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Rassegna delle metodologie di stima dell’incertezza di misura nelle prove microbiologiche con cenni alle
novità introdotte dalla ISO 29201:2012
per la matrice acqua
Dino SpolaorVeneto Agricoltura – Istituto per la Qualità e le Tecnologie Agroalimentari
ISO 7218:2007
MICROBIOLOGY OF FOOD AND ANIMAL FEEDINGSTUFFS – GENERAL REQUIREMENTS AND GUIDANCEFOR MICROBIOLOGICAL EXAMINATION
Scopo e Campo di applicazione- Guida per i laboratori dimicrobiologia - Applicabile ad alimenti e mangimi, all’ambiente diproduzione e manipolazione degli alimenti.
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CALCOLO DEL CONTEGGIO(ISO 7218)
)d0,1nV(n
CN
21 += ∑
• Un grande impegno dei laboratori per calcolare l’incertezza di misura ma … assicuriamoci prima di applicare correttamente la formula di calcolo del conteggio!
Riepilogo modalità di espressione del risultato
0
3
12
45
8
67
910
m.o. inferiori a 1/d UFC/g
m.o. presenti ma inferiori a 4/d UFC/g
UFC stimate / g
UFC / g
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ISO / TS 19036:2006
Microbiologia degli alimenti
Linea Guida per la stima dell’incertezza dimisura per le determinazioni quantitative
ISO / TS 19036:2006
Campo di Applicazione- Prodotti destinati al consumo umano ed animale- Campioni ambientali (aree di produzione e manipolazione
alimenti)
NON APPLICABILE- Prove in MPN
- Prove quantitative con bassa concentrazione di m.o. (UFC<10)
Amd1:2009
- Prove QUALITATIVE elaborazione di un nuovo documento
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sR DI UN METODO valutazione INTRALABORATORIO
Protocollo
- Matrice (realmente contaminate /m.o. stressati)
- Sottocampione (utilizzato per prelevare la porzione per test)
- Almeno 10 campioni per ciascuna matrice
- Diversi giorni in un lungo periodo di tempo
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SCARTO TIPO DI RIPRODUCIBILITA’( sR)
QUANDO CALCOLARLO?
• Per ciascun tipo di m.o.target(o gruppi)
• Per ciascuna matrice (o gruppi)
• Per ciascun metodo
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Problema: quali matrici?Secondo criteri di tipo fisico
Categoria I• Liquidi e polveri (es. latte, latte di cocco, acqua, latte essiccato, caseinati,
cipolle in polvere)
Categoria II• Solidi ben miscelati(es. carne macinata, carne separata meccanicamente,
salumi, crushed meat, panna montata, gelato al latte, crema di soia, ecc.)
Categoria III• Solidi di piccola taglia (es. prezzemolo/funghi essiccati, carote e sedano rapa
grattugiati, tagliolini secchi, insalata IV gamma, gamberetti, cozze, cereali, mangimi, nocciole tritate)
Categoria IV• Altri solidi (carni non tritate, formaggi, prodotti di pasticceria, pesce, piatti
pronti, prosciutto,)
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Incertezza estesa UUGUALE PER TUTTI?
• E’ caratteristica di un laboratorioE’ correlata ad un dato ottenuto in specifichecondizioni(operatori, apparecchiature, reagenti, …)
• Non è caratteristica di un metodo analitico diper sé, indipendentemente dal laboratorio chela calcola (legame metodo-laboratorio)
RSU 2=
6
Stesso campione (instabile)analizzato da due operatori diversi
contemporaneamente
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Stesso campione (stabile)analizzato dallo stesso operatore in giorni diversi
GIORNO 1
GIORNO 2
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sR DI UN METODO valutazione INTRALABORATORIO
Protocollo- Campioni con diversi livelli di contaminazione (quelli
usuali del lab)- Calcolo SR non per livello- Trasformazione log dei dati (stabilizzazione della varianza di
riproducibilità / livelli di contaminazione (<10 ufc escluse!)
