MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL SAÚDE PÚBLICA
ANA CARLA PEIXOTO GUISSONI
ATIVIDADE LARVICIDA DE ANACARDIUM OCCIDENTALE COMO ALTERNATIVA DE CONTROLE PARA AEDES AEGYPTI
E SUA TOXICIDADE EM ANIMAIS DE LABORATÓRIO
Orientadora: Profª. Drª. Heloisa Helena Garcia da Silva
Goiânia-GO, 2011
i
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA
ANA CARLA PEIXOTO GUISSONI
ATIVIDADE LARVICIDA DE ANACARDIUM OCCIDENTALE COMO ALTERNATIVA DE CONTROLE PARA AEDES AEGYPTI
E SUA TOXICIDADE EM ANIMAIS DE LABORATÓRIO
Orientadora: Profª. Drª. Heloisa Helena Garcia da Silva
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade Federal de Goiás como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre, na área de concentração de Parasitologia.
Goiânia-GO, 2011
ii
Dedico este trabalho a meus
pais,
Carlos Alberto Guissoni e
Antônia Modesto Peixoto
Guissoni.
iii
Agradecimentos
Agradeço primeiramente a Deus, Pai-Criador, por mais uma conquista,
pela oportunidade da vida e do aprendizado. Que eu possa utilizar os
conhecimentos adquiridos à luz de Sua sabedoria;
Aos meus pais e minhas irmãs, que mesmo à distância não deixaram de
me apoiar e de acreditar em mim. Saibam que a saudade nos momentos de
maiores dificuldades, somente valorizou ainda mais essa minha conquista;
Ao Gustavo, pela compreensão, apoio, encorajamento nas horas de
dúvida e pelo amor que tem por mim;
A Dra. Heloisa Helena Garcia da Silva, Professora Adjunto do
Departamento de Microbiologia, Imunologia, Patologia e Parasitologia
(DMIPP), do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública (IPTSP), da
Universidade Federal de Goiás (UFG), pela orientação, dedicação,
ensinamentos e apoio imprescindíveis neste trabalho;
Ao Dr. Ionizete Garcia da Silva, professor Titular do Departamento de
Microbiologia, Imunologia, Patologia e Parasitologia (DMIPP), do Instituto
de Patologia Tropical e Saúde Pública (IPTSP), da Universidade Federal de
Goiás (UFG), pelo apoio e sugestões;
Ao IPSTP e ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e
Saúde Pública da UFG pela oportunidade;
iv
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior,
CAPES, pelo apoio financeiro concedido;
A Carmeci Natalina Elias, Técnica de Laboratório da Secretaria de
Estado da Saúde de Goiás/ Fundação Nacional de Saúde-GO e aos amigos
Edson de Castro, Girlene Sena de Assis e Taísia Izabel Vieira, do
Laboratório de Biologia e Fisiologia de Insetos, do IPTSP/UFG, pelo apoio
técnico e amizade durante o desenvolvimento deste trabalho.
Ao Dr. Jayrson Araújo de Oliveira, Professor Adjunto do
Departamento de Morfologia, do Instituto de Ciências Biológicas da UFG,
pela ajuda na formatação final deste trabalho;
Aos amigos do Laboratório de PD&I de Produtos Fitoterápicos, da
Faculdade de Farmácia.
v
Sumário
Lista de Abreviações e Símbolos ....................................................................Vii
Lista de Figuras.................................................................................................iX
Lista de Tabelas................................................................................................X
Resumo.............................................................................................................Xi
Abstract.............................................................................................................Xiii
1. Introdução................................................................................................. 15
1.1 Dengue......................................................................................................15
1.2 Aedes aegypti............................................................................................19
1.3 Controle e Resistência do Vetor................................................................ 22
1.4 Inseticidas Alternativos.............................................................................. 25
1.5 Inseticidas Botânicos................................................................................. 27
1.6 Bioprospecção........................................................................................... 28
1.7 Anacardium occidentale.............................................................................30
1.8 Toxicidade Aguda em Animais de Laboratório.......................................... 32
2. Objetivos.................................................................................................... 33
2.1 Geral.......................................................................................................... 33
2.2 Específicos................................................................................................ 33
3. Material e Métodos.................................................................................... 34
3.1 Obtenção do Material Botânico................................................................. 34
3.2 Obtenção do Líquido da Castanha de Caju............................................... 34
3.3 Fracionamento do Líquido da Castanha de Caju ..................................... 35
3.4 Obtenção das Larvas..................................................................................36
3.5 Bioensaios Larvicidas em Laboratório....................................................... 37
3.6 Efeito Residual do Líquido da Castanha de Caju...................................... 38
vi
3.7 Ensaio de toxicidade aguda do Líquido da Castanha de Caju, segundo as diretrizes da OECD 2001.......................................................................... 39
3.7.1 Descrição dos Animais........................................................................... 39
3.7.2 Alojamento e Manejo dos Animais......................................................... 40
3.7.3 Descrição do Protocolo Experimental.................................................... 40
4. Resultados e Discussão......................................................................... 40
5. Referências Bibliográficas...................................................................... 42
Artigo I - Submetido á Revista da Sociedade Brasileira de Medicida Tropical
Atividade larvicida de Anacardium occidentale como alternativa ao controle de
Aedes aegypti e sua toxicidade em Rattus novergicus .................................. 57
RESUMO......................................................................................................... 56
ABSTRACT...................................................................................................... 57
INTRODUÇÃO................................................................................................. 57
MÉTODOS....................................................................................................... 58
RESULTADOS................................................................................................. 61
DISCUSSÃO.................................................................................................... 63
AGRADECIMENTOS....................................................................................... 65
REFERÊNCIAS................................................................................................ 66
vii
Lista de abreviações e símbolos
AO Anacardium occidentale
ANOVA Análise de Variância
Bti
BC
BHC
Bacillus thuringiensis var israelensis
Biotério Central
Benzeno-Hexa-Clorado
°C Graus Celsius
CDC Centers for Disease Control and Prevention
CL Concentração letal
CL50 Concentração letal que mata 50% das larvas
CL90
CNSL
Concentração letal que mata 90% das larvas
Cashew nut shell liquid
DMSO Dimetilsulfóxido
DEN V 1 Dengue vírus 1
DEN V 2 Dengue vírus 2
DEN V 3 Dengue vírus 3
DEN V 4
FF
Dengue vírus 4
Faculdade de Farmácia
FHD Febre hemorrágica do dengue
FUNASA Fundação Nacional de Saúde
g gramas
viii
h
Hj
IPTSP
Horas
Hormônio juvenil
Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública
L
LCC
Litros
Líquido da Castanha do Caju
MS
NEPET
OECD
Ministério da Saúde
Núcleo de Estudos e Pesquisas Tóxico-Farmacológicas
Organization for Economic Co-operation and Development
OMS Organização Mundial de Saúde
OPAS
PNCD
Organização Pan-Americana da Saúde
Plano Nacional de Controle da Dengue
SVS
UBV
UFG
Secretaria de Vigilância em Saúde
Ultra baixo volume
Universidade Federal de Goiás
WHO World Health Organization
ix
Lista de figuras
Figuras da Apresentação
Figura 1: Ciclo Biológico do Aedes aegypti Imagens da criação cíclica mantida no Laboratório de Biologia e Fisiologia de Insetos, do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás .......................... 21
Figura 2: Caju, castanha de caju e líquido da castanha de caju (Fonte: Mazzetto et al. 2009)........................................................................................ 31
Figura 3: Exsicata autenticada mantida no Herbário da Unidade de Conservação da Universidade Federal de Goiás ............................................ 34
Figura 4: Aspecto do Líquido da Castanha de Caju, obtido em estufa de ventilação forçada ............................................................................................ 35
Figura 5: Organograma do fracionamento do Líquido da castanha de Caju .......................................................................................................................... 35
Figura 6: Fracionamento do Líquido da Castanha de Caju em coluna cromatográfica, segundo a técnica de gradiente de polaridade. ...................... 36
Figura 7: Organograma dos bioensaios em laboratório ................................... 38
Figura do Artigo I
Figura 1 – Efeito residual da solução do líquido da castanha de Anacardium
occidentale, a 200ppm, sobre larvas de Aedes aegypti .................................. 63
x
Lista de Tabelas
Tabela da Apresentação
Tabela I: Incidência de dengue, em Goiás, no período de 2000 a 2010 ...........19
Tabela do Artigo I
Tabela I: Atividade larvicida, em laboratório, do líquido e das frações de Anacardium
occidentale sobre larvas de 3º estádio de Aedes aegypti ........................................ 62
xi
Resumo
Mosquitos hematófagos, vetores de doenças, representam uma grande
ameaça à saúde pública global. O mosquito Aedes aegypti (Diptera, Culicidae)
é o principal vetor dos quatro sorotipos do vírus da dengue e da febre amarela
urbana. A dengue é uma doença humana viral que está, gradualmente,
tornando-se endêmica na América Central e em vários países sul-americanos.
