TAP CHÍ KHOA HOC DHQGHN. KHTN & CN. T XX. So 2PT . 2004

X Á C Đ ỊN H G IỚ I T ÍN H G À B A N G K Ỹ T H U Ậ T P C R

P h a n T u â n N gh ĩa , N guyễn M ộng H ùng, N g u y ế n T h ị V ân A nh,N guyến Q uốc T ru n g , N guyễn T h ị T h ảo , N guyễn T u ấ n A nh , Vũ P h ư ơ n g Ly

Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN

1. M ở đ ầ u

Gà nói riêng hay gia cầm nói chung là nhóm vật nuôi đóng vai trò quan trọng bậc nhất trong việc cung cấp th ịt cho con người. Xác định sớm giới tính ở gia cầm có ý nghĩa quan trọng trong cả nghiên cứu về phôi học cũng như ứng dụng trong sản xuất dê chủ động diều khiên tỷ lộ đực /cái theo các hướng mong muốn. Đê xác định sớm giới tính ở gia cầm đã có một sô phương pháp khác nhau được áp dụng như phân tích hình thái lỗ huyệt hay phán biệt kiểu nhân. Tuy vậy, các phương pháp vừa nêu có hạn ch ế ở chỗ hoặc là m ất nhiều thòi gian hoặc chi’ áp dụng dược cho một sô’ ít đôi tượng. Chính vì vậy, trong nhũng năm gần đây các phương pháp sinh học phân tử dựa trên sự sai khác ở mức ADN giữa các cá th ể đực và cái đã dược áp dụng [2.3,4,6,7,8,9,11]. Mặc dầu vậy, khi chúng tôi áp dụng m ột sô’ qui trình kỹ thuật đã công bô' [3,9] để xác định giới tính ở gà đã không thu được kết quả thực sự tin cậy. Hơn thê nữa, cho đến nay ở Việt Nam việc áp dụng các kỹ th u ậ t sinh học phân tử để xác dịnh giới tính gia cầm vẫn chưa dược quan tâm . Nghiên cứu của chúng tôi nhằm từng bước th iết lập qui trình xác định giói tính của gia cầm từ giai đoạn phôi đến trưởng thành bằng kỹ thuật PCR cỏ độ nhạy và độ tin cậy cao, góp phần hỗ trợ cho công tác nghiên cửu phôi sinh học củng như phát triển chản nuôi ỏ trong nước.

2. N guyên liệu v à p h ư ơ n g p h á p n g h iê n cứu2.1. Nguyên liệu

Nguyên liệu sử dụng để tách ADN là máu lấy từ gồ (Galus dom esticus), chim cút {Turnix tanki), bồ câu (Columba livià), vịt (Anas platyrhincha) và phôi gà. Mẫu phôi do Phòng Công nghệ tế bào động vật, thuộc Trung tâm Sinh học phán tử và Công nghệ tế bào cung cấp.

Các cập mồi dược m ua từ hãng Integrated DNA Technology (IDT, Mỹ), thang chuẩn ADN klH indĩĩỉ và 1 kb của hãng Ferm entas (Lithoania). Các hoá chấ t còn lại đểu đạt mức tinh khiết cho nghiên cứu sinh học phân tử.

2.2. Phương p h á p

ADN của máu gà hay gia cầm khác và của phôi gà được tách bằng kit GFX của hãng Pharmacia (Thuỵ Điển). Ngoài ra ADN còn được tách theo phương pháp của Albarino và Romanowski [1] có cải tiến. ADN được định lượng bằng cách đo dộ hấp th ụ ở bước sóng 260 nm (AMn) và kiểm tra băng điện di gel agarose.

Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) được thực hiện trong một thể tích 25^1 có chứa 10- 70 ng ADN khuôn, mồi xuôi và mồi ngược ở nồng độ 0,5 nM, 2,5 đơn vị Taq ADN

156

X.R ill nil JJII'I hull ;j. I h.m ;■ k\ [hu.'H l’( k 157

polymerase và dNTP 0.4 mM. Chẽ độ nhiệt bao gồm các bước khởi dộng nóng ỏ 94°c trong 5 phút, biến tính ADN khuón ở 94"C trong 30 giây, gắn mồi ớ 65"C trong 15 giây, kéo dài chuỗi ớ 72"C trong 25 giây, với 35 chu kv lặp lại và giũ phán ứng ớ 72"C trong 1 phút, s à n phấm dược phàn tích bằng điện di gel agarose và nhuộm băng bang ethidium bromide.

