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• Composition– Buffer (phosphate based)– Nitrogen source (ammonium
chloride or ammonium sulfate)– Carbon Source (glucose or
glycerol)– Trace Metals (Ca, Co, Cu, Fe,
Mn, Mo, Se and Zn)– Vitamins (Biotin, thiamine,
folic acid, riboflavin, niacinamide, PABA, pantothenic acid and pyridoxine)
• Composition– Tryptone
– Yeast extract
– Sodium Chloride
• Examples– Luria Broth (LB)
– 2xYT
– TB (phosphate buffered)
Rich Media Chemically Defined
M9 medium is a minimal growth medium used for bacterial cultures.
It has the advantage of being cheap
M9 minimal medium
Isotopically labeled proteins can be prepared straightforwardly in E. coli by growing cells in minimal media M9 supplemented with appropriate nutrients (15NH4Cl, 13C-glucose)
For large proteins deuterium labeling provides simplified spectra for the remaining 1H nuclei and has useful effects on relaxationproperties of attached or adjacent atoms (1H, 15N,13C).
1x M9 salts 2mM MgSO4 0.1mM CaCl2
0.4% carbon source (e.g. glycerol, glucose, etc.)1g nitrogen source (15N)
In sterile H2O
5X M9 salts contains: 64 g Na2HPO4.7H2O
15 g KH2PO4 2.5 g NaCl 5 g NH4Cl
dissolved in deionized water to a final volume of 1 L
Rich vs. Minimal Media
pET expression of At3g17210
pQE expression of At3g17210
Parametri delle colture
Temperatura
Da 16°C a 37°C
Surf1 pTH24 C41 25° Surf1 pTH24 C41 18°M IB Prot FT1 FT2 W1 W2 W3 W4 W5 E1 E2 E3M IB IB Prot FT1 FT2 W1 W2 W3 W4 W5 E1 E2 E3
IPTG
Differenti concentrazioni
1mM - 0.1mM
Induzioni a tempi diversi
FASE DI LATENZA: intervallo di tempo in cui i microrganismi si adattano all’ambiente (non si moltiplicano)
FASE ESPONENZIALE: periodo di tempo in cui i microrganismi si moltiplicano in modo progressivo e costantePLATEAU: si stabilisce un equilibrio tra il numero delle cellule che si moltiplicano e il numero di cellule che muoiono
FASE DELLA MORTE: cessa la moltiplicazione dei microrganismi che invecchiano e muoiono
t
Uni
tà f
orm
anti
colo
nie
latenza
espo
nenz
iale
plateau
morte
Trasformazione del DNA per espressione proteica
Trasformazione in BL21 A 100.0 l di cellule competenti di E. coli (BL21) si aggiungono X l (corrispondenti a 100 ng) di uno dei campioni di DNA plasmidico che hanno dato risultato positivo allo screening. Controllo: in parallelo compiere la stessa reazione aggiungendo X l di acqua sterile invece del plasmide. 30’, ghiaccio 90’’, 42°C 2’, ghiaccio aggiungere 900.0 l 2xYT, 1h shaker a 37°C, 150 rpm. Strisciare su piastre contenenti 2xYT + amp (200 g/ml), 200.0 l di ognuna delle trasformazioni. O/N, 37°C
Coltura massiva
Inoculo Si prelevano singole colonie che vengono trasferite in alcuni ml di terreno liquido. Si lascia incubare in shaker alla temp. opportuna per il ceppo batterico, per circa 12-16 ore (fase stazionaria)
Coltura massivaL’inoculo viene trasferito in alcuni litri di terreno liquido, 1% in volume .Si lascia incubare in shaker alla temp. opportuna.All’inizio della fase esponenziale l’espressione della proteina viene indotta per aggiuntadi un induttore che determina l’avvio della trascrizione proteica
tempo di incubazione
0 4 8 12 16
fase esponenziale
Abs600
+IPTG
raccolta celluleO
S
HH
OH
H
OH
H OH
H
OH
CH3
CH3
IPTG
Procedura per l’espressione di rame proteina
Preparazione inoculo da piastra
Inoculare 2 tubi contenenti ciascuno 6 ml di 2xYT + amp (200 g/ml) con 2-3 colonieprelevata da piastra. Mettere ad incubare in shaker O/N a 37°C. Preparazione coltura massiva
Inoculare 2 beute da 2l contenenti ciascuna 0.5 l 2xYT + amp (200 g/ml) con 5 ml di inoculo già preparato. Mettere ad incubare in shaker a 37°C. Misurare ad intervalli regolari la densità ottica a 600 nm. Quando la densità ottica raggiunge il valore di 0.6, aggiungere a ciascuna beuta 1.0 ml di soluzione di IPTG 0.5 M (concentrazione finale 1 mM) e 125 l di soluzione di CuSO4 1 M Continuare l’incubazione in shaker alla temperatura di 25°C per 16 h.Aggiungere 375 l di soluzione di CuSO4 1 M 45’ prima di raccogliere le cellule
