0
UNIVERSIDADE PARANAENSE - UNIPAR
CURSO DE FARMÁCIA - TOLEDO
ALEXANDRE FIORAVANTI SCHACHT
CULTIVO DE UMA LINHAGEM DE BASIDIOMICETO SOB DIFERENTES
CONCENTRAÇÕES DE INDUTORES VISANDO A PRODUÇÃO DE LACASE E
BIOMASSA MICELIAL
TOLEDO - PR
2018
1
ALEXANDRE FIORAVANTI SCHACHT
CULTIVO DE UMA LINHAGEM DE BASIDIOMICETO SOB DIFERENTES
CONCENTRAÇÕES DE INDUTORES VISANDO A PRODUÇÃO DE LACASE E
BIOMASSA MICELIAL
Trabalho de Conclusão do Curso apresentado à Banca
Examinadora do Curso de Graduação em Farmácia -
Universidade Paranaense - Unidade Universitária de
Toledo, como requisito parcial para a obtenção do título
de Farmacêutico, sob orientação do Prof. Me. Douglas
Rossi Jesus.
TOLEDO - PR
2018
2
3
CULTIVO DE UMA LINHAGEM DE BASIDIOMICETO SOB DIFERENTES
CONCENTRAÇÕES DE INDUTORES VISANDO A PRODUÇÃO DE LACASE E
BIOMASSA MICELIAL
Alexandre Fioravanti Schacht1
Douglas Rossi Jesus2
1Alexandre Fioravanti Schacht - Acadêmico do 4º ano do Curso de Farmácia da Universidade
Paranaense - Unidade Universitária Toledo. Endereço para correspondência: Rua Bento Munhoz da
Rocha Neto, 2283, Jardim La Salle, Toledo - Paraná. CEP: 85902-000. Fone: (45) 99956-8264.
e-mail: [email protected]
2Douglas Rossi Jesus - Professor adjunto do Curso de Farmácia da Universidade Paranaense -
Unidade Universitária Toledo. Endereço para correspondência: Av. Parigot de Souza, 3636, Jardim
Prada, Toledo - Paraná. CEP: 85903170. Fone: (45) 3277-8500.e-mail: [email protected]
4
CULTIVO DE UMA LINHAGEM DE BASIDIOMICETO SOB DIFERENTES
CONCENTRAÇÕES DE INDUTORES VISANDO A PRODUÇÃO DE LACASE E
BIOMASSA MICELIAL
Influência de indutores na produção de lacase e biomassa
RESUMO: Os fungos basidiomicetos auxiliam na manutenção do equilíbrio do ecossistema, além
de serem biorreguladores. Destacam-se por desempenharem um importante papel na ciclagem de
nutrientes, por meio da degradação da lignina a partir da ação coordenada de uma série de enzimas
intra e extracelulares. Buscou-se realizar o cultivo de uma linhagem de basidiomiceto sob diferentes
concentrações de indutores visando a produção da lacase e biomassa micelial. Para isso, três
linhagens de basidiomicetos (U15-3, U15-7 e U16-5) foram cultivadas em extrato de malte 2%
durante 14 dias a 28 °C. Após esse período, foi avaliada a produção de lacase, biomassa micelial e
pH. Constatando a linhagem de maior produção enzimática, foi analisada a influência de diferentes
concentrações de indutores (50, 100, 150, 200 e 250 µM de sulfato de cobre, associado ou não a 1
mM de guaiacol, xilidina ou vanilina) sobre a atividade de lacase, crescimento micelial e pH final
do meio. Entre as linhagens analisadas, a U15-7 se destacou na produção de lacase e biomassa.
Apenas as associações de sulfato de cobre e xilidina, em todas as concentrações, demonstraram
aumento significativo na produção de lacase e no crescimento micelial em comparação ao controle.
De forma geral, a menor produção de biomassa foi observada com xilidina (81,876 mg mL-1) e a
maior no tratamento vanilina 1 mM + 150 µM sulfato de cobre (163,544 mg mL-1). Nenhum pH foi
superior ao tempo zero (pH 5,67) e ao controle (pH 5,23). Os indutores vanilina (37669 U L-1) e
guaiacol (37484 U L-1) se destacaram na atividade de lacase em relação à xilidina e ao controle.
Novos estudos são necessários a fim de otimizar a influência de indutores no metabolismo fúngico.
PALAVRAS-CHAVE: Fenoloxidases. pH. Crescimento micelial. Sulfato de cobre. Indutores
fenólicos.
CULTIVATION OF A BASIDIOMICET LINEAGE UNDER DIFFERENT
CONCENTRATIONS OF INDUCTORS AIMING THE PRODUCTION OF LACASE AND
MICELIAL BIOMASS
Influence of inductors on the production of laccase and biomass
ABSTRACT: The basidiomycete fungi help in maintaining the balance of the ecosystem, besides
being bioregulators. They play an important role in the cycling of nutrients, through the degradation
of lignin from the coordinated action of a series of intra and extracellular enzymes. The cultivation
of a basidiomycete strain was carried out under different concentrations of inducers aiming at the
production of laccase and mycelial biomass. For this, three basidiomycete strains (U15-3, U15-7
and U16-5) were grown in malt extract (2%) for 14 days at 28 °C. After this period, laccase
production, mycelial biomass and pH were evaluated. The influence of different concentrations of
inducers (0, 50, 100, 150, 200 and 250 μM of copper sulfate and 0 and 1 mM of guaiacol, xylidine
or vanillin) on the activity of laccase, mycelial growth and final pH of the medium. Among the
analyzed strains, U15-7 stood out in the production of laccase and biomass. Only associations of
copper sulfate and xylidine at all concentrations showed a significant increase in laccase production
and mycelial growth compared to control. In general, the lowest biomass production was observed
with xylidine (81.876 mg mL-1) and the highest in the treatment 1 mM vanillin + 150 μM copper
sulfate (163.544 mg mL-1). No pH was higher than time zero (pH 5.67) and control (pH 5.23). The
vanillin (37669 U L-1) and guaiacol (37484 U L-1) inducers were prominent in laccase activity
relative to xylidine and control. New studies are needed in order to optimize the influence of
inducers on fungal metabolism.
KEYWORDS: Phenoloxidases. pH. Mycelial growth. Copper sulphate. Phenolic inducers.
5
INTRODUÇÃO
Considerados na maioria das vezes prejudiciais pela população, os fungos são utilizados por
muitas indústrias na fabricação de seus produtos, como a indústria alimentícia, farmacêutica e
biotecnológica (FERREIRA et al., 2016). Cerca de 100.000 espécies compõe o Reino Fungi,
entretanto, os filos Ascomiceto e Basiodiomiceto possuem maior atividade degradante da matéria
orgânica. Os fungos têm habilidade de se reproduzirem sexuada ou assexuadamente. Os de
reprodução sexuada, denominados fungos perfeitos ou telemorfos, produzem zigosporos ou
basidioporos, enquanto os imperfeitos ou amorfos, se reproduzem assexuadamente por meio de
brotamentos, fragmentos e produção por conídios (KAMIDA et al., 2005; NIEUWENHUIJZEN;
OEI, 2006; CERNIGLIA; SUTHERLAND, 2010).
