Zborník prác - Jesseniova lekárska fakulta UK¥ použitej dávke (10 ug/kg), ktorá bola v porova ví s iýi prácai (Meeyoug, 2009; hirubolo, 2010) viekoľkoásob ve vižšia

Nové trendy vo farmakoterapii VII.

1

Martin, 2015


Zborník prác

Nové trendy vo farmakoterapii VII. Recenzovaný zborník prác Zostavovatelia: doc. RNDr. Soňa Fraňová, PhD., mim. prof. doc. MUDr. Juraj Mokrý, PhD. Recenzenti: prof. MUDr. Gabriela Nosáľová, DrSc. doc. MUDr. Martina Šutovská, PhD. Zborník neprešiel jazykovou korektúrou. Za jazykovú a gramatickú stránku zodpovedajú autori jednotlivých príspevkov. Miesto a rok vydania: Jesseniova lekárska fakulta UK v Martine, 2015 Počet strán: 37 Dostupné online: http://www.jfmed.uniba.sk ISBN: 978-80-8187-001-9 EAN: 9788081870019

http://www.jfmed.uniba.sk/


3

Obsah

Predhovor 4

Kazimierová et al. Farmakodynamické účinky vybraných polyfenolických zmesí a samo-statne pôsobiacich polyfenolov

5

Kertys et al. Vplyv olprinonu, selektívneho PDE3 inibítora na reaktivitu dýchacích ciest v podmienkach experimentálne navodeného alergického zá-palu

10

Pappová et al. Vplyv experimentálne vyvolaného alergického zápalu na ciliárnu frekvenciu

15

Urbanová et al. Bronchodilatačné a protizápalové účinky teofylínu v závislosti od jeho plazmatických koncentrácií v modeli alergickej astmy

20

Jošková et al. Adenozíntrifosfát – regulátor pohybu cílií dýchacieho systému 26

Kocmálová et al. Mechanizmy regulujúce kontraktilitu maternice 29

JLF UK v Martine, 2015

4

Predhovor

Siedme vydanie „Nových trendov vo farmakoterapii“ vzniklo na základe snahy prezen-

tovať najmä práce doktorandov, ktorých počet sa na Ústave farmakológie zvyšuje. Toto vyda-

nie však opäť ponúka čitateľovi okrem originálnych výskumných prác aj metodologické a pre-

hľadové práce, a to z oblasti respiračnej farmakológie, samotnej respirológie a ftizeológie, ale

tiež psychofarmakológie, či imunofarmakológie a farmakológie hladkej svaloviny.

Dúfame, že čitateľov zborníka pri študovaní prezentovaných prác zaujmú niektoré vý-

skledky a inšpirujú k hlbšej diskusii, či ďalšej vedecko-výskumnej činnosti.

V Martine, 22.12.2015

Zostavovatelia


5

Farmakodynamické účinky vybraných polyfenolických zmesí a samostatne pô-sobiacich polyfenolov

Ivana Kazimierová, Marta Jošková, Lenka Pappová, Martina Šutovská, Soňa Fraňová

Ústav farmakológie, Jesseniova lekárska fakulta UK, Biomed Martin E-mail: [email protected]

Úvod Prevalencia alergickej astmy vo

svete neustále rastie ako dôsledok vzájom-ných interakcií genetických a environmen-tálnych faktorov (Henderson, 2012). Aj keď súčasná terapia astmy je účinná, nedokáže zabezpečiť dostatočnú kontrolu u všetkých pacientoch trpiacich závažnou formou tohto ochorenia. Naše porozumenie pato-mechanizmu vzniku astmy nám umožňuje hľadanie nových liečebných postupov, ktoré môžu buď modulovať proces alergic-kej senzitizácie, alebo alterovať funkciu imunitného systému a zápalovú odpoveď (Chirumbolo, 2010). Zaujímavou skupinou v terapii mnohých chronických ochorení sa javia polyfenoly. Polyfenoly sú široko dis-tribuované v rastlinnej ríši. Okrem toho, že zohrávajú významnú úlohu vo fyziológii rastlín, existujú mnohé epidemiologické a experimentálne štúdie, ktoré preukázali ši-roké spektrum ich biologicky významných účinkov. Vzhľadom na ich anti-alergické a antioxidačné vlastnosti, ako aj ich schop-nosť modulovať dôležité pro-zápalové a protizápalové signálne dráhy môžu prispieť k rozšíreniu palety anti-astmatických liečiv (Li, 2014). Cieľom článku je prezentovať do-terajšie, a tiež nami získané poznatky o schopnosti vybraných polyfenolických zmesí (Provinol, Flavin7) a samostatne pô-sobiacich polyfenolov (morin, kvercetin, re-sveratrol) ovplyvniť proces alergického zá-palu a s ním spojených symptómov. Zame-rali sme sa na ich potenciálny bronchodila-tačný a protizápalový účinok, hodnotený v experimentálnych podmienkach.

Protizápalový účinok polyfenolov V patomechanizme alergickej astmy

zohrávajú dominantnú úlohu Th2 lymfo-cyty, ktoré uvoľňujú pro-zápalové cytokíny IL-4, IL-5, IL-13. Zvýšenou tvorbou uvede-ných cytokínov môže byť vysvetlená nad-produkcia IgE protilátok, infiltrácia steny DC eozinofilmi a rozvoj bronchiálnej hyper-reaktivity. Liečba alergických ochorení sa upriamuje na supresiu IgE produkcie, práve cez reguláciu expresie a uvoľňovania Th2 cytokínov ako aj mnohých iných zápalo-vých mediátorov (Ishmael, 2011; Han, 2007). Polyfenoly sú schopné ovplyvniť zá-palový proces na základe mnohých mecha-nizmov účinku.

V experimentálnych štúdiách bolo identifikovaných niekoľko mechanizmov protizápalového účinky morinu. Jedným z nich je aj potenciál ovplyvniť expresiu in-duktívnej formy NO- syntetázy (iNOS), ktorá vykazuje vo vyšších koncentráciách pro-zápalový účinok (Raso, 2001). V našej štúdii aplikácia morinu v dávke 30 mg/kg počas senzibilizácie ovalbumínom (OVA) viedla k zmierneniu alergického zápalu a k zníženiu hyperreaktivity DC. Dlhodobé po-dávanie morinu pozitívne ovplyvnilo hla-diny zápalových cytokínov (IL-4, IL13) v bronchoalveolárnej laváži (BAL). Naopak, v hladinách IL-5 došlo len k miernemu zníže-niu. Podobné výsledky boli dosiahnuté aj v inom experimente. Ma a kol (2015) potvr-dili, že morin môže inhibovať alergickú zá-palovú reakciu redukciou hladín IgE protilá-tok a Th2 cytokínov v BAL počas OVA- indu-kovanej alergickej astmy.

mailto:[email protected]


6

Ďalšou z možností ovplyvnenia aler-gického zápalu je inhibícia aktivácie transkripčných faktorov predovšetkým NF-κB a GATA-3. Transkripčný faktor GATA3 posúva rovnováhu Th1/Th2 na stranu Th2 lymfocytov. V experimentálnom modely astmy kvercetin dokázal potlačiť expresiu GATA3 a tým aj produkciu pro-zápalových cytokínov tvorených Th2 lymfocytmi. Nao-pak jeho aplikácia viedla k zvýšeniu expre-sie transkripčného faktora T-bet, čo potvr-dilo jeho potenciál v regulácii nerovnováhy Th1/Th2 charakteristickej pre alergickú as-tmu (Park, 2009). V našom experimente kvercetin výrazne neovplyvnil zápalovú re-akciu, čím sa naše výsledky dostávajú do rozporu s výsledkami iných štúdií, u ktorých bol preukázaný jeho protizápalový efekt. Tento neúspech môžeme pripísať farmako-kinetickým vlastnostiam kvercetinu ako je rýchly metabolizmus a exkrécia, ktoré môžu znižovať jeho biologickú dostupnosť. My sme kvercetin podávali po dobu 21 dní

v dávke 20mg/kg p.o.. Práce ktoré pouka-zujú na jeho signifikantné protizápalové účinky sa líšia od našej formou a dĺžkou tr-vania aplikácie, dávkou a spôsobom prí-pravy suspenzie (Chirumbolo, 2010; Roge-rio, 2010; Park, 2009).

Odlišnosti medzi výsledkami našej práce s inými sme pozorovali aj pri testo-vaní protizápalového účinku resveratrolu. Tento polyfenolický stilbén dostatočne za-stúpený v hrozne a červenom víne je známy svojou dobrou anti-oxidačnou a protizápa-lovou aktivitou. Aj keď mnohé in vivo a in vitro štúdie poukazujú na jeho signifikantný protizápalový účinok sprostredkovaný cez rôzne mechanizmy (obr.1), v našej práci re-sveratrol nedokázal ovplyvniť zápalovú re-akciu v zmysle redukcie hladín Th2 cyto-kínov (IL-4, IL-5). Neúčinnosť látky v našom modely alergického zápalu, môžeme pripí-sať použitej dávke (10 mg/kg), ktorá bola v porovnaní s inými prácami (Meeyoung, 2009; Chirumbolo, 2010) niekoľkonásobne nižšia.

Obr. 1 Schéma zobrazujúca resveratrolom a ďalšími látkami sprostredkovanú moduláciu bunkovej signalizácie počas zápalového procesu vyvolaného oxidačným stresom. Obrázok zobrazuje mechanizmus protizápalovej aktivity resveratrolu cez inhibíciu IκB a aktiváciu histon deacetylázy (Han, 2007).


7

Všetky vyššie popísané látky a mnohé ďalšie sú súčasťou polyfenolických zmesí Provinolu a Flavinu7. Viaceré práce poukazujú na benefit polyfenolických zmesí pri liečbe chronických ochorení. My sme chceli potvrdiť ich možný potenciál aj v liečbe astmy. Morčatá senzibilizované OVA prejavovali typické znaky alergického zápalu: rozvoj bronchiálnej reaktivity a prí-tomnosť Th2 cytokínov v BAL. Podávanie Provinolu (20mg/kg) a Flavinu7 (2ml/kg) po dobu 21 dní viedlo k ich signifikantnému potlačeniu. Tento fakt poukazuje na priaz-nivý vplyv zmesí aj na moduláciu alergic-kého zápalu v respiračnom trakte. Provinol a Flavin7 obsahujú jednotlivé polyfenolové monoméry ako sú antokyaníny (Park, 2007), hesperidin (Kim, 2011), chryzin (Bae, 2011), apigenín a luteolín (Tanaka a Takahashi, 2013). Interakcia medzi jed-notlivými monomérmi má priaznivý vplyv na farmakokinetiku a farmakodynamiku podaných polyfenolických zmesí. Výsled-kom ich vzájomného pôsobenia je lepšia bi-ologická dostupnosť a potenciácia protizá-palových účinkov. Bronchodilatačný účinok polyfenolov

Pretrvávajúci zápal prispieva k roz-voju bronchiálnej hyperreaktivity charakte-ristickej pre astmu. Infiltrácia dýchacích ciest (DC) zápalovými bunkami môže pri-spieť k mnohým tkanivovým zmenám ako je poškodenie epitelu DC a zhrubnutie ba-zálnej membrány. Výsledkom zmien je zní-žená tvorba bronchodilatačne pôsobiacich látok, a naopak zvýšená tvorba broncho-konstrikčne pôsobiacich kinínov. Navyše, aktiváciou zápalových buniek predovšet-kým eozinofilov a mastocytov dochádza k uvoľňovaniu mediátorov schopných vyvo-lať kontrakciu hladkej svaloviny DC (Barnes, 2011; Fredberg, 2004).

Je pravdepodobné, že v mecha-nizme relaxácie hladkého svalstva DC zo-hráva významnú úlohu chemická štruktúra

polyfenolov. Príkladom je štúdia, ktorej cie-ľom bolo zhodnotiť bronchodilatačný po-tenciál medzi dvomi skupinami- flavóny a flavonoly. Výsledky preukázali, že pred-stavitelia zo skupiny flavonoly disponujú výraznejšou schopnosťou relaxovať hladkú svalovinu trachey (Ko, 2003). Polyfenolické látky kvercetin a morin patria práve do sku-piny flavonolov so silným bronchodilatač-ným účinkom. Zo širokého spektra biologic-kých účinkov kvercetinu na úrovni respirač-ného traktu môžeme spomenúť jeho inhi-bičný vplyv na vyplavovanie bronchokon-strikčného mediátora- histamínu vo všet-kých fázach alergickej reakcie (Djelili, 2012). Rovnako morin je schopný ovplyvniť uvoľňovanie histamínu cez inhibíciu degra-nulácie mastocytov (Kim, 2009). Okrem toho, morin v našej práci signifikantne zní-žil hladiny IL-13. Zo všetkých cytokínov pro-dukovaných Th2 lymfocytmi práve IL-13 in-dukuje hypereaktivitu DC (Ishmael, 2011).

Ako už bolo spomínané, zápal zo-hráva kľúčovú úlohu v patomechanizme as-tmy. U pacientov trpiacich astmou bola po-zorovaná IL-5 sprostredkovaná eozinofília, ktorá prispieva k hyperreaktivite DC pro-stredníctvom tvorby cytotoxických produk-tov ako sú eozinofilový kationický proteínu (ECP), hlavný bázický proteín (MBP) a mno-hých ďalších mediátorov. Pre resveratrol bude platiť tá istá skutočnosť ako pre mnohé iné polyfenoly. Jeho bronchodila-tačný účinok bude výsledkom ovplyvnenia zápalového procesu. Jeden z možných me-chanizmov ako resveratrol propaguje svoj antiastmatický účinok je práve inhibícia uvoľňovania cytokínov a zmiernenie infil-trácie DC eozinofilmi (Meeyoung, 2009).

Pozitívny vplyv polyfenolických zmesí bol potvrdený aj pri vyšetrení reakti-vity DC v podmienkach in vivo a in vitro. Bolo dokázané, že Provinol a Flavin7 sú schopné inhibovať tonus hladkej svaloviny artérii a trachey (Szentimiklósi, 2003; Fitzpatrick, 1993). Relaxácia hladkého sval-stva DC a artérii je spôsobená zosilním


8

tvorby endogénneho relaxačného faktoru- oxidu dusnatého (NO) (Ermert, 2002). Han a spol. (2007) vo svojej práci dokázal, že Provinol je schopný vyvolať endotel-depen-dentnú relaxáciu v izolovaných artériach cez dva rôzne mechanizmy: (i) Ca2+ induko-vaným zvýšením aktivity NOS a (ii) fos-foryláciou eNOS cez PI3/Akt kinázovú dráhu. Okrem toho, Provinol inhibuje syn-tézu endotelínu-1. Relaxačný účinok Flavinu7 bol dokázaný v pilotnej štúdii Crystal Inštitutu (Szentimiklósi, 2003). Flavin7 relaxoval hladkú svalovinu trachey prekontrahovanej metacholínom len v prí-pade poškodenia epitelu. Pri použití tra-chey s intaktným epitelom sa tento účinok

neprejavil. Tento fakt naznačuje, že me-chanizmus pôsobenia Flavinu7 v relaxácii hladkej svaloviny trachey môže súvisieť s metabolizmom NO.