Isolamento della proteina
Rottura delle celluleSeparazione dell’estratto dalle cellule
Ottimizzazione per lo scale-up
Minifors fermenters• Interactive control of culture
parameters: Temp, pH, pO2
• Parameters can be automatically changed during the culture from a computer
• Possibility of feed/continuous cultures
GESTIONE DEI PARAMETRI DI PROCESSO
Temperatura riscaldamento/raffreddamento
Agitazione impostazione/variazione di un “set point”
Flusso aria impostazione/variazione di un “set point”
pH aggiunte di acido/base e/o feed
pO2 agitazione/ flusso aria/ arricchimento in O2 e/o feed
Schiuma aggiunte di antischiuma
Alimentazione impostazione/variazione di un ciclo di attività della pompa del feed
Nei processi di estrazione e purificazione delle proteine, a differenza di quanto avviene per il DNA/cellule, non occorre prestare attenzione alla sterilità ma bisogna evitare la denaturazione dei campioni (elevate temperature, detergenti, valori estremi di pH possono denaturare facilmente le proteine)
Inoltre è importate procedere all’estrazione delle proteine il più velocemente possibile, per evitare processi degradativi.
Per conservare i campioni da cui estrarre le proteine vanno congelati rapidamente in azoto liquido (-140°C) e poi conservati in frigo a -80°C
ESTRAZIONE______________________________________________
LISI DELLE CELLULE
Localizzazione della proteina
Tipo di cellule
Quantità di cellule
BUFFER DI LISI
Localizzazione della proteina
Parametri chimico-fisici della
proteina (pI, idrofobicità, …)
Presenza di Cys ridotte/ossidate
Metalli
Regioni transmembrana
Attività proteolitica
Rimozione di acidi nucleici
CHIARIFICAZIONE
Centrifugazione
Ultrafiltrazione
Proteine extracellulari secrete nel terreno di cultura o nel siero possono essere rimosse dal materiale insolubile per semplice centrifugazione
Proteine intracellulari possono essere recuperate dopo rottura delle cellule
La procedura adottate per ottenere un estratto grezzo (estratto contenente tutte le proteine cellulari solubili nel tampone di estrazione utilizzato) dipende dalla localizzazione cellulare della proteina di interesse.
I metodi utilizzati per la rottura delle cellule dipendono in gran parte dalla fragilità delle cellule
Cellule animali
-Cellule fragili(eritrociti)
-Cellule che contengono materiale fibroso(c. muscolari)
Cellule vegetali
Più difficili da rompere perché contengono cellulosa
Microorganismi
-Batteri che si lisano facilmente
-Batteri con pareti più resistenti
• Utilizzo di detergenti per dissolvere la membrana cellulare
Proteine di secrezione Le proteine contengono segnali che ne determinano la destinazione.Una proteina può restare nel citosol, può essere portata sulle membrane plasmatica o interna,nello spazio intermembrana o nel mezzo intracellulare.
Sequenze segnale aminoterminali (16-26 AA) dirigono le proteine batteriche attraverso le membrane plasmatiche od esterne del batterio. Vengono riconosciute e tagliate da opportune peptidasi
Proteine secrete nel periplasma possono essere recuperate per rottura della sola membrana esterna (shock osmotico)
Shock osmotico
Per 1 litro di coltura Centrifugare la cultura a 8000 rpm per 10’, 4°C. Disperdere il pellet in 50 ml Tris-HCl 10 mM a pH 7.5. Aggiungere 50 ml di soluzione di saccarosio al 40% in 10 mM Tris-HCl pH 7.5 + 2 ml di soluzione EDTA 0.5 mM pH 8. Le soluzioni devono essere ice-cold. Tenere in agitazione in ghiaccio in camera fredda per 20’.
Centrifugare 10000 rpm per 15’ a 4°C. Rimuovere accuratamente il surnatante.
Disperdere il pellet in 30 ml H2O fredda tenere in bagno di ghiaccio per 20’.
