ANEMIA HEMOLTICA AUTO-IMUNE Aspectos moleculares
Dra. Lilian Castilho
Os mtodos moleculares mudaro a rotina dos laboratrios de Imunohematologia ???
HEMAGLUTINAO
Onde estamos falhando?Stainsby et al. Serious hazards of transfusion: a decade of hemovigilance in the UK. TMR 2006; 20:273-82 2623 casos (1996-2004) 10.2%- Reaes transfusionais hemolticas agudas (incompatibilidade ABO) 9.7%- Reaes transfusionais hemolticas tardias
HEMAGLUTINAO
Onde estamos falhando?Reaes transfusionais hemolticas tardias 8 mortes 53% anti-Jka/Jkb 38% anti-Rh 14% erros poderiam ter sido evitados melhorando a prtica laboratorial (Como melhorar?)
LIMITAES DA HEMAGLUTINAO Dificuldade na fenotipagem de pacientes politransfundidos com transfuso recente Dificuldade na fenotipagem de hemcias cobertas com IgG Dificuldade na identificao de ags variantes Dificuldade na identificao de ags de baixa e alta frequncia Limitao dos estoques de antgenosnegativos Impossibilidade de determinar zigozidade
LIMITAES DA HEMAGLUTINAO
O que fazer!
Zoom no DNA
Genotipagem!!!Resultados seguros nas situaes (AHAI) em que a hemaglutinao limitada
Anlise por DNA em pacientes com TDA positivoDificuldades na remoo do ac IgG Anticorpos monoclonais IgM ou monoclonais murinos no esto disponveis Anti-soros so fracamente reativos Antgeno sensvel ao tratamento de remoo da IgG
PROTOCOLOS DE GENOTIPAGEM PARA UTILIZAO NA CLNICA AS-PCR, PCR-RFLP, Multiplex
RHD D+/D-(D), D parcial, D fraco, Del, zigozidade RHD RHCE C/c, E/e, VS, variantes Rh C, E/e KEL K/k, Jsa/Jsb FY Fya/Fyb,GATA, Fyx
JK Jka/Jkb GYPB S/s; S-silencioso Dombrock Doa/Dob , HY, JO Diego Dia/Dib, Memphis II
PROTOCOLOS DE GENOTIPAGEM PARA UTILIZAO NA CLNICA Microarray- BeadChipTM , Bioarray Solutions Ltd
RHCE C/c, E/e KEL K/k FY Fya/Fyb,GATA, Fyx LW Lw a/Lw b CO Coa/Cob SC Sc1/2
JK Jka/Jkb GYPA M/N GYPB S/s, S silencing, Uvar DO Doa/Dob , Hy, Jo DI Dia/Dib LU Lua/Lub
RESULTADOS DE GENOTIPAGEM NA AHAI 2003-2006
Total de pacientes: 28Em 28 pacientes a genotipagem auxiliou na deduo do perfil antignico (Rh, Kell, FY, JK, Ss) e consequentemente na seleo de sangue fentipo compatvel Em 8 pacientes foi possvel diferenciar alo de auto Em 11 pacientes foi possvel identificar aloanticorpos aps adsores alognicas 8 pacientes foram genotipados como FYB-33 e puderam receber sangue Fy(b+)
RESULTADOS DE GENOTIPAGEM NA CLNICA CASO CLINICO 1-HISTRICO
Paciente feminina descendente de Africanos, 52 anos Transfuses prvias? Diagnstico: AHAI, Hb 6.8 Solicitado 2 unidades de sangue TDA positivo (IgG1) PAI positiva 2+ em AGH Painel positivo 2+ em AGH com todas as clulas, Autocontrole positivo
RESULTADOS DE GENOTIPAGEM NA CLNICA CASO CLINICO 1-GENOTIPAGEM
Silencing FY
ChipName
Sample WarnMsg
Fyx[Fy(b+w) No No 1 No No No
HgbS
Jo(a)
LWb
LWa
Dob
Cob
Fya
Doa
Coa
Lub
Fyb
Lua
Sc1
Sc2
Jka
Jkb
Dia
Dib
Hy
M
C
Cmmnt
K
N
e
k
E
HEA04961_1 HEA04961_2 HEA04961_3 HEA04961_4 HEA04961_5 HEA04961_6 HEA04961_7 HEA04961_8
A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8
+ + + + + -
+ + +
