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EVALUACIÓN DE LA PRODUCCION FLAVONOIDES A PARTIR DE ORÉGANO
(Origanum vulgare) MEDIANTE LA TÉCNICA DE SUSPENSIONES CELULARES.
YULIETH ALEJANDRA MANTILLA ARIAS
UNIVERSIDAD DE SANTANDER
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, FÍSICAS Y NATURALES
PROGRAMA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BUCARAMANGA
2018
ii
EVALUACION DE LA PRODUCCIÓN DE FLAVONOIDES A PARTIR DE ORÉGANO
(Origanum vulgare) MEDIANTE LA TÉCNICA DE SUSPENSIONES CELULARES.
YULIETH ALEJANDRA MANTILLA ARIAS
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito Para optar al título de
MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL
Director
CHRISTIAN ANDREI CHACIN ZAMBRANO
Ing. MSc en Biotecnología Microbiana
UNIVERSIDAD DE SANTANDER
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, FÍSICAS Y NATURALES
PROGRAMA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BUCARAMANGA
2018
iii
iv
AGRADECIMIENTOS
Quisiera agradecer a Dios, a mi familia por estar siempre a mi lado impulsándome y apoyándome
a alcanzar estos logros. A mis padres, que más que una inspiración, se han convertido en mis
asesores académicos y personales brindándome en todo momento lo necesario para convertirme en
un gran ser humano.
Agradezco a mi tutor Christian Andrei Chacín Zambrano por brindarme el apoyo y la confianza de
desarrollar mi tesis profesional el espacio e impulso para llevar a cabo cada una de mis ideas y
vivir en un ambiente idóneo la experiencia de la investigación.
Gracias María Cañas por su acompañamiento y ayuda en todo el proceso con sus conocimientos,
al profesor Fernando Acebedo por su apoyo y motivación, a Jesús Cano por su respaldo y paciencia
y a la Universidad de Santander – Sede Bucaramanga.
Al SENA Tecnoparque nodo Bucaramanga por su apoyo académico y técnico durante la ejecución
de este trabajo.
v
DEDICATORIA
A mis padres a quienes agradezco todas sus enseñanzas, y apoyo en mis decisiones sin ellos no
habría llegado a ser la persona que soy hoy, a mis hermanos por acompañarme y alegrarme la vida
a Dios por la sabiduría y la paciencia para continuar trabajando con esfuerzo alcanzando triunfos.
vi
Contenido
1 INTRODUCCIÓN .................................................................................................................... 1
2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ................................................................................. 4
3 PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN ....................................................................................... 7
4 JUSTIFICACIÓN ..................................................................................................................... 8
5 MARCO TEÓRICO ................................................................................................................ 10
5.1 Cultivo in vitro ............................................................................................................................. 10
5.2 Cultivo en suspensión .................................................................................................................. 11
5.3 Metabolitos primarios y secundarios en plantas ........................................................................ 13
5.4 Fenoles ........................................................................................................................................ 15
5.5 Flavonoides .................................................................................................................................. 16
5.6 Origanum vulgare ........................................................................................................................ 17
5.7 Diseño de Biorreactor Airlift para cultivo de células vegetales .................................................. 18
6 MARCO REFERENCIAL ...................................................................................................... 20
7 HIPÓTESIS ............................................................................................................................. 23
NULA: ..................................................................................................................................................... 23
ALTERNA: ................................................................................................................................................ 23
8 OBJETIVOS ........................................................................................................................... 24
8.1 Objetivo General: ........................................................................................................................ 24
8.2 Objetivos Específicos: .................................................................................................................. 24
9 METODOLOGÍA ................................................................................................................... 25
vii
9.1 TIPO DE INVESTIGACIÓN ............................................................................................................. 25
9.2 Fases de investigación. ............................................................................................................... 25
9.2.1 FASE I. Construcción del biorreactor ................................................................................. 25
9.2.2 FASE II. Determinación de condiciones para la obtención de flavonoides de Origanum
vulgare en biorreactor Airlift. ............................................................................................................. 25
9.2.3 FASE III. Identificación preliminar de flavonoides por medio de métodos cualitativos. .. 28
e. Determinación de fenoles y flavonoides totales ........................................................................ 30
f. Condiciones de almacenamiento ................................................................................................ 30
g. Análisis Estadístico ...................................................................................................................... 30
10 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ......................................................................................... 31
10.1 FASE I. Construcción del biorreactor .................................................................................. 31
10.2 FASE II. Determinación de condiciones para la obtención de flavonoides de Origanum
vulgare en biorreactor airlift. .................................................................................................................. 33
10.3 Producción de biomasa por tratamiento en peso fresco ................................................... 34
10.4 Incidencia de pH en la producción de flavonoides. ............................................................ 37
10.5 Influencia de los grados Brix en la producción de flavonoides. .......................................... 40
10.6 Influencia de azúcares reductores en la producción de flavonoides y crecimiento vegetal42
10.7 Producción de flavonoides con diferentes concentraciones de oxígeno y temperatura. .. 44
10.7.1 FASE III: Determinación de flavonoides totales en el extracto ......................................... 48
a. Resultados del tamizaje químico ................................................................................................. 48
11 CONCLUSIONES .............................................................................................................. 50
12 RECOMENDACIONES ..................................................................................................... 51
viii
13 ANEXOS ............................................................................................................................. 52
13.1 Anexo 1. Análisis de varianza Fase II: producción de biomasa por tratamiento en Peso
freso ............................................................................................................................................ 52
13.2 Anexo 2. Análisis de varianza Fase II: influencia del de pH en la producción de flavonoides. .... 54
flavonoides. 54
13.3 Anexo 3. Análisis de varianza Fase II Brix en la producción de flavonoides y crecimiento
vegetal ............................................................................................................................................ 55
13.4 Anexo 4. Análisis de varianza Fase II: Curva de calibración de glucosa. .................................... 56
13.5 Anexo 5. Análisis de varianza Fase II: Resultados estadísticos de azúcares reductores
(DNS) ............................................................................................................................................ 57
13.6 Anexo 6. Análisis de varianza Fase II: Curva de calibración catequina. ...................................... 58
13.7 Anexo 7. Análisis de varianza Fase II: Producción de flavonoides.............................................. 59
13.8 Anexo 8. Fase I: Diseño Biorreactor air-lift .................................................................................. 61
14 BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................. 63
ix
LISTA DE TABLAS
Tabla 1 Temperatura y oxigenación estandarizados en los tratamientos para la producción de
flavonoides a partir de Origanum vulgare. ................................................................................... 27
Tabla 2 Pruebas colorimétricas para flavonoides. ......................................................................... 49
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Prototipo del Biorreactor airlift para la producción de flavonoides. ............................. 32
Figura 2. Producción de callos a partir de Origanum vulgare con una edad de dos meses en el
laboratorio de tejidos vegetales, Universidad de Santander. ......................................................... 33
Figura 3 Cinética de crecimiento de callo de Origanum vulgare en un periodo de 20 días A) proceso
de crecimiento sin Oxígeno B) crecimiento con 0,1vvm de oxígeno C) crecimiento con 0,3vvm de
oxígeno. ......................................................................................................................................... 34
Figura 4 Resultados de pH del extracto de flavonoides obtenido a partir de Origanum vulgare en
un periodo de 20 días A) pH sin Oxigeno B) pH con 0,1vvm de oxigeno C) pH con 0,3vvm de
oxígeno. ......................................................................................................................................... 37
Figura 5. Resultados de los Grados Brix del extracto de flavonoides obtenido a partir de Origanum
vulgare en un periodo de 20 días A) Grados Brix sin Oxigeno B) Grados Brix con 0,1vvm de
oxigeno C) Grados Brix con 0,3vvm de oxígeno. ......................................................................... 40
Figura 6. Resultados de Azucares Reductores del extracto de flavonoides obtenido a partir de
Origanum vulgare en un periodo de 20 días A) DNS sin Oxigeno B) DNS con 0,1vvm de oxigeno
C) DNS con 0,3vvm de oxígeno. .................................................................................................. 42
Figura 7. Producción de flavonoides obtenidos a partir de Origanum vulgare en un periodo de 20
días A) Producción sin Oxigeno B) Producción con 0,1vvm de oxigeno C) Producción con 0,3vvm
de oxígeno. .................................................................................................................................... 44
Figura 8. Resultado positivo de la prueba de shinoda para el extracto obtenido mediante el proceso
en biorreactor A) Extracto con la prueba de shinoda B) Patrón. ................................................... 48
xi
ANEXOS
Anexo 1. Análisis de varianza Fase II: producción de biomasa por tratamiento en Peso freso .... 52
Anexo 2. Análisis de varianza Fase II: influencia del de pH en la producción de flavonoides. ... 54
Anexo 3. Análisis de varianza Fase II Brix en la producción de flavonoides y crecimiento vegetal
....................................................................................................................................................... 55
Anexo 4. Análisis de varianza Fase II: Curva de calibración de glucosa. ................................... 56
Anexo 5. Análisis de varianza Fase II: Resultados estadísticos de azúcares reductores (DNS) .. 57
Anexo 6. Análisis de varianza Fase II: Curva de calibración catequina. ...................................... 58
Anexo 7. Análisis de varianza Fase II: Producción de flavonoides. ............................................ 59
Anexo 8. Fase I: Diseño Biorreactor air-lift .................................................................................. 61
xii
GLOSARIO
Biorreactor: Es un sistema que mantiene un ambiente biológicamente activo, puede involucrar
microorganismos, o sustancias bioquímicamente activas para generar diversos procesos
biotecnológicos.
Callos: Son agregados celulares a partir de células vegetales, siendo células somáticas no
diferenciadas de un espécimen o plántula adulta.
Cultivo de tejidos: cultivo de protoplastos, células, tejidos, órganos, embriones o semillas in vitro.
Disgregación: Reducción de un fragmento vegetal, debido a la acción de agentes externos o
componentes en el medio de cultivo.