3. Kết q u á n g h iê n cửu

3.1. Tách A D N từ m áu và phô i gà

Để tách ADN từ máu gà chúng tôi đã sử dụng kit tinh sạch ADN từ máu ký hiệu CrFX của hãng Pharm acia, lượng máu sử dụng là 2j.ll. Riêng với phôi phải có thêm bước nghiền tế bào trước khi lấy m ẫu tách ADN, Lượng ADN thu được từ khoảng 2-6 ng. Kết quả kiểm tra độ sạch bằng điện di trên gel agarosel% dược trình bày ỏ hình 1. Có thế dễ dàng nhận thấy ràng chế phẩm ADN của các mẫu máu gà (A), chim cút (B; hai cột đầu) hay bồ cảu (B: hai cột tiếp theo) thuộc hai giới đực và cái dều cho một băng nguyên vẹn. có kích thước lớn. khõng lần ARN. chứng tỏ chế phấin thu được có độ sạch cao.

Bẽn cạnh việc tách ADN bằng kit GFX, chúng tôi cũng đã liến hành tách ADN từ máu gà theo phương pháp của Albarino và Romanowski []]. Đây là phương pháp áp dụng cho tách ADN lừ máu người và không dùng chất chống dông. Tuv vậy, khi chúng tôi áp dụng phưrlng pháp này đè' tách ADN từ máu gà thì thấy rằng máu gà dông rấ t nhanh vì vậy chúng tỏi đã bô sung thêm vào m áu một the tích tương điíơng dung dịch muôi sinh lý (NaCl0.9%) và sứ dụng hỗn hợp phenol: chloroform: isoamyl alcohol (ti lệ 25:24:1 vê thế tích) thay cho việc sử dụng chiết hai bước bằng phenol và bằng chloroform: isoamyl alcohol như trong qui trình gốc. Kết quả phân tích cho thấy lượng ADN thu được tương tự như khi sử dụng kit, tuy nhiên để tách ADN theo phương pháp này, lượng mẫu cần lấy ban đổu là từ 20 ị.il trỏ lên. Kết quả diện di chế phẩm ADN thu đươe ở hình 1D cho thấy ADN thu từ máu gi1! trông và gà mái đều cho một bâng, eó kích thưốc lớn, không lẫn ARN. Dể tách ADN từ phôi, chúng Lôi đã nghiền mẫu và ủ ở 37°c trong 1 phút. Sau đó ly tâm để thu tế bào và tiếp tục tách chiết với qui trình tương tự nhu với mẫu máu. Ngoài ra , qui trình tách ADN từ phôi cẩn có thâm bưỏc xứ lỹ bảng ARNase dê loại ARN. Chế phẩm thu dược có chất lượng không sai khác với chế phàm lách bằng kit.

Hình 1: Điện di agarose chè phãm ADN m áu g ia cắm và phôi gà.A: ADN cùa mâu gà. B: ADN cùa m áu ch im cú t (2 cột đẩu tiê n ) và bố câu (2 cột cuối cùng). C: ADN củạ phõi, D: ADN của máu sà tách băng phương pháp không dùng kit. M: thang chuân 1 kb (A, B và C) hay HindiII (D), P: Phôi.

3.2. X ác đ ịn h giới t in h bằng k ĩ th u ậ t PCR

Đe xác tlịnh giới lính gà bằng PCR. chúng tôi đã sử dụng 2 cặp mồi có ký hiệu NP/MP2 và NP8/MP3 (bảngl). được th iết kế dụa cặp mồi NP/MP trong nghiên cứu Ito và tập thê [7] đẽ xác dịnh giới lính một sô' loài thuộc họ chim cát (Falconìformes) bằng PCR. Các cặp mồi này dểu dựa vào sự sai khác về trình tụ nucleotit ớ vùng intron của gen

A B c D

<r í M đ 1 * t < ì M M PI P2 n M f 9

Eiil

158 Phan Tuẫn Nghĩa. Nguyẻn Mộng Hùng. Nguyen Thi Vân Anh

CDH1W và CDH1Z nằm tương ứng trên nhiễm sắc thể w và z đặc trưng cho giới tính cái và đực của gà. Trong 2 cặp mồi NP/MP2 và NP8/MP3 (bảng 1) th ì NP có trinh tự giông nhau giữa các gen CHD1 của các loài chim cắt và gà còn MP2 và MP3 là được chúng tôi th iết kê dựa trên trình tự đặc trưng của CDH1W. MP2 được lựa chọn để kết thúc bằng adenin ờ đầu 3’-OH nên không th ể gắn bô sung vào trình tự gen CDH1Z (giới tín h đực) vốn chứa cytosine. Ngoài ra , trong trìn h tự của MP2 còn có một nucleotit sai khác (A) giữa CDH1Z so với CDH1W (T).

