1
Μοριακή ∆ιαγνωστική
στην Κλινική
Ανοσολογία. ∆ανάη Ειρήνη Τερζάκου (10047), Τµήµα Ιατρικών Εργαστηρίων, ΤΕΙ Αθήνας.
2
Περιεχόµενα:
Εισαγωγή...................................................................................................................σελ. 4
Μοριακή ∆ιαγνωστική
στηνΑνοσολογία........................................................................................................σελ. 4
Κεφάλαιο 1. PCR.......................................................................................................σελ. 5
• Κεφάλαιο 1.1Αρχή της PCR
• Κεφάλαιο 1.2 Εκκινητές/ Primers
• Κεφάλαιο 1.3 Παραλλαγές της PCR
• Κεφάλαιο 1.3.1 real-time PCR
• Κεφάλαιο 1.3.2 Multiplex PCR
• Κεφάλαιο 1.3.3 RT- PCR
• Κεφάλαιο 1.3.4 Hot-Start PCR
Κεφάλαιο 2. Μicroarrays.........................................................................................σελ. 10
Kεφάλαιο 3. Ιn Situ Hybridization...........................................................................σελ. 11
• Κεφάλαιο 3.1 Μέθοδος FISH ( Fluorescent In Situ Hybridization).
Kεφάλαιο 4. Sequencing..........................................................................................σελ. 12
• Κεφάλαιο 4.1 Mέθοδος Sanger
• Κεφάλαιο 4.2 Νext Generation Sequencing
• Κεφάλαιο 4.3 Ιon Semiconductor Sequencing
• Κεφάλαιο 4.4 Pyrosequencing
Kεφάλαιο 5. Ηybridization………………………………………………………..σελ 14
• Κεφάλαιο 5.1 Dot Blot
• Κεφάλαιο 5.2 Ανάστροφη Υβριδοποίηση
• Κεφάλαιο 5.3 Southern Blot
• Κεφάλαιο 5.4 Northern Blot
3
Kεφάλαιο 6. c DNA................................................................................................σελ. 18
• Κεφάλαιο 6.1 Αρχή της c DNA βιβλιοθήκης
• Κεφάλαιο 6.2 Εφαρµογές στην Κλινική Ανοσολογία
Κεφάλαιο 7. Ανάλυση MLPA………….....................................................................σελ.21
• Κεφάλαιο 7.1 Αρχή της MLPA
• Κεφάλαιο 7.2 Εφαρµογές στην Κλινική Ανοσολογία
Kεφάλαιο 8. Γονιδιωµατική Βιβλιοθήκη..................................................................σελ. 26
• Κεφάλαιο 8.1 Αρχή της Γονιδιωµατικής Βιβλιοθήκης
• Κεφάλαιο 8.2 Εφαρµογές στην Κλινική Ανοσολογια
Κεφάλαιο 9. Μοριακές ∆ιαγνωστικές και Βιοπληροφορική......................................σελ 28
Κεφάλαιο 10. SNP διαγνωστική................................................................................σελ. 30
Βιβλιογραφία.
4
Μοριακή ∆ιαγνωστική στην Κλινική
Ανοσολογία. Η µοριακή διαγνωστική αποτελεί πλέον, τη βέβαιη και ασφαλή λύση –σε όσους έχουν
την οικονοµική πολυτέλεια- στη διάγνωση και όχι µόνο πολλών ασθενειών που κάποτε
αποτελούσαν µυστήριο για πολλούς επιστήµονες.
Eισαγωγή.
Όταν οι James Watson και Francis Crick
ανακάλυψαν τη δοµή του DNA, ο
Watson είπε χαρακτηριστηκά ότι
βρήκαν το µυστικό της ζωής, και είχε
δίκιο.
Το DNA αποτελεί την αρχή αλλά και το
τέλος της ζωής, είναι η κινητήριος
δύναµη της αναπαραγωγής, του
πολλαπλασιασµού, της διαφοροποίησης.
Στην αρχή οι επιστήµονες, µε πρώτους
τους βιοχηµικούς, είκαζαν ότι οι
πρωτεϊνες –όντας το µεγαλύτερο και
πολυπλοκότερο µακροµόριο- έφεραν τη
γενετική πληροφορία. Μα ευτελή
«βήµατα» και µικρές ανακαλύψεις µε
κορύφωση την ανακάλυψη των Franklin,
Watson και Crick απέδειξαν ότι το DNA
κρύβει το µυστικό της ζωής.
Άµα αναλογιστεί κανείς, όµως τα
πειράµατα που πραγµατοποιούσαν για
την απόδειξη τούτης της εικασίας, θα
παρατηρούσε ότι αποτελούσαν µια
πρώιµη µορφή της µοριακής
διαγνωστικής, µε πρώτο τον Griffith, ο
οποίος αποµόνωσε αδρά και λεία
στελέχη πνευµονιόκοκκου από νεκρούς
και µη ποντικούς.
Πολλοί ήτο δε εκείνοι που
«εκµεταλλεύτηκαν» τούτα τα
προτερήµατα του DNA και το
µετρέτεψαν σε ένα χρήσιµο διαγνωστικό
εργαλείο.
Μοριακή ∆ιαγνωστική στην Κλινική Ανοσολογία.
Αποτελεί ένα κλειδί που µπορεί να
ανοίξει πολλές πόρτες. Ένα εργαλείο
που µέχρι και σήµερα εξακολουθεί να
διευρύνει τους ορίζοντες πολλών
επιστηµόνων από κάθε τοµέα, µε πρώτο
αυτούς που εκπροσωπούν τον τοµέα της
Kλινικής Ανοσολογίας. Εξελίσσονται
και βελτιστοποιούνται συνεχώς µε την
πάροδο των χρόνων, καθώς είναι πολλά
ακόµα τα ζητήµατα που δεν έχουν
καλυφθεί όπως το υψηλό κόστος τούτων
των µεθόδων.
Ωστόσο, αυτά τα σύχρονα µοριακά τέστ,
αυξάνουν την ικανότητα του επιστήµονα
να ταυτοποιήσει σε σχετικά µικρό
χρονικό διάστηµα τις αιτίες κάποιας
5
µόλυνσης και όχι µόνο. Παράλληλα,
µπορούν όχι µόνο να διαγνώσουν
καποια ασθένεια µα να βοηθήσουν στη
χορήγηση των σωστών φαρµάκων
καθώς και στη βελτιστοποίηση
φαρµάκων.
1. PCR
( Polymerase chain reaction)
Εισαγωγή.
Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης
(PCR) αποτελεί µια ταχεία και σχετικά
απλή µέθοδος αντιγραφής και
πολλαπλασιασµού συγκεκριµένων
αλληλουχιών DNA, όταν είναι γνωστή
µια ακολουθία 20 ζεύγος βάσεων στα
άκρα των τµηµάτων.
1.1 Aρχή της PCR.
Η µέθοδος τούτη στηρίζεται στην
ικανότητα του θερµοσταθερού ενζύµου
DNA-πολυµεράση να συνθέται
συµπληρωµατική έλικα DNA πάνω σε
εκµαγείο προϋπάρχοντος µονόκλωνου
DNA. Η δράση της πολυµεράσης έχει
κατεύθυνση 5’-->3’ και η έναρξή της
προϋποθέτει την ύπαρξη ενός βραχέο
τµήµατος DNA, που θεωρείται η
περιοχή εκκίνησης της αντιγραφής.
Τούτη περιοχή δηµιουργείται µε την
πρόσδεση µιας βραχείας σειράς
συνθετικών συµπληρωµατικών
ολιγονουκλεοτιδίων γνωστή και ως
εκκινητές ή primers στο 3’-άκρο
καθενός από τα δύο µονόκλωνα
τµήµατα DNA που προκύπτουν από την
αποδιάταξη του αρχικού κλώνου.
