Onur

Seve

nDOĞAN

YENİ ENZİMLERİN KEŞFİNDE

METAGENOMİK YAKLAŞIMLAR

Mikrobiyal komüniteler bakteri ve arke türlerini fazlaca

bulundurur, bunların büyük bir çoğunun daha önceden kültürü veya resmi olarak tür tayin analizi yapılmamıştır. Metagenomik –aynı zamanda çevresel genomik de denilir– daha önce tanımlanmamış organizmaların çevreden, direkt olarak habitatlarından DNA ya da RNA’larını izole ederek bu organizmaların tanımlanmasını amaçlayan bir disiplindir. Nasıl ki bir organizmanın total gen içeriğine genom diyor isek, organizmaların içinde bulundukları çevredeki toplam gen içeriklerine de metagenom adı verilir. DNA, RNA veya protein analiz yöntemleriyle mikrobiyal komünitedeki canlıların genlerindeki, gen ekspresyonlarının yapıldığı bölgeler araştırılabilir. 

 

Metagenomik Nedir?

Bir çok ortam geniş metagenom sekanslama projeleriyle

takip edilmektedir. Ekstrem ortamlarda, –halofilik, asidik gibi– veya toprak ve aquatik ortamlar gibi bir çok alanda metagenomik çalışmalar yürütülmektedir. Metagenomikte ilginç olan bir bulgu da şudur ki; çevredeki çokça genin hücresel organizmalardan ziyade virüslere ait olmasıdır.  

 

 

Metagenomik

İnsan vücudu 10 trilyon hücre ihtiva etmektedir ancak her birimiz

vücut hücrelerimizin 10 katı kadar daha fazla prokaryotik hücre barındırmaktayız. Böyle düşünürsek vücudumuzdaki hücrelerin sadece %10’u bize ait olmaktadır. Bu da bizim diğer genomumuzu oluşturmaktadır –insan mikrobiyomu– çünkü birçok hastalığın nedeninin bu barındırdığımız prokaryotik hücreler kaynaklı olabileceği düşünülmektedir ve bunun üstüne çok ciddi çalışmalar, bulgular bulunmaktadır. Birçok prokaryotik bağırsaklarımızda yaşamaktadır ve bunlar iki büyük bakteri grubuna aittirler Bacteroidetes ve Firmicutes. Buradaki merak uyandıran buluş şu olmuştur ki; insanlar ve fareler üzerinde yapılan deneyler sonucunda bağırsak mikrobiyomunun obeziteyle ilişkili olduğu belirlenmiştir. Firmicutes bakterilerinin yüksek oranda olması insanı veya fareyi şişmanlatmaktadır. Bunu nasıl olduğu hakkında önerilen mekanizma şu yöndedir; Firmicutes bakterilerinin dietary liflerini –selüloz içeren besinler– kısa zincirli yağ asitlerine çevirdiği ve böylece insanın veya farenin bu besinleri absorblayacağı hale dönüşmesinden kaynaklanmaktadır. Yani kişi aynı ölçüde beslense dahi daha çok şişmanlayacaktır.  

 

 

Metagenomik

Gen madenciliği potansiyel olarak faydalı olabilecek yeni

genlerin o genleri taşıyan organizmaların kültürünü yapmaksızın organizmalardan toplanmasıdır; ki bu da metagenomiğin temelini oluşturmaktadır. Bu proseste DNA ya da RNA direkt olarak çevresel ortamdan toplanır ve metagenomik kütüphane oluşturmak üzere uygun bir vektöre klonlanır. Nükleik asitler yaşayan organizmadan veya ölü hücrelerden toplanabilir ancak toplanacak olan nükleik asitin degrade olmadan önce alınmasına özen gösterilmelidir, aksi takdirde genomik değerlendirmelerin ve nükleik asit sekanslamaların yapılması mümkün değildir. Eğer çevresel habitatdaki canlılardan RNA izole edildiyse bu RNA revers transkriptaz enzimiyle önce DNA’ya dönüştürülmelidir, ardından vektöre klonlanıp metagenomik kütüphanelere eklenmelidir.