No momento não existem medicamentos antivirais específicos para seu
tratamento e nenhuma vacina está disponível para prevenção. A única medida
disponível para interromper a transmissão é o controle do vetor. Este é feito
através da eliminação dos criadouros potenciais, aplicação de larvicidas em
coleções de água e, para os adultos, aplicações espaciais de inseticidas. No
entanto, a crescente resistência das populações de Ae. aegypti aos atuais
inseticidas tem dificultado um eficiente controle. Além disso, outros problemas
graves surgiram por seu uso contínuo, tais como a toxicidade ambiental e
humana. Isto, consequentemente, aumentou a demanda pelo desenvolvimento
de métodos alternativos para o controle do mosquito, que sejam menos
agresivos para os humanos e outros seres vivos. Assim, os compostos
derivados de plantas têm surgido como bons candidatos, não só como
ferramentas eficazes no controle do vetor, mas também como agentes
ambientalmente seguros. Após a coleta e aquecimento dos frutos de
Anacardium occidentale L. a 40° C, obteve-se um líquido, conhecido como
Líquido da Castanha do Caju (LCC), que depois de testado quanto à sua
atividade larvicida em laboratório, foi fracionado em coluna de sílica gel. O
fracionamento deu origem a oito frações, as quais foram codificadas como AO1
xii
a AO8. Neste trabalho, o LCC, e suas frações foram avaliados quanto a sua
atividade biológica em larvas de 3° estádio de Ae. aegypti Foi avaliado também
o efeito residual do LCC e sua toxicidade em animais de laboratório (Rattus
novergicos). Para o LCC foram encontradas CL50 e CL90 de 6,55 e 10,98 ppm,
respectivamente. Já as frações ativas, AO2 e AO3, apresentaram CL50 e CL90 de
3,18 e 7,80 ppm, e 3,57 e 10,47ppm, respectivamente. O LCC apresentou
efeito residual até o 6º dia e mostrou ser atóxico após tratamento subagudo via
oral em ratos.
Palavras chaves: Aedes aegypti, Dengue, Anacardium occidentale
xiii
Abstract
Feeding mosquitoes and disease vectors have been considered a major threat
to global public health. The mosquito Aedes aegypti (Diptera, Culicidae) is the
main vector of the four serotypes of dengue and urban yellow fever. Dengue is
a viral human disease that is gradually becoming endemic in Central America
and several South American countries. Nowadays, there is no specific antiviral
drug for treatment and no vaccine available for prevention. The only available
measure to interrupt transmission is vector control, which is done when
potential breeding are eliminated with larvicides application in water recipients,
and, in case of adult vectors, with insecticides dispersion though the air.
However, the increasing resistance of populations of Ae. aegypti to current
insecticides has made effective control hard to achieve. Besides, other serious
problems have arisen because of their continued use, such as environmental
and human toxicity, which, consequently, have encouraged the development of
alternative mosquito control methods, less aggressive to humans and other
living beings. Thus, compounds derived from plants have been considered good
choice to be used as effective tools in controlling the vector, also as
environmentally safe agents. After collecting and heating Anacardium
occidentale L. fruits 40 ° C, the liquid obtained was tested to confirm its
larvicidal activity. Then, it was fractionated by silica gel column. The
fractionation resulted in eight fractions, which were coded as AO1 to AO8. In this
paper, the Cashew Nut Shell Liquid (CNSL) and its fractions were evaluated for
their biological activity in third instars’ larvae of Ae. aegypti. The residual effect
of CNSL and its toxicity in laboratory animals (Rattus novergicos) were
xiv
evaluated. Considering the CNSL, LC50 and LC90 of 6.55 and 10.98 ppm,
respectively, were found in the laboratory. The active fractions, AO2 and AO3,
presented LC50 and LC90 of 3.18 and of 7.80 ppm, and 3.57 and 10.47 ppm,
respectively. The CNSL had residual effects until the 6th day and was shown to
be nontoxic after oral subacute treatment in rats.
Key words: Aedes aegypti, Dengue, Anacardium occidentale
15
1. Introdução
1.1 Dengue
A dengue é uma doença febril aguda, causada por um arbovírus da
família Flaviviridae, pertencente ao gênero Flavivirus. Na etiologia da dengue
estão envolvidos quatro sorotipos virais, denominados DENV-1, 2, 3 e 4
(Figueiredo 2000), transmitidos por meio da picada de fêmeas do gênero
Aedes, infectadas, sendo o Aedes aegypti (Diptera, Culicidae) (Linnaeus,1762)
seu principal vetor (Tauil 2001, Braga & Valle 2007).
As manifestações clínicas da dengue são descritas como uma síndrome
viral, inespecífica e benigna, ou um quadro grave e fatal de doença
hemorrágica. Os fatores de risco para casos graves são a cepa do sorotipo do
vírus infectante, o estado imunitário e genético do paciente, a concomitância
com outras doenças e a infecção prévia por outro sorotipo viral da doença
(Tauil 2001). A transmissão ocorre preferencialmente na zona urbana,
ambiente no qual se encontram todos os fatores fundamentais para sua
ocorrência: o homem, vírus, vetor e principalmente as condições políticas,
econômicas e culturais que formam a estrutura que permite o estabelecimento
da cadeia de transmissão (Hino et al. 2010).
Os primeiros relatos da dengue, na literatura, são de 1779 e 1780, com
ocorrência simultânea de surtos na Ásia, na África e na América do Norte (CDC
2008), mostrando a ampla distribuição do vírus e vetor, nos trópicos, há mais
de 200 anos (Gubler 1998, Pérez et al. 1998, Guzmán & Kourí 2001, Twiddy et
al. 2003, CDC 2008). Atualmente, a dengue é endêmica em mais de 100
países, e a Organização Mundial de Saúde (OMS) estima que 3,5 bilhões de
16
pessoas no mundo vivem atualmente em áreas com o Aedes aegypti (MS
2002).
A disseminação da doença pelo mundo se deu, principalmente, por meio
da navegação e do comércio, e foi responsável por epidemias devastadoras
em cidades portuárias (Gubler & Kuno 1997) uma vez que o mosquito Ae.
aegypti se disseminava através das embarcações.
No Brasil, os primeiros relatos da dengue, com base em evidências
epidemiológicas, datam do século XIX com surtos nos Estados do Rio de
Janeiro, Bahia, Pernambuco e outras localidades no norte do país (Mariano
1917). Em 1981, ocorreu a primeira epidemia documentada clínica e
laboratorialmente, em Boa Vista, Roraima. Tratou-se de uma epidemia com
caráter local, causada pelos sorotipos DENV-1 e DENV-4, atingindo cerca de
11.000 pessoas (Osanai et al. 1983).
Em 1986 ocorreu a introdução do DENV-1 no Rio de Janeiro, com cerca
de 95.000 casos notificados (Schatzmayr et al. 1986; Figueiredo 1996). O país
se viu diante de uma nova situação epidemiológica, uma vez que o Rio de
Janeiro era um grande centro urbano, com fluxo intenso de pessoas e uma
cidade portuária. Esses fatores, associados ao deficitário programa de controle
do vetor, contribuíram para a disseminação da dengue para outros Estados
(Maciel et al. 2008). No mesmo ano foram registradas epidemias nos estados
de Alagoas e Ceará (Vasconcelos et al. 1995). Até 1989, surtos epidêmicos
causados pelo DENV-1 foram registrados em São Paulo, Minas Gerais, Bahia e
Pernambuco (Marzochi 1994, Nogueira et al. 1995).
Em 1990, o DENV-2 foi isolado em Niterói, RJ (Nogueira et al. 1990), e a
circulação simultânea do DENV-1 e DENV-2 resultou no aparecimento dos
17
primeiros casos de febre hemorrágica da dengue (FHD) no Brasil, com 1.316
notificações, 462 casos confirmados e 8 óbitos (Teixeira et al. 1999, Siqueira -
Júnior et al. 2004).
Casos de FHD, ocasionados por DENV-2, também ocorreram durante a
epidemia no Ceará, em 1994, com 14 óbitos registrados (Nogueira et al. 1999).
Naquele ano os sorotipos DENV-1 e DENV-2 já estavam presentes em 20 dos
27 estados do país (Santos 2003). Em 1998, 2.675 dos 5.507 municípios do
Brasil, já tinham o sorotipo DENV-1 em seus territórios e o Ae. aegypti, único
transmissor comprovado da dengue no Brasil, tinha sido detectado em 2.910
municípios (Teixeira et al. 2002). Em 1998, foi detectado o DENV-3, pela
primeira vez, em um caso isolado na cidade de Limeira, São Paulo (Rocco et
al. 2001). Nos anos de 2000 e 2001 foi detectado em Nova Iguaçu-RJ e em
Roraima, respectivamente.
