Zloženie medu

Slovak Academy of Sciences

Bratislava, Slovakia

RNDr. Katarína Bíliková, PhD.

Oddelenie molekulárnej apidológie

Ústav molekulárnej biológie, Slovenská akadémia vied

Bratislava

[email protected]

Včelí med ako liek

Včelí národ je jako jedna bytosť s kolektívnym vedomím

svoje výsadné postavenie a obdiv si včela zaslúžila svojou dokonalou organizáciou činnosti desiatok tisícov jedincov,

ako i tým, že poskytuje oddávna človeku svoje liečivé produkty

med, peľ, materskú kašičku, propolis ako aj nenahraditeľnou úlohou

v opeľovaní rastlín



Nemecký egyptológ Ebers kúpil v r. 1873 v Luxore

zvitok papyrusu, napísaný v hieratickom písme (3500 r. pred Kristom).

Bol dlhý 22,23 metrov a obsahoval až 900 receptov

vrátane návodov na farmaceutické použitie medu.

Starovekí grécki filozofi Hippokrates, Democritos

odporúčali užívať med pre získanie telesnej zdatnosti,

upevnenie zdravia, dlhovekosť a plodnosť ...



Liečivé účinky včelích produktov




med v zdravej výžive všetkých vekových skupín obyvateľstva, pri rekonvalescencii po ťažkých chorobách a operáciách, pri chorobách srdca, pečene, obličiek, žalúdka a čriev, pri zápalových ochoreniach dýchacích ciest, pri zmiernení, nervovej vyčerpanosti, únavy, nespavosti, účinkuje ako antibiotikum, ochraňuje pokožku, využíva sa v oftalmológii, …

materská kašička je všeobecne uznávaná a používaná ako zdravie podporujúca substancia. podpora vitality, proti bolesti hlavy a únave, animikrobiálne,

imunostimulačné, dermatologické, stimulatčné, tonizujúce a revitalizačné účinky, dlhovekosť …

včelí jed zmiernenie zápalov kĺbov, špeciálne viazaných s atritídou, ...

propolis mnohoraké liečivé účinky, vrátane antimikrobiálnych, antioxidačných a najnovšie sa zistilo, že účinkuje aj voči HIV, ...

včelí peľ antioxidačné vlastnosti a extrakt z peľu sa používa v liečbe prostaty, ...

včelí vosk použitie v kozmetike a farmaceutickom priemysle, ...

Napriek dôkazom o liečivých účinkoch včelích produktov existuje v odbornej lekárskej komunite skepticizmus

a nedôvera voči ich používaniu

Problém spočíva v tom, že doteraz nie sú presne definované účinné látky

a najmä, že lekári nemajú k dispozícii potrebné údaje o množstve účinnej látky

vo včeľom produkte




včelia výživa

včela nekonzumuje priamo rastlinné produkty, ale ich modifikuje, konzervuje a uskladňuje

Ide o technologické procesy, v ktorých sa upravuje prirodzený

bielkovinový (peľ) a sacharidový materiál (nektár) tak,

aby sa ich výživová hodnota nezmenila v priebehu 1 roka pri teplote 34 -35C.



med larválna výživa včelí peľ

nektár a sladké sekréty rastlín voda kvetový peľ

http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Bienenwabe_mit_Eiern_und_Brut_5.jpg



Čo je med ?

med je zahustená a enzymaticky upravená zmes látok

zo sladkých štiav rastlín alebo medovice obohatená o

sekréty cefalických žliaz včiel krmičiek.

včela používa pre konzervovanie svojej potravy

vysokú koncentráciu cukru (80%), nízky obsah vody (14% – 18%)

kyslé prostredie (pH 3.7) prítomnosť antibakteriálnych látok včelieho i rastlinného pôvodu

voda 17%

ostatné cukry

9%

glukóza 31%

ostatné látky

4%

fruktóza 38%

sacharóza 1%

Chemické zloženie medu

špecifické zloženie medu závisí od zmesi kvetov navštívených včelami,

liší sa podľa lokality, obdobia, regionálnych a klimatických podmienok

a od jednotlivých včelstiev

enzýmy, proteiny a peptidy

včelieho pôvodu (0,1 - 0,5%),

aminokyseliny, vitamíny, hormóny,

organické látky, fytochemikálie,

minerály, …



Oddelenie molekulárnej apidológie Ústav molekulárnej biológie, Slovenská akadémia vied, Bratislava

rok 1987

Doc. Ing. Jozef Šimúth, DrSc., zakladateľ výskumu bielkovín včelej materskej kašičky u nás a vo svete