De acordo com Kirk et al. (2010), o filo Basidiomycota é composto por 29.914 espécies
conhecidas, como os populares cogumelos e orelhas-de-pau, carvões, ferrugens, gasteromicetos e os
gelatinosos. Eles apresentam uma estrutura produtora de esporos exógenos em número de quatro
ou, dificilmente, dois, chamado de basídio, caracterizando a sua diferença. Ainda apresentam
micélio filamentoso e pluricelular (PAULA et al., 2007; SALVI, 2011).
Os basidiomicetos podem ser divididos em fungos causadores de podridão branca, deixando
a madeira com uma coloração esbranquiçada, pois degradam a celulose, hemicelulose e lignina; e os
fungos causadores de podridão parda, que possuem as mesmas capacidades degradativas dos fungos
de podridão branca, com exceção da lignina, alterando sua cor (SALVI, 2011).
Segundo Gou et al. (2009), dentre todos os microrganismos que possuem capacidade de
descolorir efluentes por biosorção e biodegradação, os fungos basidiomicetos são mais
frequentemente usados para esse propósito. Fato justificado pelas habilidades comuns dos fungos da
decomposição branca em oxidar compostos fenólicos, relacionados à lignina, que na maioria dos
casos está associada a enzimas extracelulares ligninolíticas (MELO; AZEVEDO, 2008). As
enzimas modificadoras de lignina, possuindo falta de especificidade ao substrato, têm a capacidade
de degradar uma extensa variedade de xenobióticos, incluindo os corantes sintéticos (MUNARI et
al., 2008).
Essas enzimas estão atraindo a atenção de diversas aplicações industriais, devido à
capacidade de catalisar a oxidação de fenóis e outros compostos aromáticos, como a
deslignificação, produção de etanol, modificação de fibras da madeira, clareamento de corantes e
remediação de solos e águas contaminadas. Com a habilidade de atuar em condições brandas de pH
e temperatura, elas permitem maior controle da geração de produtos de interesse, a um menor custo
energético e com menor impacto ambiental (BINOD et al., 2008).
6
As principais enzimas ligninolíticas presentes nos fungos basidiomicetos são: Lignina
Peroxidase (LiP), possuindo capacidade em oxidar compostos fenólicos e não fenólicos de alto
potencial redox; Manganês Peroxidase (MnP), capaz de oxidar compostos fenólicos na presença de
manganês, e ainda oxidar um segundo mediador para efetivar a quebra de compostos não fenólicos;
e Lacase, que por sua vez possui capacidade em oxidar compostos fenólicos simultaneamente à
redução do oxigênio molecular à água (WONG, 2009). De acordo com suas capacidades oxidativas,
essas enzimas ligninolíticas podem ser ordenadas em LiPs > MnPs > Lacases (AGUIAR; FERRAZ,
2011).
Quatro íons de cobre, subdivididos em três sítios ativos compõe a estrutura molecular da
lacase, que se envolvem para a transferência de elétrons do substrato para a direção do oxigênio
(GIARDINA et al., 2010). Conforme Neto (2006), as lacases possuem massas moleculares que
variam de 45 a 100 kDa.
A localização dos fungos na natureza, a concentração do substrato, a temperatura, o pH e
outras condições do ambiente aos quais eles estão expostos influenciam e regulam a produção
destas enzimas (HERRERA-ESTRELLA; HORWITZ, 2007). Além de outros fatores como tempo
de cultivo, composição química do meio, aeração, estágio de desenvolvimento e presença de
indutores como o nitrogênio e compostos aromáticos (DEKKER et al., 2007), a citar: álcool
veratrílico, ácido vanílico, 2,5 xilidina, ácido ferúlico, siringaldazina e guaiacol.
Os compostos aromáticos possuem estrutura similar à lignina ou derivados de lignina,
entretanto, dependendo da linhagem do fungo, do tipo do composto e da concentração empregada, a
influência de tais compostos ocorre de forma distinta (PISCITELLI et al., 2011). A utilização de
indutores pode ser empregada para diversas aplicações industriais, desde que a adição dessas
substâncias aumente consideravelmente a produção de lacase, subsidiando a produção de enzimas
em larga escala (COUTO; TOCA-HERRERA, 2007).
Devido ao cobre em seu sítio ativo, as lacases fúngicas são capazes de catalisar reações de
desmetilação, importantes em processos de biodegradação de cadeias poliméricas, rompendo anéis
aromáticos presentes na estrutura da lignina (PERALTA et al., 2004). Esses atributos tornam o
cobre um dos indutores mais eficientes (GALHAUP; HALTRICH, 2001; DEKKER et al., 2007). O
cobre também promove a síntese de isoformas de enzimas ligninolíticas (TERRON et al., 2004;
COUTO; TOCA-HERRERA, 2007).
A possibilidade de produção em curto período de tempo, elevada produção em um espaço
reduzido e facilidade de controle dos parâmetros físico-químicos, garantindo menores riscos de
contaminação e a obtenção dos produtos de maneira uniforme, possibilitam que a fermentação
submersa se torne uma alternativa promissora para a produção eficiente de biomassa de fungos e
seus metabólitos de interesse biotecnológico (GREGORI et al., 2007). Assim, este trabalho teve por
7
objetivo realizar o cultivo de uma linhagem de basidiomiceto sob diferentes concentrações de
indutores visando a produção de lacase e biomassa micelial.
MATERIAL E MÉTODO
O estudo foi conduzido nos laboratórios de Biotecnologia, Microbiologia e Farmacotécnica
da Universidade Paranaense - UNIPAR, Unidade Universitária de Toledo, entre os meses de abril e
outubro de 2018.
Microrganismos e produção de inóculo
Três linhagens (U15-3, U15-7 e U16-5) de basidiomicetos pertencentes à coleção de culturas
do Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Aplicada à Agricultura da Universidade
Paranaense (UNIPAR), Unidade Universitária de Umuarama, foram utilizadas neste estudo. Com
exceção da linhagem U16-5, os outros dois isolados se encontram em fase de identificação
molecular (Tabela 1).
Tabela 1: Provável táxon e local de coleta das três linhagens de fungos
basidiomicetos.
Linhagem Provável Táxon Local de Coleta
U15-3 Puffball Umuarama - PR
U15-7 Polyporaceae Iporã - PR
U16-5 Trametes polyzona Umuarama - PR
As linhagens foram mantidas em meio ágar-extrato de malte (AEM) 1% (m/v) a 28 ºC por
repique contínuo e cultivadas em AEM 2% (m/v) a 28 ºC para produção de inóculo.
Cultivo submerso
O meio fermentativo utilizado no cultivo submerso foi o extrato de malte, preparado com 20
g de malte para 1 L de água purificada (2%, m/v). Após o preparo do meio, foram inoculados cinco
discos de AEM (6 mm de diâmetro) contendo o micélio sem setoriamento. Os frascos foram
mantidos por 14 dias a 28 ºC, sem influência de luz e agitação (BOD). Ao final do período de
cultivo, foi realizada a filtração de cada amostra utilizando bomba a vácuo. Com o filtrado foi
determinada a atividade de lacase e o pH final do meio, enquanto que a biomassa micelial foi
avaliada com o resíduo retido no papel filtro.