O ano de 2001 foi marcado pela mais grave epidemia de dengue já
ocorrida no Brasil após a dispersão do DENV-3, com mais de 794.000 casos
notificados (SVS/MS 2003), dos quais 288.245 no Rio de Janeiro (Nogueira et
al. 2001, Maciel et al. 2008). Esse quadro de risco elevado de epidemias e de
aumento nos casos de FHD levou o Ministério da Saúde (MS) a elaborar o
Programa Nacional de Controle da Dengue (PNCD) (Funasa 2002).
Já no ano de 2003, os três sorotipos virais (DENV-1,2 e 3) circularam
concomitantemente em 22 unidades federadas, sendo o DENV-3 o sorotipo
prevalente na maioria dos estados. Foram notificados 324.512 casos de
dengue, 618 de FHD e 33 óbitos, representando uma taxa de letalidade de
5,3% (SVS/MS 2003). Em 2007, foram notificados no país 85.018 casos de
dengue, sendo a maioria em Mato Grosso do Sul - 40.187 (50,4%); Mato
18
Grosso - 5.764 (7,2%); Rio de Janeiro - 4.196 (5,2%); Paraná - 3.815 (4,7%);
Minas Gerais - 3.704 (4,6%) e São Paulo - 2.908 casos (3,6%). Em 2008 foram
registrados, de janeiro a março, 120.413 casos de dengue clássica, 647 casos
de FHD e a ocorrência de 48 óbitos (MS 2008).
No Brasil, os casos notificados de dengue e de FHD predominam em
adultos jovens, e desde 2006, verifica-se, cada vez mais, um aumento do
número de casos em crianças (Teixeira et al. 2008), o que é um alerta para o
risco de mudanças no perfil de dengue no Brasil, semelhante ao padrão
asiático, onde a FHD foi uma doença que acomete crianças, sendo uma das
principais causas de hospitalização infantil (Halstead 2006).
A situação epidemiológica da dengue em Goiás vem se agravando desde
a introdução do DENV-1, em 1994. Estudando a incidência de dengue em
Goiás, de 2001 a 2005, Souza et al. (2010) observaram maior incidência nos
meses chuvosos, quando aumentam, tanto a densidade como a longevidade
do vetor. Hoje circulam no estado três sorotipos DENV-1, 2, 3; e a grande
maioria dos casos é registrada na região metropolitana de Goiânia.
Em Goiás ocorre a grande epidemia em 2002 (Tabela I), provavelmente
devido à entrada do sorotipo DENV-3 com mais de 80% dos casos na região
metropolitana de Goiânia (Souza et al. 2010). No ano de 2005, outra importante
epidemia aconteceu, com um aumento de casos de 307% em relação ao ano
anterior. Até outubro de 2010 registrou-se um aumento de 85% dos casos em
relação ao total de casos de 2009 (Tabela I).
19
Tabela I: Incidência de dengue, em Goiás, no período de 2000 a 2010.
ANO CASOS
NOTIFICADOS
ÓBITOS POR DENGUE HEMORRÁGICA
(FHD)
ÓBITOS POR DENGUE COM COMPLICAÇÕES
TOTAL DE ÓBITOS
2000 2.769 1 4 5
2001 13.612 2 2 4
2002 28.373 2 4 6
2003 12.977 4 4 8
2004 8.973 0 0 0
2005 23.412 6 5 11
2006 30.386 7 17 24
2007 15.698 11 13 24
2008 46.269 15 30 45
2009 44.083 20 27 47
2010* 98.724 26 39 65
*Dados parciais, referentes a 39ª semana de 2010 (até dia 02/10/2010).(Fonte: Secretaria da Saúde do Estado de Goiás)
1.2 Aedes aegypti
O principal vetor da dengue, o Ae. aegypti, é um mosquito de origem
africana, encontrado principalmente em países de clima tropical e subtropical
(Mackenzie et al. 2004). Foi reconhecido como vetor da febre amarela em 1881
(Rodriguez & Finlay 1971) e em 1906 foram publicadas as primeiras evidências
de que a espécie era também o vetor da dengue (CDC 1979). Atualmente é o
principal vetor da febre amarela urbana e dos quatro sorotipos do vírus dengue,
em mais de 100 paises (Foley et al. 2007).
É um mosquito sinantrópico, altamente antropofílico e possui atividade
hematofágica diurna (Gubler 2002, Tauil 2002). Machos e fêmeas alimentam-
20
se de seiva, entretanto, a fêmea necessita de repastos sanguíneos para a
maturação de ovos, sendo apenas as fêmeas hematófagas (Consoli & Oliveira
1998). Uma vez infectada a fêmea do Ae. aegypti, permanece assim por toda a
sua vida. A fêmea realiza múltiplos repastos antes de completar seu ciclo
gonotrófico, contribuindo para o maior potencial de disseminação da virose
(Donalísio & Glasser 2002). Platt et al. (1997) mediram o tempo médio de
repasto de fêmeas infectadas comparadas com não infectadas e notaram uma
maior duração da refeição em mosquitos infectados, fato que aumenta a sua
capacidade vetorial, como transmissor da dengue, pois induz a fêmea à
procura de hospedeiros seqüenciais.
O Ae. aegypti tem desenvolvimento holometabólico, com as fases de ovo,
larva, pupa e adulto (Figura 1). Os ovos medem aproximadamente 1mm de
comprimento e têm uma alta capacidade de entrar em quiescência e resistir à
dessecação. Este fato foi observado por Silva & Silva (1999) demonstrando
que em condições de laboratório os ovos permanecem viáveis até 492 dias
eclodindo mais tarde quando em contato com a água.
A larva apresenta um sifão respiratório no último segmento abdominal,
ficando posicionada perpendicularmente à água, movimenta-se ativamente e
alimenta-se constantemente. Passa por quatro estádios larvais e após um
período de 2 dias transforma em pupa. Esta não se alimenta e permanece
nessa fase de um a três dias, após o qual emerge o adulto.
21
Figura 1: Ciclo Biológico do Aedes aegypti. Imagens da criação cíclica mantida no Laboratório de Biologia e Fisiologia de Insetos, IPTSP/UFG.
Os primeiros registros da presença do Ae.aegypti em terras brasileiras
datam de 1898 (Franco 1969). Diante de grandes campanhas contra esse
vetor, ele foi considerado erradicado no território nacional nos anos de 1958 e
1973. Falhas na vigilância entomológica propiciaram sua reintrodução em
1976, e dez anos após, a estratégia de erradicação foi substituída pelo controle
(Teixeira & Barreto 1996). Em Goiás foi introduzido em 1987; três anos após
era notificada sua presença em Goiânia (Silva et al.1990) e em 12 meses já
estava presente em todos os bairros (Silva et al. 1991).
A complexidade do mundo moderno, com o crescimento da indústria de
embalagens descartáveis e a expansão desorganizada dos centros urbanos,
22
gera grande acúmulo de lixo inorgânico que serve como criadouro, dificultando
o controle do Ae. aegypti (Funasa 2002). Apesar de ter preferência por
recipientes contendo água relativamente limpa, já se observam indícios de
adaptação desse mosquito a ambientes poluídos (Clements 1999, Silva et al.
1999b).
1.3 Controle e Resistência de Aedes aegypti
O controle da dengue vem tendo insucesso em quase todo o mundo,
devido a não disponibilidade de vacinas (Guzman 1988) e inexistência de
drogas antivirais capazes de reduzir a viremia. Assim, os programas de
controle baseiam-se em medidas direcionadas para a eliminação do principal
vetor, o Ae. aegypti. A estratégia mais adotada nas ações de controle é o uso
de inseticidas químicos para adultos e larvas. A maior problemática nesta
prática é o surgimento da resistência aos produtos utilizados o que favorece o
crescimento das populações de mosquitos, resultando no aumento da doença
(Luna et al. 2004).
O desenvolvimento de inseticidas que permanecem ativos por longos
períodos foi um dos mais importantes avanços no controle de insetos no século
XX. O primeiro inseticida de efeito prolongado, ou propriedade residual, foi o
dicloro-difenil-tricloroetano (DDT), um organoclorado desenvolvido durante a
Segunda Guerra Mundial, que, quando aplicado em paredes e tetos de casas,
permanecia ativo contra os insetos por vários meses (Rozendaal 1997).