Micropropagación: Propagación vegetativa de plantas in vitro.
Reguladores de crecimiento vegetal: son moléculas orgánicas que afectan en muy pequeña
concentración, de manera profunda los procesos de la planta, tales como, el crecimiento, la
organogénesis.
Vitroplantas: son plantas que se obtienen mediante la propagación in vitro de micro plantas madre.
xiii
RESUMEN.
Título: Evaluación de la producción de flavonoides a partir de orégano (Origanum vulgare)
mediante la técnica de suspensiones celulares.
Autor: Yulieth Alejandra Mantilla Arias
Palabras clave: Cultivo in vitro, flavonoides, Origanum vulgare, Biorreactor
Descripción.
El cultivo de células y tejidos in vitro en suspensión se convierte en una alternativa para la
síntesis y obtención de metabolitos secundarios de interés industrial a partir de las plantas, dentro
de estos metabolitos podemos encontrar los flavonoides los cuales son moléculas antioxidantes,
eliminadores de radicales libres, antiinflamatorios empleados en la industria farmacéutica como
cosméticos y medicamentos. Diferentes estrategias in vitro han sido desarrolladas con el fin de
aumentar el contenido de metabolitos secundarios como el uso de biorreactores. Los cuales,
generan condiciones ideales para procesos de producción.
El objetivo de esta investigación producir flavonoides a partir de Origanum Vulgare (Orégano)
por medio de suspensiones celulares en biorreactor airlift., como resultado realizaron pruebas
colorimétricas como el ensayo de Shinoda, Álcalis, entre otros con resultado positivo, mostrando
la posible presencia de flavonas, calconas, flavonoles y flavonoides, además se obtuvo un máximo
de producción de flavonoides de 22,587,280 g de catequina por ml de extracto a partir de callos
de Origanum vulgare en un periodo de 10 días a 18 ℃.
Se evidenció que el oxígeno es una variable importante incidencia el proceso, pues se obtiene
una ganancia de 5 días para la producción de flavonoides y existen diferencias significativas (p<
xiv
0,05) con respecto a la ausencia de aireación en el sistema; y la temperatura, así como la variable
tiempo, se convierte en inductores de crecimiento y producción de flavonoides. De esta manera las
aplicaciones de nuevas técnicas biotecnológicas generan nuevas posibilidades de desarrollo
sostenible y contribuyen con la preservación del medio ambiente.
xv
ABSTRACT
Title: Evaluation of the production of flavonoids from oregano (Origanum vulgare) using the
technique of cell suspensions.
Author: Yulieth Alejandra Mantilla Arias
Key words: In vitro culture, flavonoids, Origanum vulgare, bioreactor.
Description.
The cultivation of cells and tissues in vitro suspension becomes an alternative for the synthesis
and production of secondary metabolites of industrial interest from plants, inside of these
metabolites can be found flavonoids which are molecules antioxidants, eliminators radical free,
anti-inflammatory drugs used in the pharmaceutical industry such as cosmetics and medicines.
Vitro, different strategies have been developed in order to increase the content of secondary
metabolites such as the use of bioreactors. Which create ideal conditions for production processes.
This work aims to produce flavonoids from Origanum Vulgare (Oregano) by means of cell
suspensions in bioreactor airlift., as result tested colorimetric as the trial of Shinoda, alkalis, among
others with positive result, showing the possible presence of flavones and Flavonols and calconas,
flavonoids, also obtained a maximum of production of 22,587,280 g of catechin flavonoids per ml
of extract from callus of Origanum vulgare in a period of 10 days to 18 ℃.
It was evident that oxygen is a significant variable impact the process, because you get a gain
of 5 days for the production of flavonoids and there are significant differences (p < 0,05) with
respect to the absence of ventilation system; and temperature, as well as the variable time, becomes
ii
inducers of growth and flavonoids production. In this way, applications of new biotechnological
techniques generate new possibilities.
1
1 INTRODUCCIÓN
Las plantas generan sustancias vitales para todos los ciclos por medio de la fotosíntesis,
constituyendo procesos bioquímicos y moléculas como proteínas, carbohidratos, grasas, vitaminas,
así mismo se convierten en la base de la cadena alimenticia que sobrelleva todas las formas de vida
de nuestro planeta, además mantienen la atmosfera deficiente en dióxido de carbono y rica en
oxigeno permitiéndonos respirar (Martinez M, 2005). Podemos encontrar miles de especies de
plantas, así mismo, Colombia es uno de los países que cuenta con una gran diversidad de especies
vegetales (Rangel, 2005) lo cual hace que su flora tenga una diversidad genética muy alta. (Gil
Gonzales & Miladys Esther, 2014). Una de las zonas con alta diversidad de especies aromáticas
presente es la cuenca media del cañón del río Chicamocha, el cual presenta un clima seco, con una
temperatura media de 25.4 ºC y una precipitación de 731 mm/año; en ella se asienta un tipo de
vegetación característica de estos enclaves xerofíticos interandino, por lo tanto existe un fuerte
interés en estudiar la composición y propiedades bioquímicas de distintas especies aromáticas
nativas de esta zona, además de sus usos potenciales, La flora de esta zona ha sido recientemente
estudiada para la obtención de compuestos de interés en el área de la medicina y la biotecnología.
(Días, puerto, & fernandez, 2011)
Partiendo de lo anterior, las especies aromáticas productoras de metabolitos secundarios de
interés industrial se encuentran las del género labiadas que pertenece a la familia Lamiaceae, la
cual agrupa especies medicinales, las cuales han sido utilizadas como fuente de nuevas moléculas
para la síntesis de drogas quimiopreventivas y anti-cáncer (Chacon sanchez & Vega vela, 2011)
2
Uno de los géneros de interés industrial el cual es Origanum perteneciente a la
familia Lamiaceae, llamado comúnmente como Orégano, es una planta aromática,
perenne y ramificada (Camacho & Chacín, 2016), herbácea, vivaz muy aromática (Acevedo,
Navarro, & Monroy, Composición Química del Aceite Esencial de Hojas de Oregano
vulgare), 2013).
Entre las plantas aromáticas de interés industrial y en vía de extinción se encuentra Origanum
vulgare la cual se considera una especie de importancia económica con una gran distinción entre
otras, el mayor interés a nivel industrial es en el área farmacéutica por la producción de
metabolitos secundarios, los cuales se emplean en jabones, perfumes, cosméticos, saborizantes,
medicamentos entre otros (Garcia Pérez et al, 2012) además, posee propiedades antibacteriales,
antifúngicas, antiparasitarias, antimicrobianas y antioxidantes. (Garcia Pérez et al, 2012).
Al igual que muchas especies aromáticas, constituye un reto en laboratorio al preservar y
mantener sus características fisiológicas metabólicas y genéticas sin variabilidad además
presentan una alta cantidad de compuestos y metabolitos secundarios potencialmente
importantes (Chacon sanchez & Vega vela, 2011).La composición y la cantidad de los
metabolitos secundarios de estas plantas dependen de factores climáticos, la altitud, la época de
cosecha, y su estado de crecimiento. Por lo tanto, el estudio de dichos factores y su influencia
en su cultivo es importante para su mejor aprovechamiento y explotación, así mismo las células
vegetales en suspensión se han convertido en productores de valiosos metabolitos secundarios
de extracción a partir de plantas silvestres (Rojas Idrogo, Kato, Delgado Paredes, Segal Floh, &
Handro, 2014).
3
Refiriéndonos a los componentes esenciales del orégano y la producción de metabolitos
secundarios se han identificado los flavonoides como la apigenina y la luteolina, agliconas,
alcoholes alifáticos, compuestos terpénicos y derivados del fenilpropano (Acevedo, Navarro, &
Monroy, Composición Química del Aceite Esencial de Hojas de Oregano (Origanum vulgare),
2013) que presentan una capacidad antioxidante observada en propiedades antialérgicas necesarias
en cosméticos y fármacos con el fin de obtener metabolitos segundarios como flavonoides los
cuales se pueden generar a partir del cultivo in-vitro de células vegetales en suspensión, en especial
cuando las plantas son nativas y silvestres, variando las condiciones ambientales, factores externos
controlando las condiciones del cultivo y alcanzando una mayor calidad y rendimiento en los
procesos de conservación, micropropagacion y obtención de metabolitos secundarios. (Arias M. ,
Aguirre, Angarita, Montoya, & Restrepo, 2008)
Es importante mencionar la ejecución de este trabajo en comparación con otras investigaciones
sobre la implementación de las técnicas de suspensiones celulares como una de las herramientas
de innovación a nivel in vitro, reducción de costos, y obtención en mayores cantidades de estos
compuestos de interés de una manera biológica con la metodología propuesta como una alternativa
de mejoramiento genético y aporte a nuevas investigaciones en la biotecnología vegetal.
4
2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Los flavonoides son compuestos metabólicos presentes en plantas y alimentos con la
de proteger al organismo del deterioro por rayos ultravioleta, agentes oxidantes sustancias
químicas y polución ambiental (Martinez Flores, Gonzales Gallego, Culebras, & Tuñón,
2002).Estas moléculas entregan sus electrones a radícales libres, finalizando la cadena de
oxidación (Hess & Varas Pacheco, 2004) Así mismo, son empleados como compuestos de
almacenamiento, mecanismos de defensa contra virus, hongos, bacterias, como sustancias
alelopáticas, fitoalexinas o disuasorios nutritivos (Pérez Alonso & Jiménez, Producción de
metabolitos secundarios de plantas mediante el cultivo in vitro, 2011). Este tipo de compuestos
también pueden ser localizados de manera simultánea en las células fotosintéticas, cumpliendo
un importante papel en la prevención de afecciones ocasionadas por radicales libres, resultantes
de la exposición constante a radiación UV. (Martínez Garcia & Mosquera Manrtinez, 2014)
Uno de los cultivos de interés industrial que posee un contenido importante de flavonoides
es Origanum Vulgare (orégano), el cual presenta un gran potencial económico en la industria
farmacéutica y cosmética principalmente por su capacidad antioxidante que contrarresta la
formación de radicales libres, cuya influencia se revela en características antialérgicas,
antivirales o vasodilatadores antimicrobianas, antiinflamatorias, antitumorales, estrogénicas,
entre otras (Pérez Santiago, González Castillo, Alejandre iturbide, & González Güereca, 2011),
teniendo demanda a nivel nacional como internacional por contribuir al desarrollo de nuevos
compuestos con aplicaciones en la agronomía, medicina, (González, 2007).