V našej práci sme pre vyšetrene bronchodilatačnej aktivity polyfenolov po-užili ako hodnotiaci parameter špecifický odpor DC a zmeny v amplitúde kontrakcie hladkého svalstva trachey. Získane vý-sledky preukázali signifikantný bronchodi-latačný účinok v prípade použitia polyfeno-lických zmesí a samostatne pôsobiaceho morinu. Kvercetin a resveratrol relaxovali hladkú svalovinu DC len mierne.

Tab. 1 Bronchodilatačné a protizápalové pôsobenie polyfenolických zmesí a samostatne pôsobiacich polyfeno-lov v experimentálnom modely astmy (↓*-signifikantný účinok; ↓-nesignifikantný účinok, X-nedosiah-nutý účinok)

polyfenoly Provinol Flavin7 Kvercetin Resveratrol Morin

reaktivita DC in vivo

↓*** ↓** ↓ X ↓***

reaktivita DC in vitro

↓* ↓* ↓* ↓ ↓**

protizápa-lová aktivita

IL-4 ↓** ↓** X X ↓*

IL-5 ↓* ↓** X X X

IL-13 ↓ ↓** ↓***

Záver Výsledky našej práce sú v súlade s mno-hými experimentálnymi štúdiami, ktoré po-tvrdzujú benefit polyfenolických látok v liečbe ochorení respiračného traktu. Poly-fenolické zmesi, rovnako aj samostatne pô-sobiace polyfenoly môžu byť vhodným do-plnkom v terapii astmy vďaka ich schop-nosti redukovať príznaky tohto ochorenia. Avšak hlavnou nevýhodou je ich nízka bio-logická dostupnosť, ktorá predstavuje pre-kážku v terapii výskumu. Preto by bolo po-trebné hlbšie upriamiť pozornosť na far-makokinetické vlastnosti týchto látok. Táto práca bola podporovaná Agentúrou na podporu výskumu a vývoja na základe Zmluvy

č. APVV-0305-12, CEKR II. –Projekt spolufinan-covaný zo zdrojov EU; Grant VEGA 1/0165/14 a MZ 2012/35- UK. Zoznam použitej literatúry 1. Bae Y, Lee S, Kim SH. Chrysin suppresses mast

cell-mediated allergic inflammation: involve-ment of calcium, caspase-1 and nuclear factor-κB. Toxicol Appl Pharmacol. 2011; 25: 56-64

2. Barnes PJ. Pathophysiology of allergic inflam-mation. Immunological Reviews 2011; 242: 31-50

3. Djelili H, Arrar L, Naline E, Devillier P. Relaxant effect of quercetin and rutin on human isola-ted bronchus. Chinese Medicine 2012; 3: 94-100

4. Ermert M, Ruppert C, Gunther A, Duncker HR, Seeger W, Ermert L. Cell –specific nitric oxide


9

synthase –isoenzyme expression and regula-tion in response to endotoxin in intact rat lungs. Lab Invest 2002; 82: 425-441

5. Fitzpatrick DF, Hirschfield SL, Coffey RG. En-dothelium-dependent vasorelaxing activity of wine and other grape products. Amer J Physiol 1993; 265: 774-778

6. Fredberg JJ. Bronchospazms and its bio-physical basis in airway smooth muscle. In Res-piratory Research 2004; 5: 2

7. Han X, Shen T, Lou H. Dietary polyphenols and their biological significance. Int J Mol Sci 2007; 8: 950-988

8. Henderson AJ. Aetiology of asthma. Pediatrics and Child Health 2012; 23: 287-290

9. Chirumbolo S. The role of quercetin, flavonols and flavones in modulating inflammatory cell function. Inflamm Allergy Drug Targets 2010; 9: 263-285

10. Ishmael FT. The Inflammatory Response in the Pathogenesis of Asthma. J Am Osteopath Assoc 2011; 111 (11): 11-17

11. Kim JW, Lee JH, Hwang BY, Mun SH, Ko NY, Kim DK, Kim B, Kim HS, Kim YM, Wahn SCH. Morin inhibits Fyn kinase in mast cell and IgE-media-ted type I hypersensitivity rsponse in vivo. Bio-chemical Pharmacology 2009; 77: 1506-1512

12. Kim SH, Kim BK, Lee YC. Antiasthmatic effects of hesperidin, a potential Th2 cytokine antago-nist, in a mouse model of allergic asthma. Me-diators Inflamm 2011;485402

13. KO WCH, Liu PY, Chen JL, Leu IJ, Shih CM. Re-laxant effects of flavonoids in isolated guinea pig trachea and their structure- activity rela-tionships. In Planta medica. 2003; 12: 1086-1090

14. Li AN, Li S, Zhang YJ, Xu XR, Chen YM, Li HB. Resources and biological activities of natural polyphenols. Nutrients 2014; 6: 6020-6047

15. Ma Y, Ge A, Zhu W, Liu YN, Ji NF, Zha WJ, Zhang JX, Zeng XN, Huang M. Morin attenuates oval-

bumin-induced airway inflammation in mo-dulating oxidative stress-responsive MAPK sig-naling. Oxidative Medicine and Cellular Lon-gevity 2015; 763740

16. Meeyoung L, Kim S, Kwon K, Oh SR, Lee HK, Ahn K. Anti-inflammatory and anti-asthmatic effect of resveratrol a polyphenolic stilbene, in a mouse model of allergic asthma. Internatio-nal Immunol 2009; 9: 418-424

17. Park H, Lee CH, Jung ID, Lee JS, Jeong Y, Chang JH, Chun SH, Kim MJ, Choi IW, Ahn SC, Shin YK, Yeom SR, Park YM. Quercetin regulates Th1/Th2 balance in a murine model of asthma. International Immunopharmacology 2009; 3: 261-267

18. Park SJ, Shin WO, Seo JW, Kim EJ. Anthocy-anins inhibit airway inflammation and hyper-responsiveness in a murine asthma model. Food and Chemical Toxicology 2007; 45: 1459-1467

19. Raso GM, Meli R, Carlo G, Pacilio M, Carlo R. Inhibition of nitric oxide synthase and cy-clooxygenase-2 expression by flavonoids in macrophage J774A.1. Life Sci 2001; 68: 921-931

20. Rogerio AP, Dora CL, Andrade EL, Chaves JS, Silva LF, Lemos-Senna E, Calixto JB. Anti-in-flammatory effect of quercetin-loaded micro-emulsion in the airways allergic inflammatory model in mice. Pharmacol Res. 2010; 61: 288-297

21. Szentimiklósi AJ. Study on cardiovascular and bronchial effects of FLAVIN7 in isolated tissues, 2003; Interné materiály Crystal Insti-tute Ltd., 1-79

22. Tanaka T, Takahashi R.: Flavonoids and as-thma. Nutrients 2013; 5: 2128-2143


10

Vplyv olprinonu, selektívneho PDE3 inibítora na reaktivitu dýchacích ciest v podmienkach experimentálne navodeného alergického zápalu

Martin Kertys, Anna Urbanová, Juraj Mokrý

Ústav farmakológie a BioMed, Jesseniova lekárska fakulta UK v Martine E-mail: [email protected]

Úvod Bronchiálna astma (AB) je chronická

zápalová choroba dýchacích ciest s prieduš-kovou hyperreaktivitou, ktorá vedie k opa-kujúcim sa záchvatom piskotov, dýchavice, tiesne na hrudníku a kašľa – predovšetkým v noci a v skorých ranných hodinách. Zá-chvaty sa zvyčajne spájajú s variabilnou ob-štrukciou dýchacích ciest, ktorá je reverzi-bilná buď spontánne, alebo po liečbe (Todo-Bom, 2007).

Bronchiálna astma ako zápalové ochorenie dýchacích ciest je riadené aktivá-ciou Th2 typu T lymfocytov. Tieto bunky produkujú rôzne zápalové cytokíny, akými sú IL-4, IL-13 a IL-5. Interleukín IL-4 a IL-13 stimulujú B bunky imunitného systému k produkcii IgE protilátok. IL-5 napomáhajú aktivácii eozinofilov nachádzajúcich sa v dý-chacích cestách a IL-9 spolu s IL-13 prispie-vajú k bronchiálnej hyperreaktivite (Vignola, 2000).

Je známe, že aktivácia druhých pos-lov v cytoplazme je kľúčovým mechaniz-mom v ovplyvnení aktivity zápalových bu-niek aj buniek hladkej svaloviny dýchacích ciest. Cyklický adenozín-monofosfát (cAMP) a cyklický guanozín-monofosfát (cGMP) tak zohrávajú významnú úlohu v regulácii tonusu hladkej svaloviny a lu-menu dýchacích ciest, ako aj v stabilizácii imunitných buniek. Za ich degradáciu je zodpovedný enzým fosfodiesteráza (PDE). Fosfodiesterázy (PDEs) sú skupinou hydro-lytických enzýmov zodpovedných za hyd-rolýzu fosfodiesterovej väzby v cyklickom adenozín-monofosfáte (cAMP), resp. cyk-lickom guanozín-monofosfáte (cGMP),

ktoré plnia funkciu druhých poslov v eu-karyotických bunkách. V súčasnosti je zná-mych 11 izoenzýmov (PDE 1-11) distribuo-vaných v rôznych orgánoch, kde ovplyv-ňujú rôzne funkcie. V dýchacích cestách sú majoritné izoformy PDE3 a PDE4, obe hyd-rolyzujúce cAMP, avšak prítomné sú aj PDE1, PDE5 a PDE7 vyskytujúce sa v tka-nive hladkej svaloviny, resp. zápalových bunkách (Essayan, 2001).

Pri liečbe chronických respiračných ochorení ako sú astma a CHOCHP sa využí-vajú selektívne a neselektívne inhibítory fosfodiesteráz. K tzv. neselektívnym inhibí-torom PDE patria metylxantíny (teofylín). Metylxantíny však pôsobia okrem toho aj antagonisticky na adenozínových A1 recep-toroch a aktivujú históndeacetylázu. Inhibí-ciou fosfodiesterázy dochádza k akumulácii cyklického AMP. Hoci cAMP je zodpovedný za mnoho celulárnych funkcií, pri terapii as-tmy sa využíva najmä schopnosť relaxovať hladké svalstvo bronchov a znížiť imunitnú a zápalovú aktivitu špecifických buniek. In-hibíciou PDE preto dochádza k zníženiu uvoľňovania cytokínov a chemokínov zo zá-palových buniek, čím sa zníži aj migrácia a aktivácia imunitných buniek (Dahl, 2002).

Olprinon je imidazopyridínový deri-vát selektívne inhibujúci PDE3. Má pozi-tívne inotropný účinok na myokard a vazo-dilatačný účinok, čím sa podieľa na znížení zaťaženia srdca pri insuficiencii (Mizushige, 2002). Vo viacerých štúdiách bolo pozoro-vané, že selektívna inhibícia PDE3 viedla k významnej bronchodilatácií u astmatic-kých pacientov (Bardin, 1998) a taktiež



11

viedla k zníženiu bronchokonstrikcie v ex-perimetálne navodenom alergickom zápale u morčiat (Howell, 1993). Cilostazol, selek-tívny PDE3 inhibítor redukoval bronchiálnu reaktivitu u zdravých ľudí a aj astmatikov (Fujimara, 1997). Cieľom tejto štúdie bolo zistiť vplyv olprinonu na vybrané para-metre u senzibilizovaných morčiat, u kto-rých bol experimentálne navodený aler-gický zápal charakterizujúci bronchiálnu as-tmu. Materiál a metódy

Všetky postupy boli schválené Etic-kou komisiou Jesseniovej lekárskej fakulty Univerzity Komenského v Bratislave. V ex-perimentoch boli použité zdravé dospelé samce morčiat kmeňa TRIK, ktorých hmot-nosť sa pohybovala v rozmedzí od 250-350 g. Zvieratá boli umiestnené v centrálnom zverinci a bolo im podávané krmivo a voda ad libitum. Zvieratá pochádzali z akredito-vaného chovu, podstúpili 7-dňovú karan-ténu a aklimatizáciu pred začatím experi-mentov.

Zvieratá boli náhodne rozdelené do 6 skupín (8 morčiat v skupine) nasledovne: prvá skupina bola ponechaná ako nesenzi-bilizovaná kontrola (zdravá kontrola- po-dané vehikulum) , zvyšných 5 skupín bolo senzibilizovaných ovalbumínom za účelom navodenia alergénom indukovaného aler-gického zápalu. Následne bola jedna z týchto skupín ponechaná ako senzibilizo-vaná kontrola bez liečby, a zvyšným 4 sku-pinám bol podaný olprinon v dávke 0,5 mg/kg jednorázovo resp. kontinuálne 7 dní a 1 mg/kg jednorázovo resp. kontinuálne 7 dní. Ovalbumínom indukovaná hyperreaktivita dýchacích ciest

Senzibilizácia morčiat ovalbumínom bola vykonávaná počas 21 dní. Ovalbumín bol podávaný ako 1 % roztok vo vode. Prvý deň senzibilizácie intraperitoneálne (0,5

ml) a subkutánne (0,5 ml). Na 3. deň senzi-bilizácie bol ovalbumín podaný iba intrape-ritoneálne (1 ml) a na 14. a 21. deň iba in-halačne (30 sekúnd), pričom bol rozpus-tený vo fyziologickom roztoku. Skupiny, ktorým bola podaná iba jednorázová dávka liečiva podstúpili iba 14 dňovú senzibilizá-ciu Olprinon bol podávaný intraperitone-álne, rozpustený v aqua pro injectione.

Meranie špecifického odporu dýchacích ciest – in vivo metóda

Špecifický odpor dýchacích ciest (RxV) bol meraný na bdelých zvieratách po-užitím dvojkomorového celotelového pletyzmografu pre malé zvieratá (morčatá), ktorý sa skladá z torakálnej a nazálnej ko-mory. Špecifický odpor dýchacích ciest bol meraný po 2 minútovej inhalácii fyziologic-kého roztoku a 2 minútovej inhalácií bron-chokonstrikčnej látky (histamín, 10-6 mol/l), a to 1. deň senzibilizácie pred poda-ním ovalbumínu a v 14. a 21. deň senzibili-zácie 5 hodín po aplikácii ovalbumínu.