8
Determinação da atividade de lacase
Por meio da oxidação de uma solução (1 mM) de ABTS (2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-
6-sulfatonato), foi avaliada a atividade de lacase. Para isso, 0,2 mL do meio de cultivo foi
misturado com 0,7 mL de água, 0,45 mL de tampão acetato de sódio (0,1 M, pH 5,0) e 0,15 mL de
ABTS (HAN; CHOI; SONG, 2005). A mistura foi mantida a 30 ºC por 10 minutos, sendo esta
diluída com 3,5 mL de água purificada e, então, realizada a leitura da absorbância a 420 nm (ε
=36000 M-1 cm-1). Como controles analíticos foram utilizadas uma mistura de meio de cultivo (0,2
mL), água (0,85 mL) e tampão acetato de sódio (0,45 mL) e outra mistura de água (0,9 mL),
tampão acetato de sódio (0,45 mL) e ABTS (0,15 mL). Uma unidade (U) de atividade enzimática
foi definida como a quantidade de enzima necessária para oxidar 1 μmol de ABTS por minuto
(BOURBONNAIS; LEECH; PAICE, 1998).
Determinação da biomassa micelial
A biomassa de cada amostra foi introduzida em frascos de coleta universal previamente
secos e tarados em balança analítica com quatro casas decimais. Os frascos com o material fúngico
foram levados à estufa de secagem com ar circulante a 60 ºC até massa constante (MARIM, 2017).
Determinação do pH
A leitura do pH foi feita por meio da imersão do eletrodo do pHmetro (marca Gehaka®),
previamente calibrado com soluções padrão pH 4 e 7, no filtrado de cada linhagem. Além disso, o
pH do meio de cultivo também foi determinado no primeiro dia, antes da inoculação das linhagens.
Influência de indutores sobre a produção de lacase e biomassa micelial
A linhagem que demonstrou maior atividade enzimática foi cultivada nas mesmas condições
do experimento anterior, acrescida de diferentes concentrações de indutores. Inicialmente foi
testada a interferência do sulfato de cobre (CuSO4) a 50, 100, 150, 200 e 250 µM, sendo um grupo
sem o composto empregado como controle.
Feito isso, o CuSO4 nas diferentes concentrações foi associado aos indutores aromáticos
guaiacol, xilidina e por último vanilina, todos a 1 mM. O tratamento contendo apenas o indutor
aromático foi usado como controle em cada um dos experimentos. Lembrando que também foi
avaliada a influência dos diferentes indutores aromáticos em relação ao controle (sem indutor). Os
indutores foram esterilizados por filtração (membrana Millipore 0,22 μm) e adicionados
assepticamente aos meios de cultivo no quarto dia de fermentação.
A atividade de lacase, a produção de biomassa micelial e a leitura do pH do meio foram
determinadas no 14º dia de cultivo, conforme procedimentos descritos anteriormente.
9
Análise estatística
Todos os ensaios seguiram o delineamento inteiramente casualizado (DIC), conduzidos em
triplicata. Os resultados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e as diferenças
significativas entre as médias (p≤0,05) determinadas pelo teste de Scott-Knott com auxílio do
software SISVAR 5.6 - DEX - UFLA.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Depois de permanecerem 14 dias sob temperatura de 28 ºC na BOD, foi analisada a
atividade enzimática, biomassa e pH final do meio contendo as linhagens U15-3, U15-7 e U16-5,
com o objetivo de utilizar a linhagem que registrasse maior produção enzimática para a avaliação
sob a influência de indutores. Neste caso, a linhagem U15-7 teve a maior produção de lacase (32323
U L-1), sendo superior estatisticamente à linhagem U15-3 (25240 U L-1), seguida da U16-5 (11140
U L-1) (Tabela 3).
Um meio de cultura líquido possui muita importância para a produção de fungos, devendo
conter fontes de nitrogênio, carbono e minerais (BARBOSA et al., 2004). Se controladas as
condições de pH e temperatura, a fermentação em estado submerso é a mais propícia ao
crescimento dos microrganismos e consequente recuperação das enzimas extracelulares (FEITOSA,
2009). Além disso, os meios líquidos são facilmente controlados e satisfatórios para a produção de
lacase (MAJEU; TYAGI, 2010). Fenice et al. (2003) verificaram em seu estudo que a produção de
lacase em fermentação em estado submerso foi maior (4600 U L-1) do que em fermentação em
estado sólido (1300 U L-1).
Tabela 3: Atividade de lacase, produção de biomassa e pH final do meio de cultivo de três
linhagens (U15-3, U15-7 e U16-5) mantidas em meio extrato de malte 2% a 28 ºC por 14 dias.
Todos os resultados foram expressos em média ± desvio padrão.
Linhagem Atividade de lacase
(U L-1)
Produção de biomassa
(mg mL-1)
pH final do meio
T0 = 5,63 ± 0,01b
U15-3 25240 ± 1827b 35,392 ± 4,615c 6,06 ± 0,141a
U15-7 32323 ± 1168a 130,946 ± 7,765a 5,06 ± 0,176 c
U16-5 11140 ± 1649c 56,332 ± 12,703b 4,61 ± 0,062d
*Letras minúsculas comparam colunas e letras diferentes indicam diferença estatística pelo teste de Scott-Knott
(p≤0,05).
10
Em relação ao crescimento micelial, foi possível perceber que a maior produtora também foi
a linhagem U15-7 (130,946 mg mL-1), seguida da linhagem U16-5 (56,332 mg mL-1) e por último,
da U15-3 (35,392 mg mL-1) (Tabela 3).
A biomassa é constituída por citosol, parede celular e membrana plasmática. Fazendo parte
do metabolismo dos fungos, ela confere o formato das células e possui uma flexibilidade para que
ocorram mudanças nas suas estruturas durante o seu desenvolvimento, fornecendo aos fungos
proteção contra ações mecânicas, ataque de outros microrganismos, mudanças de calor e frio e
pressão osmótica (PÉREZ; RIBAS, 2004; FUKUDA et al., 2009; GUPTA et al., 2012; FREE,
2013).
Os fungos alteraram o pH durante o cultivo, demonstrando diferença estatística entre as
linhagens mantidas em extrato de malte 2%. O maior valor de pH foi visto para a linhagem U15-3
(pH 6,06), que obteve um aumento estatístico quando comparada ao T0 (pH 5,63). As demais
linhagens U15-7 (pH 5,06) e U16-5 (pH 4,61) também registraram uma diferença estatística em
relação ao T0, entretanto, apresentaram pH inferior ao mesmo e diferentes entre si (Tabela 3).
