
Patient A (technique manuelle du 15.04.13)DLRS 0.13 / 0.15
del(17)(p11.2p11.2) de 4.7Mbde 15,786,351 à 20,515,050pb (hg19)
Patient A (BRAVO le 23.12.13)DLRS 0.20 / 0.20
del(17)(p11.2p11.2) de 4.7Mbde 15,786,351 à 20,515,050pb (hg19)
Test 1 : Vérifications d’anomalies connues (Quatuor 1)Patient A grand CNV pathogènePatient B dérivé de translocationPatient C petit CNV pathogènePatient D grand CNV en mosaïque
Lyon le 10 Septembre 2014 19
Manuel BRAVO
Test 1 : Vérifications d’anomalies connues (Quatuor 1)Patient A grand CNV pathogènePatient B dérivé de translocationPatient C petit CNV pathogènePatient D grand CNV en mosaïque
Patient C (technique manuelle du 10.04.13)
DLRS 0.16 / 0.16
del(X)(q26.3) de 40.7kb de 135,080,988 à 135,121,564pb (hg19)
Patient C (BRAVO le 23.12.13)
DLRS 0.20 / 0.28
del(X)(q26.3) de 40.7kb de 135,080,988 à 135,121,564pb (hg19)
Lyon le 10 Septembre 2014 21
Manuel BRAVO
Test 1 : Vérifications d’anomalies connues (Quatuor 1)Patient A grand CNV pathogènePatient B dérivé de translocationPatient C petit CNV pathogènePatient D grand CNV en mosaïque
Patient D (technique manuelle du 06.08.13)DLRS 0.12 / 0.15
Dup(19)(p13.12-p12) de 8.3Mb de 15,987,511 à 24,340,741pb (hg19) en mosaïque à 58%
Patient D (BRAVO le 23.12.13)DLRS 0.20 / 0.20
Dup(19)(p13.12-p12) de 8.3Mb de 15,987,511 à 24,340,741pb (hg19) en mosaïque à 44%
Test 1: Toutes les CNV pathogènes ont été retrouvés à l’oligo prêt.22
Manuel BRAVO
Lyon le 10 Septembre 2014
Test 2 : (Quatuor 2) : Technique automatisée VS Technique Manuelle
Cy5 Cy3 Cy5 Cy3Patient I 0.20 0.17 0.12 0.14Patient H 0.14 0.20 0.12 0.12Patient G 0.20 0.14 0.13 0.12Patient F 0.17 0.20 0.14 0.13
DLRSBRAVO
(premiers essais)Manuelle
Qualité de la technique BRAVO dépendant des problèmes
techniques rencontrés.
Patient G : Technique Manuelle Patient G : BRAVO
Test 2 : Test à refaire
Lyon le 10 Septembre 2014 23
Manuel BRAVO
Test 3 : un patient (Quatuors 2 – 3 – 4) Patient E analysé 3 fois dans 3 quatuors différents (contre de nouveaux patients/témoins à chaque fois: patients F à N.)Technique réalisée le même jour, en même temps -> Lames hybridées à des dates ultérieurs différentes.