- Contaminazione artificiale (se richiesta): attenzione al nuovo elemento di variabilità (simulare il più possibile la contaminazione naturale in termine di m.o. stressati / di competizione / “background microflora”)
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sR INTRALABORATORIO
n
bas
ni
iii
R 2
)log(log1
2∑=
=
−=
ai e bi = primo e secondo risultato della prova sullo stesso campione(logai-logbi) = differenza tra i 2 risultati, espressi in logaritmo decimalen = numero di prove eseguite in doppio (n ≥10)i = 1, 2, … n
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sR INTRALABORATORIO
Radice della Sommatoria/n
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ISO /TS 19036:2006 /Amd1:2009
... la ISO 19036:2006/Amd1:2009 parte dall’assuntoche la stima dell’incertezza di misura basata sulcalcolo dello scarto tipo di riproducibilità, limitataalle conte superiori a 10 UFC/piastra, trascuril’errore casuale dato dalla distribuzione di Poisson.
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ISO /TS 19036:2006 /Amd1:2009
∑+=
CU sR
18861,02
2
RSU 2=Se ΣC > Clim
incertezza estesa calcolata con scarto tipo di riproducibilità
Se ΣC ≤ Climvengono combinate le duecomponenti
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Concetto delle basse conte
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U=0,20
U=0,25
U=0,30
U=0,35
U=0,40
U=0,45U=0,50
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250
Somma delle colonie in piastra
Val
ore
C li
m
.
Area di applicazione dell'AMD 1:2009
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INCERTEZZA DI MISURA (ISO/TS 19036:2006 )
3. COME va espressa?
- Risultato ed Intervallo in log10
5,0 log ± 0,2 log(UFC)/g oppure 5,0 log [ 4,8 , 5,2 ]
- Risultato ed Intervallo in Valore naturale
100.000 UFC/g [ 63.000 , 160.000 ]105 UFC/g [ 6,3 x 104, 1,6 x 105 ]
- Intervallo in percentuale
100.000 UFC/g [ 100.000 -37% , 100.000 +58% ]
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INCERTEZZA DI MISURA (ISO/TS 19036:2006 )
4. DOVE va espressa?Sul R. di P.: come incertezza estesa U associata al risultato nella sua stessa forma (log, n°) oppure espressa in percentuale (%)
Definiti : il Livello di probabilità p ed il Fattore di copertura k
Gradi di Libertà: N.A.Recupero: N.A.
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Ma se la matrice è …
ACQUA?
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CALCOLO DELL’INTERVALLO DI FIDUCIA
• UNI ENV ISO 13843:2003. Qualità dell’acqua – Guida perla validazione di metodi microbiologici
• UNI 10674:2002. Acque destinate al consumo umano –Guida generale per determinazioni microbiologiche
• ISO 8199:2005 – Water quality –General guidance on theenumeration of micro-organisms by culture
• ISO 29201 - Water quality — The variability of test resultsand the uncertainty of measurement of microbiologicalenumeration methods
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ISO 8199:2005 Water quality – General guidance on
the enumeration of micro-organisms by culture
dove • Csè la stima del numero espresso come UFC (conteggio) nel volume di riferimento Vs.• Z è la somma delle colonie contate sulle piastre o membrane derivate dalle diluizioni
considerate nel calcolo del risultato• Vtotè il volume totale del campione originale distribuito nelle piastre sottoposte a conta.
