« Actualités ( commentées…)du Diagnostic Virologique »
Patrice Morand
Laboratoire de Virologie
Faculté de Médecine-CHU Grenoble
DU Antibiologie Grenoble 2007
- Y a t-il du nouveau en Sérologie ?
- Faut-il abandonner la Culture Virale au profit de la Biologie Moléculaire?
-Les difficultés d’interprétation de la charge virale
- Intérêts et limites du séquençage moléculaire
L’ apport des tests combinés ( Ag+ Ac ) dans le dépistage des primo-infections à VIH et à VHC ?
Y Y YY
Y
Y
Ag Ac
SérumPatient
YY
Y YY EEE
Y a t-il du nouveau en Sérologie (1) ?
- 5 000 primo-infection / an / France ? .
- 50 % symptomatiques.
-Intérêt du dépistage des primo-infection.
.pour l’individu infecté :traitement de la primo-infection symptomatique ?30%- 50% des infections découvertes au stade SIDA
.pour ses partenaires :transmission très fréquentes à partir de patients en primo-infection
L’ apport des tests combinés ( Ag+ Ac ) dans le dépistage des primo-infections à VIH
joursJ 0
Ac
ARN
Ag P24
Fenêtre sérologiques
Fenêtres virologiques
ARN
11-12
14-15
20-21
28-29
Ag p24
Sérologie 3° G (Ac)
Test sérologiques combinés (Ac +Ag)Raccourcissement de la fenêtre sérologique
L’ apport des tests combinés ( Ag+ Ac ) dans le dépistage des primo-infections à VIH
- Nouveaux Test combinés Ag- Ac ( les plus récents) :
- gain moyen en jours /test Ac lors d’une séroconversion = 5 jours
- sensibilité détection Ag variable mais se rapprochant de parfois des test Ag P24 (5 à 20 pg/ml )
- quelques cas de résultats douteux avec 3 génération +
Suspicion de PI VIH avec 4e génération négatif ou douteux : toujours faire Ag P24 ou ARN
Kwon JA J Virol Method 2005Ly TD J Virol Method 2004
L’ apport des tests combinés ( Ag+ Ac ) dans le dépistage des primo-infections à VIH
Sérologie combinée Ag + Ac dans l’infection VHC
Laperche S , Transfusion 2005
- Alternative au DGV dans pays en développement ?
- Panels de séroconversions VHC .délai moyen apparition
Ac = 66 jours Ag- Ac délai moyen = 40 joursARN = 35 jours
. Spécificité test Ag-AC 99.8%
5 jours (0-24)
- transfusion sur les 2.5 millions de dons en France2 cas de contamination prévenus par DGV 1 cas de contamination prévenu par Ag-Ac
- suivi hémodalysé ?- suivi sujet à risque de primo-infection (épidémie chez homosexuel VIH +)
- Intérêt en France ? :
Apport des sérologies Herpes simplex spécifique de typeHSV1- HSV2 dans l’herpes génital ?
Y a t-il du nouveau en Sérologie (2) ?
- Séroprévalence HSV2 :
. USA: + 30 % dans la population générale (1980-1990)
. France étude herpimax : HSV2 +: 17.9% femmes 13.5 % hommes
. 100 patients HSV2.20 « diagnostiqués ».60 symptomatiqués et non diagnostiqués . 20 asymptomatique
. La majorité des transmission HSV2 à partir d’une excrétion asymptomatique
- des herpes génitaux HSV1 dans les pays occidentaux :. 30% - 50% des premiers épisodes?
Malkin JE, 2002
Apport des sérologies Herpes simplex spécifique de type HSV1- HSV2 dans l’herpes génital ?
herpes génital (HSV2) et VIH:
- Patient HSV2 + VIH-
Augmentation X2 du risque d’être contaminé par HIV
- Patient HSV2+VIH+
Probable augmentation du risque de transmettre VIH
herpes génital et herpes néonataux- USA Seattle 1 in 3,200
- Netherlands National 1 in 35,000
Apport des sérologies Herpes simplex spécifique de type HSV1- HSV2 dans l’herpes génital ?