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-
+ -
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+ + + + -
+ + -
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S + -
c
s + + + + + + + +
+ -
+ + + + + + + +
+ + + + +
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-
+ -
+ + + + + + + +
+ + + + + + + +
-
+ + + + + + + +
-
+ ++ +
1
No No 1 2 2 1
No No 2
+
+
Fentipo da paciente: KFy(a (aJk(a+b (a+b- M+NLu(a (aO, Ro, K-k+, Fy(a-b-), Jk(a+b-), M+N-S-s+, Lu(a- b+), Hy+, Jo(a+), Di(a (aCo(a+b- Sc1,Do(a+b+), Hy+, Jo(a+), Di(a- b+), Co(a+b-), Sc1,-2
RESULTADOS DE GENOTIPAGEM NA CLNICA CASO CLINICO 1-CONCLUSO
Adsoro alognica com hemcias R0r, K-, Fy(a-), Jk(b-), S-
antiPaciente com anti-E, -K, -Jkb, -S Confirmao sorolgica com adsores seletivas (E- K- Jk(b S(bTransfuso fentipo compatvel (E-, K-, Jk(b-), S-) Fy(b+) e Fy(b+) Aumento nveis de Hb de 6.8 para 8.6 aps transfuso
RESULTADOS DE GENOTIPAGEM NA CLNICA CASO CLINICO 2-HISTRICO
Paciente masculino caucaside 64 anos Portador de AHAI, politransfundido Solicitado 2 unidades de sangue TDA positivo (IgG3) positiva/Auto AutoPAI positiva/Auto-controle positivo anti- autoAnticorpos identificados no soro: anti-D, auto-IgG Fenotipagem: K- Fy(a+b+),Jk(a+b+) (a+b+),Jk Fenotipagem: R1R2, K-, Fy(a+b+),Jk(a+b+) Provas de compatibilidade: incompatveis
RESULTADOS DE GENOTIPAGEM NA CLNICA CASO CLINICO 2- GENOTIPAGEM
Gentipo do paciente: RHD+, RH*Cc, RH*ee, RH*Cc, RH*ee, Cc ee
KEL*2/KEL*2, FY*A/FY*A JK*B/JK*B, GYPB*S/sFY A/FY A
GATA
normal,
100 pb
RHDCc
100 pb
100pb
RH ee
K2K2
JK B/JK B
S+
100 pb
s+
RESULTADOS DE GENOTIPAGEM NA CLNICA CASO CLINICO 2- GENOTIPAGEM
Genotipagem complementar RHD Fraco, RHD parcial
RHD Fraco: negativo RHD Parcial: positivo (D parcial categoria VI)100 pb DVI
RESULTADOS DE GENOTIPAGEM NA CLNICA CASO CLINICO 2- CONCLUSO
Adsoro alognica com hemcias R1r, K-, Fy(b-), Jk(a-)
antiAcs identificados no soro do paciente: anti-D, Jka KSangue selecionado para a transfuso: rr, K-, Jk(a Fy(b (a(bJk(a-), Fy(b-) autoAvaliao do significado clnico do auto-ac antes da transfuso
RESULTADOS DE GENOTIPAGEM NA CLNICA CASO CLINICO 3- HISTRICO
Paciente transfundido a cada 3 semanas com 2 unidades de concentrado de hemcias Histria de anti-c, -E, -K Servio de Hemoterapia do Hospital relata reatividade adicional Suspeita:anti-Jka
RESULTADOS DE GENOTIPAGEM NA CLNICA CASO CLINICO 3- INVESTIGAO SOROLGICA
Laboratrio de referncia confirma anti-c, -E, -K Autoanticorpo IgG tambm detectado Fenotipagem demonstra campo misto Por segurana o hospital seleciona unidades de hemcias c, E, K, Jk(a)
RESULTADOS DE GENOTIPAGEM NA CLNICA CASO CLINICO 3- GENOTIPAGEM/CONCLUSO
Genotipagem: RHD+, RH*C/C, RH*e/e, KEL*2/2, FY*A/B, JK*A/B Fentipo deduzido: R1R1, K-k+, Fy(a+b+), Jk(a+b+) Paciente no desenvolver aloanti-Jka 1 em 6 unidades so c, E, K 1 em 25 unidades so c, E, K, Jk(a)
RESULTADOS DE GENOTIPAGEM NA CLNICA CASO CLINICO 4- HISTRICO/GENOTIPAGEM
