Zeitschrift fiir Zellforschung 66, 197--199 (1965)

Aus dem Pathologischen Institut der Humboldt-Universit~t Berlin, dem Rudolf-Virchow- ttaus der Charit6 (Direktor: Prof. Dr. L. H. KETTLER)

ZUM V E R H A L T E N D E R M I T O C H O N D R I E N DES E N D O T H E L S D E R A O R T A U N D D E R A R T E R I A PULMONALIS

IN D E R G E W E B E K U L T U R

Von

RUDOLF MEYER und HANs ALOIS HACKENSELLNER $

Mit 2 Textabbfldungen

(Eingegangen am 21. Dezember 196~)

Unte r suchungen an mi t Coriphosphin f luorochromierten Endothelschabepr~- pa ra ten der Aorta und der Arter ia pulmonal is e rbrachten e inen u m etwa 40% h6heren Mitochondrienbesatz fiir das Pulmonalendothe l (HAcKENS]~LLN]~R und MEY]~R 1962). Die Arbeitshypothese, da2 im GefaBendothel zwischen der Mito- chondrienzahl pro Zelle u n d dem Sauerstoffpart ia ldruck des vorbeffliel3enden Blutes ein reziprokes Verhifltnis besteht , konnte durch Vergleich der am Endothe l der A. m a m m a r i a in terna , der V. m a m m a r i a in te rna und des Ductus thoracicus e rhobenen Befunde gesti i tzt werden (HuYoFF und HACKENSELLNER, im Druck).

I n der vorl iegenden Arbei t wird fiber das Verhal ten der Mitochondrien im Endothe l tier Aor ta u n d der Arter ia pulmonal is in der Gewebekultur , d. h. un te r einheit l ichen Milieubedingungen, berichtet.

Material und Methodik Als Ausgangsmaterial dienten Aorta und A. pulmon~lis yon 60 Ki~lbern. Das durch

Sebaben gewonnene Endothel wurdo in steriler, phosphatgepufferter Salzl6sung (PBS-L6sung) aufgefangen, durch Zentrifugieren bei 500 U/min fiber 3 min sedimentiert und nach Entfomen des l~berstandes in 0,25%iger Trypsinl6sung (VEB Berlin-Chemie) aufgeschwemmt. Unter st~ndigem Schfitteln lio0en wir die Fermentl6sung 3--5 min einwirken. Dann wurdo die glei- che Menge PBS zugegeben und erneut (unter don oben angegebonen Bedingungen) zentrifu- giert. Der Bodensatz - - woitgehend isolierte Endothelzellon - - wurde im dofinitiven N~hr- medium aufgenommon. Dieses bestand aus Eagleschem Medium (Institut fiir Seuehonschutz, Berlin-Wois gol6st in Hanksscher L6sung, und aus 10 % inaktiviertem K~lberserum; dom N~hrmedium wurde Penicillin und Streptomycin (200 IE bzw. 0,2 mg/ml) zugesetzt. Die durch kurzes Aufschfitteln erhaltene Endothelzellsusponsion wurde nun in Petrischalen einge- braeht, deren Boden mit Deekgl~schen ausgelegt worden war. Die Kultivierung erfo]gte bei 370 C, ohne weiteres Ffittern oder Umsetzen bis zum Versuehsende.

Am 1., 2 , 3, 4., 5. und 6. Kulturtag wurden den Potrischalen endothelbewaehsene Dock- gliisehen entnommon. Sie stammten yon jewefls 10 Tieren. Zur Darstellung der Mitochondrien wurde Coriphosphin 0 (Arco-Chomie, Berlin) nach einer von uns angogebenen Methode ver- wendct (M~YER u. HACKENSELLNER 1963). Die Dokumentation effolgte unter Blaulicht- fluoreszenz (greBe Lumineszenzoinrichtung des VEB Carl Zeiss Jona) auf Schwarz-WeiB- Filmen (OI~WO NP 18). Die eigontliehe Mitochondrienz~ihlung geschah am Projoktionsbild dor Photonegative (Endvergr61~erung etwa 1.600fach). Es wurden jeweils Gruppon von Zellen (moist 5--10) ausgewertet. Dureh Division der Mitochondrienzahl durch die Zahl dor zugo- h6rigen Kerne erhielten wir den Mitochondrienbesatz pro Zolle.

* Fraulein B ~ B A ~ ELS mSchten wir fiir ihre interessierte und ox~kte Mitarbeit danken.

198 RUDOLF MEYER u n d HANS ALOIS HACKENSELLI~ER:

E r g e b n i s s e u n d D i s k u s s i o n d e r B e f u n d e

D i e E r g e b n i s s e u n s e r e r U n t e r s u c h u n g e n s i n d i n d e r T ~ b e l l e z u s ~ m m e n g e s t e l l t .

Tabel le

Aorta A. pulmonalis

Kalturtag Kerne Mitochondrien (K A) (M A)

397 452 533 564 461 422

2455

1~

2. 3. 4. 5. 6.