Com exceção dos fungos filamentosos, que podem suportar variação do pH de 2,0 a 9,0, o
pH ideal para o cultivo fúngico varia de 4,0 a 6,0 (SANTAELLA et al., 2009). Segundo Prasad et al
(2005), o pH é um parâmetro que pode ser utilizado como mecanismo de otimização da produção
enzimática. Fato justificado por Tavares et al. (2006), que por meio de um estudo em diferentes
concentrações iniciais de glucose utilizando o fungo Trametes versicolor, constataram que quanto
menor o pH, menor a produção de lacase.
Devido ao melhor resultado da atividade de lacase entre as três linhagens analisadas (U15-3,
U15-7 e U16-5) ser da linhagem U15-7, ao quarto dia após sua nova inoculação, foram acrescidos
ao meio os indutores sulfato de cobre associado ou não ao guaiacol, xilidina e vanilina, para avaliar
a influência destes na atividade de lacase, produção de biomassa e pH do meio de cultivo.
Embora as diferentes concentrações de cobre tenham promovido um aumento da produção
de lacase, esse aumento não foi significativo em relação ao controle (34907 U L-1), que não possuía
a presença do indutor (Tabela 4). Os resultados elevados na produção de lacase devem ser
atribuídos a uma característica da linhagem, e não como influência do indutor sulfato de cobre,
podendo ser utilizado 50 µM devido a proximidade da atividade de lacase nas diferentes
concentrações ou até mesmo nem adicioná-lo.
Segundo Faraco, Giardina e Sannia (2003), a influência do cobre na regulação da expressão
gênica de lacase ocorre via elementos sensíveis a metal (MRE - metal responsive element) presentes
na região promotora de genes de lacase, sendo indiretamente afetados pela presença de cobre no
meio de cultivo. Mais tarde, os autores identificaram quatro MREs na região promotora de dois
genes de lacase de Pleurotus ostreatus.
11
Tabela 4: Atividade de lacase, produção de biomassa e pH final do meio líquido extrato de malte
2% contendo a linhagem U15-7 sob influência do indutor sulfato de cobre em diferentes
concentrações (50 a 250 µM). Resultados expressos em média ± desvio padrão.
Sulfato de cobre
(µM)
Atividade de lacase
(U L-1)
Produção de
biomassa (mg mL-1)
pH final do meio
T0 = 5,67 ± 0,000a
0 (C) 34907 ± 2266a 119,436 ± 5,939a 5,23 ± 0,000b
50 36967 ± 1816a 114,422 ± 2,488a 4,88 ± 0,070c
100 36234 ± 676a 101,809 ± 14,352a 4.,93 ± 0,020c
150 37068 ± 257a 109,174 ± 4,771a 4,79 ± 0,060c
200 37654 ± 524a 102,113 ± 10,490a 4,79 ± 0,047c
250 36659 ± 215a 99,235 ± 5,632a 4,78 ± 0,145c
(C) = controle; T0 = tempo zero.
*Letras minúsculas comparam colunas e letras diferentes indicam diferença estatística pelo teste de Scott-Knott
(p≤0,05).
Fonseca et al. (2010) constataram uma maior produção de lacase na presença de 500 µM de
cobre por diferentes espécies nativas da Argentina (Ganoderma applanatum, Peniophora sp.,
Pycnoporus sanguineus e Coriolus versicolor f. antarcticus). Apesar dos dados disponíveis sobre a
presença de MREs nos promotores de lacases, são poucas as análises sobre os mecanismos
moleculares envolvidos na regulação da expressão de lacase por diferentes estímulos, como
presença de cobre.
Além de provocar o aumento da atividade de lacase, o cobre ainda induz a transcrição da
enzima. O estresse oxidativo provocado pela adição do metal aos cultivos tem sido relacionada à
indução da transcrição (GALHAUP; HALTRICH, 2001). Fato comprovado por Peralta, Souza e
Bôer (2004), que ao constatarem que a produção de lacase por Pleurotus pulmonarius aumentou
com o cobre, determinaram que a razão fisiológica da produção pela adição de cobre é o estresse
provocado pelos íons cobre. Entretanto, o cobre é extremamente tóxico para as células microbianas
em níveis mais elevados em sua forma livre (HESS et al., 2002).
De acordo com Saparrat et al. (2002), na presença de 150 µM de CuSO4, a produção de
lacase por Coriolopsis rigida foi antecipada e aumentou cerca de 500 vezes (~95000 U L-1). Mais
recentemente, Silva et al. (2012) também observaram aumento significativo da produção de lacase
com a adição de CuSO4 na mesma concentração de 150 M feita após 3 dias de cultivo por
linhagens de Lentinula edodes, Pleurotus ostreatus e Pleurotus florida.
Outra análise que também não apresentou diferença significativa em relação ao controle foi
a produção de biomassa, reforçando assim a ausência de uma interferência do sulfato de cobre sobre
a linhagem (Tabela 4). No trabalho realizado por Nogueira et al. (2009), os meios de cultura (Batata
dextrose; Pontecorvo e Extrato de malte + Peptona) proporcionaram o crescimento micelial de
Lentinus strigellus quando submetidos à luz e a condições estáticas. O meio de cultivo de batata
12
proporcionou a maior produção de biomassa, considerando a massa micelial seca da colônia no
período de 20 dias.
Já o pH do controle (5,23) quando comparado ao T0 (5,67) apresentou resultados estatísticos
inferiores, porém, superior em comparação com as diferentes concentrações de sulfato de cobre
(Tabela 4). Segundo diversos estudos, uma boa produção enzimática pelas enzimas obtidas por
meio dos fungos ocorre entre as faixas de pH 3,0 e 5,2, sendo que estas estão relacionadas com as
funções fisiológicas e nicho ecológico das mais diferentes espécies (BALDRIAN, 2006;
MADHAVI; LELE, 2009; GIARDINA et al., 2010; STRONG; CLAUS, 2011).
Na segunda bateria de tratamento, foi avaliada de maneira isolada a influência do guaiacol,
seguida da associação com o sulfato de cobre em diferentes concentrações. Tanto a atividade
enzimática, quanto o crescimento micelial não apresentaram diferença estatística em relação ao
controle (somente indutor guaiacol) (Tabela 5).
Além do MRE, a região promotora de genes de lacase possui sequências denominadas
elementos sensíveis a xenobióticos (XRE - xenobiotic responsive element) e elementos sensíveis a
antioxidantes (ARE - antioxidant responsive element). Por meio da interação com outros elementos,
essas sequências estimulam a transcrição de genes de lacase na presença de compostos aromáticos
(GIARDINA et al., 2010). A presença desses elementos na região promotora possibilitaria a
indução da lacase por compostos aromáticos e a ausência de indução ocorre pela ausência desses
elementos (GIARDINA et al., 2010; PISCITELLI et al., 2011).
Tabela 5: Atividade de lacase, produção de biomassa e pH final do meio líquido extrato de malte
2% contendo a linhagem U15-7 sob influência do indutor guaiacol (1 mM) e em associação com
sulfato de cobre em diferentes concentrações (50 a 250 µM). Resultados expressos em média ±
desvio padrão.