zameranie systematický, molekulárno - genetický výskum proteinov a peptidov

vylučovaných včelou do včelích produktov (materská kašička, med, včelí peľ, propolis)

cieľ objasniť ich funkciu vo včelstve

z nutričného, fyziologického a defenzívneho aspektu, ako aj prispieť k objasneniu liečivých účinkov

včelích produktov

rok 2012

Proteiny a peptidy včelej materskej kašičky sú v centre súčasného molekulárneho a fyziologického výskumu

vo svete



Bíliková K. and Šimúth, J. as Members of Scientific Consortium: Insights into social insects from the genome of the honeybee Apis mellifera. Nature 443, 931-947 (2006).

kDa 1 2

200.00

116.25

97.40

66.20

45.00

31.30

21.50

14.00

apa 5 (82-87 kDa) apa 3 (60-70 kDa)

apa 1 (55 kDa) apa 2 (49 kDa)

APALBUMINY hlavné proteíny materskej kašičky


Hlavné bielkoviny materskej kašičky

predstavujú 90% všetkých proteínov MK

patria do jednej proteínovej rodiny

pozostávajúcej z 9 členov

Mw 49-87 kDa

sú pre včelu špecifické



Fyzikálno-chemické vlastnosti týchto bielkovín

sú podobné známym albumoidným proteínom

(ovoalbumín, sérum albumín)

preto pomenovanie apalbumíny.

Najviac zastúpená bielkovina materskej

kašičky je apalbumin1 predstavujúci 50%

bielkovín obsahu materskej kašičky.

Bíliková. K. et al. (2001) Apidologie 32, 275-283.

Antimikrobiálna aktivita inhibícia rastu Paenibacillus larvae pôvodca moru včelieho plodu

A. Bacillus subtilis B. P. larvae, ATCC 2547 C. P. larvae, ATCC2548 D. P. larvae, ATCC9545

BS9/58 PL47 PL48 PL45

R 5.10-6M R 2,5.10-5M

control H2O2 5.10-4M

Antifungálna aktivita

Botrytis cinerea

Bacterial strains (G+)

Bifidobacterium adolescentis ATCC15703

Bifidobacterium bifidum ATCC15696

Bifidobacterium breve ATCC15700

Bifidobacterium infantis ATCC 15697

Bifidobacterium longum ATCC15707

Clostrídium perfringens ATCC13124

Corynebacterium pyogenes

Eubacterium aerofacience

Lactobacillus acidophilus ATCC311

Lactobacillus acidophilus ATCC4356

Lactobacillus bulgaricus ATCC1841

Lactobacillus helveticus ss. Jugurti

Lactobacillus lactis ATCC8000

Lactobacillus leichmannii ATCC7830

Lenconostoc cremoris ATCC19254

Staphylococcus aureus SC-D

Streptococcus cremoris SCR-812

Streptococcus thermophilus ATCC19258

Fujiwara S. et al. (1990) J.Biol. Chem.265. 11333-11337.



ROYALISIN antimikrobiálny a antifungálny faktor larválnej výživy a medu

51 aar, 5523 Da, pI 7,75

molekulárna charakterizácia

Bíliková K. et al (2002), FEBS Letters 528, 125-129.



APISIMIN antimikrobiálny, antifungálny a immunoaktívny peptid

včelej materskej kašičky 54 aar, 5540 Da, pI 4,68

pI 1 2

3.50

3.75

4.55

5.20

5.85

7.35

8.15

8.45

9.50

Tricin-SDS-PAGE

1. Mw protein marker

2. royal jelly

3. apisimin

Native PAGE

1. royal jelly

2. apisimin

IEF

1. IEF marker

2. apisimin

Native PAGE-

-Western blot

1. royal jelly

2. apisimin

1 2



The PSIPRED Protein Structure Prediction Server http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/psiform.html Bíliková K. et al (2002). FEBS Letters 528. 117-121

APISIMIN antimikrobiálny, antifungálny a immunoaktívny peptid

včelej materskej kašičky 54 aar, 5540 Da, pI 4,68

Apisimin+

5541.5 Da

K

5412.2 T

5311.0

S

5224.3

štrukturálna charakterizácia MALDI-TOF MS CD spectrum

20 10 1 10 20 30 40 50

MSKIVAVVVLAAFCVAMLVSDVSAKTSISVKGESNVDVVSQINSLVSSIVSGANVSAVLLAQTLVNILQILIDANVFA

CCHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHCCEEEEEEEECCCHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHCC

wavelenght [nm]

190 200 210 220 230 240 250

20

10

0

-10

34 % helix

20 % sheet

11 % turn

Bíliková K. et al (2009) Proteomics. 9. 2131-2138.

