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Activité antivirale des protéines de lactosérum estérifiées.
Jean-Marc Chobert et Thomas Haertlé
INRA BIA-FIPL, Nantes, France
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Le laitde vache
Lait écrémé
Caséines Lactosérum
pH=4,6centrifugation
caséine αs1
caséine βcaséine κcaséine αs2
β-lactoglobulineα-lactalbumine
…
Protéines
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La β-lactoglobuline, protéine majeure du lactosérum, est une protéine globulaire, résistante à la protéolyse par la pepsine
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Structure tridimensionnelle de la β-lactoglobuline
Masse du monomère : 18,4 kDa, 8 feuillets, β tonneau, 1 hélice α, 5 cystéines – 2 ponts SS, fixation de molécules hydrophobes, dimérique au pH du lait (6,8)
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Dans leurs structures primaires, les protéines du lait renferment de nombreux peptides actifs, libérés par protéolyse
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Quelques exemples de peptides bio-actifs issus des protéines laitières.
Peptides Protéines de départ Type de bio-activité
Casomorphines caséines α et β Agoniste opioïde
α-lactorphine α-lactalbumine Agoniste opioïde
β-lactorphine β-lactoglobuline Agoniste opioïde
Lactoferroxines Lactoferrine Antagoniste opioïde
Casoxines caséine κ Antagoniste opioïde
Casokinines caséines αs1 et β Anti-hypertension
Casoplatelines caséine κ Anti-hypertension
Caséinomacropeptide caséine κ Anti-thrombique
Immunopeptides caséines α et β Immunostimulant
Lactoferricine Lactoferrine Transport de minéraux
Phosphopeptides caséines α et β Transport de minéraux
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Trouver des moyens de rendre la BLG hydrolysable par la pepsine afin de produire des peptides présentant une activité biologique
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Réaction d’estérification
R-COOH + EtOH / MetOH RCOOEt/Met
HCl
Protéines amphiphiles
Protéines « basifiées »
Interactions avec des charges négatives
Interactions avec des acides nucléiques
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De simples modifications des protéines laitières α-lactalbumine et/ou β-lactoglobuline génèrent à peu de frais des protéines
chargées positivement.
+ CH3OH ou CH3CH20HRouge - Charges négativesBleu - Charges positives
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Isoélectrofocalisation3.503.75
4.55
5.20
5.85
6.55
6.85
7.358.158.458.65
9.30
1 2 3 4 5 6 7 8
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Hydrolyse pepsique de la BLG en milieu hydro-éthanolique
0%
20%
25%
30%
35%
40%
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Diversified and amplified peptide libraries produced by combination of chemical modifications and proteolysis.
"Procédé d'obtention de populations peptidiques nouvelles. Produits obtenus." Jean-Marc Chobert, Loïc Briand et Thomas Haertlé, French Patent N° 93 15764. P.C.T.World extension N° 94 01500.
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Influence de la concentration en 100% Met-BLG
(1: 180 µM; 2: 240 µM)
dans le milieu d’incubation sur son activitéantivirale envers le phage bIL67 (105 pfu/mL), par rapport à un contrôle réaliséen absence de protéine (C).
1 2
C
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0 20 40 60 80 100
0
20
40
60
80
100
0.1 MOI, 2 days0.01 MOI, 3 days1.0 MOI, 1 day1.0 MOI, 2 days
Figure 1
Ant
ivir
al a
ctiv
ity (%
)
Concentration of 100% Met-BLG (µg mL-1)
A
Concentration of esterified whey proteins (µg mL-1)
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Ant
ivir
al a
ctiv
ity (%
)
0
20
40
60
80
100
68% Met-ALA100% Met-BLG
B
A
Poliovirus
Coxsackie virus
(A): activité antivirale de 68% Met-ALA ( ) et de 100% Met-BLG ( ) contre le poliovirus type 1 (1.0 MOI) inoculé dans des cellules Vero, après 48 h d’incubation à 37°C.
(B): activité antivirale de 100% Met-BLG contre le virus Coxsackie B6 après incubation à 37°C en présence de 5% CO2pendant 24 h ( : 1.0 MOI), 48 h ( : 0.1 MOI; : 1.0 MOI), et 72 h ( : 0.01 MOI).
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0
20
40
60
80A
Protein concentration (µg/ml)
0 25 50 75 100 125
Ant
ivira
l act
ivity
(%)
0
20
40
60
80B
Cyt
otox
icity
(%)
0
20
40
60
80C
Protein concentration (µg/ml)
0 25 50 75 100 125
0
20
40
60
80D
60% Met-ALA and its peptic peptides 100% Met-BLG and its peptic peptides
Ant
ivira
l act
ivity
(%)
Cyt
otox
icity
(%)
Activité antivirale de 60% Met-ALA (A) et après son hydrolyse pepsique de 10 h (B), 100% Met-BLG (C) et après son hydrolyse pepsique de 10 h (D) contre HSV-1 [( ) 100% CPE, ( ) 50% CPE] inoculé dans des cellules Vero, après 72 h d’incubation à 37°C. ( ): cytotoxicité
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Inhibition de la réplication de différents virusBactériophage M13. Spécifique d’E. coli. Comparaison
avec les effets des histones et du lysozyme
Bactériophages de lactocoques. Comparaison avec les effets des histones, du lysozyme et des polylysines
Virus Herpes simplex de type 1
Poliovirus (enterovirus)
Cytomégalovirus
Comparaison avec acyclovir et L-polylysines (5-14 kDa)
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M. Sitohy ; S. Billaudel ; T. Haertlé ; J.-M. Chobert. Antiviral activity of esterified α-lactalbumin and β-lactoglobulin against herpes simplex virus type 1. Comparison with the effect of acyclovir and L-polylysines. J. Agric. Food Chem. 2007, 55 (24) DOI: 10.1021/jf0724421 .