6
Όπως περιγράφεται και στο σχήµα η
PCR επιτυγχάνεται µε τη βοήθεια
συσκευών που φέρονται ως θερµικοί
κυκλοποιητές και η οποίοι επιτυγχάνουν
την αποδιάταξη του DNA µε θέρµανση
του περιβάλλοντος της αντίδρασή µέχρι
τους 94 oC. Εν συνεχεία η θερµοκρασία
µειώνεται –στους 55 oC περίπου- έτσι
ώστε να γίνει ο υβριδισµός των
εκκινητών µε τη συµπληρωµατικής τους
DNA-ακολουθία. Η αύξηση της
θερµοκρασίας στους 72 oC ευνοεί τη
σύνδεση της πολυµεράσης στη θέση που
έχουν υβριδισθεί οι εκκινητές. Τέλος το
ένζυµο, χρησιµοποιώντας τα
τριφωσφορικά δεοξυριβονουκλεοτίδια,
επιµηκύνει τους εκκινητές συνθέτοντας
µια συµπληρωµατική αλυσίδα DNA στη
προϋπάρχουσα. Η αυτοµατοποιηµένη
και διαδοχική επανάληψη τούτο του
κύκλου έχει ως αποτέλεσµα το
διπλασιασµό των επιθυµητών
αντιγράφων DNA µετά από κάθε κύκλο.
1. [John M.S Bartlett and David Stirling
(Editors) Humana Press Inc. Totowa,
NJ.]
H PCR θεωρείται η εύκολη λύση τόσο
γιατί προσφέρει διάγνωση και ανίχνευση
ενός νοσήµατος όσο γιατι είναι µια
γρήγορη µέθοδος. Μέσω τούτης της
µεθόδου µπορεί να εντοπισθεί ιϊκό
γενετικό υλικό είτε αυτό είναι DNA είτε
είναι RNA. H υψηλή ευαισθησία που
διαθέτει αυτή η τεχνική µπορεί να
διαπιστώσει το ιϊκο γενετικό υλικό λίγο
µετά τη µόλυνση του οργανισµού µε
αυτό και πολλές φορές πρίν την
εµφάνιση συµπτωµάτων της δεδοµένης
ασθένειας.
1.2 Εκκινητές.
Ο σχεδιασµός τους αποτελεί ένα από τα
σηµαντικότερα στοιχεία, καθώς δεν
αρκεί απλώς να είναι συµπληρωµατικοί
7
στα άκρα των δύο αλυδίδων DNA που
αντιγράφεται αλλά ταυτόχρονα δε
πρέπει να εµφανίζουν
συµπληρωµατικότητα µε άλλες θέσεις
των µορίων DNA που περιέχονται στο
δίαλυµα αντίδρασης. Αυτό ισχύει όταν
αντιγράφεται και άλλο τµήµα DNA
παράλληλα, µε αποτέλεσµα να µειωθεί η
αποτελεσµατικότητα της αντιγραφής του
επιθυµητού κλώνου και επιπλέον να
δηµιουργηθούν παραπροϊόντα. Η
ακολουθία βάσεων τους µάλιστα,
καθορίζει και την ακριβή θερµοκρασία
αναδιάταξης
.
1.3 Παραλλαγές της PCR που χρησιµοποιούνται για διάγνωση.
1.3.1 Real Time PCR.
Αποτελεί µια παραλλαγή της µεθόδου και
τελευταία παρουσιάζει ευρεία διάδοση. Κατά
την εφαρµογή της, χρησιµοποιείται κάποια
φθορίζουσα χρωστική µε τέτοιο τρόπο ώστε ο
φθορισµός που εκπέµπεται να είναι ανάλογος
της ποσότητας του παραγόµενου προϊόντος. Ο
θερµικός κυκλοποιητής µετρά τον φθορισµό
που εκπέµπεται από το δίαλυµα της αντίδρασης
κατά τη πραγµατοποίησή της. Συµπερασµατικά
υπολογίζεται η αύξηση της σύνθεσης του
προϊόντος κατά τον χρόνο που παράγεται.
Επίσης από τις τιµές των µετρήσεων είναι
δυνατός υπολογισµός του ακριβούς αριθµού
των αρχικών αντιγράφων του τµήµατος DNA ή
RNA ( σε περίπτωση reverse transcriptase real-
time PCR – κάτι που θα αναλυθεί παρακάτω-).
Με το τρόπο τούτο µπορεί να παραληφθεί η
ηλεκτροφόρηση και σγχρόνως παράγονται
ποσοτικές πληροφορίες για το δείγµα. 2.[Beggs
AH, Koenig M, Boyce FM, Kunkel LM. ]
1.3.1.1 Εφαρµογές στην κλινική Ανοσολογία.
• Αποτελεί ένα αγαπηµένο
«εργαλείο» στη διάγνωση
µολυσµατικών ασθενειών σε
επείγουσες περιπτώσεις, καθώς
είναι µια γρήγορη και ευαίσθητη
µέθοδος. 3. [Department of
Microbiology and Molecular Cell
Biology,]. Μπορεί να θεωρείται
8
µια σχετικά γρήγορη µέθοδος µα
απαιτεί σχετική ακριβή
οργανολογία, µια πολυτέλεια που
δεν έχουν όλα τα ερευνητικά
κέντρα-νοσοκοµεία.
• Επιπροσθέτως µέσω της real-
time PCR καθιστάται δυνατή η
παρακολούθηση της
ανοσολογικής απόκκρισης. Κάτι
τέτοιο µπορεί να βοηθήσει τόσο
στην µεταγενέστερη θεραπεία
του καρκίνου όσο στην
τοποθέτηση του σωστού
αντιγόνου ή στελέχος του για τη
δηµιουργία και την αξιολόγηση
ενός εµβολίου. 4. [Stordeur P -
Monitoring the immune response
using real-time PCR ].
Χαρακτηριστικό παράδειγµα
τούτης της εφαρµογής είναι η
ανάλυση της ανοσολογικής
απόκκρισης κατά το κλωστηρίδιο
του τετάνου.
• Παράλληλα µε τη βοήθεια της
real-time PCR είναι έυκολη η
παρακολούθηση και η ανίχνευση
είτε των ασθενειών είτε του
καρκίνου, λόγω υψηλής
ευαισθησίας. Χαρακτηριστικό
παράδειγµα είναι η ανίχνευση
της οξείας λευχαιµίας. 5. [Bacher
U, Schnittger S, Haferlach C,
Haferlach T].
• Ποσοτικοποίηση m RNA
κυτταροκίνων. Όπως
αναφέρθηκε και παραπάνω η
real-time PCR είναι ιδανική
στον ακριβή υπολογισµό
νουκλεϊκών οξέων. 6. [Patrick
Stordeur, Lionel F Poulin, Ligia
Craciun, Ling Zhou, Liliane
Schandené, Aurore de Lavareille,
Stanislas Goriely, Michel
Goldman ]. Οι κυτταροκίνες
αποτελούν ετερογενή οµάδα
µικροµοριακών πρωτεϊνών, οι
οποίες παράγονται από διάφορα
κύτταρα του οργανισµού
αναστέλλουν είτε διεγείρουν τη
λειτουργία των κυττάρων
δρώντας επ’αυτόν κατά
αυτοκρινή ή παρακρινή τρόπο. Η
έκκρισή τους είναι ταχεία,
βραχείας διαρκείας και
αυτοπεριοριζόµενη. Γενικά οι
κυτταροκίνες δεν αποθηκεύονται
ενδοκυτταρίως ως
προσχησµατισµένα µόρια. Η
σύνθεσή τους είναι αποτέλεσµα
νέας παροδικής γονιδιακής
µεταγραφής, η οποία
επιτυγχάνεται µέσω ασταθών και
βραχύβιων m RNAs.