250

150

100

75

50

37

25

kDa apa2 apa2a apa2 apa2a

ENSP

AIVR

(apa2)

(apa2a)

9.5

8.5

8.0

7.5

7.0

6.5

6.0

4.5

3.5

pI 1 2

IEF of apalbumin2 10% SDS-PAGE Western blot analysis

with polyclonal antibody

against apa2



Molekulárna charakterizácia

Apalbuminu2a

Antibacterial effect of apalbumin2a on the growth

of P. larvae (ATCC 2547) in MYPGP medium,

with addition of:

apa2 - apalbumin2 (1.8x10-4 M);

apa2a - with addition of apalbumin2a (1.8x10-4 M)

Tcc - with addition of tetracycline hydrochloride

(1x10-5 M) as a positive control.

control - P. larvae withouth of antimicrobial agent

Absorbance measured at 595 nm.

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Time of incubation [h]

Ab

sorb

an

ce [m

AU

]

apa2

control

ATCC2457

apa2a

Tcc

Apalbumin2a minoritný homológ apalbumínu2

inhibuje rast Paenibacillus larvae (pôvodca moru včelieho plodu)



včela dokáže transformovať výživové bielkoviny na antibiotické

Bíliková K, et al (2009) Proteomics, 9, 2131-2138.

Bielkoviny materskej kašičky pôsobia ako imunostimulátory idukujúce tvorbu cytokinov TNF-alfa, kľúčový cytokín zodpovedný za reguláciu antiviralnych, antibakteriálnych a antiparazitických

defenzívnych mechanizmov organizmu

0,0

200,0

400,0

600,0

800,0

1000,0

contr

ol

LP

S

RJP

apa

-1-o

ligo

me

ric

ap

a-1

-mo

no

mer

ap

a-2

apis

imin

TNF-

alp

ha

[pg.

ml-1

]

0,0

200,0

400,0

600,0

800,0

1000,0

1200,0

3 H 6 H 24 H

control LPS RJP

TNF-

alp

ha

[pg.

ml-1

]

Šimúth J., Bíliková K., Kováčvá E., Kuzmová Z., Schroder W. (2004) J. Agric. Food Chem. 12154-12158.

Imunostimulačné vlastnosti bielkovín materskej kašičky



? Pravý včelí med



parameter metóda

Senzorické farba, chuť, vôňa priame senzorické pozorovania

Fyzikálno-chemické

obsah vody, vodivosť, gravimetria, elektrická konduktivita,

kyslosť, voľné kyselín (glukónová, mravčia, octová, oxalová,...) pH, titračné metódy

Celkový obsah dusíka, stanovenie proteinov,

vitamínov, voľných aminokyselín, ... LC, HPLC,

stanovenie minerálov AAS, AES, OES

Analýza cukrov optická otáčavosť, index lomu

celkový obsah, jednotlivé a pomerné zastúpenie cukrov refraktometria, HPLC, HPLC/MS,

(fruktoza/glukoza, sacharóza, redukujúce cukry, oligosacharidy, ...) stanovenie 13C/12C , IRMS, NMR, ICP-MS detekcia falšovania škrobovými sirupmi, invertom FTIR spectroscopy, HPAEC-PAD, ...

Enyzmatická aktivita

diastazová, invertázová aktivita kolorimetria, polarimetria

Kontaminanty a toxické látky

HMF UV, HPLC, GC, GC/MS,

pesticídy, insekticídy, antibiotiká HPLC/MS, IR, …

toxické látky rastlinného pôvodu (alkaloidy, terpeny, PAH, ...)

ťažké kovy AAS, AES, OES

Botanický pôvod

peľová analýza mikroskopia

aromatické látky rastlinného pôvodu a rastlinné polyfenoly UV, HPLC, GC, GC/MS, HPLC/MS, SPME, ...

Mirobiologické zloženie

baktérie, kvasinky, mikrobiologické metódy

multivariačné štatistické metódy

Používané metódy hodnotenia pravosti včelieho medu



kDa

100

70

55

40

35

25

15

10

M RJP apa1 apa1 agát

lip

a ga

štan

re

pka

p

úp

ava

sa

ch.c

uko

r

um

elý

p

úp

avo

vý

agát

ový

nek

tar

ex

trak

t p

eľu

Proteiny materskej kašičky su prítomné v mede a vo včelom peli

Apalbumin1 je hlavným proteínom medu

apa1

55 kDa



100

70

55

40

35

25

15

10

Imnochemická detekcia

apalbuminu1

Western blot analysis

using polyclonal anti-apa1

antibody

Electroforetický profil

vzoriek medov, nektáru

a včelieho peľu

12% SDS PAGE

Coomassie Brilliant Blue

staining

Bíliková K. & Šimúth J (2010) JAFCH, 9, 2131-2138.