Meranie kontraktility hladkej svaloviny - in vitro metóda

Zmeny amplitúdy kontrakcie pľúc-nych a tracheálnych stripov s hladkou sva-lovinou na bronchokonstrikčné mediátory histamín a acetylcholín (vzostupná koncen-trácia od 10-8 mol/l-1 – 10-3 mol.l-1) v pod-mienkach in vitro boli merané použitím me-tódy orgánových kúpeľov. Do jednotlivých komôrok aparatúry, v ktorých sa nachádzali tkanivové stripy, bol privádzaný pneu-moxid (95 % O2 a 5 % CO2), aby zabezpečil prísun O2 a aby sa udržalo stále pH Krebs-Henseleitovho roztoku. Teplota roztoku bola udržiavaná prostredníctvom vodného kúpeľa na hodnotách 37 ± 0,5 °C.

Štatistické spracovanie výsledkov

Výsledky sú uvádzané v grafoch a tabuľkách ako priemerné hodnoty a SEM. Štatistické rozdiely medzi skupinami boli vypočítané použitím Studentovho t-testu,


12

pričom za štatisticky významné boli pova-žované rozdiely s p < 0,05. Výsledky a diskusia

Bronchiálna astma je chronické zá-palové ochorenie tkaniva dýchacích ciest, ktoré vzniká na podklade genetickej predis-pozície a za účasti včasnej senzibilizácie ve-die k zápalu sprostredkovanému Th2 bun-kami, ktorý spôsobuje bronchiálnu hyper-reaktivitu a vedie k prestavbe dýchacích ciest s príznakmi astmy (Backer, 1995). Je dokázané, že výskyt bronchiálnej astmy v posledných desaťročiach stúpa a stáva sa závažným celospoločenským problémom. V súčasnosti postihuje približne 4 – 8 % po-pulácie, pričom v poslednom desaťročí sa prevalencia bronchiálnej astmy nezávisle od demografických faktorov zvýšila o 25 % (Sears, 2014). Antiastmatiká používané v súčasnosti delíme do dvoch hlavných sku-pín a to kontrolóry astmy (inhalačné korti-kosteroidy, antileukotriény, kromóny) a úľavové lieky, tzv. uvoľňovače (betami-metiká, anticholinergiká). Keďže mnohé z týchto liečiv majú potenciálne závažné

nežiadúce účinky, resp. môže vzniknúť re-zistencia na liečbu, výskum sa upriamuje na nájdenie nových, účinnejších a bezpečnej-ších liečiv (Zdanowich, 2007). Medzi jednu z možností patria selektívne inhibítory fos-fodiesterázy. Bolo dokázané, že majoritné izoformy v dýchacích cestách sú PDE3 a PDE4. Selektívny PDE4 inhibítor roflumi-last, je v súčasností schválený na terapiu závažnej chronickej obštrukčnej choroby pľúc a súbežne prebiehajú štúdie jeho vyu-žitia v terapii bronchiálnej astmy (Mokrý, 2014).

Našou úlohou bolo pozorovať vplyv olprinonu, selektívneho PDE3 inhibítora na reaktivitu dýchacích ciest u senzibilizova-ných morčiat. Zvieratá boli senzibilizované podľa schémy uvedenej vyššie, čo viedlo k zvýšeniu reaktivity dýchacích ciest po po-daní bronchokonstrikčných látok (histamín a acetylcholín). Po 7 dňovej aplikácii olpri-nonu v dávke 0,5 mg/kg a 1,0 mg/kg došlo k významnej redukcii a potlačeniu reakti-vity dýchacích ciest meranej metódou in vivo podľa vyššie uvedeného postupu (obr. 1.).

Obr. 1 Porovnanie zmien špecifického odporu (sRaw) dýchacích ciest u zdravej kontroly, senzibilizovanej kontroly

na 14. a 21. deň a skupín ktorým bolo podané liečivo.


13

Taktiež sme merali reaktivitu tkanív dýchacích ciest, trachey a pľúc, pomocou in vitro metódy. Reaktivita bola meraná ako zmena kontraktility stripov tkanív po po-daní histamínu a acetylcholínu (broncho-konstrikčné mediátory). Pozorovali sme vý-znamné zníženie kontraktility tkanív ako po

7 dňovej aplikácií v dávke 0,5 mg/kg a 1,0 mg/kg tak aj jednodňovej aplikácii v dávke 1mg/kg. Avšak po jednodňovej aplikácii ol-prinonu v dávke 0,5mg/kg došlo k poklesu kontraktility iba u trachey, v pľúcnom tka-nive k poklesu nedošlo ani po podaní ace-tylcholínu resp. histamínu (tab. 1 a tab. 2).

Tab. 1 Zmena kontraktility stripov tracehy a pľúc oproti senzibilizovanej skupine po podaní kumulatívnych dávok

acetylcholínu.

Tab. 2 Zmena kontraktility stripov tracehy a pľúc oproti senzibilizovanej skupine po podaní kumulatívnych dávok histamínu

Jedna z príčin prečo nedošlo k ovplyvneniu kontraktility v pľúcnom tka-nive sú farmakokinetické vlastnosti olpri-nonu a jeho neschopnosť penetrovať do pľúc v nižších koncentráciách po intraperi-toneálnom podaní. Uvedenú hypotézu plá-nujeme študovať pomocou meraní tkanivo-vých koncentrácií olprinonu pomocou vy-sokocitlivej hmotnostnej tandemovej spek-trometrie. Táto metóda nám taktiež umožní porovnať vplyv olrinonu na hodno-tené parametre in vivo a in vitro v korelácií s tkanivovou resp. plazmatickou hladinou olprinonu. Záver

Záverom môžeme konštatovať, že selektívnou inhibíciou PDE3 olprinonom sa nám podarilo redukovať reaktivitu dýcha-cích ciest v alergénom indukovanom aler-gickom zápale u morčiat. Olprinon vykazuje terapeutický potenciál v ovalbumínom in-dukovanom eozinofilnom zápale, ktorý je

typicky prítomný u astmatických pacientov. Keďže PDE3 spolu s PDE4 izoformou majo-ritne zastúpená v dýchacích cestách, pred-stavuje inhibícia týchto enzýmov jednu z nových možností intervencie pri obštrukč-ných chorobách dýchacích ciest. Práca vznikla za podpory grantu APVV-0305-12, Grantu MZ 2012/35-UKMA-12 a grantu VEGA 1/0260/14. Podporené projektom Bio-med (ITMS 26220220187). Zoznam použitej literatúry 1. Backer V. Bronchial hyperrespensiveness

in children and adolescents. Danish Me-dical Bulletin, 1995, 42: 397–409

2. Bardin PG. Effect of selective phospho-diesterase 3 inhibition on the early and late asthmatic responses to inhaled aller-gen. British Journal of Clinical Pharmaco-logy, 1998, 45: 387-391.

3. Barnes PJ. Severe asthma: advances in cur-rent management and future therapy. The


14

journal of allergy and clinical immunology, 2012, 129:48-59.

4. Dahl R, et al. Effect of long-term treatment with inhaled budesonide or theophylline on lung function, airway reactivity and as-thma symptoms. Respiratory Medecine. 2002; 96: 432–438.

5. Essayan D.M. Cyclic nucleotide phospho-diesterases. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 2001, 108: 671−680.

6. Fujimara M et al. Effect of a phosphodies-terase 3 inhibitor, cilostazol, on bronchial hyperresponsiveness in elderly patients with asthma. International Archives of Al-lergy and Immunology. 1997, 114: 379-384.

7. Giembycz, MA. Development status of se-cond generation PDE4 inhibitors for as-thma and COPD: the story so far. Monaldi Archives for Chest Disease, 1, 2002, 48-64.

8. Gross J.H. Mass spectrometry: A Textbook. Springer, Berlin, Heidelberg, 2004, 518.

9. Hoffmann E et al. Mass Spectrometry: Pri-nciples and Applications. John Wiley & Sons, Chichester, 489.

10. Howell R. et al. Pulmonary antiallergic and bronchodilator efects of isozyme-selective phospodiesterase inhibitors in guinea pigs. Journal of Pharmacology and Experi-mental Therapeutics, 264: 609-615.

11. Hrubiško M. Astma pod kontrolou: Vieme čo to je a ako na to?. Ambulantná terapia, 2008, 6: 8-13.

12. Chung KF. Phosphodiesterase inhibitors in airways disease. European Journal of Pharmacology, 2006; 533: 110-7.

13. Mizushige K. et al. Olprinone: a phsopho-diesterase III inibitor with posible inotro-pic and vasodilator efects. Cardiovascular drugs reviews, 2002, 20: 163-174.

14. Medveďová I. et al. Influence of roflumi-last on in vivo and in vitro airways reacti-vity and apoptosis in ovalbumin sensitized guinea pigs. Advances in Experimental Medicine and Biology, 2015, 11-18.

15. Mokrý J. et al. Influence of selective inhi-bitors of phosphodiesterase 3 and 4 on co-ugh and airway. Journal of physiology and pharmacology, 2008, 59 : 473-482.

16. Mokrý J. et al. Selective PDE4and PDE5 in-hibition suppresses immunological mar-kers of ovalbumine – induced inflamma-tion in guinea pigs. International Confe-rence "Advances in Pneumology" [elektro-nický zdroj]. - Wroclaw : Medical Univer-sity, 2014.

17. Sears MR. Trends in prevalence of asthma. Chest Journal, 2014, 145:219-225.

18. Todo-Bom A. et al. Apoptosis and Asthma in the Erderly. Journal of Allergy and Cli-nical Immunology, 2007; Vol.17(2):107-112.

19. Vignola A. M. et al. Apoptosis and airway inflammation in asthma. Apoptosis 2000; 5(5):473-85.

20. Zdanowicz M. Pharmacotherapy of as-thma. American Journal of Pharmaceutical Education, 2007, 71:98.


15

Vplyv experimentálne vyvolaného alergického zápalu na ciliárnu frekvenciu

Lenka Pappová, Marta Jošková, Ivana Kazimierová, Martina Šutovská, Soňa Fraňová

Ústav farmakológie a BioMed, Jesseniova lekárska fakulta UK, Martin

E-mail: [email protected]

Úvod Mukociliárny klírens je dôležitou sú-

časťou obranných mechanizmov respirač-ného traktu. Prispieva k bariérovej funkcii epitelu dýchacích ciest, podieľa sa na klí-rense hlienu a čistí dýchacie cesty od vdýchnutých alergénov, patogénov, iritan-tov či vírusov (Ganesan et al., 2013). Hlien a cílie predstavujú dve základné zložky mu-kociliárneho transportu. Hlien tvorí súvislý gél na povrchu epitelu, v ktorom sa zachy-távajú alebo disociujú vdýchnuté enviro-mentálne častice. Táto hlienová vrstva je neustále odstraňovaná koordinovaným ryt-mickým pohybom cílií a súčasne nahradzo-vaná novosyntetizovaným hlienom (Fahy a Dickey, 2010). Zmena v ktorejkoľvek zložke môže vyvolať poškodenie mukociliárneho systému, ktorý tak nielenže stráca svoju protektívnu funkciu, ale sa môže aj vý-znamne zapájať do patogenézy chronic-kých ochorení dýchacích ciest ako je astma (Rogers, 2005). Priamym následkom spo-malenia mukociliárneho klírensu je reten-cia hlienu v dýchacích cestách. Tá výrazne prispieva k obštrukcií dýchacích ciest a ná-sledne ku klinickým prejavom astmy ako je dyspnoe či kašeľ (Munkholm a Mortensen, 2014). Navyše, neefektívne vylučovanie vdýchnutých antigénov a patogénnych or-ganizmov zvyšuje náchylnosť pacientov na respiračné infekcie a uľahčuje aeroalergé-nom interakciu s epitelom. Práve respi-račné infekcie a vystavenie epitelu aler-génu predstavujú vysoké riziko vzniku exacerbácie astmy (Holgate et al., 2009).

Mechanizmus, ktorým dochádza k zníženiu klírensu hlienu u astmy nie je plne objasnený. Avšak, patologické zmeny

epitelu DC ako je hypertrofia submukóz-nych žliazok a hyperplázia pohárikovitých buniek poskytujú uspokojivé vysvetlenie zníženia mukocilárneho transportu. Tieto bunky sú zodpovedné za produkciu nad-merného množstva patologického hlienu, ktorý je len ťažko odstraňovaný ciliárnym pohybom (Mall, 2008). Napriek uvede-nému, je pravdepodobné, že ide o multi-faktoriálnu príčinu, v ktorej ciliárna dys-funkcia môže zohrávať významnú úlohu.

V tejto práci sme sa zamerali na hodnotenie vplyvu alergického zápalu na ciliárnu frekvenciu, ktorá predstavuje je-den zo základných farmakokinematických parametrov ciliárneho pohybu určujúceho rýchlosť mukociliárneho transportu (Bra-iman a Priel, 2008). Zmeny v ciliárnej frek-vencií sme sledovali na dvoch modeloch alergickej astmy a získané výsledky sme ko-relovali so zmenami zápalových cytokínov (IL-4, IL-5, IL-13) v bronchoalveolárnej la-váži (BAL). Materiál a metódy Zvieratá

Experiment bol schválený Etickou komisiou Jeseniovej lekárskej fakulty v Martine, Univerzity Komenského v Brati-slave a vykonaný v súlade s požiadavkami na ochranu zvierat používaných na vedecké alebo vzdelávacie účely. V experimente boli použité dospelé samce kmeňa TRIK s hmot-nosťou 200-350 g. Zvieratá boli náhodne rozdelené do experimentálnych skupín (n=8):

i) Kontrolná skupina (zvieratám bolo po-dávané len vehikulum ovalbumínu v súlade so senzibilizačnou schémou)



16

ii) Skupina zvierat, ktorá podstúpila 21 dňovú senzibilizáciu ovalbumínom (trojtýždňový model experimentálne vyvolaného alergického zápalu);

iii) Skupina zvierat, ktorá podstúpila 28 dňovú senzibilzáciu ovalbumínom (štvortýždňový model experimentálne vyvolaného alergického zápalu).