Paciente com sinais e sintomas de hemlise Transfundido com 2 unidades de concentrado de hemcias Identificado: anti-Jka; Jk(a+CM) Interpretao: reao transfusional [recebeu hemcias Jk(a+) em outro hospital] Genotipagem: JK*A/JK*A Interpretao: Jk(a+), autoanti-Jka (IgG3 hemoltico)
RESULTADOS DE GENOTIPAGEM NA CLNICA CASO CLINICO 5-HISTRICO/GENOTIPAGEM
Paciente com AHAI, O RhD+, TDA+ Histria transfusional:? Ac identificado no eluato e soro: anti-D Auto ou alo? Genotipagem: D fraco tipo 1 Interpretao: auto-anti-D (IgG1 no hemoltico) Sangue selecionado para transfuso: O RhD+
RESULTADOS DE GENOTIPAGEM NA CLNICA CASO CLINICO 6-HISTRICO
Paciente (O RhD-negativo) admitido no hospital com Hb de 4.5 g/L, 6 dias aps cirurgia e transfuso TDA positivo com C3; eluato negativo PAI: ac com fraca reatividade em PEG e LISSCoombs e reativo em papana Transfundido com hemcias O, Jk(b), Le(a) Hemlise aps transfuso
RESULTADOS DE GENOTIPAGEM NA CLNICA CASO CLINICO 6-HISTRICO/GENOTIPAGEM
Nenhum anticorpo contra drogas detectado Teste de Donath Landsteiner negativo Interpretao hemlise foi um resultado da transfuso! Fentipo deduzido do gentipo:S+s+, K, Fy(ab+), Jk(a+b) Campo misto na fenotipagem Fya demonstrou sobrevida de hemcias do doador na circulao do paciente
Importncia da genotipagem em pacientes com AHAIIdentificao de aloanticorpos Diferenciao entre alo e auto Selecionar hemcias fenotipicamente compatveis Preveno da aloimunizao Aumento da sobrevida das hemcias transfundidas
GENOTIPAGEM NA CLNICAGenotipagem de grupos sanguneos na clnica requer: Conhecimento em grupos sanguneos Experincia na interpretao das reaes de PCR utilizadas Obteno dos achados sorolgicos e da histria clnica do paciente antes de interpretar os resultados da genotipagem Conhecimento dos genes que codificam os antgenos de GS e suas formas variantes (fentipos e gentipos podem no correlacionar) na populao estudada
HEMOCENTRO UNICAMPLaboratrio de Biologia Molecular de Grupos Sanguneos19991999-Lab pesquisa protocolos moleculares na Imunohematologia clnica uso rotineiro quando resultados sorolgicos so questionveis ou duvidosos, duvidosos, fenotipagens no disponveis, disponveis, genotipagem pode auxiliar na recomendao da (auto/alo alo) conduta transfusional (auto/alo) integra o Consortium for Blood Group Genes (CBGG) participa de testes de proficincia (ISBT e NYBC)
Transfuso em pacientes com AHAI
? fazer O que ? azer f omo C
Significado clnico do autoac Investigao de aloanticorpos Fenotipagem Genotipagem
Fenotipagem eritrocitriaVantagens Tcnica simples e rpida No requer equipamento sofisticado Sensibilidade e especificidade
Desvantagens Valor limitado em pacientes recentemente transfundidos ou que apresentam teste direto da antiglobulina positivo 4+ (Auto IgG + C)
Genotipagem eritrocitriaVantagens Resultados seguros nas situaes (AHAI) em que a hemaglutinao limitada
Desvantagens Requer mais tempo na execuo Maior custo Fcil contaminao
ImunohematologiaFentipo Fen Gentipo Gen
+aglutinao DNA
Tcnicas moleculares: potencial para mudar a prtica na medicina transfusional