As propriedades inseticidas do DDT foram descobertas pelo
entomologista suíço Paul Muller, premiado com o Prêmio Nobel de Medicina,
no controle dos vetores de malária, febre amarela e muitas outras doenças
23
(Ware 2000, Solomons & Fryhle 2008). Embora o modo de ação do inseticida
nunca tenha sido claramente estabelecido, sabe-se que ele atua no canal de
sódio, provavelmente mantendo-o aberto e destruindo o equilíbrio de íons sódio
e potássio dos axônios, impedindo, assim, a transmissão normal de impulsos
nervosos em insetos e mamíferos. Seu efeito é inversamente proporcional à
temperatura: quanto mais baixa a temperatura, mais tóxico é o DDT para os
insetos (Ware 2000, Braga & Valle 2007).
O efeito obtido com o DDT trouxe um otimismo exagerado e este
começou a ser empregado de maneira indiscriminada e em doses cada vez
maiores. Em pouco tempo, porém, iniciou-se o declínio dessa fase. Observou-
se que os inseticidas clorados (DDT, BHC) e fosforados (Parathion, Malathion)
causavam efeitos indesejáveis aos ecossistemas e eram altamente tóxicos
para o homem. Além disso, com sua enorme capacidade de adaptação, a
natureza respondia com o surgimento de populações de insetos mais
resistentes. Carson (1962), com seu livro Silent Spring, provocou no homem
uma reflexão e a conscientização de que a natureza é vulnerável à intervenção
humana, levando-o a um maior respeito aos mecanismos naturais de
adaptação.
Os organofosforados, descobertos posteriormente aos organoclorados,
incluem todos os inseticidas que contêm fósforo em sua fórmula estrutural
(Crinnion 2000). Estes foram amplamente utilizados em saúde pública por
apresentarem muitas vantagens sobre os organoclorados. Mas são
substâncias a instáveis quimicamente, o que torna obrigatória a renovação
periódica de sua aplicação. Além disso, são mais tóxicos para os vertebrados
24
que os organoclorados, mesmo em doses relativamente baixas (Ware 2000,
Palchick 1996).
Para o controle das larvas, o temephos (organofosforado) era, até pouco
tempo, o produto exclusivo, e foi usado por mais de 30 anos. É utilizado a
1ppm de princípio ativo, adsorvido em grãos de areia em uma formulação
contendo 1% dessa substância (Lima et al. 2006). Com as epidemias de 1986,
seu uso foi amplamente intensificado.
Para o controle de adultos, tem sido utilizada a aplicação de inseticidas a
ultra-baixo-volume (UBV). Porém, o pequeno impacto desse método na
circulação viral tem levado a uma reavaliação das estratégias de controle
(OPAS 1995). Atualmente é utilizado o inseticida cipermetrina, composto
pertencente ao grupo dos piretróides, na concentração final de 0,3% do
princípio ativo.
Em várias regiões do Brasil como em São Paulo, no Rio de Janeiro,
Espírito Santo, Ceará, Alagoas e Sergipe, Goiás e Paraíba, já se observa um
quadro bastante preocupante de resistência ao temephos (Macoris et al. 2003,
Lima et al. 2003, Braga et al. 2004, Lima et al. 2006, Carvalho & Silva 1999,
Beserra et al. 2007
O aparecimento de resistência é um processo inevitável, resultante do
efeito seletivo de exposição a dosagens que matam os indivíduos suscetíveis,
sobrevivendo os resistentes que transferem essa capacidade a seus
descendentes. Quanto mais o inseticida for utilizado, mais rápido e maior é a
seleção de insetos resistentes na população e, consequentemente, maior o
nível de resistência atingido. A capacidade dos insetos de resistir
concentrações inicialmente letais promove uma redução gradual na eficácia
25
dos inseticidas, até a sua completa ineficiência (OMS 1987). Desta forma, as
atividades de controle têm requerido o uso de novos inseticidas ou a sua
substituição por métodos físicos e agentes biológicos, durante o maior período
possível (OMS 1992).
Os fatores operacionais também desempenham um importante papel na
implantação da resistência. Estes estão relacionados ao uso de inseticidas
(classe, formulação e concentração, método de aplicação, freqüência de
tratamentos) e por isso, podem ser perfeitamente controlados, fato que, na
verdade, não ocorre devido ao uso indiscriminado dos produtos (Cruz 2002,
Carvalho et al. 2004).
A contínua utilização de inseticidas químicos no controle dos insetos
vetores pode causar desequilíbrios ambientais como a eliminação de insetos
benéficos e a contaminação do meio ambiente (solo, água, atmosfera). E
também podem ser responsáveis por intoxicações acidentais em pessoas,
devido à má utilização desses produtos. Assim, todas as substâncias químicas
podem causar efeitos adversos à saúde dependendo da dose e das condições
às quais os indivíduos são expostos a elas (Paumgartten 1993).
Todos esses fatores alertam a comunidade científica para a elaboração
de formas alternativas para o controle dos insetos vetores.
1.4 Inseticidas Alternativos
Além do controle químico, outros produtos, pertencentes aos grupos dos
inseticidas biológicos e dos reguladores de crescimento, vêm sendo utilizados
no controle de vetores, como medidas alternativas.
26
No grupo dos reguladores de crescimento, pode-se citar, além do
methoprene, um dos mais antigos análogos de hormônio juvenil desenvolvidos,
o pyriproxifen, também quimicamente relacionado ao hormônio juvenil natural
(HJ), de grande eficácia (Hoy 1985). Ambos são recomendados pela OMS para
controle de Aedes sp. em água (Mulla et al. 1982, Lourenço-de-Oliveira et al.
2003). Existem outros compostos, os inibidores da síntese de quitina, que,
apesar de não quimicamente relacionados ao HJ, produzem efeitos similares
(Mulligan et al. 1980, Mulla et al. 1982, Scholte et al. 2003). Os mais
conhecidos são o diflubenzuron e o triflumuron, que atuam sobre as larvas
ocasionando sua morte durante a ecdise (Borges et al. 2004, Martins & Silva
2004). A larva não consegue eliminar a cutícula velha porque, aparentemente,
devido à inibição da deposição de quitina, não há rigidez suficiente para isso.
O controle biológico de mosquito utiliza microorganismos capazes de
parasitar ou de ser predador de mosquitos em suas várias fases evolutivas. As
intervenções baseadas na introdução desses organismos ainda são, em
grande parte, experimentais, e as informações referentes a eficácia do controle
biológico são baseadas em resultados de campo em pequena escala (Funasa
2001). Dentre as alternativas disponíveis, o MS vem adotando o uso do
Bacillus thuringiensis israelensis (Bti). O Bti tem elevada propriedade larvicida e
seu mecanismo de atuação baseia-se na produção de endotoxinas protéicas
que, quando ingeridas pelas larvas, provocam sua morte (MS 2010).
Fungos entomopatogênicos são também estudados para controle de
mosquitos. Atividades larvicida e adulticida de Beauveria bassiana e
Metharizium anisopliae em mosquitos já foram descritas em condições de
laboratório (Scholte et al. 2003, Silva et al. 2004a, Silva et al. 2004b, Scholte et
27
al. 2007, Luz et al. 2007, 2008 ). A atividade de fungos varia de acordo com a
espécie e linhagem. Linhagens virulentas que conseguem infectar e eliminar
todos os estágios evolutivos de Ae. aegypti tem potencial para um controle
desse vetor.
1.5 Inseticidas Botânicos
As plantas são fontes naturais de substâncias inseticidas e
antimicrobianas, já que as mesmas são produzidas pelo vegetal em resposta a
um ataque patogênico. Essas substâncias são sintetizadas e degradadas por
inúmeras reações anabólicas e catabólicas, que compõem seu metabolismo.
Os compostos resultantes desse metabolismo são separados em produtos do
metabolismo primário (glicídios e lipídios) que, em geral, são macromoléculas
amplamente produzidas pelos seres vivos (Harbone & Tomas-Barberam 1991),
e os do metabolismo secundário, que são micromoléculas como os
terpenóides, alcalóides, fenóis, glicosídeos etc.
Atualmente, sabe-se que essas substâncias são defesas de natureza
química e que as rotas metabólicas que levam à produção desses compostos
secundários são ativadas durante alguns estágios particulares de crescimento
ou em períodos de estresse (Mann 1987).
A biodiversidade das florestas tropicais serve como foco para a
descoberta de novas plantas medicinais. A interação entre plantas tropicais e
seus predadores naturais pode ser usada como suporte para a descoberta de
substâncias ativas com propriedades inseticidas e seletivas para serem usadas
em futuras formulações de um produto comercial (Braz Fillho 2010). Diversos
28
estudos comprovam a atividade de extratos vegetais e moléculas botânicas
contra diferentes espécies de mosquitos (Guimarães et al. 2001, Macêdo et al.
1997, Nath et al. 2006, Pavela 2008) incluindo Ae. aegypti (Angerilli 1980,
Ciccia et al. 2000, Arruda et al. 2003, Carvalho et al. 2003, Silva et al. 2003,
Silva et al. 2004, Simas et al. 2004, Silva et al. 2007, Geris et al. 2008,
Massebo et al. 2009).