Experimentálny model alergického zápalu dýchacích ciest

Alergický zápal bol indukovaný pra-videlnou expozíciou zvierat alergénu oval-bumínu. Ovalbumín bol aplikovaný ako 1% roztok spolu s nosičom hydroxidom hlini-tým v pomere 1:20 (5 mg OVA/100 mg Al(OH)3/zviera), intraperitoneálne a subku-tánne alebo ako čistý 1% roztok, inhalačne. Roztok ovalbumínu bol aerosolizovaný pro-stredníctvom nebulizátora (PARI jet nebuli-ser, Paul Ritzau, Pati-Werk GmbH, Ger-many, output 5 1.s-1, particles mass median diameter 1,2 µm), ktorý je súčasťou dvojko-morového celotelového pletyzmografu (HSE typ 855, Hugo Sachs Elektronik, Ne-mecko). Počas 21 dňovej senzibilizácie zvie-rat, bol ovalbumín podávaný intraperitone-álne v 1., 4., 11. a 15. deň, subkutánne v 1., 9. a 14.deň a inhalačne v 16., 17., 18., 19. a 20. deň senzibilizácie (Fraňova, 2013). Pri 28 dňovom modeli senzibilizácie ovalbumí-nom, bol ovalbumín aplikovaný intraperi-toneálne v 1. a 4. deň, subkutánne v 1., 12. a 20. deň a inhalačne v 9., 15., 18., 22., 24. a 27. deň senzibilizácie. Frekvencia kmitania cílií

Frekvenciu kmitania cílií sme hod-notili v in vitro podmienkach, 24 hodín po poslednej dávke ovalbumínu. Zvieratá boli usmrtené transverzálnym prerušením mie-chy. Z proximálnej časti trachey sme cyto-logickou kefkou odobrali vzorku ciliárneho tkaniva. Získaná vzorka bola resuspendo-vaná na podložnom sklíčku v kvapke fyzio-logického roztoku. Pohyb cílií bol sledovaný svetelným mikroskopom a zaznamenávaný

vysokorýchlostnou kamerou (BASLER A 504kc). Z každej vzorky sme získali približne 10 videozáznamov. Krátke videosekvencie boli analyzované softwérom LabwiewTM, ktorý identifikoval oblasti záujmu (ROI) s pohyblivými cíliami. Pre každú ROI bol vy-počítaný medián frekvencie kmitania cílií, ktorý bol použitý ako hodnotiaci parameter ciliárnej kinematiky. Výsledná hodnota ci-liárnej frekvencie pre jednu vzorku bola vy-jadrená ako priemer mediánov jednotli-vých oblastí vzorky. Stanovenie Th2 cytokínov v BAL

Bronchoalveolárnu tekutinu sme získali výplachom pravého bronchu fyzio-logickým roztokom zahriatým na telesnú teplotu. Potrebné množstvo fyziologického roztoku bolo vypočítané podľa hmotnosti zvieraťa (10 ml/kg). Hladiny sledovaných zápalových mediátorov boli stanovované v supernatante BAL. Na kvantifikáciu a kvali-fikáciu cytokínov sme použili komerčne do-stupnú súpravu Th1/Th2 panel Human Cy-tokine, 9 - Plex, Bio-Plex Pro™ Human Cyto-kine (BIO-RAD, USA) s obsahom všetkých potrebných reagentov a protilátok. Postup analýzy bol vykonaný podľa odporúčaní vý-robcu a reakčná zmes bola analyzovaná prí-strojom Bio-Plex® 200 System (Bio-Rad, USA). Výstupné údaje boli vyhodnotené softvérom Bio-Plex Manager™ 6.0 a pre-zentované ako koncentrácia v pg/ml. Štatistická analýza

Výsledky sú v grafoch uvádzané ako priemer ± SEM. Na štatistické spracovanie výsledkov sme použili analýzu rozptylu s jedným faktorom (ANOVA). Za štatisticky významné boli považované rozdiely s p < 0,05. Výsledky Frekvencia kmitania cílií

Frekvencia kmitania cílií (Hz) je jed-ným zo základných hodnotiacich paramet-rov kinematiky cílií respiračného traktu.


17

Alergický zápal, indukovaný 21 dňovou sen-zibilizáciou zvierat ovalbumínom, vyvolal mierny vzostup ciliárnej frekvencie. Nao-pak, predĺženie senzibilizácie pri štvortýž-dňovom modely alergického zápalu dýcha-cích ciest viedlo k štatisticky signifikant-nému poklesu ciliárnej frekvencie v porov-naní s kontrolnou skupinou (obr. 1). Hladiny zápalových cytokínov v BAL

Hladiny Th2 cytokínov boli stano-vené v bronchoalveolárnej laváži. Oba ex-perimentálne modely alergického zápalu dýchacích ciest boli charakterizované signi-fikantným zvýšením hladín IL-4, IL-5 a IL-13 v porovnaní s kontrolnou skupinou. Hla-diny IL-4 boli u oboch modelov porovna-teľné. Výrazný rozdiel sme zaznamenali v koncentráciách IL-5 a IL-13. U štvortýž-dňového modelu alergického zápalu sme pozorovali výrazný nárast v hladinách IL-5

a pokles IL-13 v porovnaní s trojtýždňovým modelom (obr. 2)

Obr. 1 Zmeny ciliárnej frekvencie (Hz) v podmien-kach experimentálne vyvolaného alergického zá-palu u trojtýždňového a štvortýždňového modelu alergického zápalu dýchacích ciest. Hodnoty v gra-foch sú uvádzané ako priemer ± SEM. Štatistická vý-znamnosť: + p<0,05 vs. kontrola

Obr. 2 Porovnanie zmien v hladinách zápalových cytokínov (pg/ml) IL-4, IL-5 a IL-13 stanovených v BAL u tro-jtýždňového a štvortýždňového experimentálneho modelu alergického zápalu dýchacích ciest . Hodnoty v gra-foch sú uvádzané ako priemer ± SEM. Štatistická významnosť:: +++ p<0,001 vs. kontrola; ++ p<0,01 vs. kontrola; + p<0,05 vs. kontrola

Diskusia Alergický zápal zohráva kľúčovú

úlohu v patogenéze astmy. Je iniciovaný na povrchu epitelu, ktorý sa zároveň aktívne podieľa na regulácií zápalového procesu. Aktivácia epitelových buniek alergénom ve-die k uvoľneniu mnohých cytokínov a che-

mokínov, ktoré stimulujú aktivitu subepite-liálnych dendritických buniek, mastocytov, priťahujú imunitné bunky a podporujú roz-voj Th2 alergického zápalu (Erle a Shepard, 2014). Th2 efektorové bunky sú zdrojom cytokínov (IL-4, IL-5, IL-9 a IL-13), ktoré podporujú vznik alergickej imunopatológie. Stimulujú dozrievanie a diferenciáciu


18

mastocytov, vyvolávajú eozinofíliu a zvy-šujú IG-E produkciu v B bunkách . Výsled-kom tejto zložitej imunologickej kaskády je infiltrácia bronchiálnej sliznice mnohými zápalovými bunkami (Leonardi et al., 2013; Locksley, 2010). Tie uvoľňujú komplex zá-palových mediátorov, ktoré nielenže regu-lujú imunitnú a bronchokostrikčnú odpo-veď na inhalovaný alergén, ale zároveň ovplyvňujú funkciu jednotlivých štrukturál-nych zložiek dýchacích ciest (Halwani et al. 2011). Ciliárne bunky, umiestnené na roz-hraní vonkajšieho a vnútorného prostredia, sa tak stávajú jedným z hlavných cieľových štruktúr, na ktoré pôsobia endogénne uvoľ-nené mediátory (Rogers, 2004). Ich kom-plexný účinok môže viesť k zvýšeniu ako i k zníženiu ciliárnej frekvencie s násled-ným ovplyvnením mukociliárneho tran-sportu (Grzela et al., 2013). Podľa Svarten-grena a kol. (1989) mukociliárny klírens môže byť zvýšený, ale i znížený u astmy. Autori taktiež uvádzajú, že iniciálna zápa-lová reakcia môže viesť k prechodnému po-dráždeniu a zvýšeniu mukociliárneho tran-sportu. V našej práci, výsledný efekt expe-rimentálne vyvolaného alergického zápalu viedol k miernemu zvýšeniu ciliárnej frek-vencie u trojtýždňového a naopak k signifi-kantnému poklesu ciliárnej motoriky u štvortýždňového modelu alergického zá-palu dýchacích ciest (obr.1). Práve prvotné zvýšenie ciliárnej frekvencie môže byť príči-nou zvýšenia mukociliárneho transportu. Našim cieľom bolo tieto zmeny v ciliárnej frekvencii korelovať so zmenami v hladi-nách zápalových cytokínov stanovených v BAL. Zamerali sme sa na hlavné Th2 cyto-kíny IL-4, IL-5 a IL-13, ktoré sa významne podieľajú na riadení zápalového procesu. Kým hladiny IL-4 boli u oboch modelov po-rovnateľné, výrazná zmena nastala v hladi-nách IL-5 a IL-13 (obr.2). IL13 má mnoho pleiotropných účinkov na epitel dýchacích ciest. Stimuluje transdiferenciáciu ciliár-nych buniek na pohárikovité, indukuje ich hyperpláziu, inhibuje transkripčný faktor

nevyhnutný pre syntézu cílií a stimuluje ex-presiu mucínov ako hlavnej zložky hlieno-vej vrstvy. Taktiež je v literatúre jedným z najpopisovanejších interleukínov, ktoré priamo inhibujú ciliárny pohyb (Laoukili et al. 2011; Gomperts et al., 2007). Napriek ši-rokému spektru účinkov, výraznejší nárast koncentrácie IL-13 u trojtýždňového mo-delu (obr.2) nebol sprevádzaný znížením ci-liárnej frekvencie (obr.1). Naopak, zníženie pohybu cílií sme zaznamenali u štvortýž-dňového modelu (obr.1), ktorý bol charak-terizovaný redukciou IL-13 a výrazným ná-rastom IL-5 v porovnaní s trojtýždňovým modelom (obr.2). Tento interleukín zo-hráva kľúčovú úlohu v regulácií rastu, dife-renciácie a aktivácie eozinofilov. Zrelé, ak-tívne eozinofily za prítomnosti IL-5 degra-nulujú a uvoľňujú katiónové proteíny zahr-ňujúc hlavný bazický proteín (Barnes, 2011). Ten môže priamo rozrušiť epitel dý-chacích ciest a zároveň vykazuje silný cilio-inhibičný účinok (Del Donno et al., 2000).

Okrem týchto vysoko toxických lá-tok eozinofily uvoľňujú aj lipidové mediá-tory (Holgate, 2008), z ktorých najmä leu-kotriény D4 a C4 preukázali v experimen-tálnych štúdiách negatívny vplyv na ciliárnu frekvenciu (Bisgaard a Pedersen, 1987). Tak pozorované zníženie ciliárnej frekven-cie u štvortýždňového modelu alergického zápalu môže byť výsledkom aktivácie eozi-nofilov.

Záverom môžeme konštatovať, že zníženie ciliárnej frekvencie môže výrazne prispievať k zníženiu mukociliárneho tran-sportu u astmy a zároveň tak znížiť rezis-tenciu epitelu voči škodlivinám. Naše vý-sledky taktiež naznačujú možný nepriaz-nivý vplyv IL-5 na ciliárnu frekvenciu, prav-depodobne sprostredkovaný cez aktiváciu eozinofilov, ktoré sú bohatým zdrojom cili-oinhibičných mediátorov.

Práca vznikla za podpory grantov APVV 0305-12, VEGA 1/0165/14 a MZ 2012/35- UK, CERK II


19

Zoznam použitej literatúry 1. Barnes PJ. Pathophysiology of allergic in-

flammation. Immunol Rev. 2011 Jul;242(1):31-50.

2. Bisgaard H, Pedersen M. SRS-A leukotrie-nes decrease the activity of human respi-ratory cilia. Clin Allergy. 1987 Mar;17(2):95-103.

3. Braiman A., Priel Z. Efficient mucociliary transport relies on efficient regulation of ciliary beating. Respiratory Physiology & Neurobiology. 2008; 163(1-3): 202-7

4. Del Donno M, Bittesnich D, Chetta A, Oli-vieri D, Lopez-Vidriero MT. The effect of inflammation on mucociliary clearance in asthma: an overview. Chest. 2000 Oct;118(4):1142-9.

5. Erle DJ, Sheppard D. The cell biology of as-thma. J Cell Biol. 2014 Jun 9;205(5):621-31

6. Fahy JV, Dickey BF. Airway Mucus Fun-ction and Dysfunction. The New England journal of medicine. 2010; 363(23):2233-2247

7. Franova S, Joskova M, Sadlonova V, Pavel-cikova D, Mesarosova L, Novakova E, Su-tovska M. Experimental model of allergic asthma. Advances in Experimental Medi-cine and Biology. 2013;756:49-55

8. Ganesan S, Comstock AT, Sajjan US. Barrier function of airway tract epithe-lium. Tissue Barriers 2013; 1(4):e24997

9. Gomperts BN, Kim LJ, Flaherty SA, Hackett BP. IL-13 regulates cilia loss and foxj1 ex-pression in human airway epithelium. Am J Respir Cell Mol Biol. 2007 Sep;37(3):339-46.

10. Grzela K, Zagórska W, Jankowska-Steifer E, Grzela T. Chronic inflammation in the res-piratory tract and ciliary dyskinesia. Cen-trEur J Immunol. 2013; 38 (1): 122-128

11. Halwani R, Al-Muhsen S, Al-Jahdali H, Ha-mid Q. Role of transforming growth factor-β in airway remodeling in asthma. Am J Respir Cell Mol Biol. 2011 Feb;44(2):127-33.

12. Holgate ST, Roberts G, Arshad HS, Ho-warth PH, Davies ED. The Role of the Airway Epithelium and its Interaction with Environmental Factors in Asthma Patho-genesis. Proc Am Thorac Soc. 2009 Dec;6(8):655-9.

13. Holgate ST. Pathogenesis of asthma. Clin Exp Allergy. 2008 Jun;38(6):872-97.

14. Laoukili J, Perret E, Willems T, Minty A, Parthoens E, Houcine O, Coste A, Jorissen M, Marano F, Caput D, Tournier F. IL-13 al-ters mucociliary differentiation and ciliary beating of human respiratory epithelial cells. J Clin Invest. 2001 Dec;108(12):1817-24

15. Leonardi S, Coco A, Miraglia Del Giudice M, Marseglia GL, La Rosa M.: The airway epithelium dysfunction in the pathogene-sis of asthma: The evidence. Health. 2013; 5 (2); 331-338

16. Locksley RM. Asthma and allergic inflam-mation. Cell. 2010 Mar 19;140(6):777-83

17. Mall MA. Role of cilia, mucus, and airway surface liquid in mucociliary dysfunction: lessons from mouse models. J Aerosol Med Pulm Drug Deliv. 2008 Mar;21(1):13-24.

