2. ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE PROTEÍNAS
Purificación de LDH de músculo de Gallus gallus
CICLO DE CORI
↑Demanda de ATP↓O2
Piruvato
NADH
Lactato deshidrogenasa (LDH)
L-Lactato NAD+
Hígado
Sangre
Músculo
Glucosa Glucosa Glucógeno
L-Lactato L-Lactato
ATP + GTP
ADP + GDP + Pi ADP + Pi
ATP
Glucogenolisis y Glucólisis
Gluconeogénesis
2. PURIFICACIÓN DE LA ENZIMA LACTATO
DESHIDROGENASA DE MÚSCULO ESQUELÉTICO
DE BOVINO
PARTE I. EXTRACCIÓN Y PRECIPITACIÓN POR SALADO.
¿PARA QUÉ PURIFICAR UNA PROTEÍNA?
Lipasa Hexosa oxidasa Vacuna Hepatitis B Insulina Gelatina Proteínas recombinantes
varias Pectinoesterasas
•Suero fetal bovino•Colorante de carne•Proteína liofilizada
¿POR QUÉ QUEREMOS PURIFICAR UNA PROTEÍNA?
Precisar secuencias de aminoácidos.
Establecer relaciones evolutivas.
Investigar la función bioquímica.
Establecer relaciones estructura-función.
Aplicaciones terapéuticas o biotecnológicas
GUIA PARA PURIFICAR UNA PROTEÍNA
GUIA PARA PURIFICAR UNA PROTEÍNA
GUIA PARA PURIFICAR UNA PROTEÍNA
FASES DE LA PURIFICACIÓN
1. Fase I ó fase de captura, el objetivo es aislar, concentrar y estabilizar la proteína de interés. Se deben de eliminar los contaminantes críticos que comprometan la estabilidad de la proteína.
2. Fase II ó fase intermedia, el objetivo es eliminar la mayoría de las impurezas como otras proteínas, ácidos nucléicos, endotoxinas y virus.
3. Fase III ó fase de perfeccionamiento, la mayoría de las impurezas ya han sido removidas excepto aquellas que están muy relacionadas con la proteína de interés y que se encuentran en cantidades muy pequeñas. El objetivo es logar la mayor pureza posible.
DEFINIR LAS PROPIEDADES DE LA PROTEÍNA DE INTERÉS
SELECCIONAR LA FUENTE DE PROTEÍNA
La elección de la procedencia de la proteína debe basarse en criterios tales como:
a)la facilidad de obtener cantidades suficientes del tejido del que se aísla la proteína,
b)la cantidad de la proteína de interés en el tejido y c)cualquier propiedad peculiar de la proteína escogida,
que ayudará en su estabilización y su aislamiento.
RUPTURA DE LA CÉLULA¿QUÉ PROPIEDAD DE LA PROTEÍNA ES IMPORTANTE? ESTABILIDAD Las proteínas se desnaturalizan fácilmente por temperaturas
elevadas, aunque algunas se pueden desnaturalizar a 25°C. La purificación de las proteínas debe llevarse a cabo a 0°C ó temperaturas cercanas.
•Suaves:Lisis celular (choque osmótico)Digestión enzimática (lisozima)Lisis química (detergentes)Homogenización manualMolienda
Menos agresivos, previenen desnaturalización de la proteína, pero no aseguran su liberación celular.
MÉTODOS
RUPTURA DE LA CÉLULA¿QUÉ PROPIEDAD DE LA PROTEÍNA ES IMPORTANTE? ESTABILIDAD
•Moderados:Homogenización con cuchillasMolienda abrasivaCongelamiento
•Vigorosos:UltrasonicaciónHomogenizador Manton-GaulinPrensa francesa Reducen viscosidad del extracto, pero pueden inactivar proteínas.
MÉTODOS
SELECCIONAR LA FUENTE DE PROTEÍNA
SELECCIONAR LA FUENTE DE PROTEÍNA
Aditivos
FRACCIONAMIENTO CELULAR: CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL
Eliminar contaminantes o clarificar la muestra
Separación de los componentes con base en las diferencias en densidad, tamaño y forma. Como resultado, el efecto de la gravedad para cada proteína es diferente.
Partículas más grandes y pesadas migran más rápido.
Diagrama para la obtención de diferentes fracciones celulares
Homogenización del tejido
Baja velocidad de centrifugación (1 000 g, 10’)
Baja velocidad de centrifugación (1 000 g, 10’)
Sobrenadante sujeto a velocidad de centrifugación
media(20 000 g, 20’)
Sobrenadante sujeto a velocidad de centrifugación
alta(80 000 g, 1 h)
Sobrenadante sujeto
a velocidad de centrifugación
muy alta(150 000 g, 3 h)
Sobrenadante
contiene proteínas solubles
Tejido homogena
do
Pellet, contiene células
completas, núcleos, membran
as plasmátic
as
Pellet, contiene
mitocondrias,
lisosomas, peroxisom
as Pellet, contiene
microsomas (fragmentos
de RE), vesículas pequeñas Pellet, contiene
ribosomas, macromoléculas
grandes
Otros compuestos utilizados para formar el gradiente: detergentes no iónicos, Ficoll, Percoll, Nycodenz y Optiprep.
Centrifugación
Muestra
Gradiente de
Sacarosa
Componentes menos
densosComponen
tes más densos
Fraccionamiento
REMOVER CONTAMINANTES Y/O CONCENTRAR LA MUESTRA Después de romper las células y estabilizar las
proteínas, el siguiente paso es concentrar. Se pueden utilizar diferentes métodos:
Ultrafiltración
Liofilización
PrecipitaciónPrecipitación
Precipitación¿Qué propiedad de la proteína es importante? SOLUBILIDAD
La solubilidad de una proteína es sensible a la temperatura, el pH, la fuerza iónica.
Si afectamos alguna de éstos factores podemos disminuir o incrementar la solubilidad de la proteína.
El método más comúnmente empleado es la precipitación por salado con (NH4)2SO4.
¡Y es el que vamos a hacer en la práctica!
Sin embargo, también hay otros métodos…Pp con solventes orgánicos.Pp isoeléctrica.Pp térmica.
Precipitación¿Qué propiedad de la proteína es importante? SOLUBILIDAD
Fuerza Iónica
Log
(S
/S’)
Precipitación¿Qué propiedad de la proteína es importante? SOLUBILIDAD
Solubilidad
Capa de Hidrataci
ónSalting
inSalting
out
Concentración de sal
Precipitación¿Qué propiedad de la proteína es importante? SOLUBILIDAD
EXISTEN TABLAS QUE NOS INDICAN CUANTO AÑADIR DE SULFATO DE AMONIO
Y TAMBIÉN EN INTERNET
http://www.proteinchemist.com/cgi-bin/s2.pl Conocer:1. Sulfato de amonio sólido2. Conocer el volumen de la solución3. Y la concentración final de la sal
¿CÓMO VAMOS A PURIFICAR A LA LDH DE Gallus gallus?
PROPIEDADES DE LDH DE Gallus gallus
LDH A LDH B
Numero de aminoácidos 332 333
Peso molecular (Da) 36514.4 36318.0
Punto isoeléctrico 7.75 7.07
Promedio general de hidropaticidad (GRAVY)
-0.004 0.087
Localización celular Citoplasma Citoplasma
Forma activa Homotetrámero
Homotetrámero
Superfamilia LDH/MDH LDH/MDH
Tipo de enzima Oxidoreductasa Oxidoreductasa
Cofactor NAD+ NAD+