9
1.3.2 Multiplex PCR.
Κατά την πολυπλεκτική PCR, έχουµε τη
χρήση δύο ή περισσότερων εκκινητών,
έτσι ώστε να πολλαπλασιάζονται
περισσότερα του ένος τµήµατα DNA σε
µια αντίδραση. Πλεονεκτεί από τις
άλλες καθώς είναι πολύ πιο γρήγορη
καθώς παράγει περισσότερα του ενός
προϊόντα. Παρόλο ταύτα, έχει µειωµένη
ευαισθησία συγκριτικά µε µια απλή PCR
λόγω των περισσότερων εκκινητών
10
καθώς επίσης δεν είναι δυνατή η
βελτιστοποίηση καθώς ο σχεδιασµός
τους αποτελεί µια αρκετά πολύπλοκη
διαδικασία.
1.3.2.1 Εφαρµογές στην κλινική
Ανοσολογία.
Πολλοί είναι εκείνοι που χρησιµοποιούν
την multiplex PCR για διαγνωστικους
σκοπους όπως για τον πολλαπλασιασµό
εξωνιών στη Μυική ∆υστροφία
Duchenne καθώς και στη Μυική
∆υστροφία Becker ή για ταυτοποίηση
µολυσµατικών παθογόνων
µικροοργανισµών.
1.3.3. RT-PCR (reverse transciptase).
Στη καθοµιλουµένη είναι γνωστή και ως
αντίστροφη µεταγραφάση PCR.
Περιλαµβάνει αρχικά την αποµόνωση
RNA από κύτταρα, τη σύνθεση c DNA
µε τη βοήθεια του ενζύµου αντίστροφη
µεταγραφάση και έπειτα την εφαρµογή
της PCR. Με βάση τους εκκινητές που
θα χρησιµοποιηθούν , πολλαπλασιάζεται
η επιθυµητή αλληλουχία RNA,
δηµιουργώντας µόρια DNA που φέρουν
τη γενετική πληροφορία.
1.3.3.1 Εφαρµογές στην κλινικά
Ανοσολογία.
Στις εφαργµογές της RT-PCR
περιλαµβάνεται η κλωνοποίηση µορίων
m RNA. Χρησιµοποιείται κυρίως για τη
διάγνωση RNA ιών. Επίσης
χρησιµοποιείται για τον έλεγχο
έκφρασης γονιδίων όπου ελέγχεται η
παρουσία µορίων m RNA. Ευρεία
εφαρµογή έχει και η σύνθεση
επισηµασµένων µορίων c DNA όπου
µπορούν να χρησιµοποιηθούν σαν
ανιχνευτές για µικροσυστοιχίες. Με τον
τρόπο τούτο, ελέγχεται η έκφραση των
γονιδίων σε διαφοροποιηµένα κύτταρα. .
7. [Beggs AH, Koenig M, Boyce FM,
Kunkel LM ]
1.3.4 Hot-Start PCR.
To κύριο µειονέκτηµα της PCR είναι ότι
πολλές φορές παράγονται µη ειδικά
προϊόντα, λόγω της µη ειδικής σύνδεσης
των εκκινητών σε θέσεις του
υποστρώµατος που δεν υπαρχει πλήρης
συµπληρωµατικότητας. Το πρόβληµα
συνδέεται µε την δράση της
θερµοανθεκτικής DNA πολυµεράσης,
κατά την προετοιµασία της αντίδρασης.
Πιο συγκεκριµένα, καθώς η
προετοιµασία της αντίδρασης
πραγµατοποιείται σε θερµοκρασία
αρκετά χαµηλότερη συγκριτικά µε την
επιθυµητή θερµοκρασία αναδιάταξης,
ευνοείται η πρόσδεση των εκκινητών σε
µη πλήρως συµπληρωµατικά τµήµατα
του υποστρώµατος.
Αν και η δράση της DNA-πολυµεράσης
σε αυτές τις θερµοκρασίες είναι
µειωµένη, είναι και υπαρκτή. Έτσι
συνθέτονται τµήµατα DNA, που είναι
µη ειδικά, αλλά φέρουν πλέον στα άκρα
τους ακολουθίες των εκκινητών. Με την
εκκίνηση του θερµοκυκλοποιητή, τούτα
τα τµήµτατα DNA πολλαπλασιάζονται,
έχοντας σαν αποτέλεσµα τη
συσσώρευση µη ειδικών προϊόντων,
βέβαια για να αποφευχθεί αυό είναι η
προσθήκη της DNA-πολυµεράσης. Η
έναρξη της αντίδρασης
πραγµατοποιείται µε την προσθήκη του
ενζύµου σε ψηλή θερµοκρασία
1.3.4.1 Εφαρµογές της Ηοt-start PCR
στην Κλινική Ανοσολογία.
11
Ένώ είναι µια τεχνική που έχει δείξει
θεαµατικά αποτελέσµατα, αλλά το
εγγενές πρόβληµα είναι η προςθήκη
µικρού όγκου αντιδραστηρίου σε θερµό
δίαλυµα. Αυτό µπορεί να οδηγήσει σε
επιµολύνσεις αλλά και προβλήµατα
επαναληψιµότητας στην αντίδραση. Για
την αποφυγή τούτων των προβληµάτων,
τα τελευταία χρόνια έχουν
κυκλοφορήσει ένζυµα που είναι αδρανή
στις «συγκεκριµένες» θερµοκρασίες και
ενεργοποιούνται στην θερµοκρασία
αποδιάταξης. Είναι µια τεχνική που
µπορεί να χρησιµοποιηθεί όπου και η
απλή PCR. Στην πράξη όµως, λόφω του
ελαφρώς αυξηµένου κόστους
εφαρµόζεται κυρίως στις περιπτώσεις
που το δείγµα του ασθενούς µπορεί να
περιέχει µεγάλη ποικιλία ακολουθιών
DNA και άρα µεγάλη πιθανότητα
εµφάνισης παραπροϊόντων.
2. Microarrays.
Γνωστά και ως µικροσυστοιχίες νουκλεϊκών οξέων. Θεωρείται η πιο εξελιγµένη µορφή
της ανάστροφης υβριδοποίησης. Οι ιχνηθέτες τοποθετούνται τοποθετούνται µε
συγκεκριµένη σειρά σε ένα γύαλινο υπόστρωµα, το οποίο έχει υποστεί την κατάλληλη
διεργασία για να γίνει δυνατή η προσκόλληση του DNA. Η υβριδοποίηση
πραγµατοποιείται µε δίαλυµα που περιέχει επισηµασµένο δείγµα, συνήθως c DNA που
συνθέτεται από m RNA µε τη χρησιµοποίηση ενός ενζύµου αντίστροφης µεταγραφάσης.
Να σηµειωθεί ότι κατά την πραγµατοποίηση της c DNA βιβλιοθήκης πραγµατοποιείται
ταυτόχρονα και η επισήµανση.
12
Eφαρµογές
Oι εφαρµογές των microarrays
ποικίλουν ανάλογα το είδος του
δείγµατος. Συνήθως χρησιµοποιούνται
για τη διάγνωση µεταλλαγµένων
γονιδίων καθώς και τον έλεγχο του m
RNA που παράγεται σε κάποιον
συγκεκριµένο κυτταρικό τύπο. Έχει το
βασικό πλεονέκτηµα ότι είναι δυνατή η
ανάλυση της έκφρασης χιλλιάδων
γονιδίων συγχρόνως. Έχει
χρησιµοποιηθεί για ποικίλες
ανοσολογικές µελέτες όπως στην
ωρίµανση, τον µοριακό µηχανισµό της
αλλεργίας, την ενεργοποίηση και τη
διαφοροποίηση την T- και Β-
λεµφοκυττάρων, την σχέση µεταξύ του
φαινότυπου και της γονιδιακής
έκφρασης. 8. [Zhong Xi Yi Jie He Xue
Bao.]