Sulfato de
cobre (µM)
Guaiacol
(mM)
Atividade de lacase
(U L-1)
Produção de
biomassa (mg mL-1)
pH final do meio
T0 = 5,67 ± 0,000a
0 (C) 1 37484 ± 1303a 136,325 ± 3,772a 4,84 ± 0,010b
50 1 39243 ± 773a 123,753 ± 14,844a 4,73 ± 0,010c
100 1 39151 ± 1064a 121,787 ± 0,440a 4,74 ± 0,005c
150 1 40578 ± 1853a 117,231 ± 3,904a 4,65 ± 0,086c
200 1 39583 ± 1376a 130,358 ± 18,787a 4,58 ± 0,105d
250 1 39691 ± 1539a 121,518 ± 4,665a 4,47 ± 0,080e
(C) = controle; T0 = tempo zero.
*Letras minúsculas comparam colunas e letras diferentes indicam diferença estatística pelo teste de Scott-Knott
(p≤0,05).
Terron et al. (2004) observaram com a adição de diversos compostos fenólicos, dentre eles o
guaiacol, um aumento na produção de lacase por Trametes sp. Além de demonstrar que o guaiacol
13
parece ter efeito na atividade de lacase, com os resultados do estudo relatado foi possível notar
efeitos na expressão de genes desta enzima por Trametes sp. Xiao et al. (2006) também perceberam
que a produção de lacase por Trametes sp. foi afetada pelo guaiacol, produzindo 712 U L-1 na
presença de 12 mM de indutor.
O pH do meio de cultivo contendo apenas guaiacol e em associação com sulfato de cobre
não foram superiores ao pH do tempo zero (pH 5,67). Porém, o tratamento com guaiacol se
apresentou estatisticamente superior (pH 4,84) às associações de guaiacol com sulfato de cobre.
Para as concentrações de 50 µM (pH 4,73), 100 µM (pH 4,74) e 150 µM (pH 4,65) não houve
diferença estatística significativa entre si. A concentração de 200 µM foi inferior (pH 4,58) quando
comparada às anteriores, entretanto, superior à concentração de 250 µM (pH 4,47) (Tabela 5).
Em seus estudos, Marim (2017) constatou que o pH inicial do meio de cultivo a base de
extrato de malte influenciou a produção de biomassa (p≤0,05) do fungo Lentinus crinitus. A maior
produção da linhagem U13-5 ocorreu em pH 5 (3,4 mg mL-1). Houve uma redução da produção da
biomassa da linhagem quando elevou-se o pH para 6 (3 mg mL-1) e 7 (2,9 mg mL-1).
Segundo Wesenberg, Kyriakides e Agathos (2003), o pH para cultivo desses fungos deve
estar entre 2,0 e 8,5 para que haja ótima produção da enzima lacase. Mukherjee et al. (2013)
reforçaram essa vantagem dos fungos serem cultivados em uma ampla faixa de pH, possibilitando
uma produção enzimática eficaz.
A terceira bateria de tratamento contou com a presença do indutor xilidina. A atividade de
lacase do tratamento com o indutor aromático (33295 U L-1) teve resultados estatisticamente
inferiores quando comparada às associações xilidina + sulfato de cobre em diferentes concentrações
(Tabela 6). Ou seja, a produção enzimática aumentou em 18% na associação de xilidina 1 mM com
50 µM de sulfato de cobre, 16% (xilidina 1 mM + sulfato de cobre 100 µM), 14% (xilidina 1 mM +
sulfato de cobre 150 µM), 18% (xilidina 1 mM + sulfato de cobre 200 µM) e 19% (xilidina 1 mM +
sulfato de cobre 250 µM).
Rancaño et al. (2003) compararam a interferência de etanol, álcool veratrílico e xilidina na
produção de lacase por Trametes versicolor e constataram que a xilidina se destacou, apresentando
os melhores resultados na indução da atividade enzimática (cerca de 1500 U L-1), aumentando 14
vezes a produção em relação a nenhum indutor adicionado ao meio (controle).
A xilidina foi a que conduziu a maiores atividades enzimáticas para o fungo Trametes
modesta entre muitos indutores testados (NYANHONGO et al., 2002). A adição de 2,5-xilidina
aumentou a atividade de lacase 50 vezes por diferentes linhagens do fungo Pycnoporus sanguineus
(POINTING; JONES; VRIJMOED, 2002). Por outro lado, estudos mostraram que outros fungos
como Chalara paradoxa (ROBLES et al., 2002) e Pleurotus pulmonarius (SOUZA et al., 2004) não
responderam à indução por 2,5-xilidina.
14
Tabela 6: Atividade de lacase, produção de biomassa e pH final do meio líquido extrato de malte
2% contendo a linhagem U15-7 sob influência do indutor xilidina (1 mM) e em associação com
sulfato de cobre em diferentes concentrações (50 a 250 µM). Resultados expressos em média ±
desvio padrão.
Sulfato de
cobre (µM)
Xilidina
(mM)
Atividade de lacase
(U L-1)
Produção de
biomassa (mg mL-1)
pH final do meio
T0 = 5,67 ± 0,000a
0 (C) 1 33295 ± 2424b 81,876 ± 6,754c 4,77 ± 0,015b
50 1 39220 ± 257a 121,889 ± 5,321a 4,79 ± 0,050b
100 1 38719 ± 658a 103,718 ± 7,623b 4,83 ± 0,077b
150 1 37939 ± 2016a 123,630 ± 0,906a 4,83 ± 0,025b
200 1 39413 ± 1604a 115,759 ± 6,298a 4,71 ± 0,025b
250 1 39482 ± 698a 109,285 ± 7,119b 4,74 ± 0,112b
(C) = controle; T0 = tempo zero.
*Letras minúsculas comparam colunas e letras diferentes indicam diferença estatística pelo teste de Scott-Knott
(p≤0,05).
A produção de biomassa teve maiores resultados nas concentrações de xilidina + cobre a 50
µM, 150 µM e 200 µM, sendo o aumento de 49%, 51% e 41%, respectivamente. As concentrações
associadas de 100 µM e 250 µM de cobre foram estatisticamente inferiores às outras, entretanto,
superiores quando comparada à produção de biomassa do tratamento somente com xilidina (81,876
mg mL-1). Neste caso, o acréscimo na produtividade foi de 27% (100 µM ) e 33% (250 µM). Todos
os resultados de pH foram inferiores ao tempo zero e não demonstraram diferenças estatísticas
significativas entre si (Tabela 6).
Conforme Campos et al. (2010), a produção micelial depende das características metabólicas
de cada linhagem, podendo algumas apresentar menor tempo de produção. Em seus estudos, o meio
líquido apresentou melhor produção de biomassa quando foram cultivados fungos a 30 ºC por 20
dias. Além disso, pôde-se verificar máxima produção de biomassa pelos fungos Pleurotus em nove
dias de cultivo em meio Pontecorvo sem agitação.
Conforme Purschwitz et al. (2006), evidências mostram que a sinalização de pH envolve um
complexo de membranas. Ainda no estudo ressalta-se que o pH ambiente regula a virulência
fúngica em plantas, insetos e animais, sendo que existem características específicas de pH para cada
espécie.