stottot
s VV
Z
V
ZIFC ×
±=± 2
%95
stottot
s VV
Z
V
ZIFC ×
+±+=± 122%95
per Z≥20
perZ<20
Calcolo intervallo di fiducia (IF)
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ISO 29201:2012
Water quality – The variability of test results and the uncertainty of measurement of microbiological
enumeration methods
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ISO/DIS 29201 Water quality — The variability of test results
and the uncertainty of measurement of microbiological enumeration methods
• Presentazione di due approcci principali
• Breve descrizione di altri approcci nazionali (francese, norvegese, inglese e neozelandese)
• Criteri di scelta tra i 2 approcci
• Esempi applicativi
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Di cosa tratta
• Component approach(adatto per i lab che monitorano regolarmente ogni fase analitica)
• Black-box approach(la via più agevole per laboratori che non studiano nei dettagli le fasi analitiche)
• Guida alla scelta dell’approccio più efficiente o più pratico anche se in teoria dovrebbero portare a risultati molto simili
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Component approach
Anche conosciuto come
Bottom-up o “step-by-step” approach
Basato sul principio della “legge di propagazione dell’incertezza”
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Black-box approach
Conosciuto comeTop-down o global approach
• Basato sull’analisi statistica di serie di osservazioni ripetute del risultato finale (ISO/TS 19036:2006)
• Non richiesto di quantificare o conoscere esattamente le cause dell’incertezza; l’incertezza stimata sarà applicabile ai successivi risultati del laboratorio ottenuti con lo stesso metodo.
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ISO 29201:2012Scopo e campo di applicazione
Analisi microbiologiche quantitative
• Unità formanti colonie (UFC)
• Most Probable Number (MPN)
Modalità di espressione
• Incertezza tipo (standard uncertainty)
• Incertezza tipo relativa (relative standard uncertainty)
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Incertezza estesa (expanded uncertainty)
Il valore di incertezza (incertezza composta –combined uncertainty) usato per valutare soglie legate alla sicurezza igienica o alla salute pubblica viene moltiplicato per un fattore di copertura k = 2 (95%) per estendere - a scopo di cautela - la fascia di incertezza
U=kuc(y)
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Limiti del global approach
Avvicinandosi alle basse conte
i risultati imprevedibili tendono ad aumentare
L’approccio globale mal si adatta
• alle basse conte,
• alla fase di conferma delle colonie,
• alle conte MPN
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Global approachmodificato dalla ISO 29201:2012
Distinzione tra due parametri di precisione:
• PREVEDIBILE (±): incertezza della procedura analitica (variabilità operativa)
• IMPREVEDIBILE: distribuzione delle particelle
Tenere conto di tali 2 sorgenti di incertezza fa superare le restrizioni previste per le basse conte
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Variabilità operativa: componenti
• Sottocampionamento e miscelazione (Subsampling and mixing)
• Diluizione (Dilution)
• Inoculo (Delivery of test portion(s) into the detection system of nutrient media)
• Crescita durante l’incubazione (Development duringincubation)
• Conteggio e conferma colonie (Counting and possiblyconfirming the (presumptive) target organims)
Nell’approccio globale a tali componenti nel risultato finale si somma l’incertezza data dalla casualità di ditribuzione delle cellule microbiche
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Variabilità intrinseca Incertezza di distribuzione
• Le sospensioni microbiche di norma seguono la distribuzione di Poisson
• Quando la variabilità intrinseca aumenta considerevolmente (parziale conferma delle colonie o uso della tecnica MPN) la sospensione microbica non segue la distribuzione di Poisson
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BASSE CONTEAlta variabilità intrinseca
No Distribuzione di Poisson
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Varianza relativa di una conta in singolo
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49
creld n
u12
, =
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Stima dell’incertezza operativa
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22'
2dRo uuu −=
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
6,5 13 15 30 56,5 177
od
Dall’approccio globale … il calcolo dell’incertezza composta