Qua nghiên cửu chúng tôi thấy ràng khi sử dụng cặp mồi NP/MP2 cho PCR với lượng ADN khuôn từ 50-70 ng và chế độ nhiêt: biến tính ban đầu â 94°C-5\ tiếp theo là 35 chu ký gồm 94°C-30”, 64°C-15”, 72°C-25” và 72°C-1' đã cho phép thu được bảng nhân bản với kích thước 286 bp rấ t rõ n ét với mẫu ADN khuôn của con cái và chỉ là một băng mò nhạt có kích thước 269 bp với các mẫu ADN của con đực (đoạn gen này của CDH1Z ngắn hơn của CDH1W 17 nucleotit). Theo chúng tôi, sử dụng kỹ th u ậ t PCR với cặp mồi NP/MP2 đú cho phép xác đinh giới tính ỏ gà. Qui trình này khi được thử nghiệm trên các mẫu ADN tách từ phôi đều hoặc cho bảng nhân bản 286 bp, chứng tỏ đó là phôi cái hoặc cho có kích thước gần tương đương nhưng mờ nhạt, chứng tò đỏ là phôi đực. Toàn bộ thời gian đê thực hiện việc xác định giới tính của mẫu khoảng 3,5 giờ, bao gồm việc tách ADN (khoảng 40 phút), chạy PCR ( khoảng 130 phút) và chạy điện di, phân tích kết quả (khoảng 40 phút).

Cặp mồi NP8/MP3 được chúng tôi sử dụng nhằm làm tăng tính đặc hiệu cũng như độ tin cậy của phương pháp. Trong đó MP3 vẫn là trình tự gen CDH1W nhưng lùi về sau 37 nucleotit so với MP2 để có tới 5 nucleotit sai khác so với trình tự tương ứng trong gen CDH1Z của con đực [7] còn NP8 chửa một phần trình tự của N8 và toàn bộ trình tự của NP. Việc kéo dài NP thành NP8 là để cả hai mồi NP8 và MP3 có nhiệt độ tách chuỗi (Tm) gẩn như nhau, cho phép chúng tôi sử dụng nhiệt độ gắn mồi cao như đôi với MP3 (65°C).

B ản g 1. Trình tự các cặp mồi dùng để xác đinh giới tính gà, vịt, chim cút và bồ câu.

TTKý hiệu

của cặp mồíTrình tự

B ăng nhân bản đặc hiệu giới tính s

1 NPMP2

5’-GAG AAA CTG TGC AAA ACG A 5’-CGT TTT CTT TCT GAT ATG GAA

286 bp

2 NP8MP3

5’-GAG AAT GAG AAA CTG TGC AAA ACAG 5’-ACG GGG AAT AGT TCG TGG TCG

328 bp

Kết quả chạy PCR sử dụng cặp mồi NP8/MP3 với chế độ nhiệt: biến tính ban dầu ò 94°C-5\ tiếp theo là 35 chu kỳ gồm 94°C-30”, 65°C-15”, 72°C-25” và 72°C-1’ (hình 3A) cho thấy tấ t cả mẫu ADN khuôn của gà trống đểu không cho băng nhân bản nào, còn các mẫu ADN khuôn của gà mái đểu cho một băng nhân bản rất rõ nét có kích thước 328 bp. Khi thử nghiệm qui trình để xác định giới tính của các mẫu vịt, chim cú t và bồ cáu đểu cho kết quả tương tự (hình 3A). Mặc dầu băng nhân bản ỏ mẫu ADN khuôn của vịt ít rõ nét hơn so với các đôi tượng khác nhưng vẫn đủ tính đặc trưng cho việc phân b iệt đực - cái. Chúng tôi đã áp dụng qui trình này với ADN tách từ 5 mẫu phôi (P) gà khác nhau, k ế t quả thu dược

I'.I I IL' k\ lhu.ll I’CR

(hình 3B) cho thấy, trong 5 mẫu phòi này thì P l và P3 không có bảng 328 bp, tương tự như khi sứ dụng m ầu ADN của gã trống trướng thành, chứng tó chúng là phôi đực. còn các mẫu P2. P-l và P5 đều có băng 328 hp tương tự như mẫu gà mái trướng thành và chứng tó các mẫu này là phôi cái.

Chúng tôi cũng dã tiến hành thí nghiệm xác định giới tinh gà với các nồng độ ADN khuôn khác nhau và dã phát hiện được ràng nồng độ ADN khuôn tối thiểu dế có thể thu được bằng nhãn bán rõ n é t là 10 ng. Theo tính toán thi lượng ADN 10 ng có thế tách được từ khoang 5 nanolit m áu hay từ khoáng vài tế bào phôi ban đẩu.