 

 

Gen Madenciliği

Metagenomik aynı zamanda belirli kirleticileri

degrade eden yeni enzimlerin ve yeni antibiyotiklerin keşfinde kullanılmaktadır. Şimdiye kadar birçok lipaz, kitinaz, esteraz ve diğer degradatif enzimler ve bu enzimlere ait yeni substratlar bu yöntemle bulunmuştur. Bazı enzimler sıklıkla endüstriyel uygulamalarda kullanılmaktadır, bu enzimler bazı endüstriyel ortamlara –yüksek sıcaklık, yüksek veya düşük pH– uyum sağlaması açısından kıymetlidir.  

 

 

Gen Madenciliği

Farzedelim ki belirli bir kirleticiyi yüksek sıcaklıkta

degrade etmesini istediğimiz bir enzime ihtiyacımız var. Burada öncelikle ilk adım hedef kirleticiyle kirletilmiş sıcak bir ortam bulmak olacaktır ve varsayalım ki bu kirleticiyi temizleyecek olan mikroorganizmalar da bu sıcak habitatta bulunmaktadır. Bu hipotezimizde yapmamız gereken bu sıcak ortamdaki mikroorganizmalardan DNA izole etmek ve bunları bakterilere klonlamak olacaktır ve daha sonra klon genleri bulunduran konak bakterinin hedef kirletici üzerindeki etkisi gözlemlenmelidir.

 

 

Gen Madenciliği

Başka bir örnek verelim; Varsayalım ki ticari uygulamalarda

kullanılmak üzere termostabil –yüksek sıcaklıklarda iş görebilen– lipaz enzimine ihtiyacımız var. Lipaz trigliseritleri hidrolize eden bir enzimdir ve bu nedenle kozmetikde ve farmasötik uygulamalarda kullanılmaktadır. Ancak endüstriyel üretimlerde kullanılan enzimlerin yüksek sıcaklıklarda etki göstermesi beklenir. Bu nedenle termofil mikroorganizmalardan izole DNA örnekleriyle moleküler biyologlar bir metagenomik kütüphane oluşturdular. Bu kütüphanedeki sıcaklılığa dayanıklılık geni E.coli ’lere transfer edildi ve rekombinant suşlar istenilen ortamda ve sıcaklıkla lipaz aktivitesini ifade ettiler. Bu izolatların ürettiği lipaz incelendiğinde 90°C ve üzerinde bile enzim aktivitesini gerçekleştirdiği görülmüştür.

 

 

Gen Madenciliği

Mikrobiyal komünitelerin moleküler çalışmalarına en

kapsamlı olarak yaklaşan metagenomik belirli bir çevredeki bütün mikrobiyal genomları karakterize eder. Metagenomikten önce mikrobiyal komünite analizleri tipik olarak belli bir ortamdaki tek bir genin çeşitliliğine dayalı olmaktaydı. Ancak çevresel genomikte herhangibir yerdeki mikrobiyal komünitenin bütün genleri model olarak örneklenebilir, bu da komünitenin fonksiyonu ve yapısı hakkında tek gen analizlerine göre daha ayrıntılı bir araştırma yapma olanağı sağlar. Bunu bir örnekle açıklayacak olursak. Varsayalım ki belli bir ortamda nitrojen fiksasyonu prosesinde görevli enzim toplanmak isteniyor, buradaki limitasyon şudur; ortamımız NH4

+ (amonyum) ,

NO3- (nitrat) ve fikse edilmiş N2 (nitrojenin) diğer

türlüleri ile sınırlı olmasıdır ki nitrojen fikse edebilen bakterileri seçebilelim. Oysa çevresel genomikte komünitedeki bütün DNA’nın sekanslanma imkanı vardır.  