18. Munkholm M, Mortensen J. Mucociliary clearance: pathophysiological aspects. Clin Physiol Funct Imaging. 2014 May; 34(3):171-7

19. Rogers DF. Airway mucus hypersecretion in asthma: an undervalued pathology? CurrOpinPharmacol. 2004 Jun;4(3):241-50

20. Rogers DF. Mucociliary dysfunction in COPD: effect of current pharmacothe-rapeutic options. Pulm Pharmacol Ther. 2005;18(1):1-8.

21. Svartengren M, Ericsson CH, Philipson K, Mossberg B, Carmer P. Tracheobronchial clearance in asthma-discordant monozy-gotic twins. Respiration. 1989;56(1-2):70-9.


20

Bronchodilatačné a protizápalové účinky teofylínu v závislosti od jeho plazmatických koncentrácií v modeli alergickej astmy

Anna Urbanová1, Martin Kertys1, Miroslava Šimeková2, Daniela Mokrá3, Juraj Mokrý1

1Ústav farmakológie a BioMed Martin, 2Ústav klinickej biochémie, 3Ústav fyziológie a Bi-oMed Martin, Jesseniova lekárska fakulta UK v Martine


Úvod Pri liečbe chronických respiračných

chorôb sa využívajú aj inhibítory fosfodies-teráz. Fosfodiestázy (PDE) predstavujú enzýmy, ktorých hlavnou úlohou je hyd-rolýza cyklických nukleotidov na ich neak-tívne formy. Medzi neselektívne inhibítory PDE patria metylxantíny, ktoré pôsobia rôz-nymi mechanizmami účinku. Jedným z naj-významnejších mechanizmom je práve ne-selektívna inhibícia fosfodiesteráz, kde re-laxácia hladkej svaloviny dýchacích ciest (DC) je spôsobená najmä prostredníctvom inhibície PDE3, a čiastočne aj PDE4 a PDE5.

Xantínové deriváty taktiež pôsobia antagonisticky na adenozínových A1 recep-toroch. V terapii alergickej astmy je vý-znamná najmä schopnosť relaxovať hladké svalstvo bronchov a redukovať zápalové i imunitné aktivity špecifických buniek. Pri nižších plazmatických koncentráciách teo-fylínu (5 - 10 mg/l) je významný doposiaľ neobjasnený protizápalový účinok a pri koncetráciách nad 10 mg/l dilatácia bron-chov (Barnes a Pauwels, 1994). Okrem toho metylxantíny zvyšujú aktivitu HDCA, zni-žujú hladiny vápnika v bunkách, stimulujú sekréciu adrenalínu, zvyšujú citlivosť adre-noceptorov na katecholamíny a inhibujú prostaglandíny. Výsledkom ich účinkov je uvoľnenie bronchospazmov a pľúcnych ciev, zlepšenie mukociliárnej očisťovacej schopnosti, stimulácia respiračného cen-tra, redukcia cievneho odporu v pľúcnej cirkulácii, pozitívny inotropný i chro-notropný účinok a diuretický účinok (Dahl et al., 2002).

Cieľom nášho experimentu bolo po-rovnať pôsobenie jednorazovo a dlhodobo podávaného teofylínu v rôznych dávkach na reaktivitu DC v modeli experimentálne navodeného alergického zápalu. V ďalšom postupe sme stanovovali počet leukocytov v bronchoalveolárnej laváži a v krvi. Kvôli úzkemu terapeutickémi rozsahu bolo záro-veň našim cieľom monitorovať plazmatické koncentrácie teofylínu.

Materiál a metódy

Pred začatím experimentov boli všetky experimenty schválené Etickou ko-misiou Jesseniovej lekárskej fakulty Univer-zity Komenského v Bratislave a Štátnou ve-terinárnou a potravinovou správou. V ex-perimente boli použité dospelé zdravé samce morčiat kmeňa TRIK pochádzajúce z akreditovaného chovu Dobrá Voda, kto-rých hmotnosť sa pohybovala od 250 do 400 g. Tieto zvieratá boli umiestnené v cen-trálnom zverinci, kde im bolo podávané pl-nohodnotné krmivo a voda ad libitum, a kde pred experimentmi podstúpili mini-málne 7-dňovú karanténu a aklimatizáciu.

Morčatá boli náhodne rozdelené do skupín (8 zvierat), z ktorých prvá predsta-vovala zdravú kontrolnú skupinu. V ostat-ných skupinách sa alergický zápal vyvolal ovalbumínom podávaným podľa senzibili-začnej schémy, pričom jedna z nich bola po-nechaná bez liečby (ovalbumínová kon-trolná skupina). Zvyšné senzibilizované sku-piny boli liečené rôznymi dávkami teofylínu (5, 10, 20, 50 mg/kg), a to buď jeho jedno-razovou alebo opakovanou aplikáciou.



21

Ovalbumínom navodená hyperreaktivita DC

Naša senzibilizačná schéma pro-stredníctvom ovalbumínu (Sigma Aldrich, Nemecko) trvala 21 dní. Alergén bol po-daný v 1 % koncentrácii 1. deň senzibilizá-cie intraperitoneálne (0,5 ml) a subkutánne (0,5 ml), pričom ovalbumín (OVA) sa roz-pustil v aqua pro injectione. Na 3. deň sen-zibilizácie sa OVA aplikoval iba intraperi-toneálne (1 ml) a na 14. a 21. deň iba inha-lačne (1 minútu), pričom sa rozpustil vo fy-ziologickom roztoku. Od 14. dňa boli mor-čatá liečené teofylínom.

Stanovenie špecifického odporu DC

Špecifický odpor dýchacích ciest (sRaw) predstavuje citlivý marker in vivo re-aktivity dýchacích ciest, ktorý sa hodnotí na bdelých zvieratách bez pôsobenia aneste-tika. Použitý bol celotelový pletyzmograf pre malé laboratórne zvieratá (HSE typ 855, Hugo Sachs Elektronik, Nemecko), ktorý pozostáva z torakálnej a nazálnej komory. Metóda bola popísaná Pennockom (Pen-nock et al., 1979), v ktorej princípom mera-nia je stanovenie časového posunu tlako-vých zmien medzi torakálnou a nazálnou komorou zariadenia vyjadreného v hodno-tách špecifického odporu DC. sRaw sa me-ral po 2 minútovej nebulizácii fyziologic-kého roztoku a 2 minútovej nebulizácii bronchokonstrikčne pôsobiacej látky (his-tamín, Sigma-Aldrich, Nemecko, 10-6 mol.l-1) počas 21-dňovej senzibilizácie (1., 14. a 21. deň - 5 hodín po aplikácii OVA). Vý-sledky sa hodnotili pomocou softvéru HSE Pulmodyn Pennock (Hugo Sachs Elektronik, Nemecko), v ktorých sa pri bronchokon-strikcii zvyšoval časový posun medzi zme-nou tlaku v jednotlivých komorách prístroja a tým aj hodnoty sRaw.

Stanovenie počtu eozinofilov

Po usmrtení zvierat anestetikom sme vybrali pľúca. Ľavý lalok sme lavážovali predhriatym fyziologickým roztokom (2 x

10 ml/kg) a v lavážnej tekutine sme stano-vili počet zápalových buniek, ktorý bol me-raný aj vo vzorke krvi na konci experi-mentu, kedy sa urobil náter krvi na pod-ložné sklíčko, ktoré sa nechalo uschnúť, ná-sledne sa farbilo podľa May-Grünwalda a Giemsu-Romanovského a následne sa vzorka mikroskopicky zhodnotila.

Stanovenie plazmatických koncentrácii teo-fylínu

Plazmatické koncentrácie boli me-rané vysokoúčinnou kvapalnou chromato-grafiou - HPLC (High Performance Liquid Chromatography).V našej metodike depro-teinácia vzorky bola uskutočňovaná tak, že sa ku 250 μl plazmy pridalo dvojnásobné množstvo metanolu a táto zmes sa ná-sledne pretrepepala na vortexe, zcentrifu-govala (5 min./14000 ot.) a prefiltrovala. Separácia prebiehala na kolóne C18 s re-verznými (obrátenými) fázami termostato-vanej na 40 °C a s eluentom metanol : voda (25 : 75). Objem nástreku bol 20 μl a prie-toková rýchlosť 1 ml/min. Celková dĺžka analýzy trvala 10 minút. Detekcia sa usku-točňovala prostredníctvom UV spektro-metra.

Štatistické spracovanie výsledkov

Výsledky sú uvádzané v grafoch ako priemerné hodnoty a SEM. Štatistické roz-diely medzi skupinami sa vypočítali testom ANOVA, pričom za štatisticky významné hodnoty sa považovali rozdiely s p < 0,05.

Výsledky

Plazmatické koncentrácie teofylínu sa merali pomocou HPLC. Ako prvé boli sta-novené plazmatické koncentrácie teofylínu podávaného v dávkach 5 a 10 mg/kg. Maxi-málna dosiahnutá plazmatická hladina bola 2,5 mg/l, čím sa nedosiahol rozsah terape-utických plazmatických koncentrácii teofy-línu odporúčaných v humánnej terapii, ktorý sa pohybuje v rozmedzí od 10 do 20


22

mg/l. Aj preto sme následne aplikovali zvie-ratám vyššie dávky teofylínu a merali jeho plazmatické koncentrácie (20 a 50 mg/kg). Pri týchto vyšších dávkach sme pozorovali presiahnutie odporúčaných terapeutických

koncentrácií teofylínu v humánnej medi-cíne. Na obr. 1 môžeme taktiež pozorovať, že nebol významný rozdiel medzi jedno-dňovou a sedemdňovou liečbou, čo zna-mená že pri dlhodobej liečbe nemá teofylín tendenciu sa akumulovať v organizme.

Obr. 1 Plazmatické koncentrácie teofylínu aplikovaného v dávkach 5, 10 mg/kg po jednorazovej a sedemdňovej

liečbe

Obr. 2 Plazmatické koncentrácie teofylínu aplikovaného v dávkach 20 a 50 mg/kg po jednorazovej a sedemdňovej

liečbe


23

V in vivo podmienkach ovalbumínová senzibilizácia morčiat spôsobila významné zvýšenie špecifického odporu. Následná 7-dňová liečba intraperitoneálnym podaním teofylínu ukázala po nebulizácii histamínu zníženie sRaw, a to už aj pri plazmatických koncentráciách, ktoré boli pod dolnou tera-peutickou hranicou. Vo všeobecnosti pla-tilo, že vyššia koncentrácie teofylínu viedla

k významnejšiemu zníženiu reaktivity DC (Obr. 2). V bronchoalveolárnej laváži (BAL) a krvi sme stanovovali počet eozinofilov, ktorý sa v ovalbumínom senzibilizovanej skupine významne zvýšil a liečba teofylí-nom viedla k redukcii počtu eozinofilov a to ako aj po jednorazovom (Tab. 1) tak aj po sedemdňovom podaní (Tab. 2)

Obr. 3 Zmeny špecifického odporu DC po sedemdňovej liečbe rôznymi dávkami teofylínu Tab. 1 Počet eozinofilov v krvi a BAL po jednorazovej aplikácii teofylínu (OVA = ovalbumín; T = teofylín, BAL =

bronchoalveolárna laváž; * p<0.05 vs kontrola; + p<0.05 vs OVA)

Tab. 2 Počet eozinofilov v krvi a BAL po sedemdňovej aplikácii teofylínu (OVA = ovalbumín; T = teofylín, BAL = bronchoalveolárna laváž; * p<0.05 vs kontrola; + p<0.05 vs OVA)


24

Diskusia Na našom ústave sa zaoberáme hlbším

poznaním inhibítorov fosfodiesteráz (PDE). V liečbe chronických respiračných ochorení je hlavným reprezentantom neselektívnych inhi-bítorov PDE teofylín. Napriek tomu, že sa teo-fylín používa v praxi už desiatky rokov, stále nie sú objasnené všetky jeho mechanizmy účinku. Čoraz viac zdrojov uvádza, že teofylín okrem bronchodilatačného pôsobenia disponuje aj inými anti-astmatickými účinkami. Tieto vlast-nosti zahŕňajú protizápalové a imunomodu-lačné vplyvy. Ich benefitom je, že sú prítomné pri nižších plazmatických koncentráciách ako sa požadujú pre bronchodilatačné pôsobenie teo-fylínu. Znamená to, že sa pri nich znižuje aj ri-ziko nežiaducich účinkov vzrastajúcich so stú-pajúcou plazmatickou koncentráciou, ktoré sú najlimitujúcejším faktorom použitia teofylínu v terapii (Spears et al. 2009).

Z tohto dôvodu sme stanovovali plaz-matické hladiny teofylínu. Môžeme potvrdiť, že teofylín znižuje bronchokonstrikciu aj v plaz-matických hladinách, ktoré sú pod dolnou tera-peutickou hladinou. Analýzou sme taktiež zis-tili, že viacnásobné podanie nespôsobuje aku-muláciu teofylínu v organizme a jeho plazma-tické hladiny korelujú s jednorazovou apliká-ciou.

Bronchodilatačný účinok teofylínu naj-pravdepodobnejšie vzniká v dôsledku inhibície fosfodiesteráz, ktoré spôsobujú rozpad cyklic-kých nukleotidov v bunke (Zhou et al. 2006). Naše experimenty v podmienkach in vivo po-tvrdili, že v senzibilizovaných skupinách je táto schopnosť účinná najmä pri vyšších dávkach te-ofylínu (20 a 50 mg/kg).

V súčasnosti sa rozoznáva 11 rodín PDE (Beavo & Reifsnyder 1980). Rozdielne účinky izoenzýmov PDE sa odvíjajú od funkcií orgánov a tkanív, v ktorých sú exprimované (Mokrý et al. 2009). Teofylín pôsobí na izoformy PDE ako neselektívny inhibítor, avšak nie je doteraz ob-jasnené, v akej miere sa táto inhibícia PDE po-dieľa na celkovom anti-astmatickom účinku. Pri koncentráciách teofylínu v rámci terapeutic-kého rozsahu odporúčaného v humánnej tera-pii je tento inhibičný efekt nízky.

V prezentovanej štúdii bola dosiahnutá vyššia účinnosť po dlhodobejšom podávaní te-ofylínu, čo naznačuje prevahu protizápalového

pôsobenia. Tento efekt sa potvrdil aj pri stano-vovaní kvantity zápalových buniek. V patoge-néze astmy je typický eozinofilový zápal, čo po senzibilizácii zvierat dokazuje infiltrácia eozino-filov. Naopak, následná liečba teofylínom zápal redukovala, a to ako po týždňovom, tak aj po jednorazovom podaní.