5
Uno de los procesos de extracción de flavonoides es realizado por medio de métodos químicos,
con solventes potencialmente explosivos y/o tóxicos (Martínez Garcia & Mosquera Manrtinez,
2014) liberando compuestos que se evaporan rápidamente generando contaminación atmosférica,
y riesgo para la salud por la inhalación, tienen una alta afinidad por las grasas, por ellos se acumulan
fácilmente en tejidos del cuerpo humano, son altamente inflamables al contacto con el aire (Cevera
Vidal, Beltran Arandes, & Hernández Hernández, 2015). A pesar del esfuerzo por obtener estos
compuestos, existe una duración de largos periodos de tiempo generando gasto de energía y una de
las mayores consecuencias como la producción de sustancias contaminantes con los suelos
(Martínez Garcia & Mosquera Manrtinez, 2014), generando así, la formación de nuevas moléculas
estables difícilmente degradadas por microorganismos o almacenadas por plantas. (Cevera Vidal,
Beltran Arandes, & Hernández Hernández, 2015). Según un Estudio realizado en la Universidad
Autónoma metropolitana de México (Lopez Naranjo, Moreno Aguilar, & Estrada Gonzales, 2007)
determinó que los flavonoides de extractos por medio de electroforesis capilar entre estos se
encuentra la extracción química, cromatografía liquida, cromatografía de capa fina, son métodos
inadecuados al requerir grandes cantidades de reactivos, un largo tiempo de separación, además de
tener una resolución limitada, baja sensibilidad y formación de compuestos contaminantes en el
medio ambiente.
6
Sin embargo, Colombia con sus amplios recursos vegetales, carece de una activa
participación en el mercado industrial con el gran potencial de los metabolitos que se podría
obtener, debido a la falta de estrategias, proyectos, programas e incentivos, para el desarrollo de
investigación en plantas condimentarías aromáticas y medicinales en nuestro país. ( Vega Vela
& Chacón Sánchez, 2011) Por lo tanto, la falta de diseño y estandarización de procesos para
producción de metabolitos de interés y la propagación genética de las especies aromáticas
nativas de manera biológica limita el aprovechamiento de estos recursos con potencial de nuevas
alternativas de producción de compuestos a nivel industrial en el área de la biotecnología
vegetal. (Pérez Alonso & Jimenéz, Producción de metabolitos secundarios de plantas mediante
el cultivo in vitro, 2011)
Por consiguiente la obtención de metabolitos secundarios como los flavonoides a partir de
Origanum vulgare no se ha implementado a nivel de Santander de manera biológica a su vez el
laboratorio de tejidos vegetales de la UDES no cuenta con el diseño de un protocolo para la
obtención de estos compuestos, delimitando la producción de una sustancia con un gran
potencial industrial teniendo en cuenta el banco de germoplasma que dicho laboratorio posee
actualmente, como una alternativa de conservación de especies en vía de extinción y el potencial
que tiene la universidad con esta materia prima.
7
3 PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN
¿Cuál es el efecto de la temperatura y la transferencia de oxígeno en la producción de
flavonoides empleando la técnica de suspensiones celulares a partir de Origanum vulgare
(Orégano)?
8
4 JUSTIFICACIÓN
En los últimos años se han hecho esfuerzos por generar sistemas de cultivo de células vegetales
en suspensión lo cual se convierte en una herramienta biotecnológica que permite conocer diversos
aspectos del cultivo, como su comportamiento metabólico, fisiológico y bioquímico, así como
controlar factores ambientales, abióticos (sequía, luz ultravioleta y temperaturas extremas) bióticos
(interacción con patógenos) aprovechando las diferentes propiedades que estos metabolitos tienen
y sus beneficios en la salud humana en la prevención de diversas enfermedades y control de las
mismas con el fin de obtener un aumento considerable en el rendimiento de los metabolitos
específicos como flavonoides (Pérez Alonso & Jimenez, Produccion de metabolitos secundarios
de plantas mediante cultivo in vitro., 2011). Dada la importancia medicinal de Origaum vulgare se
generó la necesidad de obtener un mayor conocimiento sobre los flavonoides como productos
naturales o biopreparados generando generando posibles tratamientos para prevenir daños en la
salud de la población, es por ello que se hace importante el desarrollo de este proyecto, con el fin
de obtener flavonoides a partir de orégano (Origanum vulgare) mediante la técnica de suspensiones
celulares, convirtiéndose esta investigación en uno de los pioneros a nivel de Santander al producir
extracto crudo de flavonoides a partir de suspensiones celulares, sumado al hecho que la
biodiversidad de Colombia es un recurso que de forma sostenible puede ser explotado
benéficamente, teniendo en cuenta el mejoramiento de diversos procesos en futuras
investigaciones. Así mismo, aportar nueva información para el laboratorio de tejidos vegetales e
innovación en la producción de metabolitos secundarios, generando un protocolo estandarizado del
proceso de producción una de las prácticas de innovación para la agricultura sostenible y
9
competitiva. También se contribuyó a la formación de recursos humanos en el área de cultivo in
vitro de tejidos vegetales, incorporando nuevos conocimientos en el desarrollo de la técnica de
micropropagación y a su vez la obtención del título de Microbióloga industrial
10
5 MARCO TEÓRICO
5.1 Cultivo in vitro
El cultivo in vitro es una de las aplicaciones biotecnológicas modernas el cual consiste en
medios nutritivos artificiales y conjuntos de técnicas que permiten la propagación de cultivos
diferentes plantas a partir de órganos, tejidos protoplastos o células en un ambiente estéril (
Navarro & Arias Zabala, 2008) en un medio de cultivo gelificado con condiciones ambientales
controladas (Luz y temperatura). De esta manera, se induce a un proceso de adaptación al medio
de cultivo seguido de la formación de brotes a partir de una planta madre, generando un proceso
de multiplicación para obtener un óptimo crecimiento, a nivel exsitu se realiza una previa
aclimatación y crecimiento donde finalmente serán para el consumo u obtención de compuestos
interés industrial. (Estopá Bagot, 2005).
El termino cultivo in vitro proviene de realizar la siembra de un cultivo a nivel de laboratorio
en un recipiente de vidrio, actualmente se han venido implementando otros materiales como el
propileno teniendo como factor común el crecimiento de una especie vegetal. (Estopá Bagot,
Así mismo, el número de plantas que se puede obtener por medio del cultivo in vitro es
prácticamente ilimitado y puede estar libre de virus y viroides. (Dominguez Rosales, y otros,
11
5.2 Cultivo en suspensión
Existe gran diversidad de sustancias producto de las plantas con gran potencial industrial, y
numerosas técnicas que permiten la producción de metabolitos secundarios de una manera más
rápida, y amigable con el ambiente, para aprovechar esto surgen nuevos procesos de manipulación
manipulación vegetal a nivel in vitro. Uno de ellos es la técnica de suspensiones celulares, las
cuales permiten el crecimiento de células, protoplastos u órganos en condiciones asépticas de
diversas especies de plantas utilizando medios de cultivos artificiales, (Arias Zabala & Perez
Navarro, 2008) las cuales generalmente se inician mediante la incubación de trozos de callos
friables en medios líquidos que se encuentran en movimiento continuo (Szabados, L; Mroginski,
L.A; Roca, W;, 1991) por consiguiente, facilita la transferencia de nutrientes y oxigeno hacia el
citoplasma, este tipo de cultivo permite el control de variables como pH, oxígeno disuelto dando
mayor ventaja al proceso. (Arias M. , Aguirre, Angarita , Montoya , & Restrepo, 2009) Por otra
parte, para seleccionar el material celular se efectúa en un medio solido mediante el plaqueo de
suspensión para seleccionar la materia prima de mejor crecimiento celular para el proceso.
(Szabados, L; Mroginski, L.A; Roca, W;, 1991).
12
Para obtener grandes poblaciones de células aglomeradas en callos se requiere llevar los
tejidos a un estado de desdifereciación, alterando artificialmente su balance endógeno, de esta
manera se genera un desequilibrio en la regulación del crecimiento, en este estado se genera el
fenómeno denominado variación somaclonal, lo cual es una variación fenotípica desarrollada
en los cultivos de plantas a nivel in vitro. Por lo tanto, esta técnica de suspensiones celulares se
convierte en una de las metodologías para generar variabilidad genética, (Ruiz cerda, 1998)
obtención de plantas libres de patógenos, conservación en germoplasma, propagación masiva,
producción de metabolitos primarios y secundarios, mejoramiento genético siendo considerado
una importante alternativa en la biotecnología vegetal (Arias Zabala & Perez Navarro, 2008)
aplicada principalmente a plantas medicinales, las cuales tienen la ventaja de producir
compuestos bajo condiciones controladas, puesto que la multiplicación celular es rápida, fácil y
de allí, nace la producción de metabolitos secundarios específicos. (Delgado Paredes, Kato,
Rojas Idrogo, & , 2013)
13
Las células vegetales en suspensión pueden caracterizarse por generar formación de agregados
de manera natural, lo cual puede afectar la producción de diversos productos de interés
consecuencia del estrés nutricional, las concentraciones de oxigeno entre otros factores importantes
de controlar. (Delgado Paredes, Kato, Rojas Idrogo, & , 2013) De modo que la implementación de
la técnica de suspensiones celulares en medio de cultivo líquido se convierte en una alternativa
para el aprovechamiento de cultivos que en campo no poseen la suficiente producción de sustancias
de manera industrial, por lo que no resulta económicamente viable (Arias Zabala & Perez Navarro,
2008)
5.3 Metabolitos primarios y secundarios en plantas
Las plantas son organismos que presentan diversas rutas metabólicas comunes, en las que se
producen diferentes compuestos necesarios para su desarrollo y su crecimiento, por consiguiente
se generan los metabolitos primarios a partir de los cultivos de plantas a nivel exsitu e in-vitro a
este grupo pertenecen los carbohidratos simples los nucleótidos, la clorofila aminoácidos y lípidos
de membrana, encargados de procesos de respiración, fotosíntesis, transporte de solutos
asimilación de nutrientes, translocación y diferenciación. (Hess & Varas Pacheco, 2004).