 

 

Metagenomik

Toplam komüniteden örneğin 16s rRNA’yı

kodlayan gen toplanır, sekanslanır ve filogenetik ağaç yapılmak üzere işlenir. Sonuçlar iki türlü olur. Birincisi, komünitedeki pek çok üyenin filogenetiği çıkartılır. İkincisi; yeni filotipler belirlenir.  

 

 

Tek Gen Odaklı İncelemeler:

Komünitenin toplam DNA’sı alınır ve ileri

teknoloji sekanslama teknikleriyle –shotgun sekanslama gibi– gen sekansları yapılır ve sekanslanan DNA fragmentleri tekrar bir araya getirilir sonuçlar incelenir. Birincisi; bütün gen katogorisi tanımlanmış olur. İkincisi; Yeni genler keşfedilir. Üçüncüsü; Genlerin filotiplerle bağlantısı tespit edilir. 

 

 

Çevresel Genomik –Metagenomik –

Metagenomik ile bilinen organizmalardaki yeni genleri ve yeni

organizmalardaki bilinen genleri tespit edebiliriz. DNA’nın proteinleri kodlayan bilgiyi içerdiğini biliyoruz. Ancak bazı proteinler homolog olarak ifade ediliyor ve bilinen başka hiçbir türde bu aynı proteine rastlanmıyor bu tip genlere ‘’ORFan’’ genler ‘’öksüz genler’’ denmektedir. ORFan isminin verilmesi Open Reading Frame’e yani proteinin oluşmaya başlaması için gerekli triplet –ATG– ‘yi içeren DNA ya da RNA zincirine gönderme olarak verilmiştir. Sargasso Denizi’nde yapılan çalışmalarla bir canlıda metabolizma ile ilgili gen kodlayan bölgelerin daha önce metabolizma ile ilgisi bilinmeyen başka canlıların genomunda da bulunduğu görülmüş. Örnek verecek olursak; amonyak monooksigenaz enzimini kodyalan genler amonyak okside eden bakteriler için temel enzimdir, ancak bu DNA fragmentleri aynı zamanda arke genlerini de içerisinde bulundurduğu görülmüş ve bu da amonyak okside eden arkelerin olabileceği görüşünün öne atılmasını sağlamıştır. Bu öneri mikrobiyologların nitrifikasyon yapan (bir tür arkenin –Nitrosopumilus maritimus– NH3  NO2

− deniz ortamından izole edilmesiyle daha da güç kazanmıştır.  

 

 

Metagenomik

Bir başka örnek verecek olursak; Yine Sargasso Denizi’nde

Yapılan çalışmalarla proteobacterilerin biyoluminesans üretmekle ilgili proteorhodopsin proteinini kodlayan gen bölgesinin filojenik olarak bakterilele bağlantılı olan başka türlerde de olduğu gözlenmiştir. Proteorhodopsin daha önceleri Gammaproteobakterilerden kültürü yapılmadan okyanus suyundan DNA fragmentleri toplanarak analiz edilmişti, ilerleyen metagenomik çalışmalar göstermiştir ki; proteorhodopsin deniz arkelerinde ve tatlı su bakterilerinde geniş bir şekilde ifade edilmektedir. Bu çalışmalar ışığın fizyolojide ve ekolojideki önemini işaret etmiş olmuştur.  

 

 

Metagenomik

Son yıllarda dünya genelinde bakterilerin direnç genleri

kazanımlarıyla ilgili olarak enfeksiyonel hastalıklarda bir artış görülmektedir. Dirençli patojenler ileri derecede ölümcül olabilmekte ve sağlık endüstrisine çok pahalıya mâl olabilmektedirler. Bu çalışmada temel amaç, kültüre alınmış mikroorganizmaların antibiyotik rezistans genlerine ve antimikrobiyal bileşiklere odaklanmaktır. Metagenomik yaklaşımlar ile bu antibiyotik rezistans genlerini ve antimikrobiyal bileşiklerin olası rezervlerini, mikroorganizmalar kültüre alınmadan mikrobiyal komünitenin bulunduğu habitatdan direkt olarak inceleyebiliriz. 