Apalbumin1 hlavný protein materskej kašičky

hlavný proteín medu

nenahraditeľný faktor v procese premeny nektáru na med

dôležitý faktor pri spracovaní kvetového peľu na obnôžkový

hlavný faktor imunostimulačných vlastností medu

syntetizovaný počas celého života včely

pre včelu špecifický

tepelne stabilný

vhodný parameter pre hodnotenie pravosti a kvality medu






výhody:

citlivosť (ng/ml)

presnosť

reprodukovateľnosť

malé množstvo vzorky

jednoduchá príprava vzorky



Metóda kvantifikácie apalbuminu1 v mede a vo včelích produktoch

s potenciálnym využitím v apiterapii, kozmetike a farmakológii


Obsah apalbuminu1 v rôznych kvetových medoch a v invertovanom sacharózovom sirupe

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

140,00

160,00

180,00

200,00

vzorky medov zo Slovenska, Česka, Talianska a Španielska

ap

alb

um

in1

[u

g/g

]

pôvod medu

rob

ínia

ag

át

lip

a

ga

šta

n

čere

šn

a

po

ma

ran

č

eu

ka

lyp

tus

rod

od

en

dro

n

rozm

arí

n

pú

pa

va

rep

ka

sln

eč

nic

a

luc

ern

a

bo

dli

ak

leva

nd

ula

tym

ián

po

lyfl

ora

lny

les

ný

sach

aró

zo

vý s

iru

p




Výsledky stanovenia apalbumin1 v mede ELISA metodou

Pôvod medu

Celkový

protein*

[μg.g-1]

apalbumin1 [μg.g-1] apalbumin1

min max priemer*

[%]

celkového

proteinu

[%]

medu

Agát (n=5) 311,42 98,74 126,11 108,64 34,88 0,010

Lipa (n=5) 483,99 96,29 109,82 100,79 20,83 0,010

Gaštan (n=5) 944,20 265,12 310,87 287,42 30,44 0,030

Repka (n=5) 650,88 81,22 137,68 102,47 15,74 0,010

Púpava (n=5) 905,72 129,75 140,86 136,42 15,06 0,010

sacharozový

sirup (n=2) 159,22 7,61 7,72 7,66 4,81 0,001

* priemer (n) vzoriek medu




Čo poodhalili analýzy včelieho genómu? včelí genóm je prekvapivo malý


včela (Apis mellifera) 10 157 génov

vinná muška (Drosophila melanogaster) 13 600 génov

komár (Anopheles gambiae) 14 000 génov

priadka morušová (Bombyx mori) 18 500 génov

človek (Homo sapiens) 22 500 génov



Včela má veľmi slabú genetickú výbavu

pre imunitu a odolnosť voči chorobám.

Včelí genóm obsahuje len 6 génov kódujúcich antimikrobiálne peptidy,

kým D.melanogaster ma 3x viac týchto génov.

Obsahuje tiež malý počet génov pre elimináciu škodlivých chemikálii vrátene insekticídov.

Prečo má včela menej génov pre vrodenú imunitu ako iný hmyz ?

Včela má vo svojich produktoch nevyčerpateľný zdroj látok,

ktoré tvoria jej obranný systém voči patogénom, pretože

výživa a zdravie včiel značne závisí

od fyziologicky účinných zložiek rastlín v propolise, peli a v nektári

tie nie sú determinované včelím genómom.

u včely sa vyvinul špecifický defenzívny systém

založený na multifunkcionalite proteinov a peptidov materskej kašičky

ako dôsledok postranslačnej modifikácie materských proteínov. Bíliková K, et al (2009) Proteomics, 9, 2131-2138

Čo poodhalili analýzy včelieho genómu?




Včela je obdarená výnimočným detekčným systémom pre vône včela má v 163 génov,

vinná muška len 62 a komár 79 génov

Včela nemá veľa génov pre chuť Včela má len 10 génov pre chuťové receptory,

kým vinná muška 68 a komár až 76 génov.

Včela sa ich evolúciou zbavila, pretože si vyvinula symbiózu s rastlinami,

ktoré jej poskytujú najchutnejšiu a najvýživnejšiu potravu

vo forme nektáru a peľu.

včela a rastliny predstavujú komplexný symbiotický systém,

ktorý sa evolúciou zdokonalil do úplnej závislosti včely na rastlinách

Čo poodhalili analýzy včelieho genómu?