Además, las rutas metabólicas primarias, las plantas pueden presentar otro tipo de rutas que
conllevan a la formación de sustancias que no son necesarias para su crecimiento y desarrollo,
como compuestos fenólicos, antioxidantes, compuestos nitrogenados y anti fúngicos empleados
como mecanismos de defensa ante patógenos y mediadores de procesos de polinización, dichas
producciones de estos metabolitos se conocen como rutas metabólicas secundarias. (Arias Zabala
& Perez Navarro, 2008)
14
Estas moléculas no parecen tener una función directa en el desarrollo y crecimiento de la
planta, convirtiéndose en mecanismos de defensa contra otros organismos, siendo almacenadas
en vacuolas a medida que son sintetizadas (Arias Zabala & Perez Navarro, 2008). La
acumulación de estos se presenta principalmente en la fase estacionaria, dependiendo del tipo
de metabolito también puede generar liberación o reserva en la fase en la fase exponencial
siendo proporcional a la producción de biomasa, esto en algunas líneas celulares. (Delgado
Paredes, Kato, Rojas Idrogo, & , 2013) Además, presentan una restringida distribución en el
reino vegetal, dentro de este grupo podemos encontrar los compuestos nitrogenados, terpenos,
y la clasificación de fenoles y flavonoides (Hess & Varas Pacheco, 2004)
A nivel industrial estos metabolitos secundarios son la principal fuente de producción de
pesticidas, saborizantes, colorantes, agroquímicos, fármacos, aditivos de alimentos y perfumes,
los cuales tienen bajo rendimiento a nivel in vitro por incluir un tratamientos con diversos
factores como estrés abiótico, elicitores y factores de señalización. (Arias Zabala & Perez
Navarro, 2008)
15
5.4 Fenoles
Se denominan fenoles a todas las moléculas químicas orgánicas cuya estructura en particular
se compone de un anillo aromático de benceno unido a varios grupos hidroxilo (Arias Zabala &
Perez Navarro, 2008), los fenoles están implicados en procesos industriales siendo aquellas
sustancias que poseen diversas funciones fenol, nombre común del hidroxibenceno, son originados
originados en las plantas como los principales metabolitos secundarios, con función de defensa de
ataques fúngicos o antibacterianos, también contribuyendo a la pigmentación de diversas partes de
la planta (Gimeno Creus, 2004).
Los fenoles se pueden clasificar según su estructura química formando nuevas moléculas más
complejas denominadas polifenoles los cuales han sido considerados en la actualidad como
antioxidantes, quelantes de metales y captadores de radicales libres. Las propiedades antioxidantes
se convierten en fuente para el tratamiento de enfermedades en la salud humana como
enfermedades neurodegenerativas (Alzheimer), prevención de cáncer y enfermedades
cardiovasculares. (Gimeno Creus, 2004). Sin embargo, estos compuestos en altas concentraciones
se convierten en sustancias toxicas para los humanos, sin embargo en bajas concentraciones se
convierten en medicamentos preventivos de enfermedades (Arias Zabala & Perez Navarro, 2008)
16
5.5 Flavonoides
Una importante división de metabolitos secundarios en plantas son los flavonoides, los cuales
son pigmentos encargados de dar coloración a las hojas, flores y frutos en las plantas en estado
libre se pueden encontrar como formadores de glicosidos, sus potenciales beneficios en la salud
humana y la presencia en la naturaleza han generado un creciente interés en su estudio. (Hess &
Varas Pacheco, 2004).
En cuanto a su función posee efectos bactericidas y antifúngicos en el organismo actuando
como inhibidores enzimáticos en procesos de transferencia de energía, siendo participes del
metabolismo celular, además tienen una importante capacidad como fijadores de metales como
cobre y hierro. (Hess & Varas Pacheco, 2004) Además estas moléculas generan respuesta a
señales moleculares o elicitores, por causa del ambiente, microorganismos patógenos, gracias a
señales receptoras de la planta en las células ( Ávalos García & Pérez Urria Carril, 2009)
Hay que mencionar, además su función de absorber una longitud de onda corta de radiación
UV-B no visible para el ojo humano generando protección de las células, así mismo realizan un
proceso de acumulación en el estrato epidérmico de los tallos y las hojas verdes absorbiendo la
luz fuertemente en la región UV-B permitiendo el paso de la luz con mayor longitud de onda a
las células fotosintetizadoras. (Hess & Varas Pacheco, 2004)
17
Por otro lado, en el área de la farmacología estos compuestos se encuentran alojados en el
interior de la célula actuando como antioxidantes presentando la propiedad de apagar los radicales
radicales libres altamente tóxicos para las células causantes de enfermedades, por su acción de
protección y la incapacidad de producción del organismo humano de estos compuestos los
flavonoides merecerían ser incorporados al grupo de nutrientes esenciales (Hess & Varas Pacheco,
Pacheco, 2004) Así por ejemplo, estudios in vitro e in vivo demuestran el papel protector de la
quercitina, con efectos ante células cancerígenas y la inhibición de estas (Martinez Flores, Gonzales
Gonzales Gallego, Culebras, & Tuñón, 2002)
5.6 Origanum vulgare
Las plantas aromáticas poseen esencias características en su raíz, fruto, semillas, flores, hojas,
rizomas, bulbos los cuales son principios activos destinados a la preparación de infusiones. (Nuñez
& Tonguino Borja, 2011) Siendo las principales productoras de una serie de principios activos con
diversas aplicaciones en la industria alimentaria y farmacéutica médica.
Los metabolitos secundarios de estas plantas son la base del rendimiento y cultivo selección de
mejora en procesos ( Ávalos García & Pérez Urria Carril, 2009) convirtiéndose en materia prima
productora de metabolitos secundarios, de interés industrial como los flavonoides. Santander es
uno de los departamentos que cuenta con especies de plantas aromáticas con un importante
contenido de flavonoides, las cuales se encuentran en vía de extinción como es la especie
Origanum vulgare (Orégano).
18
Está planta aromática se caracteriza en particular por ser perenne, polimorfa, dicotiledónea
y ramificada, con unos pelos granulares especiales que le dan la esencia característica, con tallos
que alcanzan de 30 a 80 cm de altura (Chacin & Camacho, 2016) generalmente el cultivo de
orégano es considerado marginal, porque se puede desarrollar en suelos pobres de topografía
accidentada, incluso puede vivir en condiciones de baja fertilidad (Chacin & Camacho, 2016),
en cuanto a su composición química se compone principalmente de ácidos fenólicos,
flavonoides como aspergenina y luteolina, Acido ursolico, aceites esenciales como carvacol y
timol , su raíz contiene estaquiosa y los tallos sustancias tánicas (Nuñez & Tonguino Borja,
2011) Diversos estudios sobre la bioactividad del Orégano, muestran su actividad ante diversas
bacterias patógenas, antitripanosoma y antioxidante ( Acevedo, Navarro, & Monrroy,
Composición Química del Aceite Escencial de Hojas de Orégano (Origanum vulgare), 2013)
5.7 Diseño de Biorreactor Airlift para cultivo de células vegetales
Los procesos y técnicas implementadas para el cultivo de células vegetales en suspensión se
han desarrollado a partir de la adaptación celular, teniendo en cuenta características importantes
en cada uno de los procesos, como la formación de agregados de manera natural, el tiempo de
duplicación de 20 a 100 horas y su crecimiento y diámetro. (Delgado Paredes, Kato, Rojas
Idrogo, & , 2013)
19
Partiendo de lo anterior uno de los sistemas apropiados para la producción de metabolitos
secundarios de interés es el reactor airlift el cual se compone de un reactor agitado neumático, con
con una fase gaseosa continua en forma de burbujas, lo cual produce una expansión isotérmica para
para mantener homogeneidad (Rojas Gutierrez & Jimenez lizardi, 2011) este tipo de biorreactor
acepta una mayor aireación menor daño celular y menor costo energético. La fluidización se genera
genera por la circulación del líquido dentro del biorreactor y no por la inyección de gas por lo tanto
tanto mantiene una constante homogenización simple de alta eficiencia, la distribución de energía
energía en el proceso se realiza por medio del gas y no con movimiento cinético, lo que evita
cambios metabólicos y morfológicos en las células de cultivos. (Gutierrez rojas & Lizardi Jímenez,
2011)
En cuanto al funcionamiento a nivel biotecnológico y el mejoramiento del diseño es
recomendable establecer modelos matemáticos del sistema global. El diseño de un biorreactor se
convierte en un modelo el cual es un conjunto de relaciones de un sistema que está siendo estudiado
y contiene variables que se relacionan entre sí, también específicas como causa/efecto empleadas
en el manejo de procesos. Algunas de las variables implicadas pueden ser temperatura pH
agitación, concentración de sustrato, etc., convirtiéndose este en un biorreactor multipropósito se
el cual tiene la capacidad de modificar tanto sus relaciones geométricas internas como las variables
de operación con el fin de lograr una mayor versatilidad del equipo, transformándose en un equipo
apto para diversos procesos, sin estar limitado a uno en específico (Gutiérrez, Rodríguez , & Ordaz
, 2004)
20
6 MARCO REFERENCIAL
La implementación de modelos de investigación ha permitido la formación de nuevos
protocolos y el establecimiento de nuevas técnicas que generan diversos compuestos y
productos de interés, desde el año 1939 con la inducción de los primeros cultivos de callo
exitosos, originados de plantas de zanahoria y tabaco, descubriendo la implementación de
auxinas como hormonas reguladoras del crecimiento vegetal y las vitaminas como
complemento del complejo (García Borges, 2016)
Con respecto a lo anterior Uribe moraga & Cifuentes, 2004 demuestran en sus
investigaciones realizadas que en procesos de crecimiento celular in vitro empleando la técnica
de suspensiones celulares poseen una mejor respuesta de crecimiento los explantes, utilizando
el medio MS y dos combinaciones hormonales como 0,1 y 0,5 mg/l de AIB Y 6-BAP
respectivamente.