To sa potvrdilo aj v štúdii Tarayreho et al. (1992), v ktorej na senzibilizovaných morča-tách a potkanoch sa skúmal účinok teofylínu na zápalové bunky. Došli k záverom, že u morčiat sa signifikantne potlačil eozinofilový zápal DC a pri potkanoch sa redukoval zároveň aj neut-rofilový zápal. Naše zistenia tak môžu potvrdzo-vať význam použitia teofylínu v terapii astmy. Zároveň si ale myslíme, že je nesmierne dôle-žité naďalej podrobne študovať účinky a me-chanizmy metylxantínov v závislosti od ich do-siahnutej plazmatickej koncentrácie. Táto práca bola podporovaná Agentúrou na podporu výskumu a vývoja na základe Zmluvy č. APVV-0305-12, CEKR II. –Projekt spolufinan-covaný zo zdrojov EU; Grant VEGA 1/0260/14, Grant MZ 2012/35-UKMA-12; Grant Univerzity Komenského č.UK/131/2015. Zoznam použitej literatúry 1. Barnes PJ, Pauwels RA. Theophylline in the

management of asthma: time for reappra-isal? Eur Respir J 1994; 7: 579–591.

2. Beavo JA, Reifsnyder DH. Primary sequ-ence of cyclic nucleotide phosphodieste-rase isoenzymes and the design of se-lective inhibitors. Trends Pharmacol Sci 1990; 11: 150–155.

3. Dahl R, Larsen BB, Venge P. Effect of long-term treatment with inhaled budesonide or theophylline on lung function, airway reactivity and asthma symptoms. Respir Med 2002; 96: 432–438.

4. Mokrý J, Nosáľová G, Mokrá D. Influence of xanthine derivatives on cough and airway reactivity in guinea pigs. Journal of physiology and pharmacology 2009; 60: suppl 5, 87-91.

5. Pennock BE, Cox CP, Rogers RM, Cain WA, Wells JH. A noninvasive technique for me-asurement of changes in specific airway resistance. J. Appl. Physiol. 1979; 46: 399.


25

6. Spears M, Donnelly I, Jolly L, Brannigan M, Ito K, McSharry C, Lafferty J, Chaudhuri R, Braganza G, Adcock IM, et al. Effect of low-dose theophylline plus beclometasone on lung function in smokers with asthma: a pilot study. Eur Respir J 2009; 33: 1010–1017.

7. Tarayre JP, Aliaga M, Barbara M, Tisseyre N, Vieu S, Tisne-Versailles J. Model of bronchial allergic inflammation in the

Brown Norway rat. Pharmacological mo-dulation. Int J Immunopharmacol 1992; 14: 847– 855.

8. Zhou Y, Wang X, Zeng X, Qiu R, Xie J, Liu S, Zheng J, Zhong N, Ran P. Positive benefits of theophylline in a randomized, double-blind, parallel-group, placebo-controlled study of low-dose, slow-release theophylline in the treatment of COPD for 1 year. Respirology 2006; 11: 603–610.


26

Adenozíntrifosfát – regulátor pohybu cílií dýchacieho systému

Marta Jošková1, Peter Ďurdík2, Dušan Koniar3, Libor Hargaš3, Peter Bánovčin2, Lenka Pappová1, Soňa Fraňová1

1Ústav farmakológie a BioMed Martin, 2Klinika detí a dorastu, Jesseniova lekárska fa-kulta UK a UNM Martin, 3Katedra mechatroniky a elektroniky, Žilinská univerzita, Žilina


Úvod Bronchodilatácia, zníženie bron-

chiálnej hyperreaktivity, produkcie hlienu, potlačenie kašľa, zápalu a remodelácie v dýchacích cestách je výsledkom vplyvu špecifických modulátorov na aktiváciu ATP-dependentných káliových kanálov (KATP) a vysoko alebo stredne vodivých na Ca2+ zá-vislých káliových kanálov. Káliové iónové kanály preto zohrávajú rozhodujúcu úlohu v liečbe bronchiálnej astmy a chronickej obštrukčnej choroby pľúc (Malerba et al., 2010).

KATP kanály uľahčujúce vtok K+ do vnútra bunky sú tvorené 4 membránovými pórmi Kir6.x a 4 riadiacimi podjednotkami receptora pre sulfonylmočovinu (SUR). Kir6.x existujú v 2 izoformách: Kir6.1 a Kir6.2. SUR sú známe ako regulátory ióno-vých kanálov využívajúce energiu počas hydrolýzy ATP (adenozíntrifisfát) v oblasti špecifických domén viažucich nukleotidy, ktoré sa nachádzajú vo vnútrobunkovej časti receptora (obr. 1).

Kir6.1 je exprimovaný spolu so SUR2B v srdci, ováriách, nadobličke, pľúcach, v mozgu, žalúdku, hrubom čreve, testes, štítnej žľaze, pankrease, pečeni, tenkom čreve a hypofýze. ATP, uridín 5´- di-fosfát, nicorandil, diazoxid, guanozín 5´-di-fosfát, pinacidil, guanozín-5´- trifosfát, cro-makalim a minoxidil pôsobia ako jeho ago-nisty. Účinok ATP je závislý od dávky. ATP aktivuje tieto kanály za prítomnosti podjed-notky SUR2B pri koncentrácii nižšej ako 10-

5 mol.l-1, zatiaľ čo pri koncentrácii vyššej ako 10-4 mol.l-1 ich inhibuje. Ako blokátory

tohto iónového kanála boli potvrdené gli-benclamid a tolbutamid (Slesinger et al., 2015).

Obr. 1 Nukleotidmi sprostredkovaná regulácia ATP-dependentných káliových kanálov (KATP) (Ni-chols CG, 2006, Nature)

Kir6.2 verifikovaný v kostrovom svale, srdci, Langerhansových ostrovče-koch pankreasu a mozgu, sa spája s podjed-notkou SUR1, SUR2A alebo SUR2B. Diazo-xid, pinacidil, cromakalim, diazoxid, ni-corandil a minoxidil pôsobia ako jeho ago-nisty, glibenclamid a tolbutamid ako bloká-tory iónového kanála (Slesinger et al., 2015).



27

KATP kanály sú považované za spoje-nie medzi bunkovým metabolizmom a exci-tabilitou bunky. Navyše sú cieľom pôsobe-nia neuropeptidov a neurotransmiterov. Ich aktivita sa zvyšuje pôsobením ade-nozínu, kalcitonínu génovo príbuzného peptidu (CGRP), prostacyklínu, β-agonistov prostredníctvom proteinkinázy A (PKA) a tvorby cyklického 3‘, 5‘-adenozínmo-nofosfátu (cAMP), zatiaľ čo kontraktilní agonisty napr. angiotenzín II, endotelín-1, serotonín, noradrenalín alebo α-agonisty, vazopresín, neuropeptid Y, ktorí aktivujú proteinkinázu C (PKC), znižujú aktivitu KATP kanálov, výsledkom čoho je depolarizácia a kontrakcia.

ATP je dôležitý nukleotid zložený z adenozínu a trojice fosfátov naviazaných na 5’uhlíku. Je bezprostredným energetic-kým zdrojom pre procesy, ktoré si vyžadujú dodanie energie. K takýmto procesom patrí aj pohyb cílií, ktoré sú motorickým kompo-nentom obranného mechanizmu dýchacích ciest, mukociliárneho transportu. Dyneín ako jeden zo štrukturálnych proteínov cílií v dôsledku spontánnej ATP-ázovej aktivity umožňuje ich pohyb za bazálnych podmie-nok. Fosforyláciu jeho ľahkého reťazca za-bezpečuje aktivácia PKA v axonéme ria-sinky po aktivácii adenylátcyklázy a syntéze cAMP. Táto signálna dráha mediovaná cez receptory spojené s GS-proteínom mení rýchlosť posunu mikrotubulov. Bazálna frekvencia pohybu cílií je pomalá a zvyšuje sa v odpovedi na exo- a endogénne faktory (Gudis, 2012). ATP je jedným z najčastej-ších parakrinných mediátorov v dýchacích cestách uvoľňovaný bunkami epitelu v od-povedi na stresové stimuly (Salthe, 2007). Ako purinergný agonista zvyšuje vnútro-bunkovú koncentráciu Ca2+ v ciliárnych bunkách trachey a sekundárne aj frekven-ciu kmitania cílií (CBF), avšak bez efektu na

CBF v distálnych častiach dýchacieho sys-tému (Hayashi et al., 2005).

Hoci KATP kanály boli po prvýkrát identifikované v kardiálnych myocytoch, v súčasnosti už vieme o ich expresii v rôz-nych tkanivách. Na úrovni dýchacieho sys-tému boli potvrdené v alveolárnych bun-kách (Trinh et al., 2007), epitely dýchacích ciest (Trinh et al., 2008) a imunocytoche-micky boli dokázané aj v ciliárnych bunkách (Ohba et al., 2013).

Zaujímalo nás preto, akú úlohu zo-hrávajú KATP kanály v regulácii CBF trachey morčiat za fyziologických podmienok. Ex-perimenty boli realizované v in vitro pod-mienkach po odobratí steru sliznice trachey brushingovou metodikou. Biologický mate-riál bol použitý na prípravu mikroskopic-kého preparátu, ktorý bol monitorovaný použitím vysokorýchlostnej kamery napo-jenej na mikroskop a počítač. Sledovaným parametrom bola CBF. Na potvrdenie regu-lačnej úlohy KATP kanálov v pohybe cílií boli lokálne použité otvárače (Pinacidil) a bloká-tory spomenutých typov káliových kanálov (Glibenclamid). Krátke videozáznamy boli spracované softvérom Ciliary Analysis a štatisticky vyhodnotené pomocou ANOVA Bonferroni a Post-Hoc testov. Za štatisticky signifikantné boli považované hodnoty P-value menej ako 0,05.

V našej experimentálnej štúdii sme potvrdili dôležitú úlohu KATP kanálov v regu-lácii CBF trachey morčiat za fyziologických podmienok (Obr. 2). Naše výsledky boli v súlade s výsledkami japonskej experi-mentálnej štúdie realizovanej u myší, ktorá zistila, že otvorenie KATP kanálov spojenej s hyperpolarizáciou membrány indukuje zvýšenie vnútrobunkovej koncentrácie Ca2+ v dôsledku otvorenia na napätí nezávislých Ca2+ kanálov s následným influxom Ca2+ do vnútra bunky a zrýchlením pohybu cílií (Ohba et al., 2013).


28

Obr. 2 Úloha KATP iónových kanálov v regulácii frekvencie kmitania cílií (CBF) trachey morčiat za fyziologických in vitro experimentálnych podmienok. Kontrola- cílie trachey zdravých morčiat získané brushingovou metodikou a exponované fyziologickým roztokom; DMSO - cílie trachey zdravých morčiat získané brushingovou metodikou a exponované 10 % DMSO; P6 - cílie trachey zdravých morčiat získané brushingovou metodikou a exponované otváraču KATP kanálov, Pinacidilu, v koncentrácii 10-6 mol.l-1; P6G5 - cílie trachey zdravých morčiat získané brushin-govou metodikou a exponované Pinacidilu v koncentrácii 10-6 mol.l-1 a blokátoru KATP kanálov, Glibenclamidu, v koncentrácii 10-5 mol.l-1. Vyznačené odchýlky označujú štandardnú chybu priemeru ±SEM; n=8; *P<0,05 vs. kontrola; xP˂0,05 vs. P6 skupina.

Poďakovanie: Tento výskum bol podporený nasledujúcimi projektami a grantami: VEGA 1/0165/14; MZ 2012/35-UK MA-12; APVV-0305-12; BioMed Martin (ITMS 26220220187); CEKR II. Zoznam použitej literatúry: 1. Gudis D, Zhao KQ, Cohen NA. Acquired ci-

lia dysfunction in chronic rhinosinusitis. Am J Rhinol Allergy 2012; 26: 1-6.

2. Hayashi T, Kawakami M, Sasaki S, Katsu-mata T, Mori H, Yoshida H. ATP regulation of ciliary beat frequency in rat tracheal and distal airway epithelium. Exp Physiol 2005; 90:535-544.

3. Malerba M, Radaeli A, Mancuso S a Polosa R. The potential therapeutic role of potas-sium channel modulators in asthma and chronic obstructive pulmonary disease. J Biol Regul Homeost Agents 2010; 24: 123-130.

4. Nichols CG. KATP channels as molecular sensors of cellular metabolism. Nature 2006; 440: 470-476.

5. Ohba T, Sawada E, Suzuki Y, Yamamura H, Ohya S, Tsuda H, Imaizumi Y. Enhance-ment of Ca2+ influx and ciliary beating by membrane hyperpolarization due to ATP-sensitive K+ channel opening in mouse

airway epithelial cells. J Pharmacol Exp Ther 2013; 347: 145 – 153.

6. Salathe M. Regulation of mammalian ci-liary beating. Annu Rev Physiol 2007; 69: 401-422.

7. Slesinger PA, Nichols CG, Palmer LG, Sackin H, Tucker S, Adelman JP, Clapham DE, Hibino H, Inanobe A, Jan LY, Karschin A, Kubo Y, Kurachi Y, Lazdunski M, Miki T, Pearson WL, Seino S, Vandenberg CA. In-wardly rectifying potassium channels. IU-PHAR/BPS Guide to PHARMACOLOGY 2015, http://www.guidetopharmacol-ogy.org/GRAC/FamilyDisplayFor-ward?familyId=74

8. Trinh NT, Privé A, Kheir L, Bourret JC, Hijazi T, Amraei MG, Noël J a Brochiero E. Invol-vement of KATP and KvLQT1 K+ channels in EGF-stimulated alveolar epithelial cell re-pair processes. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2007; 293: L870-L882.

9. Trinh NT, Privé A, Maillé E, Noël J a Bro-chiero E. EGF and K+ channel activity con-trol normal and cystic fibrosis bronchial epithelia repair. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2008; 295: L866-L880.