Quatuor 1DLRS
0.23/0.19
Quatuor 2DLRS
0.26/0.20
Quatuor 3DLRS
0.21/0.22
Test 3 : Test validé, les mêmes CNV sont retenus
Lyon le 10 Septembre 2014 24
Test 4: Self-self : Patient O Cy5 / Patient O Cy3La « moving average » reste centrée sur le log²=0
DLRS : 0.20Interval Based Report : 0 CNV
Lyon le 10 Septembre 2014 25
Test 5 : Analyse d’ADNs issus de différents prélèvements. (Quatuor 6)
Patient R Tissu congeléPatient S Sang (technique classique avec 2mL de sang)Patient T Liquide Amniotique (CBC : culture)Patient U Sang (quantité sang>2mL)
Technique manuelle du 28.01.13
Patient R Cy5 / Témoin Tissu Cy3 DLRS 0.15
del(4)(q32.2) de 258kb allant de 164,758,325 à 165,015,998pb (hg19)
Technique BRAVO le 23.12.13
Patient R Cy5 / Patient UCy3 DLRS 0.22
Patient S Cy5 / Patient R Cy3DLRS 0.18
del(4)(q32.2) de 258kb allant de 164,758,325 à 165,015,998pb (hg19)
Lyon le 10 Septembre 2014 26
Manuel
BRAVO
Test 5 : Analyse d’ADNs issus de différents prélèvements. (Quatuor 6) Patient R Tissu congeléPatient S Sang (technique classique avec 2mL de sang)Patient T Liquide Amniotique (CBC : Culture)Patient U Sang (quantité sang>2mL)
Technique BRAVO le 23.12.13
Patient T Cy5 / Patient S Cy3 DLRS 0.21
IBR 27 CNVs
Patient U Cy5 / Patient T Cy3DLRS 0.30
IBR 26 CNVs
Lecture visuelle : 10 CNV retenus
Technique manuelle du 06.06.13
Patient T Cy5 / Témoin Cy3DLRS 0.27
IBR 25
Lecture visuelle : 9 CNV retenus
27
Manuel
BRAVO
Lyon le 10 Septembre 2014Test 5 : Technique adaptable sur tissus spéciaux -> quantité d’ADN (Volume mini Bravo)
1Janvier-Février : 2 Séries de 24 patients
Evènements et modifications du protocole
Tests « à blanc » : heurt entre le bras de l’appareil et la « deep well 384 » -> 3 « têtes préleveuses » cassées à changer -> adaptation au consommable « deep well 384 » achetée (Marché HCL)
Installation caisson -> décalage de la tête du Bravo
Répartition mix de digestion : pas de mix dans 2 colonnes-> 2/6 Quatuors non marqués à refaire
Þ Intervention Agilent -> re-paramétrage des axes-> affiner le réglage de la hauteur
28Lyon le 10 Septembre 2014
Premières séries de patients
Premières série : améliorations apportées -> Tester « à blanc » toutes les étapes-> 2 quatuors à refaire
Troisième série : 6 quatuors validés
Lyon le 10 Septembre 2014 30
2Mars : Séries de 24 patients
Premières séries de patients
Résultats corrects: 0,15<DLRS<0,20 environ 10 CNV/patient
Mais problèmes rencontrés : apparitions de bulles -> problèmes de volumes
Intervention Agilent
Lyon le 10 Septembre 2014 31
Validation de méthodes
Série de 24 patients dont 12 patients avec anomalie connueChaque Quatuor = 2 anciens patients + 2 nouveaux patients
Toutes les anomalies connues ont été retrouvées.
Validation technique du Bravo (sur 24 patients)
Tests « à blanc » : Digestion – Marquage – Combinaison – Retube ( étapes ayant subi des changements)
Normalisation erronée -> blocage à 23/48 patients.-> intérêt de tester « à blanc » toutes les étapes avec le véritable nombre de
patients.
Installation du nouveau protocole « normalisation ».
Problème de format du fichier « feuille de route » -> caractères spéciaux.