HSV1 et HSV2 85 % identité en aa
Glycoprotéinetrès semblables :
ex : gD Tests non spécifiques
Apport des sérologies Herpes simplex spécifique de type HSV1- HSV2 dans l’herpes génital ?
glycoprotéines très différentes
ex / gG1 et gG2 Tests spécifiques de types
Sensibilité HSV2 80 à 98% (délai de séroconver. 20-60 jours)Spécificité HSV2 95 %
Wald A, Clin Infect Dis 2002Aslley -Morrow R, Sex Transm Dis 2003
Doctor test Anticorps HSV2 :
POCkit HSV2
HSV-1 HSV-2 1 +2Non
typable
01
02
03
04
05
06
07
08
IgG cont.
gDgG2
gG1
gB1 pep
IgG cont.
Sérologies spécifiques de types : l ’immunoblot
gG2
. Intérêts épidémiologiques : oui
.IVS va lancer une nouvelleenquête de séroprévalence HSV 2
. Intérêts individuels : très discuté
Couple avec un partenaire porteur de l’herpes génital ? Femme enceinte ? Sujet à multipartenariat sexuel (CDAG)….problème du HSV1 génital et de la méconnaissance de l’herpes génital dans le milieu médical
Apport des sérologies Herpes simplex spécifique de type HSV1- HSV2 dans l’herpes génital ?
Les sérologies pour dater l’infection VIH :
Test spécifiques pour diagnostiquer une infection < 6 mois sang sur buvard et quantification des Ac anti enveloppe (V3,gp41)
Sensibilité 88% Spécificité 98%
Ex Mars –Septembre 2003 :
Découvertes séro + % d’infections récentes < 6mois
Homosexuel masc.
Héterosex
111
156
58 %
32 %
Lot F, Eurosurveillance 2004Barin F, J Clin Microbiol 2005
Y a t-il du nouveau en Sérologie (3) ?
Les sérologies pour dater l’infection : Avidité des IgG :
.L’avidité des IgG pour l’antigène augmente avec le temps : une avidité élevée est en faveur d’une infection ancienne
. Infection à CMV chez la femme enceinte :
CMV: 1ere cause d ’infection congénitale (0,4 à 2,3%) en France
Femme Enceinte Sero + : 50 %
Fréquence
transmission
fœtus sympto
Mortalité
Réactivation Primo-infec
10-30 % 1- 4%
0.2- 2 % 35- 50%
excep 10 %
excep 10 %
Femme Enceinte Sero - : 50 %
chez la femme enceinte face à des IgM anti-CMV avec ou sans signe clinique de primo-infection :
avidité < 20% primo-infection ds les deux mois précédent
> 70 % infection datant de plus de 3 mois
. à ne pas mettre entre toute les mains
. à utiliser avec les autres stratégies pour dater l’infection
. sérums antérieurs
. culture ou PCR dans les urines
. Si doute Liquide amniotique
Les sérologies pour dater l’infection : Avidité des IgG :
Evolution des anticorps anti-CMV avec le temps :
IgG
IgM
IgG
IgM
IgG
IgM
Persistance prolongée des IgM
IgM
Réactivation
Avidité des IgG
Groupe 1Suspicion d’infections
respiratoires bassesn= 117
Groupe 2Absence d’infection
n= 31
Sub-groupe 1Transplantés pulmonaires
n= 31
148 LBA (2001-2002) (chez 111 adultes dont 78 % immunodéprimé ,113 LBA sous ATB )
Garbino J, Am J Respi Crit Care Med, 2004
Sub-groupe 2Transplantés pulmonaires
n= 26
4 types de Cultures cellulaires
11 RT PCRs Qualitatives
Faut-il abandonner la Culture Virale au profit de la Biologie Moléculaire?
Exemple 1 : infection respiratoires basses :
Garbino J,2004
Groupe 1 n= 117
34 virus respiratoires (29%)
Groupe 2 n= 31
2 virus respiratoires (7%)
P<0.01
- PCR positive 3 fois plus souvent que la culture ( p< 0.001)
- 45 % des infections virales : printemps- été
- Mortalité à J 30 ds groupe 1 :
-Virus + = 10%-Virus - = 14%
P=0.49
- Virus le plus fréquent dans le LBA : rhinovirus > VRS
Faut-il abandonner la Culture Virale au profit de la Biologie Moléculaire?