Esta propriedade larvicida tem despertado o interesse da comunidade
científica já que os inseticidas usados em programas do governo no combate a
insetos vetores são tóxicos e poluentes. Grupos diversos de pesquisadores
procuram inseticidas viáveis, seletivos, biodegradáveis e econômicos para
serem usados em programas de controle de insetos com baixo impacto
ambiental, buscando dar maior segurança à população (Guimarães et al. 2001,
Arruda et al. 2003, Silva et al. 2003, Silva et al. 2004, Simas et al. 2004a,
Zanon et al. 2006 Geris et al 2008, Garcez et al. 2009).
1.6 Bioprospecção
A análise de substâncias bioativas em plantas é complexa e trabalhosa,
envolvendo várias etapas e diferentes pesquisadores. Primeiramente faz-se a
coleta para a identificação botânica da espécie. Coletam-se pequenos ramos
com folhas, flores e frutos em vários estágios de desenvolvimento. As amostras
coletadas são prensadas e secas, e encaminhadas para um herbário para
identificação. Após identificação científica, a planta é catalogada, com o nome
científico e família botânica; nome de quem identificou a espécie; número de
29
registro da exsicata; local do herbário; local e data da coleta; nome popular da
planta.
Se houver coletas em locais ou épocas distintas, inicia-se novamente todo
o processo de identificação botânica, porque muitas vezes plantas diferentes
são conhecidas popularmente pelo mesmo nome (Maciel et al. 2002).
Na etapa que determina o estudo fitoquímico, escolhe-se a parte da
planta que será investigada e a quantidade de material que será coletado.
Deve-se coletar entre 3 a 6 kg de material vegetal, buscando com isso, o
isolamento em grandes quantidades de substâncias majoritárias, possibilitando
suas avaliações farmacológicas. As etapas do processamento fitoquímico
variam de acordo com a parte da planta que será trabalhada. Quando se
trabalha com caule ou raízes, geralmente as fases são de secagem, moagem,
percolação e evaporação. Todos os extratos e frações devem ser testados
biologicamente e, os que apresentarem atividade de interesse, devem ser
submetidos aos procedimentos cromatográficos que são os métodos mais
usados atualmente para isolamento e purificação de compostos ativos.
A relativa facilidade de coleta, aliada a condição ambiental favorável para
desenvolvimento sustentável, a biodiversidade estrutural de substâncias
orgânicas naturais e a possibilidade de descoberta de princípios ativos entre os
constituintes químicos permitem diagnosticar e destacar as plantas brasileiras
como a principal fonte renovável para o surgimento e desenvolvimento de
novos fármacos, além de outros produtos que podem ser utilizados para
finalidades sociais adicionais (Braz-Filho 2010).
30
1.7 Anacardium occidentale
O gênero Anacardium possui 11 espécies descritas, sendo seu principal
representante o Anacardium occidentale L. Pertencente à família
Anacardiaceae é uma árvore de aparência exótica, troncos tortuosos, folhas
glabras, flores masculinas e hermafroditas e fruto reniforme. Seu pedúnculo
(caju) superdesenvolvido e muito apreciado pela suculência é frequentemente
confundido com o fruto, quando na verdade se trata do pseudofruto,
cientificamente denominado de pedúnculo floral, com coloração variante entre
o amarelo e o vermelho (Mazzetto et al. 2009).
O cajueiro é descrito como uma ótima fonte medicinal (Shultes & Raffau
1990). É usado em aplicações como analgésico, diurético, líquido para higiene
bucal, tratamento de astenia, problemas respiratórios, gripe, bronquite, tosse,
escorbuto infantil, eczema, infecções genitais, sarna, doenças de pele,
verrugas e feridas. Do cajueiro, praticamente tudo se aproveita. Seu teor de
vitamina C é maior que o da laranja, contém niacina 6 uma das vitaminas do
complexo B, e ferro, sendo seu pedúnculo utilizado na fabricação de sucos,
vinhos, licores, doces e compotas.
Por ser rico em fibras também é muito empregado para aumentar a
movimentação intestinal. As folhas novas, quando cozidas e colocadas sobre
feridas promovem cicatrização. A madeira, muito resistente à água do mar, é
empregada na fabricação do cavername de pequenos barcos, na construção
civil, confecção de cabos de ferramentas e caixotaria (Mazzetto et al. 2009). A
casca do tronco contém uma substância tintorial vermelho-escuro usada no
31
tingimento de tecidos e redes. Após processamento, a amêndoa pode ser
consumida como castanha, torrada, farinha, no preparo de doces, pratos
quentes e é exportada para todo o mundo.
O fruto do cajueiro, popularmente conhecido como castanha de caju, é
um aquênio de comprimento e largura variável, casca coriácea lisa, mesocarpo
alveolado, repleto de um líquido escuro quase preto e inflamável, chamado de
líquido da castanha do caju (LCC) ou cashew nut shell liquid (CNSL) como é
conhecido internacionalmente (Figura 2) (Mazzetto et al. 2009).
Figura 2: Caju, castanha de caju e Líquido da Castanha de Caju (Fonte: Mazzetto et al. 2009).
Para a obtenção do LCC, emprega-se diferentes processos como a
extração a frio, extração por solventes (Kumar et al. 2002, Correia et al. 2006) e
o processo térmico-mecânico, onde o próprio LCC quente é utilizado para
aquecer as castanhas a 190 oC. Quando submetido a altas temperaturas o
ácido anacárdico sofre reação de descarboxilação convertendo-se a cardanol,
produzindo o denominado LCC técnico (Lopes 2005, Rios et al. 2008).
Mazzetto et al. (2009) analisaram tanto o LCC natural quanto o LCC técnico. O
32
natural apresentou maior quantidade de ácido anacárdico, enquanto o LCC
técnico maior percentual de cardanol.
1.8 Toxicidade Aguda de Anacardium occidentale em Rattus novergicus
O uso popular, e mesmo tradicional das plantas como recurso terapêutico,
não são suficientes para validá-las como medicamentos ou inseticidas eficazes
e seguros (Turolla & Nascimento 2006, Agra et al. 2007/2008). Os estudos
toxicológicos têm a finalidade de avaliar a idéia errônea de que produtos
naturais são isentos de efeitos tóxicos ou adversos, e que o uso popular de
plantas serve como validação da eficácia de medicamentos, praguicidas etc
(Lapa 1999, Craveiro et al. 2008)
Os estudos toxicológicos apresentam como principal objetivo a predição
dos possíveis efeitos adversos, que podem se manifestar quando da exposição
humana à determinada substância, seja ela um medicamento, um praguicida,
um agente químico industrial ou outros (Koeter 1993, Stokes 2002, Meyer
2003). Por esta razão, tais estudos são sempre requeridos nos processos
investigativos, desde o desenvolvimento de produtos até seu registro e
comercialização, sendo os modelos animais os mais utilizados para este
propósito (Ecobichon 1997, Stokes 2002, Meyer 2003).
33
2. Objetivos
2.1 Geral
� Buscar alternativas naturais, de baixa toxicidade para vertebrados, sem
impacto ambiental, que possam ser utilizadas no controle de Ae. aegypti.
2.2 Específicos
� Avançar no estudo fitoquímico do líquido obtido da castanha de A.
occidentale
� Apresentar uma nova técnica de extração do líquido da castanha de caju.
� Avaliar a atividade larvicida dos extratos e frações obtidos do LCC, sobre
Ae. aegypti em condições de laboratório.
� Verificar o potencial tóxico do LCC através de testes de toxicidade oral
aguda em ratos.
34
3. Material e Métodos
3.1 Obtenção do Material Botânico
Frutos de A. occidentale, popularmente conhecidos como castanhas de
caju, foram colhidos no setor Pedro Ludovico, em Goiânia-GO, no mês de
outubro de 2008. Uma exsicata (43180) foi autenticada (Figura 3) pelo
Professor José Ângelo Rizzo e depositadas no Herbário da Unidade de
Conservação, Departamento de Botânica da UFG.
Figura 3: Exsicata autenticada mantida no Herbário da Unidade de Conservação da Universidade Federal de Goiás
3.2 Obtenção do Líquido da Castanha de Caju
No Laboratório de Bioatividade de Plantas, do Instituto de Patologia
Tropical e Saúde Pública (IPTSP/UFG), 2 kg de frutos de caju foram colocados
em estufa de ventilação forçada, a 40°C, por 7 dias. Com esse procedimento
35
foram obtidos 600 g de LCC, um líquido viscoso de coloração marrom (Figura
4) e de odor forte (Mazzetto et al. 2009)
Figura 4 – Aspecto do Líquido da Castanha do Caju, obtido em estufa de ventilação forçada
3.3 Fracionamento do Líquido da Castanha de Caju
Inicialmente, 50 g do LCC de A. occidentale foram submetidos a uma
filtração a vácuo, em um funil de placa sinterizada, com diâmetro interno de
9 cm e uma altura de gel de sílica (70-230 mesh) de 15 cm. As frações
foram eluídas seguindo a técnica de gradiente com n-hexano, acetato de
etila e metanol, totalizando oito frações (Figura 6). Estas foram
denominadas AO1 a AO8, conforme Figura 5.
