Analize citogenetice la pacienții cu hipostatură: evaluarea cauzelor
determinante
Coordonatori: Absolvent:Conf. Dr. Viorica COȘIER Paula Petronela GROZAAsist. Dr. Diana MICLEA (UMF Cluj)
Universitatea de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară
Facultatea de Zootehnie şi Biotehnologii Cluj-Napoca
2014
CUPRINS
PARTEA IDocumentare
științifică1. INTRODUCERE2. HIPOSTATURA3. GENA SHOX4. EVIDENȚIERA
MUTAȚIILOR GENEI SHOX
PARTEA IICercetări personale
5. IPOTEZE și SCOP 6. STUDIUL I 7. STUDIUL II 8. STUDIUL III 9. STUDIUL IV 10. PERSPECTIVE
INTRODUCERE
IMPORTANTA: SHOX – factor genetic de importanță majoră în creșterea și dezvoltarea organismelor, mutațiile acesteia cauzează – hipostatură.
- Aplicarea precoce a tratamentului în vederea corectării defectului de creștere.
SCOP: Studierea posibilelor anomalii numerice și structurale ale cromozomului de sex X care cauzează
hipostatura, în special a mutațiilor genei SHOX.
TEMA: Evaluarea cauzelor determinate ale hipostaturii
Conceptul de hipostatură
- un individ cu înălțime sub media persoanelor același sex și aceeași vârstă.
- 3% din totalul populației globale
CLASIFICARE
a) Primară b) Secundarăc) Idiopatică
Sursa: http://www.gfmer.ch
Sursa: http://internalmedicine.pagesperso-orange.fr/madelung.htm
LANGER
LERI-WEILL
TURNER
GENA SHOXRegiuniile pseudoautozomale
blocuri de secvențe identice de pe heterozomi;
- 2 astfel de regiuni la oameni;
- PAR1 – 2.7Mb, 500 kb de telomeri
- PAR2 – 0.33Mb;- Conțin 29 gene cu ereditate
pseudoautozomală.- O singură genă cauzatoare
de boli
MUTAȚII 59 de mutații - pozitionate pe toate lungimea genei. Pot fi: Deleții – 70 %, Substituții, Inserții.
100% - cazurile de Sindrom Turner 70-80% - cazurile de Discondrosteoză Leri – Weill 2-15% - cazurile de hipostatură idiopatică
EVIDENȚIERA MUTAȚIILOR
Tehnici
Bazate pe PCR - MLPA
Bazate pe HIBRIDARE - FISH
CERCETĂRI PERSONALE
Cariotipare -
MONOSOMII
Evidențiere deleții-
SHOX
STUDII: 1 - BIOINFORMATIC
3 - CLINICE – CITOGENETICE
DEPARTAMENTUL DE GENETICĂ – UMF CLUJ
Evidențiere –
MOZAICISME
Studiul BioinformaticGENA SHOX UMANĂ
• Familia de gene SHOX – SHOX și SHOX 2 Datele de identificare a genelor
SHOX în bazele de date: - ID de identificare 6473 (NCBI) - Numărul de acces ENSG00000185960 (EMBL) - Sinonime: SS; GCFX; PHOG; SHOXY. - Acces referințe secvență genomică: NC_000023.11. - Secvenţa genomică - 35068 nucleotide, - Regiunea genomică cuprinsă între poziţiile 624344..659411. - SHOX2 - ID 6474 (NCBI), - Localizare: 3 în poziţia q25.32, - Coordonatele genomice (GRCh37): 3:157,813,799 - 157,823,95.1 - Sinonime: OG12; SHOT; OG12X.
Asamblarea exomului – transcriptul primar al SHOX a
Studiile Clinice – Citogenetice
I. Evidențierea absenței cromozomului X
OBIECTIV: Evidențierea absenței unui
cromozom X
Material : Sânge periferic de la 22 de paciente cu hipostatură
Metodă : Cariotiparea clasică
Rezultate: Confirmare absență cromozom X – 4 paciente
METODĂCariotiparea standard
Etape
1. Recoltare sânge venos : 5 ml sânge venos de la 10 paciente cu hipostatură
2. Cultura celulară: tuburi Chromosome kit P – 7 ml mediu complet + factor mitogen + 800 µl sânge termostat 37 C, 72 h.⁰
3. Blocarea în metafază: 100 µl colchichină termostat 37 C, 5% ⁰CO₂ , 40 minute.
4. Şoc hipoton: soluţie hipotonă KCl 0,075M centrifugare tuburi (5min. – 1500 RPM)... 10 ml KCl 0,075M (37 C) termostat ⁰37 C, 5% CO₂, 20 min.⁰
5. Fixarea : metanol+acid acetic glacial (3:1)
6. Etalare
7. Colorare – Giemsa
REZULTATECariotip normal - 18 paciente
Cariotip TURNERIAN 4 paciente.
II. Observarea mozaicismelor la pacientele cu cariotip normal
OBIECTIV: Observarea mozaicismelor
Material: Sângele periferic de la 18 paciente cu cariotip normal
200 de interfaze – 15 metafazeMetodă:
Tehnica FISH – sondă centromerică pentru cromozomul X
Rezultate: Absența mozaicismelor
Material și metodă Microscopul în epifluorescență
Zeiss
Pretratamentul lamelor Tratementul lamelor
Lame
REZULTATE
Tehnica FISH
III. Evidențierea delețiilor genei SHOX
Rezultate: o Nu s-a observat nici o deleție a genei SHOX prin
tehnica utilizată.
OBIECTIV: o Evidențierea existenței deleției genei SHOX
Material: o Sângele perifieric de la cele 18 paciente
o 200 interfaze – 15 metafazeMetodă:
o Tehnica FISH – sondă de locus specifică regiunii SHOX o Semnal fluorescent – ROȘU
Semnalul roșu pentru locusul SHOX
REZULTATE
CONCLUZII
Testarea genetică în cazul hipostaturii este foarte importantă pentru stabilirea tratamentului adecvat.
Tehnica FISH – nu prezintă o sensibilitate ridicată decât pentru delețiile de mari dimensiuni.
Utilizarea, pe viitor, a unor tehnici de înaltă precizie – cum ar fi MLPA.
VĂ MULȚUMESC
PENTRU ATENȚIE !!!