Garbino J 2004
CMV 4
Co- infect. bact/fung 5 (16%) versus 6 (23%)
CMV 4
pas de métapneumovirus ni de coronavirus
Sub Groupe 1Transplantés :
17 /31 = 55%
Sub Groupe 2Transplantés :
1/26= 4%
P <0.001
Rhinovirus 9RSV 4Influenza A /B 2Parainfluenza 1Adenovirus 1
Rhinovirus 1
Virus présent uniquement au moment des symptômes
Faut-il abandonner la Culture Virale au profit de la Biologie Moléculaire?
Sub Groupe 1Transplantés :
17 /31 = 55%
Sub Groupe 2Transplantés :
1/26= 4%
P <0.001
Garbino J 2004
Pas de différence de survie à J30 selon la présence ou non de virus dans le LBA
LBA virus + = 89 % LBA virus - = 100 %
Faut-il abandonner la Culture Virale au profit de la Biologie Moléculaire?
Van Kraaij M, Clin Infect, Dis 2005
- 72 greffés médullaires adultes ( 75 % allogreffe) (Oct. 99-Avril 2001)
. prélèvement nasal et gorge systématique J0 S3 S8 S16 S26
. prélèvement si suspicion infection respiratoire :- nez-gorge si infection haute - LBA si besoin dans infection basse
. Culture et PCR
. 41 infections respiratoires hautes et 11 infections basses (9LBA)
. Inf. hautes : 25 PCR + (61%) vs 10 Culture + ( 24%) ( p< .0001)
. Inf. basses : 8 PCR + (73%) vs 1 culture + ( 9%) ( p= .008)
Faut-il abandonner la Culture Virale au profit de la Biologie Moléculaire?
- Virologie moléculaire et infections respiratoires basses :
-3 fois plus de prélèvements positifs pour les Virus respiratoires
-mise en évidence de nouveaux virus
. métapneumo, coronaV, boccaV. (. Ou de virus respiratoires haut dans les LBA)
-Rôle en terme de mortalité et morbidité pas toujours évident
-Peu d’antiviraux
Faut-il abandonner la Culture Virale au profit de la Biologie Moléculaire?
PCR HSV 2
Cult. Pos
Neg
Pos Neg
157
104 68
Exemple 2 : l’herpes génital tout venant:334 prélèvements de patients (HSV2 séro+) avec lésions
suspectes d’herpes génital :
Ryncarz AJ, J Clin Microbiol 1999
5
Cult. + : 10 4 copies (101 à 10 6 ) Cult. - : 10 1 copies (101 à 10 4 )
Faut-il abandonner la Culture Virale au profit de la Biologie Moléculaire?
Cone RW, JAMA 1994
-Exemple 2 : l’herpes génital femme enceinte
. 100 femmes enceintes asymtomatique à l ’accouchement:
. 0 culture positive (littérature 0.05 à 2.3%)
. 9 PCR positives
. Aucun herpès néonatal
. 2 femmes asympto. avec culture négative et herpès néonatal . 2 PCR + (avec une CV élevée)
Que faire devant une culture- PCR+ ?
Faut-il abandonner la Culture Virale au profit de la Biologie Moléculaire?
Cas clinique
Femme enceinte sur le point d ’accoucher dans une clinique privée :
- Lésions grande lèvre droite. Premier épisode
- Antigène : + avec neutralisation douteuse: faux + ?
- PCR le même jour : HSV +
Césarienne
Culture positive le lendemain HSV2
- BLIPs : épisodes transitoires de 50 < CV< 1000 copies/ml chez des patientscompliants :
.Fréquence ? 30 % lors d’un suivi tous les 3mois ?
. Pas prédictif d’un échec virologique
. n’entraînent pas l’apparition de mutants résistants ?
Nettles Re, JAMA 2005Sungkanuparph S, Clin Infect Dis 2005Macias J, J Infect , 2005
-Virémie persistantes > 400 -10000
. apparition résistances
. évolution clinique à terme
Les difficultés de l’interprétation des charges virales
Exemple 1 : les charges virales faibles chez le VIH
208 patients ARN VHC – par technique conventionnelle (50 UI/mL)à la fin du Tt Peg IFN +Riba
26 ARN +
22 rechutes(96%)
26 rechutes(14%) P<0.0001
Gerotto J hepatol 2006
TMA (10UI/mL)
182 ARN -
Les difficultés de l’interprétation des charges virales
Exemple 2 Charge virale VHC en fin de traitement :
Exemple 3 :
valeur prédictive de la Charge virale EBV pour la prise en charge des syndrome lymphoprolifératifs post transplantation SLPT
Les difficultés de l’interprétation des charges virales
Slifkin M, Drugs 2004
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
PBMC SERUM PBMC SERUM SERUM PBMC
healthy IM NPC PTLD (n=32) (n=17) (n=10) (n=5)
EB
V c
opie
s /µ
g D
NA
or
/mL
ser
um
(lo
g10)
37 % 0 % 100 % 80 % 80 % 100 %
Brengel-Pesce, J Med virol 2002
Valeur prédictives des charges virales EBV dans les SLPT ?