36
óleo bruto deAnacardium occidentale
AO50 g
a
AO-10,0803 g
AO-211,7640 g
AO-37,9848 g
AO-41,0040 g
AO-52,3338 g
AO-61,0461 g
AO-70,6251 g
AO-80,9842 g
a) Filtração em funil de placa sinterizada (φ= 9 cm) contendo gel de sílica 70-230 mesh.
Eluente: hexano, acetato de etila e metanol.
Figura 5 – Organograma do fracionamento do líquido da castanha do caju
Figura 6: Fracionamento do Líquido da Castanha do Caju em coluna cromatográfica, seguindo a técnica de gradiente de polaridade.
3.4 Obtenção das larvas
As larvas foram obtidas de uma criação cíclica de Ae. aegypti, mantida no
Laboratório de Biologia e Fisiologia de Insetos, IPTSP/UFG, há 10 anos. A
câmara onde se mantém a criação é climatizada a 28 ± 1°C, 80 ± 5% de
umidade relativa e fotofase de 12 h (Silva et al. 1998). As larvas são mantidas
37
em bacias com água da rede pública de abastecimento e alimentadas com
ração para gatos. As fêmeas alimentam-se em camundongos e os machos em
algodão, do tipo o.b. (absorvente interno feminino) embebido em água
açucarada. No interior das gaiolas de criação coloca-se um copo de vidro
âmbar com água e um papel filtro para ovipostura.
3.5 Bioensaios larvicidas em laboratório
Os bioensaios foram realizados utilizando-se larvas de 3° estádio, por
serem as mais tolerantes em relação aos demais estádios (Silva et al. 2003).
O LCC e/ou as frações foram primeiramente pesados e pré-solubilizados
em dimetilsulfóxido (DMSO). A quantidade de solvente utilizada para o preparo
da solução foi previamente determinada por ensaios de tolerância das larvas
ao solvente. Observou-se tolerância até a proporção de 0,8 mL de DMSO para
24,2 mL de água (Figura 7).
Para cada uma das amostras avaliadas preparou-se uma solução-mãe,
acrescentando-se água da rede pública de abastecimento, em um volume
suficiente para obter as concentrações de 100,80,60,40,20,10,5 e 2,5 ppm para
o LCC e as frações. A partir destas soluções uma série de diluições foi
preparada para se obterem concentrações menores.
Os bioensaios foram realizados em copos de poliestireno, descartáveis,
com capacidade para 30 mL. Nestes foram colocados 25 mL de cada uma das
soluções, e, em seguida, 20 larvas de 3° estádio. Todos os bioensaios foram
realizados em triplicata. As leituras da mortalidade foram feitas após 24 h de
exposição das larvas às soluções. Essas foram consideradas mortas quando
38
havia ausência total de movimentos, mesmo quando expostas a um estímulo,
seguido do escurecimento do corpo e cápsula cefálica. Todos os experimentos
foram acompanhados de uma série controle, contendo o mesmo número de
larvas e o mesmo volume de DMSO.
Figura 7: Organograma dos bioensaios em laboratório
Pesagem das amostras
LCC + DMSO = Solução-Mãe
Diluições
100, 80, 60, 40, 20, 10, 5, 2,5 ppm
Copos plásticos + solução teste + larvas de 3°
estádio de Ae. aegypti
Leitura da mortalidade das larvas após 24h
39
3.6 Efeito residual do Líquido da Castanha de Caju em laboratório
Três amostras do LCC foram pesadas e solubilizadas em DMSO,
acrescentando-se um volume de água para se obter a concentração final de
200 ppm. Para realização dos bioensaios foram utilizados recipientes de
poliestireno, com capacidade para 200 mL, sendo três para amostras do
LCC, três para o grupo controle (água e 1% de DMSO) e três para o grupo
controle positivo (temephos a 1 ppm). Em cada recipiente introduzia-se,
diariamente, 20 larvas de 3º estádio. Após 24h, eram retiradas todas as
larvas e contavam-se as larvas mortas, acrescentando em seguida novas
larvas. Este procedimento se repetiu até que a solução de LCC não
apresentasse mais atividade larvicida. Os dados obtidos foram submetidos
à Análise de Variância (ANOVA), visando à comparação da incidência de
mortalidade diária das larvas, sendo considerados significativos valores de
p < 0,05.
3.7 Ensaios de toxicidade aguda do LCC segundo as diretrizes da OECD
2001.
O projeto de pesquisa para avaliar a toxicidade aguda do LCC segundo
as diretrizes da Organization for Ecomonic Co-operation and Development
(OECD) 423, foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa, da Pró-Reitoria
de Pesquisa e Pós-Graduação (PRPPG), da UFG, sendo aprovado segundo o
protocolo de número 292/10.
40
3.7.1 Descrição dos Animais
Foram usados no experimento Rattus novergicus (ratos Wistar), de ambos
os sexos, oriundos do Biotério Central (BC) da UFG. Os animais eram adultos
jovens com 8 a 12 meses de idade e o peso de cada um não excedeu a 20%
da média do grupo, que foi de 300g para machos e 280g para fêmeas.
3.7.2 Alojamento e Manejo dos Animais
Os animais foram mantidos no biotério do Núcleo de Estudos e Pesquisas
Tóxico-Farmacológicas (NEPET) da Faculdade de Farmácia (FF) da UFG.
Foram alimentados com ração balanceada Labina (Purina), além de água
filtrada. O ambiente foi climatizado à temperatura de 22 ± 2°C, umidade relativa
do ar variando de 50 a 70% e fotofase de 12h. Cada grupo de três animais foi
acondicionado em uma caixa de polipropileno forrada com maravalha, sendo
trocada em dias alternados.
Os animais passaram por um período de aclimatação de uma semana
antes do início dos experimentos, foram pesados e identificados.
3.7.3 Descrição do Protocolo Experimental
Para realização do experimento, dois grupos foram formados, sendo três
machos e três fêmeas em cada grupo, conforme recomendado na OECD.
A dose inicial para o teste de toxicidade foi escolhida entre as doses
preconizadas pela OECD 5, 50, 300 e 2000 mg/Kg. Por se tratar de produtos
vegetais originários de uma planta e devido a inexistência de informações de
41
casos de intoxicação por essa planta decidiu-se fazer a triagem com a dose de
2000 mg/kg.
Para a solubilização do LCC foram utilizados 0,4 mL de DMSO e o
volume foi completado com água, tendo-se o cuidado de não exceder o volume
de 1mL/100g de peso corporal. Preparou-se uma solução mãe de 10 mL para
cada grupo. Foram administrados pela via oral 3mL de substância para cada
animal. Paralelamente, realizou-se o teste com o grupo controle usando-se o
mesmo número de animais e a mesma dose. No grupo controle administrou-se
água e DMSO.
Antes da administração do LCC, os ratos foram privados de alimentação
por 12h tendo o suprimento de água á vontade. A alimentação continuou
suspensa por mais 2h após a administração do LCC. As observações foram
feitas em 15 e 30mim, e 1, 2, 3, 4, 6, 12 e 24h após a administração, a partir
daí continuaram, diariamente, até o décimo quarto dia.
Durante esse período de avaliação foram feitas as observações
comportamentais (screening hipocrático: atividade geral, frênito vocal,
irritabilidade, reposta ao toque, resposta ao aperto da cauda, contorção, força
para agarrar, tremores, convulsões, salivação, lacrimejamento, micção,
defecação, piloereção, morte). As intensidades dos eventos foram tabuladas de
zero a quatro, correspondendo, respectivamente, a ausente, pouco, moderado,
intenso (Malone & Robichaud 1962)
No décimo quarto dia os animais foram novamente pesados,
anestesiados com solução de xilasina-cetamina por via intraperitoneal, e
eutanasiados.
42
4. Resultados e discussão
Os resultados deste trabalho são apresentados no artigo 1.