Centrifugare per 15000 rpm per 15‘ a 4°C. Raccogliere accuratamente il surnatante che contiene la proteina.
Disperdere nuovamente il pellet in 20 ml H2O fredda e tenere ancora per 20’ in
bagno di ghiaccio sotto agitazione.
Centrifugare a 15000 rpm per 15’ a 4°C e raccogliere il surnatante.Riunire i due surnatanti.
LISI DELLE CELLULE
Tecniche di rottura delle cellule
Uso del lisozima nella rottura della parete cellulare
Il lisozima lisa alcuni tipi di batteri rompendo la componente polisaccaridica della parete, formata da 2 tipi di zuccheri, N-acetilglucosamina (NAM) e da acido N-acetilmuranico (NAG).La parete perde rigidita’ e il batterio scoppia a causa dell’elevata pressione osmotica intracellulare
Il lisozima idrolizza il legame glicosidico tra il C-1 del NAM e il C-4 del NAG
Alcuni sistemi per rompere le cellule
Vari modelli di omogeneizzatore.
I buffer più utilizzati sono: Fosfato – Tris – HEPES (pH: 5.8-9)
Concentrazioni del buffer: 20-50 mM
Tris: il pH dipende dalla temperatura pKa: 8.06 a 25°C 8.85 a 0°C
SCELTA DEL BUFFER DI LISI
Buffer pH range
Citric acid - NaOH 2.2 - 6.5
Sodium citrate - citric acid 3.0 - 6.2
Sodium acetate - acetic acid 3.6 - 5.6
Cacodylic acid sodium salt - HCl 5.0 - 7.4
MES - NaOH 5.6 - 6.8
Sodium dihydrogen phosphate - disodium hydrogen phosphate 5.8 - 8.0
Imidazole - HCl 6.2 - 7.8
MOPS - KOH 6.6 - 7.8
Triethanolamine hydrochloride - NaOH 6.8 - 8.8
Tris - HCl 7.0 - 9.0
HEPES - NaOH 7.2 - 8.2
Tricine - NaOH 7.6 - 8.6
Sodium tetraborate - boric acid 7.6 - 9.2
Bicine - NaOH 7.7 - 8.9
Glycine - NaOH 8.6 - 10.6
SCELTA DEL BUFFER DI LISI
TAMPONICOMMERCIALI
SCELTA DEL BUFFER DI LISI
Class of additive example concentration purpose
Salts NaCl, KCl, (NH4)2SO4
50-150 mM maintain ionic strength of medium
Detergents Deoxycholate,Triton X-100
0.1-1% solubilization of poorly soluble proteins
Glycerol 5-10% stabilization
Glucose or sucrose 25 mM Stabilize lysosymal membranes, reduce protease release
Metal chelators EDTA, EGTA 1 mM reduce oxidation damage, chelate metal ions
Reducing agents DTT, DTE2-Mercaptoethanol
1-10 mM0.05%
reduce oxidation damage
Ligands, metal ions Mg2+, ATP, GTP 1-10 mM stabilization
Protease Inhibitors PMSF, Aprotinin,… Reduced protease activity
DNase DNAse I 10-100 U/ml Reduced solution viscosity
ADDITIVI: Aumentano la stabilità della proteina Aumentano la solubilità della proteina
- 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate
- Molecular Weight: 614.88g
- Micelle Molecular Weight: 6149g
- Critical Micelle Concentration (CMC): 8 to 10mM
- Dialyzable: Yes
Un’analisi di sequenza della proteina target può evidenziare siti di taglio per specifiche proteasi
E’ importante lavorare a basse temperature
Ottimizzazione dell’estratto Il tampone di estrazione deve avere composizione salina e pH piu’ simile possibile alle condizioni cellulari, per mantenere in soluzione le proteine Forza ionica 0.15-0.2 MpH 7-7.5Generalmente 2-3 volumi di tampone rispetto al volume del pellet. Maggiore il volume minore
sarà la % di proteine perse nel pellet
Tipici tamponi utilizzati sono 20-30 mM fosfato o Tris-HCl o HEPES
Talvolta vengono aggiunti specifici stabilizzanti come, detergenti, EDTA, inibitori delle proteasi e reagenti contenenti gruppi sulfidrilici come -mercaptoetanolo e ditiotreitolo (5-20mM)
Questi hanno lo scopo di proteggere i residui cisteinici dall’ossigenoI gruppi SH delle cisteine esposti all’ossigeno possono1) formare legami disolfuro –S-S-2) ossidarsi a gruppi solfinici –S-OH3) ossidarsi a gruppi solfoniciLa reazione 1) puo’ essere accelerata da ioni metallici.EDTA rimuove gli ioni metalliciReagenti con gruppi SH si ossidano all’ossigeno al posto delle cisteine
S
OH
OR
SH
OH
HOH
H
SH
+ 1/2 O2SOH
HOH
H
S
Chiarificazione dell’estratto
L’estratto proteico, dopo la rottura delle cellule può essere viscoso per la presenza di acidi nucleiciQuesti possono essere rimossi: per aggiunta di RNAasi e DNAsi per precipitazione con solfato di protamina (composto policationico estratto da pesci)La protamina interagisce elettrostaticamente con gli acidi nucleici.Si forma un complesso che precipita a f. ionica non troppo elevata (< 0.1 M) e ne provoca la precipitazione
L’estratto viene chiarificato da organelli, frammenti di membrana e precipitati per centrifugazione.