M í .t 1

Hinh 2: Điện di gd agarose sán phẩm PCR xác ilịnh giới lính gà sứ dụng cặp mới NP và MP2.

M: Thang chuẩn ADN (5(}-20(X)hp). * tương ứng vrti cácmàu ADN khuôn của máu gà tríína và mái irướng thành.

IIinh ỉ : ĐiỌii Ui gcl agarose s;in phẩm PCR xác định giỏi lính gii sir dụng cặp mói NPH/MP.V A: Sán phàm PCR VỚI until ADN khuôn lừ máu gia cám truitng Ihìrnh. B: Síin phẩin l’CR v«ïi inAu ADN

khuôn cùa phói (P). M: Ihang chuẩn ADN Ikb.

4. T h ả o lu ận

Xác dịnh giới tính của nhiều loài thuộc tớp chim thường gập khó khồn do con đực và con cái rấ t giông nhau vể hình thái, đặc biệt là ỏ giai đoạn con non [5,8.12]. Nhiều kỹ thuật dựa trẽn sự khác nhau về ADN giữa hai giới đã được phát triển để giải quyết vấn đề này. Trong sô' các kỹ đã được sử dụng thì PCR được xem là phương pháp dáng tin cậy nhất. Điếm chung trong sử dụng PCR của các nhá nghiên cứu là dựa vào sự sai khác vé gen mà hoá như ATPase [9], DMRT1 [10] hay CDHl [3,7]... nằm trên nhiễm sắc thê giới tính w của con cái và z của con dực. Chúng tôi khi áp dụng kỷ thuật PCH với các cặp mồi như W 02/W 03 theo qui trình của P etitte vã Kegelmeyer [9] hay cặp SS1/SS2 theo qui trinh của D’Costa vã Petittc [3] đế xác định giới tinh cùa gà đã không cho kết q u á tin cậy. Cụ thế chúng tôi hoặc là thu được bãng nhân bán như nhau với mẫu ADN của cà hai giới, hoặc không thu được băng nhân bán dặc hiệu. Nguyên nhản chính cúa những sai khác này có thế do cặp mồi W 02/W 03 chi có thê áp dụng cho PCR với sự biến đôi các chế độ nhiệt trong thời gian rấ t ngắn mà các máy PCR thông thường không thực hiện được. Còn độ lặp lại thấp khi áp dụng các qui trình khác có thể lã do qui trình này chi áp dụng dược cho đôì tượng loài mà các tác giá đó quan tâm . Ito và tậ p thê [7] cho thấy việc sử dụng các cập mồi có nucleotit kết thúc ỏ đầu 3’ vào chính điểm khác nhau đặc trưng của gen CDH1W và CDHIZ đã cho phép phán biệt được giỏi tinh của nhiều loài thuộc họ chim cắt. Tuy vậy, do trình tự gen CDH1W và

160 Phan Tuán Nghĩa. Nguvỏn Mòng Hùng. Nguyèn Thị Van Anh.

CDH1Z ỏ gà có nhũng sai khác so vỏi trìn h tự CDHlW và CDH1Z của các loài chim cắt nên không thế dùng các cặp mồi này đế xác định giới tín h gà bằng PCR. Vối nguyên tắc th iế t kế mồi tương tự chúng tôi đã th iế t kê cặp mồi NP/MP2 dặc trưng cho gen CD H l ỏ gà và nhờ vậv đã cho phép dễ dàng nhận dạng giới tính của gà bằng PCR. Nhằm một bước phát triển tính đặc hiệu của phương pháp, chúng tôi đã th iế t kế cặp mồi NP8 và MP3, trong đó NP8 chửa phần trình tự có m ặt ở cả CDHlW và CDH1Z còn MP3 dựa trên phần trình trình tự có sự sai khác tỏi 5 nucleotit giữa gen CDH1W và CDH1Z, nhờ vậy đã làm cho phép phân biệt chính xác giới tính đực-cái của m ẫu vối lượng ADN khuôn rả't thấp (10 ng) và loại trừ hoàn toàn sự x u ất hiện của (các) bảng không đặc hiệu.