43
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57
Artigo I – submetido a Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical
Atividade larvicida de Anacardium occidentale como alternativa ao controle de Aedes aegypti e sua toxicidade em Rattus novergicus
Larvicidal activity of Anacardium occidentale as an alternative to the control of Aedes aegypti and its toxicity in Rattus novergicus
Ana Carla Peixoto Guissoni¹, Ionizete Garcia da Silva¹,², Regina Geris3, Luiz Carlos Cunha4, Heloisa Helena Garcia da Silva¹,²
¹Curso de Pós-Graduação em Medicina Tropical, Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, Universidade Federal de Goiás. Goiânia GO
²Laboratórios de Biologia e Fisiologia de Insetos e de Bioatividade de Plantas, Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, Universidade Federal de Goiás. Goiânia, GO
3Laboratório de Biotecnologia – Universidade Federal da Bahia – Salvador – BA
4Núcleo de Estudos e Pesquisas Tóxico-Farmacólogicas da Faculdade de Farmácia-UFG
RESUMO
Introdução: A busca por substitutos para os inseticidas sintéticos tem estimulado
muitos trabalhos científicos, contemplando inclusive a utilização de óleos, extratos ou
constituintes ativos provenientes de plantas. Esta procura pode ser justificada pelo
potencial inseticida associado a fácil degradação destes constituintes, menor toxicidade
ao homem sendo, conseqüentemente, uma alternativa mais segura para o meio
ambiente. Métodos: Após a coleta e aquecimento dos frutos de Anacardium occidentale
L., a 40°C, obteve-se um líquido denominado líquido da castanha de caju (LCC) que,
depois de testado quanto à sua atividade larvicida, foi fracionado em coluna de sílica
gel. O fracionamento deu origem a oito frações, as quais foram codificadas como AO1 a
AO8 e submetidas a ensaios larvicidas. Avaliou-se também o efeito residual do LCC em
recipientes sem renovação de água e sua toxicidade oral aguda em Rattus novergicus.
58
Resultados: O LCC e as frações AO2 e AO3 apresentaram atividade larvicida. As
concentrações letais, CL50 e CL90, do LCC foram, respectivamente, de 6,55 e 10,98 ppm
. Para AO2 e AO3 , as CL50 e CL90 foram de 3,18 e 7,80 ppm, e de 3,57 e 10,47 ppm,
respectivamente. O LCC apresentou efeito residual até o 6º dia. A estimativa da DL50 é
maior que 2000 mg/kg. Conclusões: O LCC e duas frações apresentaram potencial
larvicida sobre larvas de A. aegypti. Após tratamento subagudo via oral em ratos, o LCC
demonstrou ser atóxico.
Palavras-chaves: Anacardium occidentale. Aedes aegypti. Larvicida. toxicidade aguda.
ABSTRACT
Introduction: The search for substitutes for synthetic pesticides has stimulated many
scientific papers, including considering the use of oils, extracts and active constituents
from plants. This demand can be justified by the potential associated with insecticide
easy degradation of these constituents, less toxic to humans and, consequently, a safer
alternative to the environment. Methods: After collecting and heating Anacardium
occidentale L. fruits 40°C, the liquid obtained was tested to confirm its larvicidal
activity. Then, it was fractionated by silica gel column. The fractionation resulted in
eight fractions, which were coded as AO1 to AO8. In this paper, the cashew nut shell
liquid (CNSL) and its fractions were evaluated for their biological activity in third instar
larvae of Aedes aegypti. The residual effect of CNSL, in containers with no water
renewal, and its acute oral toxicity in Rattus novergicus also were evaluated. Results:
The CNSL and the fractions AO2 and AO3 presented larvicidal activity. The lethal
concentration, LC50 and LC90, the CNSL were, respectively, 6.55 and 10.98 ppm. The
active fractions, AO2 and AO3, presented LC50 and LC90 of 3.18 and of 7.80 ppm, and
59
3.57 and 10.47 ppm, respectively. The CNSL had residual effects until the 6th day. The
estimated LD50 is greater than 2000 mg / kg. Conclusions: The LCC and two fractions
showed larvicidal potential against larvae of Aedes aegypti. After subacute treatment in
rats orally, the CNSL has proven to be nontoxic.
Key-words: Anacardium occidentale. Aedes aegypti. Larvicidal. acute toxicity
INTRODUÇÃO
A dengue é causada por um arbovírus da família Flaviviridae, pertencente ao gênero
Flavivirus. É transmitida por meio da picada de fêmeas do gênero Aedes, infectadas,
que ao realizar um repasto sanguíneo pode transmitir qualquer um dos quatro sorotipos
virais (DENV 1, 2, 3 e 4)1, sendo o Aedes aegypti (Diptera, Culicidae) (Linnaeus,1762)
o principal vetor 2,3. Como ainda não estão disponíveis medicamentos antivirais para
tratamento, nem uma vacina eficaz para uso humano, o controle da dengue se baseia,
principalmente, em aplicações de inseticidas sintéticos ou naturais4, para o controle do
vetor. A crescente resistência das populações de Aedes aegypti aos atuais produtos tem
dificultado o êxito dos programas5.
Compostos derivados de plantas apresentam uma alternativa de controle de vetores,
não só como novos agentes inseticidas, mas também por serem ambientalmente seguros
5. No entanto, para serem registrados como um inseticida, os compostos devem ser
avaliados em relação aos seus efeitos toxicológicos e ecotoxicológicos agudos e
crônicos em condições de laboratório, conforme padronização internacional 6,7.
Anacardium occidentale L. é o nome científico do cajueiro, pertencente a família
Anacardiaceae. Seu pedúnculo ou pseudofruto é muito apreciado pela suculência e
confundido com o fruto. O fruto do cajueiro, popularmente conhecido como castanha de
60
caju, é repleto de um líquido escuro quase preto chamado de líquido da castanha do caju
(LCC) ou cashew nut shell liquid (CNSL) 8. Para a obtenção do LCC, empregam-se
diferentes processos como a extração a frio, extração por solventes9 ou processo
térmico-mecânico, onde o próprio LCC quente é utilizado para aquecer as castanhas a
190 oC. Quando submetido a altas temperaturas o ácido anacárdico sofre reação de
descarboxilação convertendo-se a cardanol, produzindo o denominado LCC técnico10,11.
O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade larvicida e o efeito residual sobre
larvas de Aedes aegypti e também a toxicidade em animais de laboratório, do líquido da
castanha de Anacardium occidentale.
MÉTODOS
Material botânico
Frutos de Anacardium occidentale foram colhidos no setor Pedro Ludovico, em
Goiânia-GO (Brasil), no mês de outubro de 2008. Uma exsicata (43180) foi autenticada
pelo Professor José Ângelo Rizzo e depositadas no Herbário da Unidade de
Conservação, Departamento de Botânica da Universidade Federal de Goiás (UFG).
Obtenção e Fracionamento do Líquido da Castanha de Anacardium occidentale
No Laboratório de Bioatividade de Plantas do Instituto de Patologia Tropical e
Saúde Pública (IPTSP) da UFG, dois kg de frutos foram colocados em estufa de
ventilação forçada, a 40°C, por 7 dias. Com esse procedimento foram obtidos 600g de
um líquido de coloração marrom e de odor forte, denominado líquido da castanha do
caju (LCC)8. Inicialmente, 50 g do líquido obtido de Anacardium occidentale foram
submetidos a uma filtração a vácuo, em um funil de placa sinterizada, com diâmetro
61
interno de 9 cm e uma altura de gel de sílica (70-230 mesh) de 15 cm. As frações foram
eluídas seguindo a técnica de gradiente com n-hexano, acetato de etila e metanol,
totalizando oito frações. Estas foram denominadas AO1 a AO8 e submetidas aos ensaios
larvicidas.
Bioensaios em Laboratório
Os bioensaios foram realizados utilizando-se larvas de 3° de estádio Aedes aegypti,
por serem as mais tolerantes em relação aos demais estádios12. O líquido e/ou as frações
foram primeiramente pesados e pré-solubilizados em dimetilsulfóxido (DMSO). A
quantidade de solvente utilizada para o preparo da solução foi previamente determinada
por ensaios de tolerância das larvas ao solvente. Neste trabalho usou-se 1% de DMSO.
Para cada uma das amostras a serem testadas preparou-se uma solução-mãe,
acrescentando-se água, num volume suficiente para obter a concentração de 100 para o
líquido e as frações. A partir destas soluções uma série de diluições foi preparada a fim
de se obterem concentrações menores de 80, 60, 40, 20, 10, 5 e 2.5 ppm. Os bioensaios
foram realizados em copos com capacidade para 30 mL. Nestes, foram colocados 25
mL de cada uma das soluções e em seguida 20 larvas de 3° estádio. Todos os bioensaios
foram realizados em triplicata. As leituras da mortalidade foram feitas após 24h de
exposição das larvas às soluções. Todos os experimentos foram acompanhados de uma
série controle, contendo o mesmo número de larvas e o mesmo volume de DMSO e
água destilada. Os dados obtidos da mortalidade x concentração (ppm) foram analisados
pelo programa SAEG (Sistema de Análises Estatísticas), Versão 9.1, em gráfico de
Probit, para determinar as concentrações letais (CL50 e 90) e os respectivos intervalos de
confiança (IC).