0*

5.002 8.572

12.772 14.875 13.067 12.544

17.779

Mitochoa- drienbesatz

der ein- zelnen Zelle (I~IA/K A )

12,6 19,0 24,0 26,4 28,3 29,7

7,2

Kerae (Kp)

304 494 455 403 392 352

1657

Mitochondriell (Mp)

4.966 11.220 12.373 11.705 12.293 11.157

16.947

Mitoehon- Iitdex drienbesatz MA/K A

der ein- Mp/Kp zel~.en Zellc

(Mp/Kp)

16,3 0,77 22,7 0,84 27,2 0,88 29,0 0,91 31,4 0,90 31,7 0,94

10,2 0,71

* N a c h U n t e r s u c h u n g e n an E n d o t h e l s c h a b e p r ~ p a r a t e n (HACKENSELLNER U. MEYER 1962).

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0 l Endolhs bepf, fp~Tra/e

Abb. 2.

2. 3. u s 8.. 0 7. Z. 3. ~. 5. KultuPlag ~ EndolhsXwh~- I Kullur/ag

bep:dpar~le Abb. 1 Abb. 2

Abb. 1. A EItdothelzellkulturen der Aorta; P E~tdothelzellkulturen der Artcria pulmonalis

A, P Wertc bezogen auf Endothelschabepr~parate (= 100%); A'. P ' Wertebezogen auf die des 1. Kulturtages ( =: 100% )

Mitochondrien des Endothels in vitro 199

Analysieren wir die Ergebnisse der vorliegenden Studie und vergleichen wir sie mit den yon uns friiher an Endothelsehabepri~paraten erhobenen Befunden (HAcxENSELLN~R U. MEYER 1962), SO kommen wir zu folgenden Feststellungen:

1. Gegeniiber den Verh~ltnissen in vivo ist eine Vermehrung der Mitochondrien- zahl pro Zelle im Explantat unverkennbar (s. auch Abb. 1). Am 2. Kulturtag sind die Werte bereits doppelt so hoch wie die fiir Sehabepri~parate gefundenen. Selbst wenn das in den ersten Kulturtagen (zum Teil) durch eine st~rkere Ausbreitung der Zellen in vitro (Deckglas) gegeniiber dem Endothel im Organismus (H~ut- chenpr~parat) bedingt sein kSnnte, glauben wir - - unter Beaehtung der weiteren Zunahme der Mitoehondrien in den spi~teren Versuchstagen - - , eine echte Ver- mehrung dieser Zellbestandteile annehmen zu diirfen.

2. Bezogen auf den Ausgangswert - - gleichgiiltig, ob man yon dem an Endo- thelh~utchen oder yon dem am 1. Tag in vitro erhaltenen Mitoehondrienbesatz ausgeht - - , steigt die Zahl der Mitochondrien w~hrend des Versuehes in Aorten- endothelkulturen relativ st~irker an als in Kulturen vom Endothel der A. pulmo- nalis (s. Abb. 2).

3. Die absolute Differenz zwischen den Mitochondrienwerten fiir Endothel der Aorta und ffir solches der Pulmonalarterie bleibt bis zum 6. Versuchstag ann/ihernd gleich (Abb. 1). Da die Werte ffir beide Endothelarten im Laufe des Zellwaehstums in vitro gleichm~Big ansteigen, verringert sich die relative Differenz, und der in der Tabelle wiedergegebene Index steigt an. Der Unterschied in der Mitochondrien- zahl ist aber bis zum 6. Versuchstag in ausreichendem MaBe als fiberzufi~llig zu sichern (1. und 2. Kulturtag: P ~ 0,1 ; 3. Kulturtag: 0,1 ~ P ~ 0,2 ; 4.--6. Kultur- tag: 0,2 < P < 1,0).

Die Ergebnisse unserer Untersuchungen best~tigen die Annahme, daB die Mitochondrienzahl milieuabh~ngig ist. Sie lassen aber gleichzeitig erkennen, dab bestimmte Wesensunterschiede zwischen Aorten- und Pulmonalendothel (in sich absehw~chender Form) bis zum 6. Kulturtag morphologisch wirksam bleiben.

Zusammenfassung An monolayer-cultures von Aorten- und Pulmonalendothel des Kalbes wurde

die Mitochondrienzahl der einzelnen Zelle fiir den 1. bis 6. Kulturtag bestimmt und mit fffiher erhobenen Werten fiir Endothelschabepr~parate vergliehen. Der Mito- ehondrienbesatz wi~chst unter den Verh~ltnissen in vitro stark an. Die relative Differenz in den Werten ffir das Endothel der Aorta und das der A. pulmonalis (im Sinne hSherer Mitochondrienzahlen im Pulmonalendothel) nimmt zwar ab, bleibt aber bis zum Ende der Untersuchungsperiode statistiseh signifikant.

Literatur HACKENSELLNER, H. A., u. Pv. MEYER: Vergleichende Untersuchung der Mitochondrien am

Endothel der Aorta und der Arteria pulmonalis des l~indes nach supravitMer Fluorochro- mierung mit Coriphosphin. Acta biol. med. germ. 9, 428--431 (1962).

I-IuYoFF, H., u. H. A. HACKENSELLNER: Zur Zahl der Mitochondrien in Gefa2endothelzellen verschiedener 0rtlichkeit. Naturwissenschaften (im Druck).

MEYER, R., U. H. A. I-IACKENSELLNER: Eine einfache fluoreszenzmikroskopische Methode zur Darstellung der Mitochondrien im Endothel der gro~en Gefal]e. Mikroskopie 18, 349--351 (1963).

R. MEYER, Dr. H. A. I-IAcKE•SELLNER Pathologisches Institut der Humboldt-Universit~t Berlin

Berlin N 4, Schumanns~r. 20/21