Brengel Pesce J Med Virol, 2002
07/99 09/99 11/99 01/00 03/00 05/00
EBV load (copies/µg ADN)
16,00014,00012,00010,0008,0006,0004,0002,000
localized PTLD
tonsillectomy
systemic PTLD
anti-CD20
Valeur prédictives des charges virales EBV dans les SLPT ?
Etude
Gärtner et al (2002)
Méthode
Quantitative PCR(copies/µg ADN)
Sensibilité
87%
Spécificité
91%
Cut-off
10 000
Grenoble PCR en temps réel :
CV élevée > 10 000 copies / mlCV tres élevée > 100 000 copies/mlVariation significative 1log
Valeur prédictives des charges virales EBV dans les SLPT ?
- intérêt d’une cinétique hebdomadaire les 3 premiers mois pour les greffes à haut risque ( R-/D+, IS+++) : Augmentation rapide de la charge virale = prédictive
- possibilité de charge virale élevée sans maladie seulement 50 % des CV élevé font un SLPT ?(Wagner Blood 2004). Charge virale haute : à interpréter avec précaution en tenant compte des autres facteurs de risque de SLPT
- possibilité de charge virale faible dans maladie localisée
- possibilité d’absence de rémission malgré évolution favorable de la cv ?
- intérêt de la mesure des CTL anti EBV ?
Valeur prédictives des charges virales EBV dans les SLPT ?
Exemple 3 la MEH Plutôt oui :
.16 patients - réaugmentation chez un patients traité décès- >100 copies / ml mauvais pronostic ?
Domingues, J Clin Microbiol 1998
. 27 enfants avec réponse au TT- 7 rechutes - 2 / 7 réapparition secondaire de l ’ADN HSV
Ito; Clin Infect Dis 2000
Plutôt non :
- 26 patients MEH (98 LCR)- diminution CV sous traitement- pas de corrélation avec gravité
Revello , Clin Diagn Virol 1997
Les difficultés de l’interprétation des charges virales
Exemple 4 : Faut-il mesurer autres choses en plus des charges virales
. VIH et ADN Proviral
.322 patients de la cohorte Séroco suivi 8 ans (1988-1996)
.dans les 6 mois qui suivent la séroconversion, l’ADN est plus prédictif de la progression de la maladie que l’ARN ou les CD4.ensuite ( 6-24mois) facteur prédictif indépendant de ARN ou CD4
Rouzioux C, J Infect Ds 2005
. ARN Messager du cycle lytique et herpes virus ?
. + Prédictif d’une maladie virale ?
Les difficultés de l’interprétation des charges virales
Intérêts et limites des génotypages viraux
Intérêts et limites des génotypages viraux « pré thérapeutiques »
En routine
Genotypage VHC
Genotypage Papilloma
Intérêt pour les autres virus ?
Génotypage VHB
Soustypage VIH
Intérêts et limites des génotypages des résistances par séquençage moléculaire
Exemple Génotypage VIH
-intérêt certains en cas d’échec virologique et dans les primo-infecet probable en début de traitement
- interprétation spécialisée
- les questions en suspend :
. sensibilité suffisante du séquençage ?
. différences d’interprétation selon les algorithmes
. intérêt de l’association avec critères pharmacologiques
. corrélation phénotype –génotype
Conclusions :
La sérologie a un avenir :
indispensable en épidémiologieintéressante dans des cas individuels difficile à condition d’avoir des bons sérologistes
La biologie moléculaire va remplacer la culture virale (et la détection d’Ag) en routine
garder un petit nombre de centre de référence pour collectionnerles souches
l’ amélioration de la sensiblité pose des pb d’interprétations médicale
les VPP pour les maladies à Herpes virus chez le transplantés sontdifficile à établir
le génotypage des résistances nécessite une expertise