3. In situ hybridization.
Στις παραπάνω τεχνικές το σύνηθες δείγµα είναι DNA που έχει αποµονωθεί από το αίµα
και τα παράγωγά του. Στη συγκεκριµένη µέθοδο χρησιµοποιείται ιστός που έχει παρθεί
από βιοψία ή παρασκεύασµα µεταφασικών χρωµοσωµάτων. Στη συνέχεια, αφού γίνει η
αποµόνωση του DNA, ακολουθεί υβριδισµός µε τον κατάλληλο ιχνηθέτη και ανίχνευση.
Σα στόχος µπορεί να χρησιµοποιηθεί και το RNA αλλά αυτό προϋποθέτει µια
διαφορετική διαδικασία. Έτσι, αυτή η µέθοδος µας δίνει πληροφορίες τόσο για την
ύπαρξη όσο για τη θέση της επιθυµητής αλληλουχίας στο δείγµα. Παράλληλα µε τη
13
κατάλληλη ζώνωση των χρωµοσωµάτων, µπορεί να ανιχνευθούν οι θέσεις των γονιδίων
σε αυτά. Επίσης είναι δυνατή η ανίχνευση m RNA ή άλλων παθογόνων παραγόντων στα
κύτταρα.
3.1 Μέθοδος FISH ( Fluorescent In Situ Hybridization).
Η µέθοδος FISH παραλλαγή της
κλασσικής in situ υβριδοποίησης. Η
µόνη διαφορά είναι ότι περιλαµβάνει
την υβριδοποίηση χρωµοσωµάτων µε
ανιχνευτή που έχει σηµανθεί µε
φθορίζουσα ουσία και την έπειτα
µικροσκόπιση του παρασκευάσµατος µε
το κατάλληλο µικροσκόπιο φθορισµού
14
4. Sequencing.
Sequencing είναι η µέθοδος µε την οποία προσδιορίζεται η ακριβή θέση νουκλεοτιδίων
σε ένα µόριο DNA. Σήµερα αποτελεί µια αυτοµατοποιηµένη και γρήγορη τεχνική όπου
µπορούν να διαβασθεί µε λεπτοµέρεια η σειρά των βάσεων (A, T, G, C) σε έναν κλώνο
DNA.
15
4.1 Μέθοδος Sanger.
Γνωστή και ως µέθοδος τερµατισµού µε
διδεοξυριβονουκλεοτίδια. Αποτελούν
δεοξυριβονουκλεοτίδια, από τα οποία
έχει αφαιρεθεί η 3’ υδροξυλοµάδα της
δεοξυριβόζης έτσι ώστε όταν
ενσωµατωθούν σε µια αλυσίδα DNA δεν
είναι δυνατή η περαιτέρω αποµάκρυνσή
τους. Στη συνέχεια πραγµατοποιούνται
µια σειρά από αντιδράσεις όπου
καθιστούν δυνατή την ανάγνωση της
νουκλεοτιδικής αλυσίδας. Τα
αντιδραστήρια είναι τέσσερα και σε
κάθε ένα πρέπει να υπάρχουν
επισηµασµένοι primers,
συµπληρωµατικοί στην αλληλουχία του
ενός άκρου του µορίου DNA,
τριφωσφορικά δεοξυριβονουκλεοτίδια,
DNA πολυµεράση καθώς και ένα από τα
τέσσερα διδεοξυριβονουκλεοτίδια.
4.1.1 Εφαρµογές στην κλινική
Ανοσολογία.
Με τη συγκεκριµένη µέθοδο οι
επιστήµονες κατάφεραν να
αποκρυπτογραφήσουν οποιαδήποτε
γενετική πληροφορία ανεξαιρέτου τη
βιολογική τους προέλευση. Βέβαια το
δείγµα θα πρέπει να προέρχεται είτε από
κάποιο βακτηριακό κλώνο είτε από
κάποια PCR.
4.2 Νext Generation Sequencing (NGS).
Μια ταχύτερη και ακριβέστερη µέθοδος συγκριτικά µε την Sanger. Παράλληλα τεθήκε
ζήτηµα για το υψηλό κόστος της συγκεκριµένης µεθόδου καθώς αποτελούσε πολυτέλεια
λίγων εργαστηριακών µονάδων καθώς και για το µέγεθος του DNA
16
4.2.1 Ion Semiconductor Sequencing.
Αποτελεί µια µέθοδο που βασίζεται στην
ανίχνευση ιόντων υδρογόνου που
απελευθερώνονται κατά τον
πολυµερισµό του DNA. Έτσι διαβάζει
το DNA την ώρα που συνθέτεται. Σε
µια πλάκα όπου υπάρχει το προς
ανάλυση DNA εκχυλίζεται ένας
µοναδικός τύπος νουκλεοτιδίου. Αν το
εισαγόµενο νουκλεοτίδιο είναι
συµπληρωµατικό προς το πρώτο
νουκλεοτίδιο, ενσωµατώνεται στον
αυξανόµενο συµπληρωµατικό κλώνο.
Αυτό προκαλεί την απελευθέρωση
ιόντων υδρογόνου, ο οποίος πυροδοτεί
έναν εξαιρετικά ευάισθητο αισθητήρα
που ο οποίος στη συνέχεια υποδεικνύει
ότι έγινε η αντιδραση. Θεωρείται µια
γρηγορή και σχετικά οικονοµική
µέθοδος, η οποία µπορεί να αξιοποιηθεί
από πολλά εργαστήρια, αλλα συγκριτικά
µε τις παλαιότερες τεχνικές sequencing
δε προσφέρει κάτι παραπάνω στην
Κλινική Ανοσολογία.
4.2.2 Partial Genome Sequencing.
Πρόκειται για µια µέθοδο που
χρησιµοποιείται αρκετά συχνά για
επιδηµιολογικές έρευνες. Αποτελεί µια
τεχνική sequencing της οποίας η
ακρίβεια αυξάνεται µε όταν αυξάνεται
και το µέγεθος του γονιδιώµατος που
πρέπει να διαβάσει. Ερευνά τις
φυλογενετικές σχέσεις µεταξύ των
µικροοργανισµών.
4.2.3 Pyrosequencing.
Η τεχνική συνίσταται στην προσθήκη
ενός νουκλεοτιδίου παρουσία DNA
πολυµεράσης και των κατάλληλων
διαλυµάτων στο υπό ανάγνωση τµήµα
DNA, στο οποίο έχει συνδεθεί
εκκινητής. Αν το νουκλεοτίδιο
ενσωµατωθεί, εκπέµπεται φθορισµός
από την διάσπαση του πυροφωσφορικού
που ανιχνεύεται. Έχει σηµαντικό
πλεονέκτηµα της αυτοµατοποίησης και
της παράλληλης επεξεργασίας σε
µεγαλύτερο βαθµό.
5. Hybridization. Μια τεχνική µε την οποία είναι δυνατόν να αναγνωριστούν µόρια νουκλεϊκών οξέων µε
συγκεκριµένη αλληλουχία βάσεων που περιέχονται σε ένα µείγµα ετερογενών µορίων το
οποίο αποκαλείται DNA ή RNA στόχος. Αυτό γίνεται χρησιµοποιώντας µόρια
νουκλεϊκών οξέων που φέρουν την επιθυµητή ακολουθία βάσεων και καλούνται
ιχνηθέτες. Αφού πραγµατοποιήθέι επισήµανση του ιχνηθέτη, ακολουθεί αποδιάταξη των
νουκλεϊκών οξέων του δείγµατος και του ιχνηθέτη. Στη συνέχεια το δίαλυµα µε τον
17
ιχνηθέτη αναµειγνύεται µε το δείγµα και επωάζεται σε κατάλληλες συνθήκες έτσι ώστε
να πραγµατοποιηθεί υβριδοποίηση. Τέλος, ανιχνέυονται τα υβριδικά µόρια –αν
υπάρχουν- και εξετάζονται. Οι διασηµότερες εφαρµογές τούτης της τεχνικής είναι µέσω
του Dot Blot, Southern Blot, Nothern Blot και Ιn Situ Hybridization –κάτι που
αναλύθηκε και παραπάνω. Πλέον, δε χρησιµοποιούνται σε µεγάλο βαθµό τούτες οι
τεχνικές καθώς έχουν αντικατασταθεί µε την εφαρµογή της PCR, βέβαια σε ορισµένες
περιπτώσεις θεωρούνται αναντικατάστατες. Το κύριο µειωνέκτηµά τους είναι ο σχετικά
µεγάλος χρόνος για τη διεξαγωγή τους καθώς και το µεγάλο κόστος που απαιτούν.