Arias Zabala & Perez Navarro, 2008 Implementan en una de sus investigaciones la
utilización de células en suspensión con el establecimiento de callos para la producción de
metabolitos secundarios como los ácidos fenólicos, quercetina, flavonoides, kaempferol entre
otros.
21
En cuanto a la producción de metabolitos secundarios generados por plantas, en el año 1930 son
descubiertos los flavonoides por el premio nobel Szent- Georgy, el cual aisló de la cascara de limón
una sustancia que regulaba la permeabilidad de los capilares sanguíneos denominada la citrina. A
comienzos eran denominados vitamina P (por permeabilidad) y también vitamina C, sin embargo
no pudo ser confirmado, las dos denominaciones en 1950 fueron abandonadas. (Hess & Varas
Pacheco, 2004). En la actualidad se han implementado estudios realizados por Soto Vásquez, 2015
analizan y cuantifican metabolitos secundarios entre estos fenoles y flavonoides totales en extractos
de propóleos de tres localidades del Perú adoptando métodos de coloración y precipitación,
encontrando alta diversidad de catequinas, esteroides, antocianidinas ,fenoles y taninos.
También se demostró la presencia de flavonoides totales por medio de técnicas colorimétricas
y espectrofotometría, presentes en la flor de pomo (Syzygium jambos) identificando pigmentos
como catequinas, antocianinas calconas, flavononas y un total de flavonoides de 3,580,8614 mg de
catequina por gramo de extracto. (Bonilla Rios, Varón, & Garzón, 2014)
Otra de las investigaciones fue acerca de la producción de biomasa y metabolitos secundarios
de tipo glicósidos cardiotónicos a escala de matraz agitado, en el cual se determinó la producción
de flavonoides en tanque agitado a partir de Thevetia peruviana, y no se encuentran diferencias en
cuanto a la aireación y la fuente de carbono así mismo, resaltan la influencia del tapón del
biorreactor con diferencias significativas en el crecimiento celular observándose mayor
crecimiento con el tapón de aluminio el cual ofrecía menor transferencia de oxígeno. (Arias Zabala
& Perez Navarro, 2008)
22
Investigaciones acerca de la planta Lippia alba (Orégano de cerro) caracterizada por ser un
arbusto muy aromático e investigada por su efecto antiespasmódico en infusión, sedante y
desinfectante, determinando que la composición química de los compuestos que produce la
dependen de sus condiciones de cultivo edad, parte de la planta empleada para la extracción y
demás factores geobotánicos, realizadas estas investigaciones en Guatemala. (Stashenko,
Jaramillo, & Martínez, 2003)
Por otro lado, un estudio realizado en la universidad de Santander evaluó el crecimiento in
vitro del cultivo de Orégano (Origanum vulgare) a partir de la técnica de Organogénesis y
diferentes tratamientos de desinfección determinando que el mejor crecimiento se generó en el
medio de cultivo T1 y se dio como producto vitroplantas libres de patógenos u otros
contaminantes ambientales. (Camacho & Chacín, 2016)
23
7 HIPÓTESIS
NULA: La temperatura y la oxigenación, no generan un efecto en la producción de flavonoides
flavonoides por medio de la técnica de suspensiones celulares a partir de la planta Origanum
vulgare.
ALTERNA: El efecto de la temperatura y la oxigenación genera producción de flavonoides por
medio de la técnica de suspensiones celulares a partir de la planta Origanum vulgare.
24
8 OBJETIVOS
8.1 Objetivo General:
Evaluar la producción de flavonoides a partir de Origanum Vulgare (Orégano) por medio de
suspensiones celulares en biorreactor airlift.
8.2 Objetivos Específicos:
Diseñar y construir un prototipo de biorreactor airlift para el proceso de
obtención de flavonoides a partir de suspensiones celulares.
Determinar condiciones ideales de Aireación y temperatura para la obtención de
flavonoides de Origanum vulgare en biorreactor Airlift.
Identificar por medio de métodos cualitativos directos la presencia de
flavonoides en suspensiones celulares de origanum vulgare.
25
9 METODOLOGÍA
9.1 TIPO DE INVESTIGACIÓN
El proyecto es experimental, debido a que estudia las alteraciones de las variables en
temperatura, aireación, azucares reductores al mismo tiempo, en un ambiente controlado, lo cual
permite evaluar el desarrollo de un proceso en particular, se desarrolló en el laboratorio de tejidos
vegetales, ubicado en el la Universidad de Santander campus Bucaramanga.
9.2 Fases de investigación.
Para el desarrollo del proyecto se realizó las siguientes etapas:
9.2.1 FASE I. Construcción del biorreactor
Se realizó diseño y construcción de un biorreactor airlift estandarizado por Acuña, R. (2004)
controlando las variables de temperatura y aireación de dicha investigación para procesos de
obtención de metabolitos secundarios a partir de suspensiones celulares.
9.2.2 FASE II. Determinación de condiciones para la obtención de flavonoides de
Origanum vulgare en biorreactor Airlift.
Se definieron las condiciones ideales de aireación y temperatura para la obtención de flavonoides, por
medio de la técnica de suspensiones celulares de Origanum vulgare en biorreactor airlift en un periodo de
20 días.
26
Preparación de las células en suspensión de Origanum vulgare
Se utilizaron callos jóvenes (2 meses de crecimiento) obtenidos a partir de Origanum vulgare,
procedentes del laboratorio de tejidos vegetales. A estos tejidos, se les realizó un proceso de
desinfección de acuerdo al estandarizado por (Camacho, H y Chacín, C, 2017). Seguidamente
se dejaron en agua destilada estéril hasta la puesta en marcha del biorreactor. La cantidad de
callo que se usó como inóculo son 0,5g de callo por tratamiento.
Preparación de medio de cultivo líquido para producción de flavonoides:
El medio cultivo líquido se realizó a partir del medio basal MS (Murashige and Skoog, 1964),
formulado y estandarizado por (Camacho. H y Chacín, C, 2017) para su proyecto de grado.
Puesta en marcha del biorreactor airlift con suspensiones celulares de Origanum vulgare
Las células orégano se cultivaron en el biorreactor de 1 litro, con un volumen efectivo de
trabajo aproximado de 50ml, se adiciono el preinóculo establecido anteriormente en cámara de
flujo laminar desarrollando 9 ensayos en 3 diferentes tratamientos los cuales tuvieron variación
en temperatura y transferencia de oxígeno.
27
Tabla 1
Tabla 1 Temperatura y oxigenación estandarizados en los tratamientos para la producción de
flavonoides a partir de Origanum vulgare.
Tratamientos
Temperatura Transferencia de oxigeno
18 °C 0.1 vvm
18 °C 0.3 vvm
18 °C Sin oxigeno
26 °C 0.1 vvm
26 °C 0.3 vvm
26 °C Sin oxigeno
22 °C 0.1 vvm
22 °C 0.3 vvm
22 °C Sin oxigeno
28
Para determinar el mejor desempeño en cada uno de los tratamientos se realizaron mediciones
a partir de las siguientes variables: Concentración máxima de biomasa, presencia de
flavonoides, Grados Brix, azúcares reductores (DNS) peso fresco y pH al finalizar el proceso
con intervalos de 5 días.
9.2.3 FASE III. Identificación preliminar de flavonoides por medio de métodos
cualitativos.
Separación de biomasa al extracto
Se realizó un proceso de centrifugación del extracto crudo del producto, extrayendo el
sobrenadante de éste.
Ensayos de coloración para determinar la presencia de flavonoides en el extracto crudo.
a. Ensayo de Shinoda
Se realizó la adición de 1 mL de extracto etanolico y metanolico 1 limadura de Mg, 3 gotas
de HCL concentrado, los flavonoides con el núcleo benzopirona (p. ej. flavonas, flavonoles,
flavanonas, etc.) Producen coloraciones rojizas cuando a sus disoluciones acuosas o alcohólicas
se les Adiciona magnesio seguido de HCl concentrado 37%. Aunque no se conoce el mecanismo
de esta Prueba, es muy utilizada para reconocer esta clase de compuestos. (Bonilla Rios, Varón,
& Garzón, 2014)
29
b. Ensayo de Mg/HCl
Se adicionó 1ml de suspensión, 1 mL de HCL 15%, posterior a ello, se adicionó 5 virutas de
magnesio, en un tiempo de 5 minutos de inmovilidad, finalizado este tiempo se agitó y se adicionará
adicionará 1ml de alcohol isoamílico. La producción de color amarillo se tomó como positivo
(presencia de flavonoides) y una coloración transparente es negativo. (Bonilla Rios, Varón, &
Garzón, 2014)
c. Ensayo de Pacheco
El sólido flavonoide se calentó sobre una llama con unos pocos cristales de AcONa (Acetona)
y 0.1 mL De anhídrido acético. Luego con 0.1 ml de HCl al 20%. Los dihidroflavonoles producen
un color rojo característico. (Bonilla Rios, Varón, & Garzón, 2014)
d. Ensayo con Zn/HCl
Se adicionó 1 mL de suspensión, 1mL de HCL 15%, posterior a ello, se adicionó 5 virutas de
Zn, en un tiempo de 5 minutos de inmovilidad, finalizado este tiempo se agitó y se adicionará 1ml
de alcohol isoamílico. Los dihidroflavonoles (o flavonoles) producen coloraciones rojo-violetas.