*×

0

5

10

15

20

CB

F (H

z)

kontrola DMSO P6 P6G5

http://www.guidetopharmacology.org/GRAC/FamilyDisplayForward?familyId=74




29

Mechanizmy regulujúce kontraktilitu maternice

Michaela Kocmálová, Martina Šutovská, Soňa Fraňová

Divízia Respirológie, Biomed Martin, Jesseniova lekárska fakulta UK, Martin E-mail: [email protected]

Úvod

Hladká svalovina (HS) maternice je vysoko excitabilné tkanivo, v ktorom za normálnych podmienok prebiehajú spon-tánne rytmické kontrakcie rôznej frekven-cie a amplitúdy (Parkington a spol., 1988). Aby sa mnohobunková HS kontrahovala ako orgán, je nevyhnutné, aby bola kon-trakcia individuálnych buniek koordino-vaná prostredníctvom tzv. sekvenčnej de-polarizácie buniek. Depolarizácia jednej

bunky vedie k aktivácii len jej susediacich nedepolarizovaných buniek a vlna aktivá-cie postupuje v špecifickom smere, ktorý vyžadujú organizované kontrakcie (Bárdoš. 1993).

Počas gravidity je maternica rela-tívne v pokoji, vyskytujú sa len slabé spo-radické kontrakcie HS. S nástupom pôrodu začnú v maternici prebiehať čoraz silnejšie a častejšie kontrakcie (Obr.1).

Obr. 1 Rozdiely vo výške amplitúdy a frekvencii kontrakcií navodených oxytocínom vo vzorkách gravídneho my-ometria v experimentálnych podmienkach. Na sledovanie rozdielov boli použité izolované prúžky HS maternice získanej od tehotných žien počas pôrodu. Kontrakčná aktivita bola porovnávaná s frekvenciou a amplitúdou kon-trakcií myometria netehotných žien (Šutovská a spol., 2015). A- Amplitúda oxytocínom navodených kontrakcií myometria B- Frekvencia oxytocínom navodených kontrakcií.

Kontraktilnými proteínmi v myo-metriu sú aktín a myozín. Hrubé filamenty, ktoré obsahujú myozín, sú vmedzerené medzi tenké filamenty tvorené aktínom. Usporiadanie filamentov v myometriu nie je pravidelné. Tenké filamenty môžu byť usporiadané paralelne s osou bunky, ale aj rozličných iných tvaroch, no neustále v spo-jení s plazmatickou membránou bunky pro-stredníctvom fokálych adhézií (Bárdoš,

1993). Tento prechod z pokojového stavu do oscilačných cyklov silnej kontrakcie je príkladom fenotypovej plasticity závislej na tom, či sa v bunke budú môcť modifikovať ich signalizačné dráhy. Na základe modifi-kácie signalizačných dráh buniek HS mater-nice vznikajú membránové oscilácie. Ide o endogénny stimulačný mechanizmus umiestnený v plazmatickej membráne, ktorý opakovane vytvára akčný potenciál



30

(AP) zodpovedný za riadenie kontrakcií po-čas pôrodu (Berridge, 2008).

V predloženej práci sme sa zamerali na prehľad najdôležitejších mechanizmov kontrakcie hladkého svalu maternice. Membránový potenciál

Kontrakcie HS maternice vyskytu-júce sa počas pôrodu sú riadené vznikom pravidelných AP. Synchrónne kontrakcie sú závislé na AP šírenom cez vrsty HS mater-nice rýchlosťou 4 cm.s-1 (Berridge, 2008). AP vytvorený influxom katiónov je zodpo-vedný za depolarizáciu bunky HS. V bun-kách HS je depolarizačný AP sprostredko-vaný iónmi Ca2+, ktoré do bunky vstupujú cez napäťovo riadené Ca2+ kanály (VOC) (Wray, 1993). Po depolarizácii nastáva ná-sledkom uvoľnenia K+ a súčasne prebieha-júcej inaktivácie Ca2+ repolarizačná fáza AP. Stimulácia alebo inhibícia kontraktilnej ak-tivity nastáva aj ako dôsledok modulácie aktivity iónových kanálov rôznymi farma-kologickými substanciami.

Úloha Ca2+ v aktivácii kontraktility

Okrem AP sa na kontraktilite buniek HS maternice podieľajú aj hormóny, neuro-transmitery a farmakologické látky (Fuchs, 1995). Ich schopnosť ovplyvniť bunkovú odpoveď je sprostredkovaná mobilizáciou Ca2+, ktorá spája excitáciu s kontraktilitou (Word, 1995). Transport Ca2+ sa uskutoč-ňuje prostredníctvom kanálov, ktoré umož-ňujú tok iónov cez bunkovú membránu a membránu endoplazmatického retikula (ER). Intracelulárna hladina Ca2+ v HS ma-ternice je udržiavaná prostredníctvom ago-nistami riadenej aktivácie fosfolipázy C (PLC) a tvorbou inositol trifosfátu (IP3); vtokom Ca2+ z extracelulárneho priestoru cez VOC a uvoľnením Ca2+ z intracelulár-nych zásob (Ruzycky a Crankshaw, 1988; Sanborn a spol., 1995) pomocou store-ope-rated kanálov (SOC) (Berridge, 2008). Po dosiahnutí potrebnej hladiny Ca2+ začínajú homeostatické mechanizmy pracovať na

obnove kľudového stavu aktívnym odstra-ňovaním nadbytku Ca2+ z vnútra bunky. Na homeostáze sa podieľajú energeticky ria-dené mechanizmy vychytávania sprostred-kované Ca2+/ Mg2+-ATPázami, Na+-Ca2+ vý-menným mechanizmom a tiež aj iónové ka-nály kanálov prítomné v membránach ER (organela zodpovedná za fyziologickú regu-láciu Ca2+) (Bárdoš a spol., 1993).

Iónové kanály

Pri kontrole kontraktility maternice hrá dôležitú úlohu kaskáda mechanizmov, ktorá umožňuje vstup Ca2+ cez plazmatickú membránu (L-typ a T-typ VOC) a uvoľnením Ca2+ z ER prostredníctvom IP3, ryanodín (RyR)-senzitívnych Ca2+ kanálov a SOC ka-nálov (Riemer a Heyman, 1998, Berridge, 2008). L-typ VOC boli identifikované v ľud-skom myometriu elektrofyziologickými aj farmakologickými (Collins a spol., 1996) štúdiami. Tento typ zohráva dominantnú úlohu pri riadení procesu kontrakcie/rela-xácie v myometriu (Young a spol., 1993). Ich expresia v gestačnom období je závislá na hormonálnych hladinách. V literatúre je im pripisovaná významná úloha z hľadiska vzniku kontrakcií a takisto frekvencie kon-trakcií.

Kým proces excitácie-kontrakcie je pomerne dobre popísaný, vznik membrá-nových oscilácii nie je ešte úplne objas-nený. Membránový potenciál závisí na ko-ordinovanej činnosti iónových kanálov, púmp a mediátorov, ktoré môžu buď depo-larizovať alebo hyperpolarizovať mem-bránu buniek HS. Po skončení AP sú domi-nantné hyperpolarizačné zložky. Po ich vy-čerpaní dochádza k depolarizácii bunkovej membrány (Berridge, 2008).

T-typ VOC sú zodpovedné za tvorbu nízkoprahových výbojov, ktoré vedú k osci-lačnému správaniu sa svalovej bunky (Kim a spol., 2001). V súčasnosti boli definované tri α podjednotky, z ktorých dve (Cav3.1 a Cav3.2) sú exprimované v longitudinálnej aj cirkulárnej vrstve myometria. Ich expresia


31

je závislá od gestačného veku a typu pod-jednotky (Ohkubo a spol., 2005). Predpo-kladá sa, že T-typ kanálu má silný podiel na iniciácii AP v HS maternice. Vstup Ca2+ cez T-typ VOC sa tiež podieľa na aktivácii ďalších komponentov dôležitých pre pro-ces kontrakcie HS maternice ako sú tran-sient receptor potential (TRP) ionové ka-nály, hlavne typy TRPM4 alebo TRPM5 (Berridge, 2008).

Okrem VOC sa na metabolizme Ca2+ podieľajú aj draslíkové iónové kanály. Ide hlavné o vysoko-vodivé draslíkové kanály aktivované Ca2+ (maxiK, alebo BKCa). V gra-vidnom aj negravidnom ľudskom myomet-riu je predominantne exprimovaný BKCa (Lorca a spol., 2014). BKCa kanály, aktivo-vané membránovou depolarizáciou a zvý-šením intracelulárnej koncentrácie Ca2+, zohrávajú kľúčovú úlohu v modulácii kon-traktility maternice (Khan et al., 1997). VOC a BKCa sa vzájomne ovplyvňujú. BKCa kanál je tvorený tetramerickým zoskupením α-podjednotky a akcesórnej β-podjednotky. Molekulový mechanizmus, ktorým BKCa ka-nál odpovedá na zmeny hladín vnútrobun-kového Ca2+ ešte nie je úplne objasnený. β-podjednotka určuje napäťovú a kalciovú citlivosť kanála, ktorá je spôsobená reduk-ciou expresie proteínu β-podjednotky s blí-žiacim sa termínom pôrodu. Depolarizácia indukovaná aktiváciou L-typom VOC spôso-buje vtok Ca2+, čím sa dosiahne zvýšená in-tracelulárna koncentrácia Ca2+. Následkom zvýšenej koncentrácie Ca2+ v bunke dochá-dza k aktivácii BKCa kanálov. BKCa kanály ria-dia eflux K+ a obnovia tak membránový po-tenciál, súčasne nastáva inaktivácia VOC kanálov. V intervale medzi týmito dvoma cyklami sa svalová bunka kontrahuje, a v prípade, že chemické aktivátory ostávajú k dispozícii svojim receptorom, sa aktivačná fáza opakuje v cyklických procesoch (Lorca a spol.,2014).

Menej sú preskúmané iónové ka-nály, ktoré sú súčasťou depolarizácie bun-kovej membrány. Patria sem hlavne iónové

kanály zo skupiny SOC, ktoré sú aktivované len v prípade potreby. Je známe, že SOC a hlavne Ca2+ CRAC kanály sú exprimované v HS maternice. Vzťah medzi schopnosťou oxytocínu urýchliť membránové oscilácie v ľudskom myometriu a aktiváciou SOC kaná-lov je v literatúre čoraz viac diskutovaná. Oxytocín stimuluje tvorbu IP3, následne sa vyprázdni časť zásob ER a otvoria sa SOC kanály, čo vedie k urýchleniu oscilácii. Ca2+ vstupujúce do bunky, môže tiež aktivovať aj iné kanály, ako sú Ca2+-release activated Ca2+ (CRAC), senzitívne chloridové kanály a TRPM4 alebo TRPM5 kanály (Berridge, 2008).

Uvoľnovanie Ca2+ z intracelulárnych zásob

Regulačné jednotky zodpovedné za uvoľnenie Ca2+ sú RyR a IP3 receptory na ER. RyR sú aktivované Ca2+ prechádzajú-cim cez VOC, zatiaľ čo IP3 receptory sú ak-tivované IP3, ktorý vzniká pri väzbe ago-nistu na receptor spojený s Gq proteínom a PLC (Ruzycky a Crankshaw, 1988; Sanborn a spol., 1995). Nízke cytoplazmatické kon-centrácie Ca2+ podporujú uvoľnenie Ca2+, zatiaľ čo vysoké koncentrácie Ca2+ inhibujú ďalšie uvoľňovanie tohto iónu. Predpo-kladá sa, že Ca2+ výboje majú veľkú úlohu pri tvorbe Ca2+ signálov vo vnútri bunky prostredníctvom VOC kanálov. Nízka inten-zita signálov stimuluje kontrakciu, a naopak sústredené signály s vysokou intenzitou v submembránových regiónoch vedú k re-laxácii. Aktivácia komplexu receptor – G protein – PLC vedie k úmernému nárastu koncenrácie IP3. Tento dej koordinuje uvoľ-nenia Ca2+ výbojov a vedie k ich sumácii do Ca2+ vĺn a následnej kontrakcii. Zvýšenie in-tracelulárnej koncentrácie Ca2+ ako výsle-dok VOC a IP3R aktivácie, vedie ku zvýšenej frekvencii a amplitúde výbojov Ca2+ z RyR. Pretože sú však tieto výboje lokalizované v blízkosti sarkolémy, zvýšená intracelulárna koncentrácia Ca2+ aktivuje BKCa kanály, kto-rých úlohou je obnova lokálneho membrá-


32

nového potenciálu a tak spôsobujú inhibí-ciu aktivácie VOC (Riemer a Heyman, 1998).

Počet a senzitivita receptorov spo-jených s Gq-proteínmi je zároveň regulo-vaná estrogénmi, progesterónom a pros-taglandínmi, hlavne počas gravidity. Naj-väčší podiel na tejto kontrole kontraktility maternice majú estrogény, ktoré signifi-kantne stimulujú expresiu uterotonických receptorov (Riemer a spol., 1987) a súčasne inhibujú expresiu GS proteínu, ktorý sa po-dieľa na konrole relaxácie HS myometria (Riemer a spol., 1988).

Oxytocín hrá kľúčovú úlohu v stimu-lácii kontrakcií maternice počas pôrodu. Je známe, že maternica sa stáva senzitívnou na oxytocín až v období bezprostredne pred pôrodom, pričom počas skorších týž-dňov gravidity na stimuláciu neodpovedá. Hustota oxytocínových receptorov v tomto je len sporadická, čo korešponduje s rela-tívne nízkou hladinou cirkulujúcich estrogé-nov. Vplyvom zmien v cirkulujúcich hladi-nách ženských hormónov ku koncu gravi-dity nastáva vzrast v denzite a afinite oxy-tocínových receptorov (Fuchs a spol., 1992; Shojo a Kaneko, 2001) a tým počas pôrodu prirodzene vzniká vysoký oxytocinergný to-nus. Presná úloha oxytocínu v spustení pô-rodu je stále nejasná, pretože je ťažké de-monštrovať, či zvýšené hypofyzárne alebo uterinné uvoľnovanie oxytocínu predchá-dza nástupu pôrodu.

Prostaglandíny majú duálnu funk-ciu - sú schopné stimulovať kontrakciu my-ometria ale aj relaxáciu myometriálnych buniek (Mackenzie a spol., 1987). Všeo-becne je akceptované, že PGF2α a PGE2 majú vplyv na aktivitu maternice myomet-ria v období gravidity a tiež mimo tohto ob-dobia. Nebolo však dokázané, či patria me-dzi fyziologických efektorov uterotonickej aktivity myometria počas pôrodu. Existuje možnosť, že prostaglandíny sú produko-vané následkom dejov sprevádzajúcich pô-

rod vo zvýšených množstvách, ale pre sa-motný začiatok pôrodu nie sú nevyhnutné. Počas menštruačného cyklu sa PG tvoria v sliznici maternice aj v myometriu a ich zvý-šené hladiny v sekrečnej fáze spôsobujú u senzitívnych žien spastické kontrakcie ma-ternice, ktoré sú podstatou patofyziológie primárnej dysmenorey (Cibula a spol., 2002).