5.1 Dot Blot.
H επιθυµητή αλληλουία DNA
αποδιατάσσεται και προσδένεται σε ένα
ειδικό φίλτρο. Στη συνέχεια ακολουθεί
υβριδοποίηση µε τον επισηµασµένο
ιχνηθέτη. Με πλύσιµο του φίλτρου,
αποµακρύνεται η περίσσεια του
ιχνηθέτη. Ακολουθεί ανίχνευση για να
διαπιστωθεί αν έχει συνδεθεί ο
ιχνηθέτης µε κάποια συµπληρωµατική
ακολουθία του δείγµατος. Να σηµειωθεί
στο σηµείο αυτό ότι σε τέτοιου είδους
πειράµατα είναι αναγκαία η ύπαρξη ένός
θετικού και ενός αρνητικού µάρτυρα. Ο
πρώτος αποτελείται από ένα δείγµα που
είναι συµπληρωµατικό προς την
αλληλουχία του ιχνηθέτη. Ο αρνητικός
µάρτυρας συνήθως είναι µια κενή θέση,
αλλά προτιµότερο είναι να περιέχει µη
συµπληρωµατικό προς τον ιχνηθέτη
DNA. Θεωρείται η απλούστερη
προσέγγιση του υβριδισµού.
5.1.1 Εφαρµογές στην Κλινική
Ανοσολογία.
Η µέθοδος τούτη χρησιµοποιείται για τη
διάγνωση παθογόνων παραγόντων.
Αποµονώνεται δείγµα από τον ασθενή
και στη συνέχεια ακολουθεί dot blot µε
ιχνηθέτη κάποιο τµήµα γενετικού υλικού
του παθογόνου παράγοντα που προκαλεί
την ίδια συµπτωµατολογία αυτή που
φέρει ο ασθενής.
5.2 Ανάστροφη Υβριδοποίηση
Η συνιθέστερη µέθοδος υβριδοποίησης τα τελευταία χρόνια. Στη προκείµενη περίπτωση,
µη επισηµασµένοι ιχνηθέτες προσκωλλόνται στη µεµβράνη, ενώ επισηµαίνεται το προς
εξέταση νουκλεϊκό οξύ. Στη συνέχεια, µετά την υβριδοποίηση, διαπιστώνεται αν το
DNA στόχος φέρει κάποια ακολουθία βάσεων που είναι συµπληρωµατική µε κάποιον
από τους ιχνηθέτες. Με τούτο τον τρόπο, µε ένα πείραµα ελέγχεται η παρουσία πολλών
ακολουθιών βάσεων στο δείγµα, ενώ µε τις προσεγγίσεις που θα αναλυθούν σε τούτο το
18
κεφάλαιο θα χρειάζονταν περισσότερα του ενός πειραµάτων. Η ανάστροφη
υβριδοποίηση χρησιµοποιεί την ίδια αρχή µε τις µικροσυστοιχίες (microarrays).
5.3 Southern Blot.
Το DNA του ασθενούς
ηλεκτροφορείται, αποδιατάσσεται σε
αλκαλικό διάλυµα και στη συνέχεια
µεταφέρεται σε φίλτρο χρησιµοποιώντας
τη ροή ρυθµιστικού διαλύµατος. Το
ρυθµιστικό διάλυµα κινείται ανοδικά
λόγω των τριχοειδών φαινοµένων. Το
αποτέλεσµα τούτης της αντίδρασης είναι
ο σχηµατισµός ενός κατοπτρικού
αντιγράφου της ηλεκτροφόρησης στο
φίλτρο. Ακολουθεί ο υβριδισµός και η
ανίχνευση, όπως και στο dot blot. Με τη
19
προκείµενη µέθοδο εκτός από τη
συµπληρωµατικότητα του δείγµατος µε
τον ιχνηθέτη, εκτιµάται και το µέγεθος
του µορίου DNA που είναι
συµπληρωµατικό µε τον ιχνηθέτη. Η
εκτίµηση του µεγέθους
πραγµατοποιείται µε σύγκριση µε ένα
µάρτυρα, γνωστού µοριακού βάρους.
Στη πράξη όµως, όταν πρόκειται για
µόρια DNA µεγάλου µεγέθους,
προηγείται πέψη από περιοριστική
ενδονουκλεάση για να διαχωριστούν
στην ηλεκτροφόρηση.
5.4 Northern Blot.
Αποτελεί µια παρόµοια τεχνική µε το
Southern Blot µε την κύρια διαφορά ότι
το νουκλεϊκό οξύ στόχος που
προσδένεται στο φίλτρο είναι RNA. Με
το Northern Blot, µπορεί να µελετηθεί η
έκφραση κάποιου γονιδίου σε
διαφορετικούς ιστούς. Αφού
αποµονωθεί το m RNA από τον κάθε
ιστό, ηλεκτροφορείται –για τον κάθε
ιστό ξεχωριστά- και ακολουθεί
20
υβριδοποίηση µε τον ιχνηθέτη και το
προς εξέταση γονίδιο. Μπορεί να
διαπιστωθεί ο βαθµός έκφρασης αλλά
και το µέγεθος των µορίων m RNA, που
παράγονται. Αυτό συµβαίνει διότι κάθε
µόριο m RNA κωδικοποιεί µια µόνο
πρωτεϊνη. ∆εν υπάρχουν γνωστές
περιπτώσεις, παραγωγής περισσότερων
από τη µία πολυπεπτιδική αλυσίδα από
ένα µόνο µόριο m RNA. Βεβαίως, η
ρύθµιση του κάθε γονιδίου γίνεται
ξεχωριστά, καθώς το κάθε ένα φέρει τον
δικό του υποκινητή.
6. c DNA.
6.1 Αρχή της c DNA βιβλιοθήκης.
Για την κατασκευή µιας c DNA
βιβλιοθήκης, απαιτείται η αποµόνωση
ώριµου m RNA από τα κύτταρα. η
αποµόνωση ώριµου m RNA
πραγµατοποιείται µε αποµόνωση ολικού
RNA. Από το ολικό RNA
αποµονώνονται τα µόρια m RNA,
δεσµευόµενα µε στήλη µε
21
ολιγονουκλεοτίδια δεοξυθυµίνης (oligo-
dT). Μετά τη σύνθεση
συµπληρωµατικών αλυσίδων DNA
(complementary DNA), µε το ένζυµο
αντρίστροφη µεταγραφάση και τον
τελικό σχηµατισµό δίκλωνων µορίων
DNA, αυτά ενσωµατώνονται στον
κατάλληλο φορέα κλωνοποίησης. Μετά
τον µετασχηµατισµό και τον
πολλαπλασιασµό των κυττάρων
σχηµατίζονται κλώνοι, το άνθροισµα
των οποίον συγκροτεί την c DNA
βιβλιοθήκη. Να σηµειωθεί στο σηµείο
αυτό ότι για την κατασκεύη µιας c DNA
βιβλιοθήκης, µπορεί να χρησιµοποιηθεί
οποιοδήποτε κύτταρο-ξενιστής ως
φορέας κλωνοποίησης. Τα συνιθέστερα
είναι τα πλασµίδια, λόγω του ότι τα
µόρια c DNA έχουν κατά κανόνα µικρό
µέγεθος και η κλωνοπίησή τους είναι
απλούστερη στα πλασµίδια. Στη
συνέχεια ανιχνεύεται ο επιθυµητός
κλώνος και κατόπιν πολλαπλασιάζεται
το βακτήριο-ξενιστής που φέρει τον
προκέιµενο κλώνο σε καλλιέργεια, ώστε
να παραχθεί η επιθυµητή ποσότητα του
προϊόντος. Τα µόρια c DNA που
κλωνοποιούνται συνιστούν ολόκληρα
γονίδια, στα οποία δε περιέχονται
εσώνια. Αυτό έχει σαν αποτέλεσµα τη
δυνατότητα παραγωγής της επιθυµητής-
κωδικοποιούσας πρωτεϊνης στα
βακτήρια, καθώς τα βακτήρια δε φέρουν
µηχανισµούς ωρίµανσης. Αυτό βέβαια
δεν ισχύει αν το τελικό προϊόν δέχεται
τροποποιήσεις που δε µπορούν να
πραγµατοποιηθούν στα βακτήρια. Τα
κύτταρα που θα χρησιµοποιηθούν για
την αποµόνωση του m RNA θα πρέπει
να µεταγράφουν το επιθυµητό γονίδιο,
ενώ δεν είναι δυνατή η κλωνοποίηση
τµηµάτων του γενετικού υλικού που δε
µεταγράφονται.