A última bateria de tratamento foi exposta ao indutor vanilina, de maneira isolada e
associada com o sulfato de cobre em diferentes concentrações. Os resultados da atividade de lacase
não apresentaram diferença estatística significativa. Ao contrário da produção de biomassa, que
apresentou diferenças no tratamento com a vanilina + sulfato de cobre a 50 µM (136,979 mg mL-1),
100 µM (146,902 mg mL-1) e 200 µM (134,944 mg mL-1), sendo inferiores quando comparadas à
biomassa dos tratamentos submetidos à presença exclusiva da vanilina e da associação com as
15
concentrações de cobre 150 µM (163,544 mg mL-1) e 250 µM (153,970 mg mL-1). Nenhum pH foi
superior ao T0 e não apresentaram diferenças estatísticas significativas entre si (Tabela 7).
Tabela 7: Atividade de lacase, produção de biomassa e pH final do meio líquido extrato de malte
2% contendo a linhagem U15-7 sob influência do indutor vanilina (1 mM) e em associação com
sulfato de cobre em diferentes concentrações (50 a 250 µM). Resultados expressos em média ±
desvio padrão.
Sulfato de
Cobre (µM)
Vanilina
(mM)
Atividade de
Lacase (U L-1)
Produção de
biomassa (mg mL-1)
pH final do meio
T0 = 5,67 ± 0,000a
0 (C) 1 37669 ± 810a 156,909 ± 3,575a 4,72 ± 0,078b
50 1 40277 ± 1641a 136,979 ± 2,105b 4,74 ± 0,090b
100 1 40478 ± 1588a 146,902 ± 13,707 b 4,67 ± 0,064b
150 1 39405 ± 1106a 163,544 ± 8,574a 4,65 ± 0,047b
200 1 40215 ± 1500a 134,944 ± 0,485b 4,56 ± 0,015b
250 1 40339 ± 846a 153,970 ± 10,230a 4,65 ± 0,105b
(C) = controle; T0 = tempo zero.
*Letras minúsculas comparam colunas e letras diferentes indicam diferença estatística pelo teste de Scott-Knott
(p≤0,05).
Determinados tipos de fungos da classe dos Basidiomicetos quando incubados com
compostos fenólicos, são induzidos à produção de lacase (FARNET et al., 2004; GARCIA;
SANTIAGO; ULHOA, 2006; SHRADDHA et al., 2011). Pode ser observado em alguns estudos a
vanilina sendo utilizada na indução da produção de lacase (SOUZA et al., 2004; CAVALLAZZI;
KASUYA; SOARES, 2005).
Para ocorrer o aumento da conversão de ácido vanílico para vanilina pelo fungo, deve haver
uma diminuição de vanilina no meio, pois acima da concentração de 1 g L-1, a vanilina é tóxica para
os microrganismos de maneira geral (LOPEZMALO; ALZAMORA; ARGAIZ, 1997).
Bugarski et al. (2002) avaliaram meios de cultivo contendo diferentes concentrações de
carboidrato (0,1; 0,2 e 0,3% de Maltex - extrato de malte contendo 55% de maltose e maltotriose e
10% de glicose e frutose) no crescimento micelial de duas linhagens de Pleurotus ostreatus. O meio
de cultivo que continha a maior concentração de açúcar proporcionou as melhores condições de
crescimento micelial para as duas linhagens.
Os microrganismos devem se adaptar ao pH para sobreviver e proliferar. Estas condições de
pH interno são um meio de garantir que a síntese das moléculas ou enzimas segregadas e
metabólitos ocorram apenas a valores de pH em que melhor se adaptam (PEÑALVA et al., 2008).
Com base nos resultados obtidos, foi possível avaliar a influência dos indutores aromáticos
no metabolismo da linhagem fúngica testada (Tabela 8). A atividade de lacase da linhagem U15-7
sob influência do guaiacol (37484 U L-1) e da vanilina (37669U L-1) foram superiores
16
estatisticamente em relação a da xilidina (33295 U L-1) e ao controle (34907 U L-1). Já a produção
de biomassa sob influência da vanilina (156,909 mg mL-1) foi superior ao do guaiacol (136,325 mg
mL-1), que por sua vez, apresentou resultado estatístico superior ao controle (119,436 mg mL-1) e
xilidina (81,876 mg mL-1).
A indução via compostos aromáticos se dá em nível transcricional, ocorrendo de forma
distinta para diferentes fungos, bem como entre diferentes isoenzimas do mesmo organismo
(PISCITELLI et al., 2011). A concentração e a estrutura dos compostos aromáticos desempenham
uma importante função na regulação da síntese enzimática (ELISASHVILI et al., 2010).
Tabela 8: Atividade de lacase, produção de biomassa e pH final do meio líquido extrato de malte
2% contendo a linhagem U15-7 sob influência dos indutores aromáticos guaiacol, xilidina e
vanilina (1 mM) em comparação ao controle (ausência de indutor). Resultados expressos em média
± desvio padrão.
Tratamento Atividade de lacase
(U L-1)
Produção de biomassa
(mg mL-1)
pH final do meio
T0 = 5,67 ± 0,000a
Controle 34907 ± 2266b 119,436 ± 5,939c 5,23 ± 0,000b
Guaiacol 37484 ± 1303a 136,325 ± 3,772b 4,84 ± 0,010c
Xilidina 33295 ± 2424b 81,876 ± 6,754d 4,77 ± 0,015d
Vanilina 37669 ± 810a 156,909 ± 3,575a 4,72 ± 0,078d
T0 = tempo zero.
*Letras minúsculas comparam colunas e letras diferentes indicam diferença estatística pelo teste de Scott-Knott
(p≤0,05).
O T0 foi superior a todos os pHs, seguido pelo pH do controle (pH 5,23), que apresentou
resultados estatísticos superiores ao pH da linhagem U15-7 sob influência do guaiacol (pH 4,84).
Tanto os tratamentos que foram submetidos à influência da xilidina (pH 4,77), quanto da vanilina
(pH 4,72) foram inferiores estatisticamente ao guaiacol (pH 4,84) (Tabela 8).
Baseado nos estudos de Joshi et al. (2013), pode-se afirmar que o pH do meio de cultivo tem
influência direta na produção micelial dos fungos basidiomicetos, pois ao buscarem maior
produtividade de biomassa micelial por Schizophyllum commune em diferentes pHs, observaram
que os resultados foram melhores quando o pH foi ajustado para 6, produzindo 8,6 mg mL-1 em 14
dias.
Strong (2011) utilizou água residual de destilaria de conhaque com o pH ajustado entre 3,5 e
6 no cultivo de Trametes pubescens e observou que os pHs diferentes ocasionaram uma grande
variação na produção de lacase, tendo sua produção maior quando o pH inicial foi 5.
17
CONCLUSÃO
A linhagem U15-7 apresentou resultados superiores em relação à produção de lacase e
biomassa micelial.