22'
2dRo uuu −=
22)( doc uuyu +=
20
STIMA DELLEPRINCIPALI COMPONENTI DELL’INCERTEZZA
NELLE PROVE MICROBIOLOGICHE
• Matrice e sottocampionamento
•Distribuzione cellule microbiche (Poisson)
• Volume di inoculo
• Fattore di diluizione
• Incubazione colture microbiche
• Lettura delle piastreD.Spolaor - Rassegna delle medodologie di stima dell'incertezza di misura - 07.12.2012 39
VALUTAZIONE COMPONENTI
COMPONENTI SIMBOLI DETERMINAZIONE
Matrice e sottocampionamentourel,M Annex H
Fattore di diluizione urel,F Annex K
Volumi di inoculo urel,V, urel,ΣV Annex I, J
Incubazione urel,I Annex M
Conteggio urel,L Annex L
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Sottocampionamento
• Acqua e materiali in polvere: la varianza disottocampionamento non eccede la varianzadella distribuzione di Poisson
• Preferibile studio delle componenti rispettoall’approccio globale
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SOSPENSIONE MICROBICA BEN MISCELATA(Bassa variabilità intrinseca - Sì distr. Poisson)
Es. campioni d’acqua
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Sottocampionamento
• Campioni solidi(la sovradispersione è la regola:preferibile l’approccio globale o studi dedicati allastima della varianza del sottocampionamento)
AL CRESCERE DELL’ETEROGENEITA’
DEI CAMPIONI
MIGLIORA PROGRESSIVAMENTE
L’EFFICIENZA DELL’APPROCCIO GLOBALE
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ETEROGENEITA’ CAMPIONI SOLIDI(Sovradispersione tra sottocampioni)
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Annex H-VALUTAZIONE SPERIMENTALE DELLA
VARIANZA DEL SOTTOCAMPIONAMENTO
• Non richiesta per le matrici liquideCAMPIONI SOLIDI• Mescolare accuratamente un campione• Prelevare k sottocampioni (min. 2)• Sospendere in diluente sterile• In condizioni di ripetibilità preparare n serie di
diluizioni (min. 2)• Seminare in piastra n serie di diluizioni e incubare• Leggere le piastre (stesso operatore)• Elaborare i dati (ANOVA) per ricavare l’incidenza %
della varianza di sottocampionamento.
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Annex M –EFFETTI DELL’INCUBAZIONEINCERTEZZA DOVUTA A POSIZIONE E DURATA
• Piccole differenze nelle condizioni di incubazione(tempo, temperatura, posizione delle piastre, …)possono incidere sul numero di colonie contate.
• Esperimento in cui le piastre seminate da una stessadiluizione in condizioni di ripetibilità vengonodistribuite in modo casuale su ripiani diversidell’incubatore, in posizioni diverse di ciascun ripiano,in posizione differente nella pila di piastre.
• Dalla varianza totale tra piastre parallele vengonosottratte la varianza intrinseca (Poisson), l’incertezza dilettura e dei volumi di inoculo, ricavando l’incertezzadovuta all’incubazione.
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Annex CIncertezza dovuta alla Distribuzione di Poisson
CALCOLO DELLE COMPONENTI D’INCERTEZZA
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Annex L - Incertezza di conteggiodovuta alla lettura delle piastre
Incertezza media di conteggio di piastre in singolo
�Rilettura in ordine casuale delle piastre
�Breve lasso di tempo tra le due letture
�Almeno una trentina di piastre
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Annex I e J Incertezza dovuta al dosaggio degli inoculi
CALCOLO DELLE COMPONENTI D’INCERTEZZA
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Annex KIncertezza dovuta al fattore di diluizione
CALCOLO DELLE COMPONENTI D’INCERTEZZA
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Annex EEventuale Incertezza di conferma delle colonie
CALCOLO DELLE COMPONENTI D’INCERTEZZA
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Componenti dell’incertezzaComponenti incertezza
Quando contribuiscono all’incertezza?
Distribuzione di Poissonud,rel
Comune a tutti i conteggi (di facile calcolo, è inversamenteproporzionale al numero di colonie contate)
Volume inoculi e dosaggio urel,V - urel,ΣV
Comune a tutti i conteggi è legata alla ripetibilità di dosaggio degliinoculi. E’ richiesta una valutazione sperimentale della ripetibilità deldosaggio con le pipette.
Fattore di diluizione
urel,F
In presenza di diluizioni (è legata alla numerosità delle diluizioniallestite e alla ripetibilità di dosaggio dei volumi del diluente) E’richiesta una valutazione sperimentale della ripetibilità del dosaggio deldiluente.
Lettura piastre urel,LComune a tutti i conteggi, richiede una preliminare valutazione dellaripetibilità dei conteggi da parte degli operatori.