6.2 Εφαρµογές στην Κλινική Ανοσολογία.
Πέρα από την παραγωγή ουσιών, η c
DNA βιβλιοθήκη, µπορεί να επιτελέσει
διαγνωστικούς σκοπούς συνδιαστικά µε
κάποια άλλη µέθοδο όπως τις
µικροσυστοιχίες (microarrays) ή την
αλυσηδωτή αντίδραση της
πολυµεράσης. Πάρα ταύτα, µέσω της
παραγωγής ουσιώνµπορεί να ανιχνεύση
22
τυχόν λανθασµένη έκφραση ενός
γονιδίου.
7. Μultiplex Ligation-Dependent Probe
Amplification
(MLPA)
7.1 Αρχή της MLPA Αποτελεί µια παραλλαγή της Multiplex
PCR- µέθοδος που αναλύθηκαε και
23
παραπάνω- η οποία επιτρέπει στους
ποικίλους στόχους να
πολλαπλασιάζονται από ένα µόνο ζεύγος
εκκινητών. Κάθε ιχνηθέτης, απαρτίζεται
από δύο ολιγονουκλεοτίδια. Ο ένας από
τους δύο ιχνηθέτες, διαθέται την
αλληλουχία που αναγνωρίζεται από τον
εκκινητή, ενώ ο άλλος την αλληλουχία
που αναγνωρίζεται από τον εκκινητή
στο αντίθετο άκρο. Μόνο όταν και οι
δύο ιχνηθέτες υβριδοποιηθούν µε την
αλληλουχία στόχο, µπορούν να δεθούν
σε έναν ολοκληρωµένο ιχνηθέτη. Το
πλεονέκτηµα του να διαχωριστεί ο
ιχνηθέτης σε δύο µονόκλωνα µέρη είναι
ότι µόνο τα νουκλεοτίδια που έχουν
υβριδοποιηθεί και όχι τα ασύνδετα
κοµµάτια θα πολλαπλασιαστούν. Σε
περίπτωση που δε διαχωριστεί ο
ιχνηθέτης, η αλληλουχία του εκκινητή
και στα δύο άκρα, θα πολλαπλασιάσει
τον ιχνηθέτη ανεξαιρέτως τον υβριδισµό
µε την επιθηµυτή αλληλουχία DNA,
έτσι το παραγόµενο προϊον δε θα είναι
όµοιο µε τις επιθυµητές θέσεις στόχους
στο δείγµα του ασθενούς.
Κάθε ολοκληρωµένος ιχνηθέτης, έχει
µοναδικό µέγεθος έτσι ώστε οι κλώνοι
να διαχωριστούν και να ταυτοποιηθούν
µε ηλεκτροφόρηση. Κάθε κλώνος,
εκπέµπει µια φθορίζουσα ουσία η οποία
µπορεί να διαβαστεί µε τον κατάλληλο
sequencer.
Τα τελευταία χρόνια και κυρίως στον κλάδο της Κλινικής Ανοσολογίας, είναι συχνή η
MLPA εξωνίων αλλά πραγµατοποιείται κατά κύριο λόγο συνδιαστικά µε την αλυσιδωτή
αντίδραση πολυµεράσης.
ΜLPA ανάλυση της µυασθενείας Duchenne (DMD)
7.2 Εφαρµογές στην Κλινική Ανοσολογία.
Η συγκεκριµένη µέθοδος έχει πολλές
εφαρµογές στον χώρο της Κλινικής
Ανοσολογίας. 9. [ Schouten JP,
McElgunn CJ, Waaijer R, Zwijnenburg
D, Diepvens F, Pals G (2002). ]Ο κύριος
της ρόλος είναι η ανίχνευση τυχόν
διαγραφών, διπλασιασµού και
µετατόπιση χρωµοσωµικών τµηµάτων,
σε γενετικές παθήσεις καθώς και
δίαφορους πολυµορφισµούς.
24
25
26
8. Γονιδιωµατική Βιβλιοθήκη.
Η γονιδιωµατική βιβλιοθήκη οργανισµού είναι ένα σύνολο βακτηριακών κλώνων που
περιέχουν τµήµατα του γενετικού υλικού ενός οργανισµού, στη µορφή
ανασυνδιασµένου DNA. Στο σύνολό του όλα τα τµήµατα γενετικού υλικού
αποτελούν το γονιδίωµα του οργανισµού.
8.1 Αρχή της γονιδιωµατικής βιβλιοθήκης.
Σκοπός της παρασκευής µιας
γονιδιωµατικής βιβλιοθήκης είναι η
εύρεση ενός συγκεκριµένου
βακτηριακού κλώνου που περιέχει
ένα τµήµα DNA που ενδιαφέρει,
ώστε να παραχθεί το DNA σε
µεγάλη ποσότητα ή να παραχθεί η
πρωτεϊνη που πιθανά κωδικοποιεί το
τµήµα DNA σε µεγάλη ποσότητα.
Για την Παρασκευή γονιδιωµατικής
βιβλιοθήκης αποµονώνεται DNA
από τον οργανισµό και πέψη µε µια
περιοριστική ενδονουκλεάση. Τα
τµήµατα που προκύπτουν
σχηµατίζουν ανασυνδιασµένο DNA
µε κατάλληλο φορέα κλωνοποιήσης
και εισάγονται σε βακτήρια. Ο
πολλαπλασιασµός των βακτηρίων
δηµιουργεί κλώνους. Το σύνολο
αυτώ των βακτηριακών κλώνων
αποτελούν τη γονιδιωµατική
βιβλιοθήκη. Στη θεωρία κάθε τµήµα
του γονιδιώµατος υπάρχει σε ένα
τουλάχιστον βακτηριακό κλώνο
στην µορφή ανασυνδιασµένου
πλασµιδίου. Αυτό δεν ισχύει στην
πράξη, καθώς πολλά τµήµατα του
γονιδιώµατος είναι αρκετά µεγάλα
σε µέγεθος, ώστε δεν είναι δυνατή η
εισαγωγή τους σε κάποιο βακτήριο.
Όταν χρησιµοποιείται σαν φορέας
κλωνοποίησης ένα πλασµίδιο τότε το
µέσο µέγεθος των τµηµάτων DNA
του γονιδιώµατος που φέρει ο κάθε
κλώνος είναι περίπου 5.000-10.000
ζεύγη βάσεων.
27
8.2 Εφαρµογές στην Κλινική Ανοσολογία.