Somente a xilidina estimulou a atividade enzimática e crescimento fúngico, quando
associada a diferentes concentrações de cobre. Nenhum pH foi superior ao T0 (pH 5,67) e ao
controle (pH 5,23).
Os indutores aromáticos vanilina e guaiacol se destacaram na produção de lacase em relação
à xilidina e ao controle. Vanilina também foi superior estatisticamente para produção de biomassa.
Novos estudos são necessários a fim de otimizar a influência de indutores no metabolismo fúngico.
REFERÊNCIAS
AGUIAR, A.; FERRAZ, A. Mecanismos envolvidos na biodegradação de materiais
lignocelulósicos e aplicações tecnológicas correlatas. Química Nova, v. 34, n. 10, p. 1729-1738,
2011.
BALDRIAN, P. Fungal laccases - occurrence and properties. FEMS microbiology reviews, v. 30,
n. 2, p. 215-242, 2006.
BARBOSA, A. M. et al. Produção e aplicações de exopolissacarídeos fúngicos. Seminário de
Ciências Exatas e Tecnológicas, v. 25, n. 1, p. 29-42, 2004.
BINOD, P. et al. Advances in fermentation technology. New Deli: Asiatech Pulishers, Inc, p.
291-319, 2008.
BOURBONNAIS, R.; LEECH, D.; PAICE, M. G. Electrochemical analysis of the interactions of
laccase mediators with lignin model compounds. Biochimica et Biophysica Acta - General
Subjects, v. 1379, n. 3, p. 381-390, 1998.
BUGARSKI, D. et al. Effect of major environmental conditions on the development of the
mycelium and growth of the oyster mushroom (Pleurotus ostreatus). Acta of Horticulture, v. 579,
2002.
CAMPOS, C. et al. Produção de biomassa, proteases e exopolissacarídeos por Pleurotus ostreatus
em cultivo líquido. Arquivo Ciências Veterinária Zoologia. UNIPAR, v. 13, n. 1, p. 19-24, 2010.
CAVALAZZI, J. R. P.; KASUYA, C. M.; SOARES, M. A. Screening of inducers for laccase
production by Lentinula edodes in liquid medium. Brazilian Journal of Microbiology, n. 36, p.
383-387, 2005.
18
CERNIGLIA, C. E.; SUTHERLAND, J. B. Degradation of polycyclic aromatic hidro carbons by
fungi. In: TIMMIS, K. N. Handbook of hydro carbono and lipid microbiology. Heidelberg:
Springer-Verlag, 2010.
COUTO, S. R.; TOCA-HERRERA, J. L. Laccase production at reactors cale by filamentous
fungi. Biotechnology Adv., v. 25, p. 558-569, 2007.
DEKKER, R. F. H. et al. Influence of nutrients on enhancing laccase production by
“Botryosphaeria rhodina” MAMB-05. Journal of the Spanish Society for Microbiology, v. 10, n.
3, p. 177-186, 2007.
ELISASHVILI, V. et al. Effect of aromatic compounds on the production of laccase and manganese
peroxidase by white-rot basidiomycetes. Journal Ind. Microbiology Biotecnology, v. 37, p. 1091-
1096, 2010.
FARACO, V.; GIARDINA, P.; SANNIA, G. Metal responsive elements in Pleurotus ostreatus
laccase gene promoters. Great Britain Microbiology, v. 149, p. 2155- 2162, 2003.
FARNET, A. et al. Purification of a laccase from Marasmius quercophilus induced with ferulic
acid: reactivity towards natural and xenobiotic aromatic compounds. Enzyme and Microbial
Technology, Amsterdam, v. 34, p. 549-554, 2004.
FEITOSA, I. C. Produção de enzimas lipolíticas utilizando bactéria isolada de solo com
histórico de contato com petróleo em fermentação submersa. Dissertação (Mestrado em
Engenharia de Processos) - Universidade Tiradentes, Aracaju, 2009.
FENICE, M. et al. Submerged and solid-state production of laccase and Mn-peroxidase by Panus
tigrinus on olive mill wastewater-based media. Journal of Biotechnology, v. 100, n. 1, p. 77-85,
2003.
FERREIRA, F. da S. et al. Otimização do crescimento de fungos degradadores de madeira.
Marupiara, v. 1, n. 1, 2016.
FONSECA, M. I. et al. Copper inducing effect on laccase production of white rot fungi native from
Misiones (Argentina). Enzyme and Microbial Technology, v. 46, p. 534- 539, 2010.
FREE, S. J. Fungal cell wall organization and biosynthesis. Advances in Genetics, v. 81, p. 33-82,
2013.
FUKUDA, E. K. et al. Polissacarídeos de parede celular fúngica: purificação e caracterização.
Semina: Ciências Agrárias, v. 30, p. 117-134, 2009.
GALHAUP, C.; HALTRICH, D. Enhanced formation of laccase activity by the white-rot fungus
Trametes pubescenes in the presence of copper. Applied Microbial Biotechnology, v. 56, p. 225-
232, 2001.
19
GARCIA, T. A.; SANTIAGO, M. F.; ULHOA, C. J. Properties of laccases produced by
Pycnoporus sanguineus induced by 2,5-xylidine. Biotechnology Letters, Dordrecht, v. 28, p. 633-
636, 2006.
GIARDINA, P. et al. Laccases: a never-ending story. Cellular and Molecular Life Sciences, v. 67,
p. 369-385, 2010.
GOU, M. et al. Azo dye decolorization by a new fungal isolate, Penicillium sp. QQ and fungal-
bacterial cocultures. Journal of Hazardous Materials, v. 170, p. 314-319, 2009.
GREGORI, A. et al. Cultivation techniques and medicinal properties of Pleurotus spp. Food
Technology and Biotechnology, v. 45, p. 236-247, 2007.
GUPTA, V.K. et al. (Ed.). Current methods in fungal biology. Springer Science & Business Media.
Laboratory protocols in fungal biology, 2012.
HAN, M.-J.; CHOI, H.-T.; SONG, H.-G. Purification and characterization of laccase from the white
rot fungus Trametes versicolor. The Journal of Microbiology, v. 43, n. 6, p. 555-560, 2005.
HERRERA-ESTRELLA, A.; HORWITZ, B. A. Looking through the eyes of fungi: molecular
genetics of photoreception. Molecular Microbiology, v. 64, n. 1, p. 5-15, 2007.
HESS, J. et al. Enhanced formation of extracellular laccase activity by the white rot fungus
Trametes versicolor. Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 98, p. 229-241, 2002.
JOSHI, M. et al. Nutrient improvement for simultaneous production of exopolysaccharide and
mycelial biomass by submerged cultivation of Schizophyllum commune AGMJ-1 using statistical
optimization. 3 Biotechnology, v. 3, n. 4, p. 307-318, 2013.
KAMIDA, H. M. et al. Biodegradação de efluente têxtil por Pleurotus sajor-caju. Química Nova,
v. 28, n. 4, p. 629-632, 2005.
KIRK, P. M. et al. Dictionary of the fungi. CAB International, Wallingford, v. 396. 2010.