62
Efeito Residual do Líquido da Castanha de Caju
Três amostras do LCC foram solubilizadas em DMSO, acrescentando-se um volume
de água para se obter a concentração final de 200 ppm. Foram utilizados recipientes de
poliestireno, com capacidade para 200 mL, sendo três para amostra do LCC, três para o
grupo controle negativo (água e 1 % de DMSO) e três para o grupo controle positivo
(temephos a 1 ppm). Em cada recipiente introduzia-se, diariamente, 20 larvas de 3º
estádio. Após 24h, eram retiradas todas as larvas e contavam-se as larvas mortas,
acrescentando em seguida novas larvas. Este procedimento se repetiu até que a solução
de LCC não apresentasse mais nenhuma atividade larvicida.
Os dados obtidos foram submetidos à Análise de Variância (ANOVA), visando à
comparação da incidência de mortalidade diária das larvas, sendo considerados
significativos, valores de p < 0,05.
Teste de toxicidade oral aguda segundo a Organization for Ecomonic Co-operation
and Development (OECD) 2001
A avaliação de toxicidade aguda foi realizada em Ratus novergicus (ratos Wistar) de
ambos os sexos, oriundos do biotério central da UFG. Os animais eram adultos jovens
com 8 a 12 meses de idade e o peso de cada um não excedeu a 20% da média do grupo,
que foi de 300g para machos e 280g para fêmeas.
Os animais foram mantidos no biotério do Núcleo de Estudos e Pesquisas Toxico-
Farmacológicas (NEPET) da Faculdade de Farmácia da UFG. Foram alimentados com
ração balanceada Labina (Purina), além de água filtrada. O protocolo experimental foi
aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal da Universidade Federal de Goiás
63
(Protocolo n º 292/10), seguindo as diretrizes da OECD 4237. Para realização do
experimento, dois grupos foram formados, com três machos e três fêmeas cada um.
Foram administrados 2000 mg/kg por via oral. Paralelamente, realizou-se o teste com o
grupo controle, usando-se o mesmo número de animais e a mesma dose. No grupo
controle administrou-se DMSO e água. Durante os períodos de observação foram feitas
as observações comportamentais (screening hipocrático: atividade geral, frênito vocal,
irritabilidade, reposta ao toque, resposta ao aperto da cauda, contorção, força para
agarrar, tremores, convulsões, salivação, lacrimejamento, micção, defecação,
piloereção, morte). As intensidades dos eventos foram tabuladas de zero a quatro,
correspondendo, respectivamente, a ausente, pouco, moderado, intenso13. No décimo
quarto dia os animais foram novamente pesados, anestesiados com solução de xilasina-
cetamina por via intraperitoneal e eutanasiados.
RESULTADOS
Utilizando-se como método de obtenção o aquecimento das castanhas a 40°C,
obteve-se, neste trabalho, um rendimento de 30% de LCC. Testado quanto à atividade
larvicida, sobre Ae. Aegypti, em laboratório, foram obtidas as CL50 e CL90 de 6,55 e
10,98 ppm, respectivamente (Tabela 1).
Do fracionamento do LCC foram obtidas 8 frações. AO2 e AO3 foram as frações que
apresentaram maior rendimento 43% e 15,7%, respectivamente e foram as únicas
frações que apresentaram atividade larvicida (Tabela I).
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Tabela I: Atividade larvicida, em laboratório, do líquido e das frações de Anacardium
occidentale sobre larvas de 3º estádio de Aedes aegypti.
Frações CL50 (IC 95%) ppm CL90 (IC 95%) ppm
LCC 6,55 (6,09 – 6,98) 10,98 (10,04 -12,44)
AO2 3,18 (2,70 – 3,64) 7,80 (6,77 – 9,31)
AO3 3,57(2,99 – 4,13) 10,47(8,71–13,49)
LCC – líquido da castanha do caju; CL - Concentração Letal; IC – Intervalo de Confiança a 95% ppm – partes por milhão; AO - Anacardium occidentale
Os resultados da Tabela I mostram que com a separação cromatográfica foi possível
obter concentrações letais mais baixas em relação ao LCC.
O efeito residual da solução de LCC foi, neste trabalho, aferido através das
percentagens de mortalidade diárias de larvas, após exposição a uma solução a 200ppm.
Estes resultados, até o período máximo de exposição de 15 dias, encontram-se na
Figura 1.
Figura 1 – Efeito residual da solução do líquido da castanha de Anacardium
occidentale, a 200ppm, sobre larvas de Aedes aegypti.
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O efeito residual da solução do líquido da castanha de Anacardium occidentale, a
200ppm, matou 100% das larvas de 3° estádio de Aedes aegypti, até o sexto dia. Depois
a mortalidade diminuiu para 97% e permaneceu até o oitavo dia, em seguida, a
degradação desse produto cai em curva descendente até não apresentar nenhum efeito
ao 16° dia. A Figura 1 sugere que para fazer o controle desse mosquito as aplicações
desse produto devem ser repetidas semanalmente, período de sua eficácia máxima.
Com relação à toxicidade oral aguda, a dose administrada de 2000 mg/kg, não
causou a morte de nenhum dos animais. As alterações comportamentais que foram
observadas durante os primeiros 10 minutos (força de agarrar e atividade geral
diminuídas) podem ter sido causadas, provavelmente, pelo estresse da administração da
substância.
DISCUSSÃO
Segundo Rios10, o LCC é uma das maiores fontes de lipídeos fenólicos de origem
natural, tendo como componentes majoritários o ácido anacárdico, cardanol, cardol e 2-
metilcardol. Quando submetido a temperaturas em torno de 180°C, o ácido anacárdico
converte-se a cardanol, produzindo o chamado LCC técnico.
A atividade larvicida do LCC técnico, obtido com o aquecimento das castanhas a
190°C, foi avaliada por Lomonaco e cols.14 sobre Aedes aegypti, e a CL50 encontrada
foi de 51,0 ppm, bem superior à encontrada no presente trabalho. Se o aquecimento
converte o ácido anarcárdico a cardanol, e diminui a atividade, podemos supor que este
ácido seja o responsável por uma maior atividade larvicida. O LCC obtido no presente
66
estudo, com aquecimento a 40°C, provavelmente tenha maior concentração de ácido
anacárdico, responsável pela maior atividade.
O fracionamento de extratos vegetais, guiado por bioensaios, é utilizado na tentativa
de se potencializar a atividade biológica e de isolamento do princípio ativo15,16. Porém,
um trabalho testando atividade larvicida de substâncias puras, mostrou que as frações
originadoras dessas, eram mais ativas que a substância pura isolada17. Isto sugere um
efeito sinergista de compostos presentes na fração. Neste trabalho, o fracionamento
originou uma fração mais ativa que o LCC inicial.
Os resultados da atividade larvicida do LCC e das frações, neste trabalho, foram
significativos para o controle de Aedes aegypti, quando comparados a outros trabalhos
pertinentes da literatura, para a mesma espécie de mosquito.
As concentrações letais obtidas com o LCC foram menores do que as encontradas
por Silva e cols.15 para o óleo resina de Copaifera reticulata, de 8,6 e 59,4ppm, para as
CL50 e CL90, respectivamente.
Esses resultados favoráveis estimulam a continuidade do estudo, visando o
isolamento do princípio ativo e principalmente formas que viabilizem o seu uso prático
para o controle de Aedes aegypti.
O efeito residual de um produto, é definido como a sua capacidade de manter
dosagens letais para um organismo alvo por um determinado período de tempo18. Não
foram encontrados na literatura trabalhos que avaliem o efeito residual de uma
substância botânica. Neste trabalho, houve mortalidade de 100% das larvas expostas à
solução-teste do LCC, a 200ppm, por 6 dias. Por se tratar de uma substância de origem
botânica a duração do efeito residual tem valor significativo tanto para o uso como
larvicida quanto pela ausência de impactos ambientais.
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Apesar do principal larvicida, usado até pouco tempo na quantidade de 1 ppm, em
programas de controle de Aedes aegypti, apresentar um efeito residual mais duradouro
como o encontrado por Pontes e cols 19,seu uso permanente acarreta desenvolvimento
de resistência e possíveis impactos na natureza.
A estimativa da dose letal mediana oral para causar a morte de 50% dos animais (
DL50 ) é maior que 2000 mg/kg. Segundo as diretrizes da OECD 423, este valor permite
classificar o LCC, na classe 5, ou seja, substância de muito baixa toxicidade.
AGRADECIMENTOS
Ao Professor Ângelo Rizzo pela identificação do material botânico.
CONFLITO DE INTERESSE
Os autores declaram não haver nenhum tipo de conflito de interesse no desenvolvimento do estudo.
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