Η χρησιµότητα µιας γονιδιωµατικής
βιβλιοθήκης έγκειται στην εύρεση
ενός συγκεκριµένου κλώνου
βακτηρίων, που περιέχει ένα τµήµα
DNA του οργανισµού, το οποίο είναι
επιθυµητό να µελετηθεί ή να
χρησιµοποιηθεί µε κάποιο άλλο
τρόπο.
Για να βρεθεί ο επιθυµητός κλώνος
χρησιµοποιούνται κατ’αρχήν
στέρεες καλλιέργειες, αφού στις
υγρές είναι αδύνατος ο εντοπισµός
συγκεκριµένου βακτηρίου. Τα
βακτήρια απλώνονται στην
επιφάνεια του στερεού θρεπτικού
υλικού και αφού σχηµατίσουν
αποικίες, κάθε αποικία εξετάζεται
για την ύπαρξη του επιθυµητού
τµήµατος DNA.
Ο τρόπος µε τον οποίο θα
αναζητηθεί η προς εξέτασην αποικία
ποικίλει και εξαρτάται από τις
πληροφορίες που είναι γνωστές για
το συγκεκριµένο τµήµα DNA, ή το
προϊόν που κωδικοποιεί, καθώς και
από τις γνώσεις του ερευνητή και τις
τεχνικές δυνατότητες του
εργαστηρίου. Η συνιθέστερη
µέθοδος είναι η υβριδοποίηση µε
επισηµασµένο ιχνηθέτη. Η διακασία
αποµόνωσης του πλασµιδιακού
DNA σε γενικές γραµµές µοιάζει µε
τη µέθοδο αποµόνωσης DNA από
κύτταρα. Καθώς τα πλασµίδια έχουν
σχετικά µικρό µέγεθος και είναι
υπερελικωµένα ακολουθούνται
κάποιες ιδιαίτερες διαδικασίες που
εκµεταλλεύονται αυτά τα
χαρακτηριστικά, ώστε να επιτευχθεί
ο διαχωρισµός από το γονιδίωµα των
βακτηρίων.
Για την παραγωγή πρωτεϊνης που
µπορεί να κωδικοποιείται από το
κλωνοποιηµένο τµήµα DNA, θα
πρέπει στο πλασµίδιο που θα
χρησιµοποιηθεί σαν φορέας
κλωνοποίησης να υπάρχει κάποιος
υποκινητής πριν τη θέση που κόβει η
περιοριστική ενδονουκλεάση. Αυτό
οδηγεί στην µεταγραφή και
µετάφραση του γονιδίου, µε
συνεπακόλουθη παραγωγή
πρωτεϊνης.
28
8.3 Γιατί δε χρησιµοποιείται τόσο συχνα;
Κατα την κλωνοποίηση γονιδίων σε
γονιδιωµατική βιβλιοθήκη, µπορεί
να παρουσιαστούν αρκετά
προβλήµατα. Το πρόβληµα του
µεγάλου µεγέθους των
ευκαρυωτικων γονιδίων λύνεται
µερικώς µε την χρησιµοποίηση
βακτηριοφάγων λ, αλλά υπάρχουν
γονίδια που φτάνουν σε µέγεθος και
τα 10.000 ζεύγη βάσεων.
Αλλό πιθανό πρόβληµα, αποτελεί η
χρησιµοποίηση των περιοριστικών
ενδονουκλεάσων που µπορεί να
κόβουν σε πολλά τµήµατα το
επιθυµητό γονίδιο, ώστε τα τµήµατα
που το αποτελούν να βρίσκονται σε
περισσότερους από έναν κλώνο. Αν
ο σκοπός είναι αποκλειστικά η
µελέτη του γονιδίου, τότε αυτό
µπορεί να µην συνιστά πρόβληµα ,
αλλά σε τέτοιες περιπτώσεις είναι
αδύνατη η παραγωγή της πρωτεϊνης
που κωδικοποιεί. Συνήθως,
χρησιµοποιείται διαφορετική
περιοριστική ενδονουκλεάση, για
την έψη του γονιδιώµατος.
∆υστυχώς στην γονιδιωµατική
βιβλιοθήκη είναι πολύ µεγάλος ο
αριθµός των κλώνων που πρέπει να
ερευνηθούν ώστε να βρεθεί ο
επιθυµητός.
Το κυριότερο µειονέκτηµα της
συγκεκριµένης τεχνικής είναι το
υψηλό κόστος.
29
9. Μοριακές διαγνωστικές και Βιοπληροφορική.
Όλες οι παραπάνω τεχνικές δε θα
οδηγούσαν σε κάποιο λογικό
αποτέλεσµα αν δεν υπήρχαν τα ειδικά
προγράµµατα στα οποία έχει καταγραφεί
και ταξινοµηθει ο τεράστιος αριθµός
παραλλαγών που εµφανίζονται στην
αλληλουχία του γονιδιώµατός µας. Το
διεθνές πρόγραµµα HapMap και η
εταιρεία Perlegen Sciences έχουν
εντοπίσει και ταξινοµήσει περίπου δέκα
εκατοµµύρια ανθρώπινους SNP σε
τέσσερις διαφορετικούς πληθυσµού.
Πολλοί από αυτούς τους
πολυµορφισµούς θεωρείται ότι
συσχετίζονται µε κοινά πολυγονιδιακά
γνωρίσµατα µεταξύ των οποίο και οι
ασθένειες. Θα ήτο αδιανόητο και
πρακτικά αδύνατο να εξεταστεί κάθε
SNP για την πιθανή συσχέτισή του µε
µια ασθένεια. Για το λόγο αυτό, οι
σχετικές µελέτες γίνονται σε επίπεδο
απλότυπων – µια οµάδα αλληλόµορφων
που ανήκουν στο ίδιο χρωµόσωµα. Oι
SNP, που βρίσκονται ο ένας δίπλα στον
άλλο σε ένα χρωµόσωµα, εφόσον δεν
απέχουν πολύ µεταξύ τους, τείνουν να
µην αναδιατάσσονται από τους
διασκελισµούς που λαµβάνουν χώρα
στη µείωση και έτσι να κληρονοµούνται
µαζί.
Οι ερευνητές στο HapMap αναζητούν
στο γονιδίωµα περιοχές µε ανισορροπία
σύνδεσης ( linkage disequilibrium)
δηλαδή συγκεκριµένους συνδιασµούς
αλληλόµορφων η γειτωνικών
πολυµορφικών δείκτες που τείνουν να
συναντώνται µαζί. Στην περίπτωση
παθολογικών αλληλόµορφων η
ανισορροπία σύνδεσης θεωρείται ότι
οφείλεται στο γεγονός πως η
πλειονότητα των ατόµων ενός
πληθυσµού που εµφανίζουν κάποια
ασθένεια προέρχεται από ένα
συγκεκριµένο «πρόγονο-ιδρυτή». Η
κατάσταση αυτή αναφέρεται ως
φαινόµενο του ιδρυτή. Ο ασθενής έχει
κληρονοµήσει το χρωµόσωµα του
προγόνου-ιδρυτή, το οποίο φέρει το
αλληλόµορφο που προκαλεί την
ασθένεια ή προδιαθέτει γι’αυτή. Οι
διασκελισµοί που συνέβησαν στο
γονιδίωµα, µε την πάροδο των γενεών,
δεν ανασυνδύασαν το αλληλόµορφο
αυτό µε τα αλληλόµορφα των
γειτονικών γενετικών τόπων. Κατά
συνέπεια ο απλότυπος του προγόνου-
ιδρυτή στην περιοχή που σχετίζεται µε
την ασθένεια είναι πιο συχνός στους
ασθενείς είναι πιο συχνός στους
ασθενείς από το αναµενόµενο.