LOPEZ-MALO, A.; ALZAMORA, S. M.; ARGAIZ, A. Effect o fvanillin concentration, pH and
incubation temperature on Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus and
Aspergillus parasiticus growth. Food Microbiology, Summit Argo, v. 14, p. 117-124, 1997.
MADHAVI, V.; LELE, S. S. Laccase: properties and applications. Bio Resources, v. 4, p. 1694-
1717, 2009.
MAJEAU, J.; BRAAR, S. K.; TYAGI, R. D. Laccases for removal of recalcitrante and emerging
pollutants. Bioresource Technology, v. 101, p. 2331-2350, 2010.
MARIM, A. R. Cultivo de Lentinus crinitus em diferentes condições abióticas visando a
produção de lacase.2017, 50 f. Tese (Mestrado em Biotecnologia) - Universidade Paranaense -
UNIPAR. Umuarama, 2017.
MELO, I. S.; AZEVEDO, J. L. Microbiologia ambiental. v. 2. Jaguariúna: Embrapa Meio
Ambiente, 2008. 647p.
20
MOREIRA NETO, S. L. Enzimas ligninolíticas produzidas por Psilocybe castanella CCB 444
em solo contaminado com hexaclorobenzeno. 2006, 110f. Dissertação (Mestrado em
Biodiversidade Vegetal e Meio Ambiente) - Instituto de Botânica da Secretaria de Estado do Meio
Ambiente, São Paulo, 2006.
MUKHERJEE, S. et al. Potential use of polyphenol oxidases (PPO) in the bioremediation of
phenolic contaminants containing industrial wastewater. Reviews in Environmental Science and
Bio/Technology, v. 12, p. 61-73, 2013.
MUNARI, F. M. et al. Decolorization of textile dyes by enzymatic extract and submerged cultures
of Pleurotus sajor-caju. World Journal of Microbioly Biotechnoly, v. 24 p. 1383-1392, 2008.
NIEUWENHUIJZEN, B. V.; OEI, P. O cultivo de cogumelos em pequena escala: pleuroto,
shiitake e orelha-de-pau. Fundação Agromisa e CTA, p. 90, 2006.
NOGUEIRA, J. C. et al. Efeito da temperatura e do meio de cultura na produção de biomassa
micelial de Lentinus strigellus. XVIII Jornada de Iniciação Científica PIBIC
CNPq/FAPEAM/INPA. Manaus. 2009.
NYANHONGO, G. S. et al. Production of laccase by a newly isolated strain of Trametes modesta.
Bioresource Technology v. 84, p. 259-263, 2002.
PAULA, E. J. et al. Introdução à Biologia das Criptógamas. São Paulo: Instituto de Biociências
da Universidade de São Paulo, Departamento de Botânica, p. 184, 2007.
PEÑALVA, M. A. et al. Ambient pH gene regulation in fungi: making connections. Trends in
microbiology, v. 16, n. 6, p. 291-300, 2008.
PÉREZ, P.; RIBAS, J. C. Cell wall analysis. Methods, v. 33, n. 3, p. 245-251, 2004.
PERALTA, R. M.; SOUZA, C. G. M.; BÔER, C. G. As principais oxidorredutases de uso
industrial. In: Said, S.; Pietro, R. C. L. R. (Ed.). Enzimas como agentes biotecnológicos, 2004.
PISCITELLI, A. et al. Induction and transcriptional regulation of laccases in fungi.Current
Genomics, v. 12, p. 104-112, 2011.
POINTING, S. B.; JONES, E. B. G; VRIJMOED, L. L. P. Optimization of laccase production by
Pycnoporus sanguineus in submerged liquid culture. Mycologia, v. 1, p. 139-144, 2002.
PRASAD, K.K. et al. Laccase production using Pleurotus ostreatus 1804 immobilized on PUF
cubes in batch and packed bed reactors: Influence of culture conditions. The Journal of
Microbiology, v. 43, p. 301-307, 2005.
PURSCHWITZ, J. et al. Seeing the rainbow: light sensing in fungi. Current opinion in
microbiology, v. 9, n. 6, p. 566-571, 2006.
RANCAÑO, G. et al. Production of laccase by Trametes versicolor in na airlift fermentor. Process
Biochemistry v. 39, p. 467-473, 2003.
21
ROBLES, A. et al. Characterization of laccase activity produced by the hyphomycete Chalara (syn.
Thielavopsis) paradoxa CH32. Enzyme and Microbial Technology, v. 31, p. 516-522, 2002.
SALVI, M. B. de. Fungos basidiomicetos em biorremediação. São Paulo: Instituto de Botânica
de São Paulo, 2011.
SANTAELLA, S. T. et al. Tratamento de efluentes de refinaria de petróleo em reatores com
Aspergillus niger. Engenharia Sanitária Ambiental, v. 14, n. 1, p. 139-148, 2009.
SAPARRAT, M. C. N. et al. Induction, isolation, and characterization of two laccases from the
white rot basidiomycete Coriolopsis rigida. Applied and Environmental Microbiology, v. 68, n.
4, p. 1534-1540, 2002.
SHRADDHA, R. S. et al. Laccase: microbial sources, production, purification, and potential
biotechnological applications. Enzyme Research, New York, v. 2011, p. 1-11, 2011.
SILVA, J. J. da et al. Produção de lacase de fungos basidiomicetos por fermentação submersa
com casca de café. Arquivos de Ciências Veterinárias e Zoologia da UNIPAR, v. 15, n. 2, supl 1, p.
191-196, 2012.
SOUZA, C. G. M. Production of laccase isoforms by Pleurotus pulmonarius in response to
presence of phenolic and aromatic compounds. Journal of Basic Microbiology, Berlin, v. 44, p.
129-136, 2004.
STRONG, P. J.; CLAUS, H. Laccase: a review of its past and its future in bioremediation. Critical
Reviews in Environmental Science and Technology, v. 4, p. 373-434, 2011.
STRONG, P. J. Improved laccase production by Trametes pubescens MB89 in distillery
wastewaters. Enzyme Research, 2011.
TAVARES, A. P. M. et al. Produção de lacase para potencial aplicação como oxidante na
indústria papeleira. 2006. 190 f. Tese (Doutorado em Engenharia Química) - Universidade de
Aveiro, 2006.
TERRÓN, M. C. et al. Structural close-related aromatic compound shave diferente effects on
laccase activity and onlcc gene expression in the ligninolytic fungus Trametes sp. Fungal Genetics
and Biology, v. 41, p. 954-962, 2004.
WESENBERG, D.; KYRIAKIDES, I.; AGATHOS, S. N. White-rot fungi and their enzymes for the
treatment of industrial dye effluents. Biotechnology Advances, v. 22, p. 161-187, 2003.
WONG, D. W. S. Structure and action mechanism of ligninolytic enzymes. Applied Biochemistry
and Biotechnology, v. 157, p. 174-209, 2009.
XIAO, Y.Z. et al. Cloning of novel laccase isozyme genes from Trametes sp. AH28-2 and analyses
of their differential expression. Applied Microbiology and Biotechnology, v. 71, p. 493-501,
2006.
22
23
24