Las flavanonas y flavanoles no producen color o producen coloraciones rosadas débiles. (Bonilla
Rios, Varón, & Garzón, 2014)
30
e. Determinación de fenoles y flavonoides totales
La mezcla de reacción consistió en 400 μL de agua destilada, seguidamente se adicionó de
100 μL de extracto (Completando a volumen de 500 μL), luego, se agregó 30 μl de NaNO2 5%
esperó 5 min), luego 30 μL AlCl3 al 10% (Se esperó 5 min.), después se agregó 200 μL NaOH
(Se esperó 15 min) y por último se adicionó 240 μL de agua destilada. Se guardó en la oscuridad
y a temperatura ambiente, por 30 min. Se leyó, la Absorbancia a 510 nm (ZHISHEN et al, 1998).
Se realizó una curva patrón usando como referencia (+)-catequina, con un rango de
concentración (5-80 μg/ml), donde se obtuvo la siguiente ecuación lineal y = 0,0250x - 0,0578,
R² = 0,9981 (Bonilla Rios, Varón, & Garzón, 2014)
f. Condiciones de almacenamiento
Una vez obtenido el extracto, para evitar la degradación por efecto de la luz, absorción de
humedad, evaporación de constituyentes volátiles, oxidación debida al aire y cambios debido a
la acción de microorganismos. Para ello se depositó el metabolito secundario en frascos de
vidrio tapa rosca color ámbar en un ambiente fresco (temperatura ambiente).
g. Análisis Estadístico
Para el análisis estadístico se realizó un diseño factorial 32, donde se realizó un análisis de
varianza mediante una ANOVA y las diferencias significativas a partir de la prueba de Fisher
en el software Infostat.
31
10 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
10.1 FASE I. Construcción del biorreactor
Con base en lo descrito por (Acuña, 2004) y los cálculos detallados en la metodología, se
definieron las medidas y volúmenes necesarios para la construcción del sistema de airlift. Este
instrumento se desarrolló en compañía de la facultad de ingeniería de la universidad de Santander.
Los resultados de los cálculos fueron los siguientes:
Diámetro del tanque Dt = Ht. 0,25
Altura de trabajo Ht = Dt / Ht
Altura de columna interna (tubo draft) Hd = 0,66 Ht
Volumen de trabajo V = π. r2.A
Coeficiente de transferencia de masa KLa= 15.8
Coeficiente de variación = 3,75
De acuerdo a los anteriores parámetros se realizó la construcción de un prototipo de biorreactor
airlift para llevar a cabo el proceso de producción de flavonoides ya que permite controlar y
monitorear el funcionamiento de las variables fundamentales como pH, temperatura, aireación, y
además de ello reduce variaciones metabólicas genéticas y ruptura celular generando un mayor
rendimiento en la obtención de metabolitos secundarios, beneficiando el aprovechamiento del
material celular, como se muestra en la figura 1.
32
El sistema está compuesto por dos llaves de paso tipo esfera, ubicadas en la zona media del
biorreactor, con una distancia de 10 cm cada una; un diámetro de salida interno del efluente de
1,27cm. Consta de una altura desde el fondo de 0,54 cm donde se encuentra ubicado el difusor
de oxigeno especializado en la regulación y formación de burbujas de 1 y 2 mm de tamaño, el
cual permitió la distribución homogénea de oxigenación en el medio, con una manguera de 2
mm de grosor y 40 cm de larga; el motor marca Airpo modelo D20285 con un voltaje de 12
VDC, se compone también de un termómetro que mantiene la temperatura constante en el
proceso y un regulador de pH que calibra el mismo si los valores se reducen o se aumentan a
medida que el proceso se encuentra en marcha, el biorreactor consta de un filtro de membrana
de 25mm de diámetro de teflón PTFE 0,2um de poro para prevenir contaminación por
microorganismos en el aire que va dirigido al medio de cultivo de manera directa. El volumen
total del prototipo es de 1500 mL. (Anexo 8)
Figura 1 Prototipo del Biorreactor airlift para la producción de
flavonoides.
33
10.2 FASE II. Determinación de condiciones para la obtención de flavonoides de Origanum
vulgare en biorreactor airlift.
El material vegetal empleado presentaba una edad de un mes de formación de callo, el cual fue
fue sometido a un proceso de desinfección estandarizado por (Chacin & Camacho, 2016) con el fin
de eliminar diferentes microorganismos que podían interferir en el proceso, y alterar la producción
del metabolito secundario. Los callos presentaban una textura suave, de color café, los cuales se
consideran friables (figura 2).
Los resultados obtenidos en los ensayos para determinar las condiciones iniciales de operación
en la producción de los flavonoides se muestran a continuación:
Figura 2. Producción de callos a partir de Origanum vulgare con una edad de
dos meses en el laboratorio de tejidos vegetales, Universidad de Santander.
34
10.3 Producción de biomasa por tratamiento en peso fresco
0,50,60,70,80,9
11,11,21,31,41,5
0 5 10 15 20
pes
o e
n (
g)
Tíempo (Días)
Peso fresco/ Sin O2
18°C 22°C 26°C
0,50,60,70,80,9
11,11,21,31,41,5
0 5 10 15 20
Pes
o e
n (
g)
Tíempo (Días)
Peso fresco 0.1vvm
18 °C 22°C 26°C
B A
0,50,60,70,80,9
11,11,21,31,41,5
0 5 10 15 20
Pes
o (
g)
Tiempo (Días)
Peso fresco 0,3vvm
18°C 22°C 26°C
C
Figura 3 Cinética de crecimiento de callo de Origanum vulgare en un periodo de 20 días A) proceso de
crecimiento sin Oxígeno B) crecimiento con 0,1vvm de oxígeno C) crecimiento con 0,3vvm de oxígeno.
35
En la figura 3, Se observa la producción de biomasa (peso fresco) en cada uno de los
tratamientos a raíz de la división celular activa, a partir del análisis estadístico no se observan
diferencias significativas de crecimiento en los tres tratamientos con las diferentes concentraciones
de oxígeno aplicadas (p>0,05) por lo tanto el crecimiento fue continuo en los tres tratamientos con
las 3 concentraciones de oxigeno implementadas ver (Anexo 1). Por lo tanto, se puede inferir que
la aireación no es una variable que induce el proceso de crecimiento de los callos de Origanum
vulgare. A pesar que se observó que la inyección de aire que presentó mayor respuesta fue 0,1vvm
en cuanto a la producción de biomasa a partir de las suspensiones celulares de callos de orégano.
En la cinética de crecimiento de callos de Origanum vulgare en los tres tratamientos, se presenta
presenta una etapa lag desde el día 5. Como se observa en la figura 3 imágenes A, B, C posterior a
la fase lag inicia la etapa de crecimiento exponencial, en la que se observan los valores de peso
fresco más significativos. Según (Chamorro, Martínez, Fernández, & Mosquera, 2007) en esta fase
ocurre el proceso de división celular de manera más acelerada. En el día 10, se obtuvo el mayor
valor en peso fresco el cual fue 1,55g, a la temperatura de 26ºC respectivamente, presentando
diferencias significativas (p < 0,05) en comparación con los otros tratamientos. La ecuación
establecida de acuerdo al análisis estadístico es la siguiente:
𝑃𝑓 = 0,45 + 2,9𝑥10 − 3Oxig + 0.06 Tiemp + 039 Temp + 2,92
36
Así mismo, otro factor importante al cual se le puede atribuir el crecimiento de los callos,
es la adición de reguladores de crecimiento vegetal como hormonas, se emplearon 2,4 D
(2.500ul/l) y 6-BAP (500ul/l) respectivamente, una de sus funciones principales fue acelerar el
proceso de división celular, generando callogénesis y a su vez la activación del metabolismo
secundario de la planta en un menor tiempo; lo anterior se observó en los tres tratamientos
empleados. (Gómez Zeledón & Jiménez, 2011)
De acuerdo con investigaciones realizadas por (Gómez Zeledón & Jiménez, 2011) se
que la adición de la hormona 6BAP en combinación con 2,4-D en fresa (Fragaria ananassa cv.
Shikinari) obtiene un aumento de callos en la suspensión celular y la producción de flavonoides
(Antocianinas) 7 veces mayor a la producción del pigmento obtenido en el medio libre de
reguladores. Con base en lo anterior el crecimiento es un signo de la activación del metabolismo
primario de la planta a medida que trascurre el tiempo, ocurriendo una transición directa hacia
el metabolismo secundario de manera productiva.
Según Mizukami y colaboradores 1988 observaron un aumento en el crecimiento vegetal de
callos y un incremento en la síntesis de flavonoides de Hibiscus sudariffa utilizando 1 µM de
2,4-D al combinar esta hormona con kinetina también son estimuladores de la síntesis de
flavonoides en un mayor grado de producción. (Gómez Zeledón & Jiménez, 2011)
37
10.4 Incidencia de pH en la producción de flavonoides.
0
1
2
3
4
5
6
0 5 10 15 20
pH
Tiempo (Días)
pH / Sin O2
18°C 22°C 26°C
0
1
2
3
4
5
6
0 5 10 15 20
pH
Tiempo (Días)
pH / 0,1vvm
18°C 22°C 26°C
0
1
2
3
4
5
6
0 5 10 15 20
pH
Tiempo (Días)
pH / 0,3vvm
18°C 22°C 26°C
A B
C
Figura 4 Resultados de pH del extracto de flavonoides obtenido a partir de Origanum vulgare en un
periodo de 20 días A) pH sin Oxigeno B) pH con 0,1vvm de oxigeno C) pH con 0,3vvm de oxígeno.