Zdravotný stav včelstiev je vážny

Čo spôsobuje hromadný úhyn včelstiev na celom svete? (CCD, Colony Collapse Disorder)

− životné prostredie

− používanie pesticídov, insekticídov, antibiotík

− elektromagnetické žiarenie

− podvíživa

− včelie patogény

− ...

− ?

Bakteriálne Paenibacillus larvae (AFB) Melissococus pluton (EFB) Paenibacillus alvei Streptococcus pluton

Fungálne Ascosphaera apis (Chalkbrood) Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus (Stonebrood) Nosema apis, Nosema ceranae

Virálne Chronic Paralysis Virus [CPV] Black Queen Cell Virus (BQCV) Kashmir bee virus (KBV) Israel acute paralysis virus (IAPV)

Parasitické Varroa mites (Varroa) Tracheal mites (Acarapis)

http://www.vcely.sk/zootechnika/varroa/varroa1.jpg



Paenibacillus larvae včelí mikrobiálny pathogén, primárny pôvodca moru včelieho plodu

American foulbrood

AFB



Nový prístup v prevencii a liečbe včelstiev

nahradenie klasických antibiotík fyziologicky účinnými látkami prítomnými v mede peli a propolise

proteiny a peptidy včelieho pôvodu

fytochemikálie, látky rastlinneho pôvodu

Tylosine

Tetracycline

chlortetracycline tetracycline hydrochlorid oxytetracycline

Použitie antibiotík bolo zakázané vo väčšine krajín EU (2005) pre výskyt reziduí týchto liečiv v mede



hlavné bielkoviny materskej kašičky majú okrem výživovej funkcie aj významné fyziologické účinky

Tento predpoklad podporuje aj ich prirodzená funkcia vo včelstve

kde majú úlohu induktora (spúšťača) defenzívnych mechanizmov počas vývoja larvy

a môžu ovplyvniť fenotypický prejav génov.

poznanie molekulárno-chemických a štrukturálnych vlastností

proteinov a peptidov materskej kašičky

prispievajú k objasneniu liečivých účinkov medu, materskej kašičky a včelieho peľu,

ktoré sa používajú ako revitalizačné prostriedky

pre upevnenie ľudského zdravia, duševnej a telesnej výkonnosti a dlhovekosti.

apalbumin1 je vhodným paramerom pre hodnotenie pravosti a kvality medu

imunochemická metóda na kvantifikáciu apalbuminu1 zisťovanie falšovania medu a dôkaz prítomnosti medu a materskej kašičky

v potravinárskych a farmaceutických a kozmetických produktoch

antibiotické proteiny a peptidy materskej kašičky sú perspektívnou náhradou antibiotík pri liečení včelstiev voči patogénom

a predstavujú novú generáciu proteínových antibiotik.

SÚHRN



7.FP EU - BEEDOC

Bees in Europe and the decline of honeybee colonies

Včely v Europe a hormadný úhyn včelstiev.

6.FP EU – BEESHOP

Bees in Europe and Sustainable Honey Production.

Včely v Europe a udržateľná produkcia medu.

6.FP EU – CONCO

Applied Venomics for Production of Inovative Biomedical Drugs.

Využitie aplikovanej venomiky pre prípravu nových bio-liečiv.

Partner Group Project

Functional genomics of physiological active proteins and peptides of honeybee

(Apis mellifera L.)

Funkčná genomika fyziologicky aktívnych proteínov a peptidov včely medonosnej

(Apis mellifera L.).

Institute of Molecular Biology Slovak Academy of Sciences, Bratislava, Slovakia

Max-Planck Institute of Molecular Genetics, Berlin, Germany

Riešené projekty Oddelenie molekulárnej apidológie

ÚMB SAV, Bratislava

Poďakovanie

za spoluprácu a poskytnutie vzoriek medu

Slovenský zväz včelárov

Výskumný ústav včelársky, Litovský Hrádok

Výskumný ústav včelársky, Dol u Prahy, Česka republika

Výskumný ústav včelársky, Bologna, Taliansko

Partnerské ústavy v Švédsku, Anglicku, Nemecku, Belgicku, Francúzsku,

Bulharsku a Španielsku

Max-Planckov ústav molekulárnej genetiky, Berlin, Nemecko

JRJ, Tokio, Japonsko

Yunlin University, Taiwan



Ďakujem za pozornosť



Documents

Zloženie medu