30
10. Oι SNP ως διαγνωστικό εργαλείο.
Αφού εντοπιστεί και χαρακτηριστεί το
γονίδιο που ευθύνεται για µια
κληρονοµούµενη διαταραχή ή
προδιαθέτει γι’αυτή, είναι δυνατή η
ανάπτυξη µοριακών τέστ για τη
διάγνωσή της (ή για τη διάγνωση της
προδιάθεσης προς αυτή). Το 1992,
µπορούσαν να διαγνώσουν πάνω από
200 διαταραχές µε την χρήση µεθόδων
που βασίζονται στην ανάλυση του DNA.
Σήµερα, υπάρχουν µοριακά τέστ που
βασίζονται σε πολλές διαφορετικές
τεχνικές για τεχνική που θα επιλεγεί
διάγνωση περισσότερων από 2.000
γενετικών διαταραχών. Η τεχνική που
θα επιλεγεί κάθε φορά εξαρτάται από τα
χαρακτηριστικά της ασθένειας: τον
αριθµό και τον τύπο των µεταλλαγών
που εµπλέκονται, τη συχνότητα τους
στην έθνική οµάδα στην οποία ανήκει ο
ασθενής και τις επιπτώσεις τους στην
πρωτεϊνη που κωδικοποιεί το γονίδιο.
Όµως οι αναλύσεις αυτές είναι
χρονοβόρες και δαπανηρές. Για να
µπορέσουν να αξιοποιήσουν τις
πληροφορίες που τους παρέχει το
Πρόγραµµα του Ανθρώπινου
Γονιδιώµατος, οι ερευνητές χρειάστηκαν
νέες µεθόδους που θα τους επέτρεπαν να
εντοπίζουν µαζικά και γρήγορα τις
παθολογικές µεταλλαγές. Αναπτύχθηκαν
λοιπόν τρείς τεχνικές που µπορεί να
αποδειχθούν πολύτιµα διαγνωστικά
εργαλεία: η ανίχνευση αταίριαστων
ζευγών βάσεων σε µικροσυστοιχίες, η
επέκταση κατά µια βάση και η
αλληλοµορφο- ειδική επέκταση
εκκινητή.
Η ανίχνευση αταίριαστων ζευγών
βάσεων σε µικροσυστοιχίες µπορεί να
χρησιµοποιηθεί για την ταυτόχρονη
γονοτυπική ανάλυση µέχρι και 100.000
µεταλλαγών. Η µέθοδος όµως αυτή δεν
µπορεί να ανιχνεύσει όλες τις
µεταλλαγές διότι βασίζεται στην
απευθείας, υβριδοποίηση του
γονιδιωµατικού DNA του ασθενούς στα
ολιγονουκλεοτίδια µιας
µικροσυστοιχίας. Κατά την
υβριδοποίηση, η σταθερότητα της
πρόσδεσης του DNA του ασθενούς στα
ολιγονουκλεοτίδια της συστοιχίας
εξαρτάται σε µεγάλο βαθµό από την
αλληλουχία που περιβάλλει την
πολυµορφική θέση. Σε ορισµένες
περιπτώσεις, η αλληλουχία γύρω από
την πολυµορφική θέση είναι τέτοια ώστε
να καθιστάται αδύνατη η γονοτύπηση
του SNP µε τη µέθοδο αυτή, γεγονός
που αποτελεί σοβαρό µειονέκτηµα.
31
References: 1. [Μethods in Molecular Biology Volume 226. PCR protocols Second Edition.
(2003).John M.S Bartlett and David Stirling (Editors) Humana Press Inc. Totowa,
NJ.]
2. [Beggs AH, Koenig M, Boyce FM, Kunkel LM. Detection of 98% of DMD/BMD
gene deletions by polymerase chain reaction. Hum Genet. 1990;86:45–8.
[PubMed] ]
3. [Department of Microbiology and Molecular Cell Biology, Eastern Virginia
Medical School, Norfolk, VA 23507, USA. [email protected]].
4. [Stordeur P - Monitoring the immune response using real-time PCR [PubMed] ].
5. [Bacher U, Schnittger S, Haferlach C, Haferlach T, Molecular diagnostics in acute
leukemias, [PubMed] ] .
6. [Patrick Stordeur, Lionel F Poulin, Ligia Craciun, Ling Zhou, Liliane Schandené,
Aurore de Lavareille, Stanislas Goriely, Michel Goldman - “Cytokine mRNA
quantification by real-time PCR” [J. Immunol. Methods 259 (2002) 55–64].
7. [Beggs AH, Koenig M, Boyce FM, Kunkel LM. Detection of 98% of
DMD/BMD gene deletions by polymerase chain reaction. Hum Genet.
1990;86:45–8. [PubMed] ]
8. [Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao.- Application of DNA microarray technology in
immunological research and its inspiration to researches on raditional Chinese
medicine, [PubMed]]
9. [ Schouten JP, McElgunn CJ, Waaijer R, Zwijnenburg D, Diepvens F, Pals G
(2002). "Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex
ligation-dependent probe amplification".]
10. [Janssen B, Hartmann C, Scholz V, Jauch A, Zschocke J- MLPA analysis for the
detection of deletions, duplications and complex rearrangements in the dystrophin
gene: potential and pitfalls.]
11. [James D. Watson, Amy A. Caudy, Richard M. Myers, Jan A. Witkowski,
“Ανασυνδιασµένο DNA, Γονίδια και γονιδιώµατα- µια συνοπτική παρουσίαση,
3η έκδοση”.]
32
12. [James D. Watson, Tania A. Baker, Stephen P. Bell, Alexander Gann, Michael
Levine and Richard Losick. Molecular Biology of the Gene. Cold Spring Harbor
Laboratory Press, ISBN 0-321-22368-3.]
13. .[Arthur M. Lesk, Introduction to Bioinformatics (2002). Oxford University Press
Inc., New York, ISBN (Pbk)0 19 925196 7]
14. [ Kenneth M. Weiss and Anne V. Buchanan. Genetics and the logic of evolution.
John Wiley & Sons Inc (2004), Hoboken, New Jersey. ISBN 0-471-23805-8.]
15. [Role of molecular diagnostics in the management of infectious disease
emergencies. Krishna NK, Cunnion KM, Department of Microbiology and
Molecular Cell Biology, Eastern Virginia Medical School, Norfolk, VA 23507,
USA. [email protected]]
16. ["The Pace and Proliferation of Biological Technologies" Robert Carlson.
Biosecurity and Bioterrorism: Biodefense Strategy, Practice, and Science.
September 2003, 1(3): 203-214. doi:10.1089/153871303769201851]
17. [Bartlett, J. M. S.; Stirling, D. (2003). "A Short History of the Polymerase Chain
Reaction". PCR Protocols 226. pp. 3–6]
18. [Saiki, R.; Scharf, S.; Faloona, F.; Mullis, K.; Horn, G.; Erlich, H.; Arnheim, N.
(1985). "Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and
restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia". Science 230]
19. [Saiki, R.; Gelfand, D.; Stoffel, S.; Scharf, S.; Higuchi, R.; Horn, G.; Mullis, K.;
Erlich, H. (1988). "Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a
thermostable DNA polymerase". Science 239]
20. [Cheng, S.; Fockler, C.; Barnes, W. M.; Higuchi, R. (1994). "Effective
Amplification of Long Targets from Cloned Inserts and Human Genomic DNA"
Proceedings of the National Academy of Sciences 91]
33
21. [ R.L Nussbaum, R.R McInnes, H.F Willard, Ιατρική Γενετική, Thompson &
Thompson.]
22. [Aναστάσιος Ε. Γερµένης, Ιατρική Ανοσολογία, Εκδόσεις Παπαζήση]
23. [E. Zietkiewicz, A. Rafalski, and D. Labuda (1994). "Genome fingerprinting by
simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification".
Genomics 20]
24. [Ochman H, Gerber AS, Hartl DL (1988). "Genetic Applications of an Inverse
Polymerase Chain Reaction" Genetics 120]
34