38
En la figura 4 las gráficas A, B, C permite analizar la influencia de pH en el proceso de
crecimiento y producción de metabolitos secundarios, se determinó que existen diferencias
significativas en los grados de oxigenación aplicados en los ensayos (p<0,05) ver (Anexo 2)
Partiendo de 5,6 a 3,2 valor final del proceso. Se observó que al realizar una inyección de aire
(0,1vvm) generó mayor respuesta en comparación con las otras aplicaciones de aire
respectivamente, en el medio de cultivo el pH se reduce de una manera más acelerada por lo
en los 5 primeros días del proceso se evidenció reducción, sin embargo en el 10 día se generó
mayor reducción de los valores de pH convirtiéndose en la inyección de aire capaz de generar
ambiente ideal para la formación de nuevos compuestos, y un signo de actividad metabólica
vegetal, manteniéndose de manera constante y sin variaciones, en lo que restó del proceso al
aumentar las diferentes inyecciones de aire afectan la variabilidad del pH permitiendo que los
valores del mismo no disminuyan de una manera acelerada, en el caso de crecimiento no
interfiere de forma directa pero en la producción de metabolitos secundarios, retardaría el
proceso de producción, esto por causa del consumo de amonio, nitrato por parte de la planta.
(Zabala Arias, Angarita Velázques, Aguirre Cardona, Restrepo Floréz, & Montolla Vallejo,
2009) y utilización de otro tipo de compuestos para el crecimiento celular.
De igual manera, se observó que la temperatura no tiene diferencias significativas en cuanto
a la reducción o aumento de pH, convirtiéndose en una variable que no generó cambios a lo
largo del ensayo. La ecuación establecida de acuerdo al análisis estadístico es la siguiente:
𝑝𝐻 = 3,46 + 0,26 𝑇𝑒𝑚𝑝 + 0,86 𝑂𝑥𝑖𝑔 + 2,38 𝑇𝑖𝑒𝑚 + 7,78
39
La reducción del pH con respecto a la producción de flavonoides se convierte en un inductor el
cual tiene efecto en la estabilidad y estructura de los flavonoides, al estar expuestos a valores ácidos
de pH se genera un efecto protector sobre la molécula, según (Acosta Pushaina, Arias Martinez,
Gomez Arias, Gutierrez Romero, & Parra Rincones, 2014) estas reducciones permiten la
formación de nuevas moléculas un ejemplo es el paso de flavilio a chalcona por la desprotonación,
Así, elevados valores de pH provocan la formación de compuestos quinoidales de coloración
purpura que se degradan rápidamente por oxidación del aire. Como se puede observar en la figura
4, las gráficas A B y C la reducción se genera hasta el valor de 3.0 manteniéndose en este rango lo
cual indicó ser un medio acuoso con características que favorecieron la obtención de flavonoides
y el crecimiento vegetal. (Acosta Pushaina, Arias Martinez, Gomez Arias, Gutierrez Romero, &
Parra Rincones, 2014). En otro estudio por (Marero et al., 1997), se demuestra que los cambios de
pH inicial en el medio de cultivo pueden afectar la producción y acumulación de metabolitos
secundarios como es el caso de la producción de indirubina por suspensiones de Indigo
chino (Polygonum tinctorium) en las cuales la producción aumenta 20% y un 30% de pH optimo
comparada con otros pH evaluados. (Zabala Arias, Angarita Velázques, Aguirre Cardona, Restrepo
Floréz, & Montolla Vallejo, 2009). Por esta razón un aumento en los valores de pH disminuye la
efectividad en el proceso de producción generando volatilización de compuestos de interés
industrial. Otro factor importante es la temperatura, en este caso tiene influencia directa con la
variación de pH, por lo tanto la temperatura de 26 ºC se convierte en la más óptima para estabilizar
y mantener por más tiempo el valor constante de pH a lo largo del proceso, sin embargo la
temperatura afecta la producción de metabolitos secundarios, aunque no se conocen con claridad
40
0
1
2
3
4
5
6
0 5 10 15 20
Gra
do
s B
rix
Tiempo (Días)
Grados Brix / 0,3vvm
18°C 22°C 26°C
0
1
2
3
4
5
6
0 5 10 15 20
Gra
do
s B
rix
Tiempo en (Días)
Grados Brix / Sin O2
18°C 22°C 26°C
0
1
2
3
4
5
6
0 5 10 15 20G
rad
os
Bri
x
Tiempo (Días)
Grados Brix / 0,1vvm
18°C 22°C 26°C
los mecanismos bioquímicos por los que esto ocurre. (Zabala Arias, Angarita Velázques,
Aguirre Cardona, Restrepo Floréz, & Montolla Vallejo, 2009)
10.5 Influencia de los grados Brix en la producción de flavonoides.
A B
C
Figura 5. Resultados de los Grados Brix del extracto de flavonoides obtenido a partir de Origanum vulgare
en un periodo de 20 días A) Grados Brix sin Oxigeno B) Grados Brix con 0,1vvm de oxigeno C) Grados
Brix con 0,3vvm de oxígeno.
41
Los resultados obtenidos permiten determinar que no hay diferencias significativas en la
aireación con respecto a la disminución de los grados Brix. Por otra parte, una de las variables
influyentes es la temperatura; a los 26 ºC existe diferencia significativa (p < 0,05) frente a los demás
demás tratamientos evaluados manteniendo una media de 3,81 a diferencia de las otras
temperaturas aplicadas, también se observó en el periodo de 20 días un aumento de los grados Brix
Brix con respecto a los demás tratamientos evaluados, esto producto de la segregación de
sustancias, y reducción del metabolismo primario en el proceso. Por lo tanto, los grados Brix se
se convierten en uno de los indicadores de actividad metabólica en células vegetales, al utilizar
azucares circundantes en el medio para procesos de crecimiento celular y producción de
compuestos, como se observa en la gráfica 3 los valores iniciales de grados Brix en el proceso se
se encontraban en un rango de 4,0 como se puede observar son inversamente proporcionales al
tiempo y a la reducción de azucares con la prueba de DNS observando una disminución de los
grados brix y un aumento de azucares como glucosa a los 26 ºC en un periodo de 10 días, esto en
en consecuencia de la utilización de azucares por parte del material vegetal para la obtención de
energía y la formación del protoplasma celular. (Angulo Montoya, y otros, 2013) Otra de las
variables en aplicadas es la temperatura, en este caso no actúa ni tiene relación directamente con
la reducción de los grados Brix, pero se convierte en un factor que estabiliza y mantiene el proceso
de producción de flavonoides, La ecuación establecida de acuerdo al análisis estadístico es la
siguiente:
𝐵𝑟𝑖𝑥 = 4,89 + 0,01 𝑂𝑥𝑖𝑔 + 2,19 𝑇𝑒𝑚𝑝 + 2,69 𝑇𝑖𝑒𝑚𝑝 + 7,15
42
10.6 Influencia de azúcares reductores en la producción de flavonoides y crecimiento
vegetal
0
1
2
3
4
5
0 5 10 15 20Ab
sorb
anci
a (n
m)
Tiempo (Días)
Azúcares Reductores/ Sin O2
18°C 22°C 26°C
0
1
2
3
4
5
0 5 10 15 20
Ab
sorb
anci
a (n
m)
Tiempo (Días)
Azúcares Reductores/ 0,1vvm
18°C 22°C 26°C
0
1
2
3
4
5
0 5 10 15 20Ab
sorb
anci
a (n
m)
Tiempo (Días)
Azúcares Reductores / 0,3vvm
18°C 22°C 26°C
A
C
B
Figura 6. Resultados de Azucares Reductores del extracto de flavonoides obtenido a partir de Origanum
vulgare en un periodo de 20 días A) DNS sin Oxigeno B) DNS con 0,1vvm de oxigeno C) DNS con
0,3vvm de oxígeno.
43
Con la finalidad de analizar el comportamiento de los azucares reductores por medio del método
(DNS) se realizaron una serie de soluciones patrón de glucosa las cuales se utilizaron directamente
mediante una interpolación, de lo anterior se determinó los equivalentes de la glucosa formados en
el medio de reacción del DNS, en el (Anexo 4) se presenta la curva patrón de glucosa con la cual
se realizaron los análisis y la obtención de los resultados, como se puede observar en el (Anexo 5)
existen diferencias significativas en la temperatura como se observa en la figura 6, representando
los 26 ºC como una de las variables que permiten la formación de glucosa en el medio, así mismo
la oxigenación y el número de días también generan formación de la molécula y reducción del DNS
de una manera constante lo que mantiene el proceso con una estabilidad en cuanto a la formación
de nuevos productos.
Se pudo observar que a diferentes concentraciones los azúcares reductores presentes en los
hidrolizados, muestran la mayor actividad óptica en una longitud de onda de 540nm estando acorde
con los datos suministrados por la literatura, así mismo el método se basa principalmente en la
reducción del DNS (de color amarillo) por la glucosa al ácido 3-amino-5- nitrosalicílico (de color
rojo ladrillo), lo cual se observó al ver un cambio de coloración, La ecuación establecida de acuerdo
al análisis estadístico es la siguiente:
𝐷𝑁𝑆 = 4,89 + 0,01 𝑂𝑥𝑖𝑔 + 2,19 𝑇𝑒𝑚𝑝 + 2,69 𝐷í𝑎𝑠 + 7,15.
44
10.7 Producción de flavonoides con diferentes concentraciones de oxígeno y temperatura.
0
5
10
15
20
25
0 5 10 15 20
(mg)
Cat
equ
ina
Tiempo (Días)
Producción de flavonoides sin O2
18℃ 22℃ 26℃
A
0
5
10
15
20
25
0 5 10 15 20(mg)
Cat
equ
ina
Tiempo ( Días)
Producción de flavonoides / 0,1vvm
18℃ 22℃ 26℃
B
0
5
10
15
20
25
0 5 10 15 20
(mg)
Cat
equ
ina
Tiempo (Días)
Producción de flavonoides / 0,3vvm.