Prozápalový mediátor bradykinín je zodpovedný nielen za vazodilatáciu, induk-ciu biosystézy prostaglandínov (Larson a spol., 1991), ale aj stimuláciu kontraktility HS. Jeho expresia bola potvrdená v ová-riách, maternici aj v tkanive placenty, kde sa podieľa na folikulárnych kontrakciách počas ovulácie (Hellberg a spol., 1991), kontrakciách HS maternice pri pôrode a na udržiavaní uteroplacentárneho toku krvi (Seino a spol., 1982; Miatello a spol., 1992). Bradykinín spolu s oxytocínom a ostatnými uterotonickými mediátormi na indukcii ak-tivity maternice, nevyhnutnej pre pôrod (Brann a spol., 1995).

Tachykiníny patria do skupiny neu-ropeptidov, ktoré sú predominantne lokali-zované v primárnych aferentných senzitív-nych neurónoch. Do prostredia sú uvoľňo-vané centrálnou alebo lokálnou cestou a vyvolávajú silné kontraktilné odpovede maternice (Pinto a spol., 1999). Imuno-his-tochemické štúdie dokázali prítomnosť ta-chykinínových imunoreaktívnych nervov, ktoré zásobujú maternicu cicavcov vrátane myši, potkana a človeka (Traurig a spol., 1991, Shew a Papka, 1994).

Endotelín-1 (ET-1) patrí do skupiny troch izoformiem známych ako ET-1, ET-2 a ET-3. Všetky endotelíny sú považované za stimulátorov myometriálnych kontrakcií (Wright a spol., 1996; Riemer a Heyman, 1998). Najvyšší vplyv na silu a frekvencu ľudských myometriálnych kontrakcií má ET-1 (Word a spol., 1992) lokalizovaný nie-len v decidue, ale aj v myometriu gravídnej ľudskej maternice. Koncentrácia ET-1 v materskej krvi je zvýšená počas gravidity a


33

dosahuje vrchol v termíne pôrodu a sú-časne je jeho koncentrácia zvýšená aj v amniovej tekutine (Sagawa a spol., 1994). Ku koncu gravidity sa maximálne zvyšuje senzitivita buniek myometria na ET-1 (Héluy a spol., 1995), ktorá je sprevádzaná korešpondujúcimi eleváciami v denzite ET-1 receptorov (Yallampalli a Garfield, 1997).

Doplnenie zásob uvoľneného a spo-trebovaného Ca2+ je výsledkom aktivácie tzv. SOC kanálov, ktoré sú stimulované pri poklese vnútrobunkových zásob Ca2+ ER. Ku ich otvoreniu dochádza bezprostredne po vyprázdnení zdrojov intracelulárneho Ca2+. SOC sa významne odlišujú stupňom Ca2+ se-lektivity a ich aktivácia je iniciovaná výlučne pri náhlom znížení koncentrácie Ca2+ v zá-sobách, nezávisle na stimulácii receptorov. Najlepšie preskúmaným typom sú CRAC ka-

nály, ktoré sa vyznačujú vysokou selektivi-tou pre Ca2+ a extrémne nízkou vodivosťou (Berridge, 1993).

V našich experimentálnych prácach sme sa zamerali na úlohu CRAC kanálov v procese kontrakcie/relaxácie myometria žien s rozdielnou hormonálnou hladinou (Šutovská a spol., 2015). V spolupráci s gy-nekologicko-pôrodníckou klinikou JLF UK a UNM sme porovnávali aktivitu vzoriek, ktoré pochádzali od pacientok s myómom vo veku 44-50 rokov a tehotných žien v 38.-40. týždni gravidity. Testovaný blokátor CRAC kanálov kyselinu 3-fluoropyridínova-4-karboxylovú(FPCA) v 100 μM koncentrá-cii a kontrolné liečivo salbutamol sme pri-dávali ku vzorkám myometria umiestne-ných do orgánového kúpeľa. Sledovali sme vplyv testovaných látok na frekveniciu a amplitúdu kontrakcií izolovanej HS ma-ternice (obr. 2, obr. 3).

Obr. 2: Zmeny amplitúdy kontrakcie izolovanej HS maternice po podaní testovaných liečiv. Schopnosť znižovať oxytocínom navodenú kontrakciu blokátora CRAC kanálov (FPCA) sme porovnávali s klinicky používaným liečivom salbutamolom. Vo vzorkách myometria od pacientok s myómom bol ich účinok porovnateľný ale u gravídnej sku-piny bol účinnejší salbutamol ako FPCA.


34

Obr. 3: Zmeny frekvencie kontrakcií izolovanej HS maternice po podaní testovaných liečiv. CRAC blokátor (FPCA) znižoval frekvenciu kontrakcií myometria od pacientok s myómom, čo bolo takmer porovnateľné s refe-renčným liečivom. V prípade frekvencie kontrakcií myometria od gravidných pacientok v čase pôrodu frekvencia bola signifikantne znížená. Salbutamol bol v tomto prípade efektívnejší ako testovaná substancia.

V procese kontrakcie HS maternice zohráva kľúčovú úlohu Ca2+, ktorého hladina je re-gulovaná viacerými intracelulárnymi a transmembránovými mechanizmami. Počas pôrodu je kontrakčná aktivita iniciovaná predovšetkým oxytocínom a regulovaná aktivitou iónových ka-nálov. Znalosť kompletného mechanizmu vzniku kontrakcií by mohla otvoriť nové možnosti nielen pri stimulácii nedostatočnej perpôrodnej aktivity myometria, ale aj pri oddialení ná-stupu predčasného pôrodu.

Poďakovanie: Tento výskum bol podporený nasledujúcimi projektami a grantami: VEGA 1/0165/14; MZ 2012/35-UK MA-12; APVV-0305-12; BioMed Martin (ITMS 26220220187); CEKR II. Použitá literatúra 1. Bárdoš, A. Kontraktilita maternice: SAP –

Slov. Acad. Press 1993, s. 14-36 2. Berridge, M.J. Inositol trisphosphate and

calcium signaling: Nature 1993, 361:315–325

3. Berridge, M.J. Smooth muscle cell activa-tion mechanisms: J Physiol 2008, 586:5047-5061

4. Brann, D.W., Greenbaum, L., Mahesh, V.B., Gao, X.X.: Changes in kininogens and kallikrein in the plasma, brain, and uterus during pregnancy in the rat. Endocrinol., 136, 1995, s. 46-51

5. Cibula, D. Henzel, M.R. Živný, J. Základy gy-nekologickej endokrinológie.: GRADA Publ. 2002, s. 45

6. Fuchs, A.R. Behrens, O. Liu, H.C. Correla-tion of nocturnal increase in plasma oxy-tocin with a decrease in plasma estra-diol/progesterone ratio in late pregnancy: Am. J. Obstet. Gynecol. 1992, 167:1559-1563

7. Fuchs, A.R. Ivell, R. Field, P.A. Chang, S.M.T. Fields, M.J. Oxytocin receptors in bovine cervix: distribution and gene ex-pression during the estrous cycle: Biol. Reprod. 1996, 54:700-708

8. Héluy, V. Germain, G. Fournier, T. Ferré, F. Breuiller-Fouché, M. Endothelin ETA re-ceptors mediate human uterine smooth muscle contraction: Eur. J. Pharmacol. 1995, 285:89-94

9. Hellberg, P. Larson, L. Olofsson, J. Hedin, L. Brannstrom, M. Stimulatory effects of bra-dykinin on the ovulatory process in the in


35

vitro-perfused rat ovary: Biol. Reprod. 1991, 44:269-274

10. Khan, R.N. Smith, S.K. Morrison, J.J. Ashford, M.L.J. Ca2+ dependence and pharmacology of large-conductanceK+ channels in nonlabor and labor human uterine myocytes: Am. J. Physiol. 1997, 273:C1721– C1731

11. Kim, D. Song, I., Keum, S. Lee, T. Jeong, M.J. Kim, S.S. McEnery, M.W. Shin, H.S. Lack of the burst firing of thalamocortical relay neurons and resistance to absence seizures in mice lacking a1G T-type Ca2+ channels: Neuron 2001, 31:35-45

12. Larson, L. Olofsson, J. Hellberg, P. Poran-nstrom, M. Selstam, G. Hedin, L. Regula-tion of prostaglandin biosynthesis by lute-inizing hormone and bradykinin in rat pre-ovulatory follicles in vitro: Prostaglandins 1991, 41:111-121.

13. Lorca, R.A. Prabagaran, M. England S.K. Functional insights into modulation of BKCa channel activity to alter myometrial contractility: Front Physiol 2014, 5:289

14. Mackenzie, I.Z. Castle, B.M. Mountford, L. Ferguson, J. Brennecke, S. Embrey, M.P. Prostaglandin release from preparations used vaginally for the induction of labour: Prostaglandins 1987, 34:939-946

15. Miatello, R.M. Lama, M.C. Gonzalez, E.S. Nolly, H.L. Kallikrein-like activity in non pregnant rat uterus, fetal membranes, placenta and amniotic fluid: Agents Ac-tions 1992, 38:106-113

16. Ohkubo, T. Kawarabayashi, T. Inoue, Y. Ki-tamura, K. Differential expression of L- and T-type calcium channels between longitu-dinal and circular muscles of the rat myo-metrium during pregnancy: Gynecol. Ob-stet. Invest. 2005, 59:80–85

17. Parkington, H.C. Harding, R. Sigger, J.N. Coordination of electrical activity in the myometrium of pregnant ewes: J. Reprod. Fertil. 1988, 82:697-705

18. Pinto, F.M. Armesto, C.P. Magraner, J. Tru-jillo, M. Martin, J.D. Candenas, M.L. Tachy-kinin receptor and neural endopeptidase gene expression in the rat uterus: charac-terization and regulation in response to ovarian steroid treatment: Endocrinol. 1999, 140:2526-2535

19. Riemer, R.K. Goldfien, A. Roberts, J.M. Es-trogen increases adrenergic- but not cho-linergic-mediated production of inositol phosphates in rabbit uterus: Mol. Pharma-col. 1987, 32: 63-668

20. Riemer, R.K. Wu, Y.Y. Bottari, S.P. Jacobs, M.M. Goldfien, A. Roberts, J.M. Estrogen reduces beta-adrenoceptor-mediated cAMP production and the concentration of the guanyl nucleotide-regulatory pro-tein, Gs, in rabbit myometrium: Mol. Phar-macol. 1988, 33:389-395

21. Riemer, R.K. Heyman, M.A. Regulation of uterine smooth muscle function during gestation: Pediatr. Res. 1998, 44:615-627

22. Ruzycky, A.L. Crankshaw, D.J. Role of ino-sitol phospholipid hydrolysis in the initia-tion of agonist-induced contractions of rat uterus: effects of domination by 17 beta-estradiol and progesterone: Can. J. Physiol. Pharmacol. 1988, 66:10–17

23. Sagawa, N. Hasegawa, M. Itoh, H., Nanno, H. Mori, T., Yano, J. Yoshimasa, T. Nakao, K. Current topic: the role of amniotic en-dothelin in human pregnancy: Pla-centa1994, 15:565-575

24. Sanborn, B.M. Qian, A. Ku, C.Y. Wen, Y. An-wer, K. Monga, M. Singh, S.P. Mechanisms regulating oxytocin receptor coupling to phospholipase C in rat and human myo-metrium: Adv. Exp. Med. Biol. 1995, 395:469–479

25. Seino, M. Carretero, O.A. Albertini, R. Scicli, A.G. Kinins in regulation of uteropla-cental blood flow in the pregnant rabbit: Am. J. Physiol. 1982, 242:H142-H147

26. Shew, R.L. Papka, R.E. McNeil, D.L. Galanin and calcitonin generelated peptide im-munoreactivity in nerves of the rat uterus: localization, colocalization, and effects on uterine contractility: Peptides 1992, 13:273-279

27. Shojo, H. Kaneko, Y. Oxytocin-induced phosphorylation of myosin light chain is mediated by extracellular calcium influx in pregnant rat myometrium: J. Mol. Re-cognit. 2001, 14:401-405

28. Sutovska, M. Kocmalova, M. Sadlonova, V. Dokus, K. Adamkov, M. Luptak, J. Franova, S. Orai1 protein expression and the role of calcium release-activated calcium chan-nels in the contraction of human term-


36

pregnant and non-pregnant myometrium: J Obstet Gynaecol Res 2015, 41:704-711

29. Traurig, H. Papka, R.E. Saria, A. Lembeck, F. Substance P immunoreactivity in the rat mammary nipple and the effects of capsa-icin treatment on lactation: Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 1984, 328:1-8

30. Yallampalli, C. Garfield, R.E. Uterine con-tractile responses to endothelin-1 and en-dothelin receptors are elevated during la-bor: Biol. Reprod. 1997, 51:640-645

31. Young, R.C. Smith, L.H. McLaren, M.D. T-type and L-type calcium currents in freshly dispersed human uterine smooth muscle cells: Am. J. Obstet. Gynecol. 1993, 169:785-792

32. Word, R.A. Myosin phosphorylation and the control of myometrial contraction/re-laxation: Semin. Perinatol. 1995, 19:3–14

33. Word, R.A. Kamm, K.E. Casey, M.L. Contra-ctile effects of prostaglandins, oxytocin, and endothelin-1 in human myometrium in vitro: refractoriness of myometrial tissue of pregnant women to prostaglan-dins E2 and F2 alpha: J. Clin. Endocrinol. Metab. 1992, 75:1027-1032

34. Wray, S. Uterine contraction and physiolo-gical mechanisms of modulation: Am. J. Physiol. 1993, 264:C1–C18

35. Wright, H.M. Malik, K.U. Prostacyclin for-mation elicited by endothelin-1 in rat aorta is mediated via phospholipase D ac-tivation and not phospholipase C or A2: Circ. Res. 1996, 79:271-276


37

Príspevky v zborníku boli podporené projektom BIOMED Martin (ITMS 26220220187)

„Podporujeme výskumné aktivity na Slovensku/Projekt je

spolufinancovaný zo zdrojov EÚ“

Vydanie zborníka bolo podporené projektom APVV-0305-12

„Nové názory na farmakologické ovplyvnenie alergickej astmy“

Documents

Zborník prác - Jesseniova lekárska fakulta UK¥ použitej dávke (10 ug/kg), ktorá bola v porova ví s iýi prácai (Meeyoug, 2009; hirubolo, 2010) viekoľkoásob ve vižšia