 

 

Toprak Metagenomundaki Yeni Antimikrobiyal Bileşimlere ve Antibiyotik Direnç Genlerine Bakış

Son zamanlarda dünya genelinde kolay kontrol edilemeyen sağlık

problemlerinin başında, enfeksiyonların tedavisinde olası engel antibiyotik direnci süregelmektedir. Antibiyotik dirençli patojenlerin yüksek sağlık masraflarına ve yüksek ölüm oranlarına sahip olduğunu söylemiştik. Yakın bir zamana kadar antibiyotikler sadece insan sağlığında iyileştirici ajan olarak kullanılmıştı, ancak günümüzde artık hemen hemen endüstriyel her yerde –agrikültürde, yemek endüstrisinde, veteriner uygulamalarında... – kapsamlı ve yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Tabiki bu geniş kullanımın doğaya ve insan sağlığına etkisi büyük olmuştur. Çünkü antibiyotiklerin bu derecede tedbirsiz kullanımı ile bakterilerde antibiyotik direnç genleri oluşmuştur ve mikribiyal enfeksiyonlara karşı tedavi yöntemlerinin mücadelesinde daha fazla efor sarfetme gereksinimi doğmuş hem de bilinen ve daha önce kullanılan antibiyotiklere karşı bakterilerde direnç yolakları gelişmiştir.  

 

 

Toprak Metagenomundaki Yeni Antimikrobiyal Bileşimlere ve Antibiyotik Direnç Genlerine Bakış

Bu koşullar dikkate alınarak son 10 yılda metagenomik

yaklaşımlar farklı çevrelerdeki antibiyotik direnç genlerine ve antimikrobiyal bileşiklerinin iç dünyasına bakmamıza imkân sağlamıştır. Metagenomik analizleri aslında moleküler metodlarla aynıdır. Ekstraksiyon, amplifikasyon, sekanslama ve çevreden alınan nükleik asitlerin analizi olarak 4 kısımda tamamlanır. Metagenomik yaklaşımlardan önce kültüre alınmış mikroorganizmalar antimikrobiyal aktiviteyi ve antibiyotik rezistans genlerini izole etmede ve klonlamada önemli kaynak olmuşlardır ancak araştırmacılar mikroorganizmaları standart laboratuvar kültürlerinde büyütmeye çalıştıklarında çokça mikrobiyal çeşitlilik de kaybolmuştur. Bu sebeple metagenomik yaklaşımlar direnç genlerini ve antimikrobiyal bileşikleri mikroorganizmaları kültüre almadan belirlemek için güvenilir bir yaklaşımdır.  

 

 

Toprak Metagenomundaki Yeni Antimikrobiyal Bileşimlere ve Antibiyotik Direnç Genlerine Bakış

Bir örnek verecek olursak; Alaska topraklarında β-lactam

antibiyotiğine dirençli ortamlar olup olmadığı araştırılmış. Bu analiz önemlidir çünkü örnek alınan toprağın daha önceden antibiyotik maddelerine ve insan kaynaklı kirliliğe maruz kalmadığı görülmüş. Bu araştırma sonucunda,  Alaska topraklarındaki β-lactamaz karakterizasyonun klinik ve laboratuvar ortamlarındaki β-lactamaz’dan daha farklı olduğuna ve daha çok atasal homologlarına ait olduğuna kânaat getirilmiştir. Ayrıca Alaska toprakları metagenomik kütüphanesinden alınan bu  β-lactamaz’ın filogenetik analizi sonucu bunun klinik ortamlardaki β-lactamaz sekansından daha farklı olduğu görülmüştür ve farklı sekansta olmasına karşın E.coli suşlarına  β-lactamaz’a karşı yine de direnç kazandırabilmiştir. 

 

 

Toprak Metagenomundaki Yeni Antimikrobiyal Bileşimlere ve Antibiyotik Direnç Genlerine Bakış