18℃ 22℃ 26℃
C
Figura 7. Producción de flavonoides obtenidos a partir de Origanum vulgare en un periodo de 20 días A)
Producción sin Oxigeno B) Producción con 0,1vvm de oxigeno C) Producción con 0,3vvm de oxígeno.
45
La producción de metabolitos secundarios se encuentra asociada con el crecimiento y el tipo de
material vegetal empleado a lo largo del proceso, como se observa en la figura 7, muestra la
producción de flavonoides por Origanum vulgare, la cual presentó un incremento constante, en
todos los ensayos realizados. Sin embargo, se observa una mayor producción del metabolito
secundario en la temperatura de 18ºC alcanzando un máximo de producción de 22,587,280 g de
catequina por mL de extracto crudo de Origanum vulgare en el día 10 del proceso convirtiéndose
en la mejor temperatura para la producción de flavonoides, a diferencia de 22ºC y 26ºC que no
representan diferencias significativas en cuanto a la producción del metabolito (Anexo7), La
ecuación establecida de acuerdo al análisis estadístico es la siguiente:
𝐹𝑙𝑎𝑣𝑜𝑛𝑜𝑖𝑑𝑒𝑠 = 402,73 + 1,54 𝑂𝑥𝑖𝑔 + 75,14 𝑇𝑒𝑚𝑝 + 325,46 𝐷í𝑎𝑠 + 512,19
Se observó que el tiempo en días se convierte en un factor de producción determínate en el proceso,
obteniendo diferencias significativas en el día 10 y 15 de los tratamientos, sin embargo el 10 día
generó mayor respuesta en cuanto a producción de metabolitos secundarios y una reducción de 5
días de proceso de producción de flavonoides en comparación con los demás tratamientos ,
refiriéndonos a la variable de oxigenación, se observan diferencias significativas en cuanto a
obtención convirtiéndose 0,1 vvm en la inyección de aire con mayor respuesta en la obtención de
flavonoides (Anexo7) por lo tanto el oxígeno se convierte en un factor importante en el
metabolismo primario de la planta para el crecimiento y un inductor esencial para la producción de
flavonoides a nivel in vitro.
46
Con base a lo anterior se presenta este comportamiento en respuesta a los diferentes tipos de
nutrientes expuestos en el medio de cultivo, jugando un papel fundamental en el crecimiento
vegetal, la estabilidad de las proteínas la activación de la trascripción de genes en los procesos
transferencia de masa y calor. (Zabala Arias, Angarita Velázques, Aguirre Cardona, Restrepo
Floréz, & Montolla Vallejo, 2009)
El rango de temperaturas generalmente empleado está entre 15-35 ºC, sin embargo, esta
puede afectar la acumulación de compuestos intracelulares de reserva (biomasa inactiva) y la
velocidad de consumo de oxígeno y la producción de metabolitos de interés. Por esta razón 18
ºC representó un rango óptimo al ser el estrés térmico un estimulador de la producción y
cuantificación de dicho metabolito convirtiéndose en una de las variables que puede generar
grandes modificaciones en procesos de transducción de señales al interior de la célula las cuales
activan diferentes enzimas especificas en la producción de estos metabolitos. (Zabala Arias,
Angarita Velázques, Aguirre Cardona, Restrepo Floréz, & Montolla Vallejo, 2009) De
obtención de nuevos compuestos acelerando y a su vez inmovilizando la producción.
47
Al pasar el día 15 de producción se reduce a los 18 ºC debido a la minimización de nutrientes en
el medio empleados por la planta, por lo tanto este tipo de metabolito solo se adapta a una
temperatura y un periodo específico de días para generar producción, por el contrario como se
puede observar en la gráfica B y C, existe la presencia del metabolito secundario a lo largo del
ensayo observando la variable de temperatura como un reductor de producción de flavonoides, sin
embargo, las suspensiones celulares continúan utilizando compuestos esenciales en el medio de
cultivo lo que permite una constante producción, pero en bajas concentraciones, analizando que
este tipo de estrés térmico modifica el metabolismo de la planta y prolonga el tiempo de generación
enzimática lo que extiende el proceso. (Zabala Arias, Angarita Velázques, Aguirre Cardona,
Restrepo Floréz, & Montolla Vallejo, 2009)
Investigaciones realizadas plantean los casos en los que se trabaja a una temperatura óptima de
producción diferente a la de crecimiento, se genera un desvío de precursores desde el metabolismo
primario hacia el secundario (Georgiev, Pavlov, & Ileva, 2004), también estudios realizados han
demostrado que seleccionar una temperatura optima logra un mejoramiento en el proceso en un
300% de producción de flavonoides como antocianinas en C. roseus y un incremento del 100% en
producción de ajmalicina. (Zabala Arias, Angarita Velázques, Aguirre Cardona, Restrepo Floréz,
& Montolla Vallejo, 2009)
48
Finalmente, este estudio en comparación con otros reportados en la literatura ha sido uno de
los mejores en cuanto a producción de flavonoides con un máximo de 22,58728 g de catequina
por ml de extracto a diferencia de los reportes de (Bonilla Rios, Varón, & Garzón, 2014) los
cuales presentan una producción de 3.580,8614 g de catequina por mL de extracto de flor de
pomo.
10.7.1 FASE III: Determinación de flavonoides totales en el extracto
a. Resultados del tamizaje químico
A partir del extracto obtenido a partir de Origanum vulgare se realizó la prueba colorimétrica
de Shinoda la cual consiste en la identificación flavonoides por un cambio de coloración. En la
figura 8, se puede observar el cambio de coloración del tubo de ensayo A con respecto al tubo
de ensayo base.
Figura 8. Resultado positivo de la prueba de shinoda para el extracto obtenido
mediante el proceso en biorreactor A) Extracto con la prueba de shinoda B) Patrón.
49
Otras pruebas realizadas al extracto fueron Alcalis, Mg +HCL las cuales consisten en la
identificación preliminar de flavonoides. Se puede observar el cambio de coloración. Los
resultados del tamizaje químico, genera una evidencia positiva de flavonoides como se muestra en
la tabla 2;
Fuente: Autor.
La prueba de Shinoda permite el reconocimiento de manera cualitativa de flavonoides que
contienen en su estructura un núcleo benzopirona, ( León Montoya , Rojas, & Pasiminio Monedero,
2015) En soluciones acuosas o alcohólicas toma un color rojizo indicando la presencia de
flavonoides. Como se puede observar en la Figura 8 presentó un cambio de coloración con respecto
al patrón lo cual permite determinar la presencia del metabolito secundario en el extracto.
Así mismo las pruebas empleadas como álcalis y Zn+HCL permiten una cualificación de los
pigmentos de tipo flavonoide en las muestras en el rango de temperatura de 18ºC donde
generalmente se observó mayor coloración en el día 10 del proceso generando diferentes tipos de
flavonoides en el extracto por el contrario, las muestras con mayor cantidad de Oxigeno
presentaron una coloración reducida.
Tabla 2 Pruebas colorimétricas para flavonoides.
50
11 CONCLUSIONES
Se construyó un prototipo de biorreactor air-lift con sensores para el control de temperatura,
pH, y regulación de Oxigeno, para llevar a cabo la producción de flavonoides a partir de
Origanum vulgare.
Se determinó que el oxígeno es una variable con una incidencia directa en el proceso
observando un aumento significativo en el crecimiento de callos y producción de
flavonoides a partir de Origanum vulgare.
Se determinó el tiempo y temperatura óptimos de producción de flavonoides fue en un
periodo de 10 días, con 0.1vvm de oxígeno a 18ºC con un máximo de producción de
22,587,280 de flavonoides sobre mL de catequina de extracto crudo a partir de Origanum
vulgare, generando una reducción en los tiempos de producción de los metabolitos de 5
días, confirmando la presencia de flavonoides con pruebas colorimétricas como ensayo de
Shinoda HCL, Álcalis con gran especificidad para este tipo de moléculas.
51
12 RECOMENDACIONES
El conocimiento generado y la experiencia adquirida en la presente investigación, brindan una base
para futuros estudios orientados al establecimiento de cultivos in vitro, la producción de
metabolitos secundarios y/o procesos de biotransformación en cultivos de células vegetales. Por
tal razón se recomienda:
Es necesario estudiar el posible efecto elicitor, que sobre la producción de metabolitos
secundarios de Origanum vulgare, pudieran tener otras sustancias que han mostrado tal efecto en
otras especies vegetales y sobre otros metabolitos. Así mismo, utilizar la luz como elicitor, pues es
bien conocido que bajo condiciones naturales, las especies producen antioxidantes para protegerse
de la radiación, también el uso de otro tipo de reguladores de crecimiento vegetal puede dar una
respuesta positiva a la producción de metabolitos.
52
13 ANEXOS
13.1 Anexo 1. Análisis de varianza Fase II: producción de biomasa por tratamiento en
Peso freso
53
54
13.2 Anexo 2. Análisis de varianza Fase II: influencia del de pH en la producción de
flavonoides.
55
13.3 Anexo 3. Análisis de varianza Fase II Brix en la producción de flavonoides y
crecimiento vegetal
56
13.4 Anexo 4. Análisis de varianza Fase II: Curva de calibración de glucosa.
y = -0,2702x + 1,352R² = 0,9966
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5
Ab
sorb
anci
a
Concentración mg/ml
Curva de Calibración
57
13.5 Anexo 5. Análisis de varianza Fase II: Resultados estadísticos de azúcares reductores
(DNS)
58
13.6 Anexo 6. Análisis de varianza Fase II: Curva de calibración catequina.
59
13.7 Anexo 7. Análisis de varianza Fase II: Producción de flavonoides.
60
61
13.8 Anexo 8. Fase I: Diseño Biorreactor air-lift
62
63
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