Qui trình th iế t lập với cặp mồi NP8/MP3 còn cho phép dễ dàng p h át hiện giới tính của vịt, chim cút và bồ câu, chứng tỏ các loài nàv có vùng gen CDH1 chọn nghiên cứu rấ t giống vói trình tự gen C D H l ở gà. Qui trình cho phép p h át hiện chính xác giới tính của gà ở ngay giai đoạn phôi. Với thời gian thực hiện gắn, số lượng mẫu mồi lần phân tích từ vài chục trở lên, qui trìn h chắc chắn sẽ rất có ý nghĩa cho việc nghiên CÛU phôi cũng như cho việc phát

triển chản nuôi gia cầm.

T À I L IỆ U THA M KHẢ O

1. Albarifto. C.G. and Romanowski, V, Phenol extraction revisited: A rapid method for the isolation and preservation of human genomic DNA from whole blood. Mol. (6 Cell. Probes8. 1994. pp. 423- 427.

2. Clinton, M, A rapid protocol for sexing chick embryos (Gallus g. domesticus), Anim. Genet. 25, 1994. pp. 361- 162.

3. D’Costa, S. and Petitte, J. N, Sex identification of turkey embryos using a multiplex Polymerase chain reaction, Poultry Sci, 77, 1998, pp. 718- 721.

4. E'llegren, H., Hens, cocks and avian sex determination, A quest for genes on z or w?. EM BORep, 2, 2001, pp. 192-196.

5. Ellegren, H, Evolution of the avian chromosomes and their role in sex determination. Trends Ecol. Evol, 25, 2000, pp. 188- 192.

6. Griffiths, R., Daan, s ., Dijkstra, c . Sex identification in birds using two CDH genes. Proc. R. Soc. Lond, 263, 1996, pp. 1249-1254.

7. Ito. H., Sudo-Yamaji, A. Abe, M., Murase, T., Tsubota, T. Sex identification by alternative polymerase chian reaction methods in Falconiformes, Zool. Sci, 20, 2003, pp. 339-344.

8. O'Neill, M., Binder. M., Smith, c ., Andrews, J., Reed, K., Smith. M.. Millar, C-, Lambert, D.. Sinclair. A. ASW: a gene with conserved avian W-linkage and female specific expression in chick embryonic gonad. Dev. Genes Evol, 210, 2000, pp. 243- 249.

9. Petitte, J. N. and Kegelmeyer, A. Rapid sex determination of chick embryos using the Polymerase chain reaction, Anim. Biotechnol, 6 ,1995, pp. 119- 130.

10. Shan, z., Nanda, I., Wang, Y., Schmid, M., Vortkamp, A.. Haaf, T. Sex-specific expression of an evolutionarily conserved male regulatory gene, DMRT1, in birds, Cytogen. Cell Genet, 89. 2000, pp. 252-257.

11. Sohr», S.H., Lee, c . Y., Ryu, E. K., Han, J. Y., Multani, A. s . and Pathak, s . Rapid sex identification of chicken Fluorescence in situ hybridization using a w chromosome-specific DNA probe, Asian-Aust. J. Anim. Sci, 15, 2002, pp. 1531- 1535.

Xác tlịnh giói linh gà bảng kỷ ihuặt PCR 161

12. Stevens, L., Sex chromosomes and sex determining mechanism in birds, Sci. Program. 80, 1997, pp. 197-216.Đi' lài dược thực hiện với sự líó n ợ kinh phi của đề tài cấp nhà nước KC.04.24

VNU JOURNAL OF SCIENCE, Nai, Sci.. & Tech., T.xx. Nọ2AP.. 2004

D E T E R M IN A T IO N O F C H IC K E N S E X B Y P C R T E C H N I Q U E

P h a n T u a n N g h ia , N g u y en M ong H u n g , N g u y e n T h i V a n A nh ,N guyen Q uoc T ru n g , N g u y en T h i T h ao , N g u y e n T u a n A nh , V u P h u o n g Ly

D epartm ent o f Biology, College o f Science, V N U

A protocol for determ ination of the sex of chicken and th e ir embryos by PCR technique has been reported using a pa ir of prim ers N P8 : 5’-AGA AAT GAG AAA CTG TGC AAA ACA G (forward) và MP3: 5’ -ACG GGG AAT AGT TCG TGG TCG (reverse). The primers were designed on the difference in nucleotide sequences of CDH1 gene located on chromosome z and w of the male and female chicks, respectively. U sing th e method, no amplified band has been observed from the DNA sam ples of the m ale while a 328 bp band has been amplified from the female DNA sam ples. The method can be applied for early and accurate identification of the sex not only for chicken and their embryos bu t also for pigeons, ducks and quails using a small DNA am ount (10 ng), which is isolated from about 5 nanolitre of blood or a few embryonic cells. In addition, a modified protocol for isolation of DNA from chicken blood and embryos has been developed, which can be used directly for application of the poultry sex detem ination technique.