Plaque PCR défectueuse / Echec technique
Intervention Agilent
Lyon le 10 Septembre 2014 32
3Mars : Série de 48 patients
Suite séries de patients
1 Série de 48 patients perdue.-> passage à 48 patients pas encore possible.
Lyon le 10 Septembre 2014 33
Suite séries de patientsMai – Juin – Juillet
Problèmes à résoudre Programmation -> Bulles -> Répartition mix digestion : inégale -> rajout manuel -> Déplacement du bras
Gestion des erreurs -> Problème position des « Tips »
Intervention Agilent
Série de 48 patients validée suite à l’intervention d’Agilent
Depuis juillet : 2 séries de 48 sans problème : Passage en routine
Temps gagné
BRAVO (48 patients) Etapes Manuelle (8 patients)
1H Préparation (feuille de route, ADNs, …) 30 min
3H Normalisation (+ Split TipBox)45 min
30 min Digestion
2H Marquage 30 min
2H Purification 1H30
1H Combinaison et Re-tube 10 min
≈ 12 min / patient ≈ 25 min / patient
Lyon le 10 Septembre 2014 34
Evaluation du temps technique
Avantages Limites
Vitesse -> tps technique/patient réduit
Reproductibilité -> démarche qualité
Qualité des résultats
Réactivité du support technique
Traçabilité (réactifs et patients) -> démarche qualité
Préparation en amont -> 48 dossiers
Tests « à blanc » obligatoires
Applicable pour 4x180K pour l’instant
Volume d’ADN mini (+5µL) et microtubes compatibles avec « Racks » -> aliquots reçus extraits/échantillons précieux
Formation logiciel et problèmes informatiques
Consommables (quantité, colonnes de purifications non utilisées)
Lyon le 10 Septembre 2014 35
Avantages / Limites de la technique
Réorganisation du service -> 1 technicien/Bravo -> hybridations « en série » par autres techniciens.
Tests « à blanc » sur toutes les étapes et pour chaque programme (nombre patients – formats lames)-> après chaque modification -> temps + consommables
Perspectives :
Automatisation plus globale du processus « ACPA »: Extraction ADN Passage à Cytogenomics -> possibilité d’autoprocessing
Refaire quelques tests-> « Validation des méthodes » -> Accréditation
ACPA en acquis : ADN patients / ADN Témoin -> reprogrammation Intervention Agilent
Lyon le 10 Septembre 2014 36
Conclusions et perspectives
Remerciements
ACPADamien Sanlaville
Marianne Till Audrey LabalmeNicolas ChatronCaroline Schluth
Eudeline AlixChantal Beche
Christelle AngeiLaurence CaineHélène GuilbertIsabelle Morin
Clément BonnefilleCassandra NivouJessica Michel
LaboratoireCaroline Perbet
Emmanuelle Banquart Christine Bel
Anne FautrelleCatherine Hempel
Brigitte JelassiSylvie Josué
Chantal LavertMichelle MartinChristine ValexCorinne Buis
Azim RafatPatrick Edery
Réseau AChroPuce
Lyon le 10 Septembre 2014 37
Automatisation du marquage des ADN pour l’Analyse Chromosomique sur Puces à ADN (ACPA): validation de la station BRAVO au CHU de Lyon.
Support Agilent
Dosage des Cyanines au Spectrophotomètre Nanodrop1000
En manuel Avec BravoCyanine 5
Concentration ADNCy5
Quantité fluorochrome
Cyanine 3Concentration ADNCy3
Quantité fluorochrome
Cyanine 5 / Cyanine 3Concentration ADNCy5 / Cy3
Quantité fluorochromes combinés
Dilution car volume 2X plus grand.Bruit de fond Cy3 dans Cy5.
Lyon le 10 Septembre 2014 38
Adaptation du protocole Bravo à l’ACPA pour Lyon
En manuel
39
Adaptation du protocole Bravo à l’ACPA pour Lyon
Dosage des Cyanines au Spectrophotomètre Nanodrop1000
En manuel
40
Adaptation du protocole Bravo à l’ACPA pour Lyon
Dosage des Cyanines au Spectrophotomètre Nanodrop1000
Avec Bravo
41
Adaptation du protocole Bravo à l’ACPA pour Lyon
Dosage des Cyanines au Spectrophotomètre Nanodrop1000
Modifications Conséquences
Digestion – Marquage : Possibilité d’introduire un « STOP » entre la digestion et le marquage
Répartir la technique sur plusieurs jours
Digestion : Suppression de l’étape de transfert de la plaque « ADN normalisés » vers une 2nde plaque « digestion »
Gain de temps Gain de quantité d’ADN Economie de consommables
Re-tube :Récupérer tout l’ADN marqué/combiné
Gain de quantité d’ADN marqué Etape de concentration
« speedvacc » supplémentaire
Lyon le 10 Septembre 2014 42
Modifications supplémentaires demandées