Conferma colonie urel,xSolo se richiesta la conferma delle colonie. In tale caso comprende equindi sostituisceud,rel (distribuzione di Poisson)
Incubazione urel,I Effetto dell’incubazione, necessita valutazione sperimentale
Matrice urel,M Effetto del sottocampionamento, necessita valutazionesperimentale
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Calcolo finale dell’incertezza di misurabasata sulla stima delle componenti di incertezza dell’analisi
2,
2, reldrelorel,c uu(y)u +=
Incertezza di misura = Risultato x Incertezza relativa (y)u rel c,
Incertezza relativa del risultato della prova Prove che non prevedono la conferma
2,
2,
2,
2,
2, IrelLrelVrelFrelMrelrel o, uuuuuu ++++=
dove
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Metodo “semplificato”Basato sul calcolo del parametro G2
⋅−
⋅⋅= ∑
=−
n
1i i
ii
21n V
ZlnZ
v
zlnz2G
NON richiede il calcolo delle singole componenti di incertezza, matiene conto delle componenti date da- distribuzione di Poisson- incertezza dei volumi di inoculo- incertezza di lettura delle piastre
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Metodo semplificato
Il metodo semplificato permette di valutare l’incertezza relativa cheinclude tutte le componenti casualiche influenzano le conte.
[ ]Zn
Gx/)x(u n 1
1
21
2
⋅−
= −
[ ] [ ]22u(F)/Fx)/xu(u(y)/y +=
In cui
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Diverse combinazioni di conta di colonieMedesimo conteggio microbico per unità di campione
Prova Diluizioni Risultato (UFC)
Incertezza estesa U
Limite inferiore
Limite superiore
10-5 10-5 10-6 10-6
n. 1 249 248 23 24 2,5 x 107 0,05 ± 510.000 2,4 x 107 2,6 x 107
n. 2 240 244 33 27 2,5 x 107 0,99 ± 2.100.000 2,3 x 107 2,7 x 107
n. 3 204 280 28 32 2,5 x 107 4,86 ± 4.700.000 2,0 x 107 3,0 x 107
n. 4 184 300 22 38 2,5 x 107 11,57 ± 7.300.000 1,8 x 107 3,2 x 107
Prove n. 1, 2, 3 e 4 2,5 x 107 ISO 19036
Esempio± 0,1 log
2,0 x 107 3,2 x 107
1n
G 21n
−−
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29
Vantaggi del metodo semplificato
Metodo semplificato: medesimo conteggio Incertezza funzione della qualità del dato analitic o
1,7E+07
1,9E+07
2,1E+07
2,3E+07
2,5E+07
2,7E+07
2,9E+07
3,1E+07
3,3E+07
0,05 0,99 4,86 11,57
Indice G2
UFC
Lim.inf.
Lim.sup.
RisultatoIso
1903
6
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DOCUMENTI di RIFERIMENTO• UNI CEI EN ISO/IEC 17025:2005 – Requisiti generali per la competenza dei laboratori di prova e di
taratura• UNI CEI ENV 13005:2000 - Guida all’espressione dell’incertezza di misura• MIKES - Centre for metrology and accreditation, Publication J4/2003, Uncertainty of quantitative
determinations derived by cultivation of microorganisms,Seppo I. Niemela• ISO 7218:2007 - Microbiology of food and animal feeding stuffs – General requirements and guidance
for microbiological examinations• ISO/TS 19036:2006 - Microbiology of food and animal feeding stuffs –Guidelines for the estimation of
measurement uncertainty for quantitative determinations• ISO/TS 19036:2006/Amd1.2009 - Microbiology of food and animal feeding stuffs –Guidelines for the
estimation of measurement uncertainty for quantitative determinations. Measurement uncertainty for lowcounts
• UNI ENV ISO 13843:2003. Qualità dell’acqua – Guida per la validazione di metodi microbiologici• UNI 10674:2002. Acque destinate al consumo umano – Guida generale per determinazioni
microbiologiche• ISO 8199:2005 – Water quality –General guidance on the enumeration of micro-organisms by culture• ISO/DIS 29201 - Water quality — The variability of test results and the uncertainty of measurement of
microbiological enumeration methods
https://sites.google.com/site/incertezzamicro/home/guida
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