M. Sitohy ; J.-M. Chobert ; M. Dalgalarrondo ; M. Nowoczin ; B. Besse ; S. Billaudel ; T. Haertlé. The effect of bovine whey proteins on the ability of poliovirus and Coxsackie virus to infect Vero cells cultures. Int. Dairy J. (accepté).
J.M. Chobert; M. Sitohy; S. Billaudel; M. Dalgalarrondo; T. Haertlé. Anti-cytomegaloviral activity of esterified milk proteins and L-polylysines. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2007, 13, 255-258.
M. Sitohy ; J.-M. Chobert ; U. Karwowska ; A. Gozdzicka-Jozefiak ; T. Haertlé. Inhibition of bacteriophage M13 replication with esterified milk proteins. J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 3800-3806.
M. Sitohy ; J.-M. Chobert ; T. Haertlé. Esterified whey proteins can protect Lactococcus lactis against bacteriophage infection. Comparison with the effect of native basic proteins, and L-polylysines. J. Agric. Food Chem., 2005, 53, 3727-3734.
M. Sitohy ; J.-M. Chobert ; J.-C. Gaudin ; T. Renac ; T. Haertlé. When positively charged milk proteins can bind to DNA. J. Food Biochem., 2002, 26, 511-532.
M. Sitohy ; J.-M. Chobert ; M. Schmidt ; A. Gozdzicka-Jozefiak ; T. Haertlé. Interactions between esterified whey proteins (α-lactalbumin and ß-lactoglobulin) and DNA studied by differential spectroscopy. J. Prot. Chem., 2001, 20, 633-640.
M. Sitohy ; J.-M. Chobert ; J.C. Gaudin ; T. Haertlé. Esterified milk proteins inhibit DNA replication. Int. J. Biol. Macromol., 2001, 29, 259-266.
M. Sitohy ; J.-M. Chobert ; T. Haertlé. Study of the formation of complexes between DNA and esterified dairy proteins. Int. Dairy J., 2001, 11, 873-883.
M. Sitohy ; J.-M. Chobert ; T. Haertlé. Susceptibility to trypsinolysis of esterified milk proteins. Int. J. Biol. Macromol., 2001, 28, 263-271.
M. Sitohy ; J.-M. Chobert ; M. Dalgalarrondo ; T. Haertlé. Factors influencing pepsinolysis of methyl-, ethyl-, and propyl- ester derivatives of ß-lactoglobulin. J. FoodBiochem., 2001, 25, 181-198.
M. Sitohy ; J.-M. Chobert ; T. Haertlé. Improvement of solubility and of emulsifying properties of milk proteins at acid pHs by esterification. Nahrung-Food, 2001, 45, 87-93.
M. Sitohy ; J.-M. Chobert ; T. Haertlé. Peptic hydrolysis of methyl-, ethyl-, and propyl- esters of ß-casein and α-lactalbumin. Milchwissenschaft, 2001, 56, 303-307.
M. Sitohy ; J.-M. Chobert ; T. Haertlé. Simplified short-time method for the esterification of milk proteins. Milchwissenschaft, 2001, 56, 127-131.
M. Sitohy ; J.-M. Chobert ; T. Haertlé. Study of factors influencing protein esterification using ß-lactoglobulin as a model. J. Food Biochem., 2000, 24, 381-398.
J.-M. Chobert ; T. Haertlé. Composition pour l’inactivation de particules virales, et applications d’une telle composition. Demande de Brevet Français déposée le 5 Juin 2003, sous le n° 03/06786. Demande Internationale PCT déposée le 7 juin 2004.
J.-M. Chobert ; L. Briand ; T. Haertlé. Procédé d'obtention de produits peptidiques et produits obtenus. Demande de Brevet Français déposée le 23 Décembre 1993, n°93/15764, délivrée le 8 Mars 1996, n° 2 714.390. Demande Internationale PCT déposée le 20 Décembre 1994, n° 94/01500, délivrée le 27 janvier 1999.
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De simples modifications des protéines lactosériques peuvent conduire, à faible coût, à la production de librairies amplifiées et diversifiées de peptides amphiphiles.
Ces protéines peuvent servir comme agents de neutralisation virale (virucides).
Certaines formes de bêta-lactoglobulines modifiées sont actives contre HSV, Polio, hCMV, bactériophages, etc« Inactivation of viral particles. » Jean-Marc Chobert and Thomas Haertlé. French
Patent N° FR-03 06786, world extension applied for.
ConclusionsConclusions
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Mahmoud SitohyZagazig University, Faculty of Agriculture, Biochemistry Department, Zagazig, Egypt
Urszula Karwowska, Anna Gozdzicka-Jozefiak A.Mickiewicz University, Zaklad Wirusologii Molekularnej, Poznan, Poland
Sylviane Billaudel Université de Nantes, UFR des Sciences Pharmaceutiques, Bactériologie-Virologie, Nantes, France
Christophe Chevalier et Bernard Delmas INRA, VIM, Équipe Virus InfluenzaJouy-en-Josas, France
CollaborationsCollaborations
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Soutiens obtenus
Partenariat Hubert Curien ‘Imhotep’ France-Égypte « Propriétés antivirales et hypoallergéniques des protéines laitières modifiées »
Département CEPIA
Région Pays de la Loire; valorisation. « Développement d’une famille de protéines et peptides antiviraux »