CHIARIFICAZIONE: CENTRIFUGAZIONE
La velocità e la durata della centrifugazione dipendono dal coefficiente di
sedimentazione (S) delle particelle da separare:
Il coefficiente di sedimentazione è un numero adimensionale che misura il rapporto tra la velocità di
sedimentazione di un corpo ideale (sfera) e quella del corpo in esame, a parità di condizioni di
riferimento. In alcuni casi è espresso come unità di misura non SI denominata Svedberg
ω = velocità angolare [rad sec-1] = 0.10472 x RPM (rotazioni per min)
r = distanza tra la particella ed il centro del rotore [mm]
dr/dt = velocità di sedimentazione della particella [cm sec-1]
dr/dt = [2/9 r2 p (p-m) 2 r]/
S = 1/ω2r x dr/dt
Differenza tra la sua densità e quella del
mezzo
Coefficiente di viscosità del mezzo
1 Svedberg = 10–13 sec
S
enzimi, ormoni peptidici, proteine solubili
2-25 s
Acidi nucleici 3-100 s
Ribosomi e polisomi 20-200 s
virus 40-1.000 s
lisosomi 4.000 s
membrane 100-100x103 s
mitocondri 20x103S-70x103 s
nuclei 4.000x103 S-40.000x103 s
Dimensione della particella
CHIARIFICAZIONE:
ULTRAFILTRAZIONE
Separazione tramite filtrazione con
membrane a diverso CUT-OFF
ESTRAZIONE DI PROTEINE ESPRESSE IN CORPI DI INCLUSIONE
REFOLDING:
L’agente denaturante viene rimosso per permettere la rinaturazione della proteina
Tecniche di refolding:Tecniche di refolding:
REFOLDING DIRETTO
DIALISI
REFOLDING IN COLONNA (proteine di fusione)
Metodo sperimentale proprietà chimico-fisiche della proteina
Preparazione materiale e soluzioni
Sterilizzare materiale (punte, eppendorf, tubi da PCR) Sterilizzare 4 beute da 2 l, con 0.5 l ciascuna di 2YT Sterilizzare H2O
Preparare 2 0.5 l 2YT sterile Preparare 2 10 ml amp sterile 1000 (2g/10 ml) Preparare 2 5 ml IPTG sterile (0.5 M) Preparare 2 10 piastre 2YT agar + amp (200 g/ ml) Soluzione sterile di ampicillina (2 g/10 ml)Sciogliere 2 g di ampicillina in 10 ml di H2O
Sterilizzare per filtrazione in Falcon sterile Soluzione sterile di IPTGSciogliere la quantità opportuna di IPTG, per avere soluzione 0.5 M, in 5 ml di H2O. Sterilizzare per filtrazione in Falcon sterile
Preparazione materiale e soluzioni
2YT 0.5 l triptone 8.0 gestratto di lievito 5.0 gNaCl 2.5 g Portare a volume con H2O – Sterilizzare in autoclave, 120 °C, 1 bar, 30’.
2YT agar 0.5 l triptone 8.0 gestratto di lievito 5.0 gNaCl 2.5 gAgar-agar 10.0 g Portare a volume con H2O – Sterilizzare in autoclave, 120 °C, 1 bar, 30’.
Aggiungere soluzione ampicillina sterile (concentrazione finale 200 g/ ml, 0.5 ml su 0.5 l) quando la soluzione e’ quasi fredda, prima che solidifichi