WYKORZYSTANIE TECHNIKI ZAPWYKORZYSTANIE TECHNIKI ZAPŁŁODNIENIA ODNIENIA IN IN VITROVITRO DO OCENY JAKODO OCENY JAKOŚŚCI NASIENIA CI NASIENIA ŻŻUBRAUBRA

P.Pawlak, M.Świątek, K.Braun, M.Giertych, N.Reńska,

M.Zajączkowska, M.Zgoła

Koło Naukowe ZootechnikówSekcja Biotechnologii Rozrodu Zwierząt

Opiekun: dr hab. Dorota Cieślak

Uczelniane sympozjum Kół Naukowych, Akademia Rolnicza w Poznaniu, 10.05.2007

Charakterystyka populacji żubra (Bison bonasus) w Puszczy Białowieskiej

1. Liczebność – rok 1914 – 727 zwierząt, rok 1919 – ginie ostatni żubr w puszczy, rok 1945 – 17, 2002 – 620 zwierząt

2. Wysoki poziom inbredu wpływa niekorzystnie na rozród i zdrowotnośćzwierząt (obecna populacja zwierząt wywodzi się od 12 założycieli)

3. Inicjatywa utworzenia banku nasienia żubra pochodzącego od samców objętych programem corocznych odstrzałów selekcyjnych (nasienie pobrane post mortem z najądrzy, mrożone) PAN Olsztyn, SSGW Warszawa

Liczebność Żubra na Świecie i w Polsce (2003)

Świat – 3053

Polska – 828 (27%)W tym:

• W stadach wolnych – 664

• W rezerwatach hodowlanych – 121

• W zoo i ogrodach pokazowych - 43

Cel badaCel badańń

Ocena jakości nasienia żubra pozyskanego z najądrzy post mortempoprzez określenie:

• udziału plemników żywych, prawidłowych morfologicznie oraz posiadających funkcjonalną błonę komórkową

• zdolności zapładniającej plemników żubra w warunkach heterologicznego zapłodnienia in vitro

MateriaMateriałł i metodyi metody

10 słomek mrożonego nasieniażubra pobranego post mortem z

najądrzy różnych samców

rozmrożenie nasienia

barwienie mieszaninąeozyny z nigrozyną

(EN)

test hipoosmotycznypęcznienia plemników

(HOS)

przepłukanie i użycie do inseminacji oocytów krowy

dojrzałych in vitro

ocena zygot w stadium

przedjądrzy

ocena rozwoju zarodków

hybrydowych

Barwienie mieszaniną eozyny i nigrozyny (EN)Ocena żywotności plemników (A - żywy, B - martwy) oraz procentu plemników

zmienionych morfologicznie

Nigrozyna wybarwia tło preparatu natomiast eozyna wnika przez uszkodzonąbłonę komórkową do wnętrza główki plemnika barwiąc ją na czerwono. Plemniki

oceniano w mikroskopie świetlnym

A

A

B

Barwienie EN Barwienie EN –– wynikiwyniki

1. Z nasienia pozyskanego z każdej słomki wykonywano 2-3 rozmazy

2. Obliczeniami objęto 400-500 plemników na każdym preparacie, do których odnoszono liczbę komórek żywych i zmienionych morfologicznie

3. Procent komórek żywych wahał się od 21.0% do 32.7%, ze średnią równą28.8%

4. Udział plemników zmienionych morfologicznie wyniósł średnio 16%.Najczęściej obserwowaną wadą morfologiczną była obecność kropli cytoplazmatycznej. W kilku przypadkach zanotowano plemniki z podwójnąwstawką.

A B

Przykłady plemników o nieprawidłowej budowie morfologicznej

A – plemnik z podwójna wstawką,

B – plemnik z kroplą cytoplazmatyczną

Hipoosmotyczny test pęcznienia plemnikówInkubacja plemników w roztworze o niższym niż wewnątrz komórki ciśnieniu

osmotycznym (100mOsm) powoduje migrację wody do plemnika i wyrównanie stężeń (pęcznienie witki połączone z jej skręceniem) Pozytywny wynik testu świadczy o ciągłości i funkcjonalności błony komórkowej. Plemniki oceniano w

mikroskopie świetlnym

Test HOS Test HOS –– wynikiwyniki

1. 200µl nasienia pozyskanego z każdej słomki poddano inkubacji w roztworze hipoosmotycznym (50 minut) po czym wykonywano 2 preparaty

2. Obliczeniami objęto 300-400 plemników na każdym preparacie, do których odnoszono liczbę plemników o funkcjonalnej błonie (ze zwiniętymi witkami)

3. Średni procent plemników ze zwiniętymi witkami wyniósł 26.6%

Zapłodnienie heterologiczne (zarodki hybrydowe)

1. Wykorzystanie oocytów innego gatunku niż dawca nasienia

2. Gatunki odległe filogenetycznie – barierę stanowią receptory ZP3 na osłonce przejrzystej oocytu (po usunięciu ZP dochodzi do penetracji i powstania przedjądrzy)

3. Gatunki bliskie filogenetycznie – dochodzi do penetracji oocytów, formowania przedjądrzy i pełnego rozwoju zarodkowo-płodowego

bydło domowe żubr europejski żubroń

Ocena zdolnoOcena zdolnośści zapci zapłładniajadniająącej plemnikcej plemnikóóww(udział zygot w stadium przedjądrzy 18 godzin po inseminacji)

Zygoty nanoszono na szkiełko podstawowe i utrwalano w EtOH, a następnego dnia wybarwiano barwnikiem fluorescencyjnym Hoechst 33342. Preparaty oceniano w

mikroskopie fluorescencyjnym

Ocena zygot w stadium przedjOcena zygot w stadium przedjąądrzy drzy -- wynikiwyniki

• Ogółem wykonano preparaty z 54 zygot

• Sygnał fluorescencyjny zaobserwowano w 21 zygotach (38,9%)

• Przedjądrza zlokalizowano w 9 spośród 21 wybarwionych zygot (33%)

7 zygot - układ prawidłowy - 2 przedjądrza2 zygoty - stwierdzono polispermię

B

A

Ocena skuteczności zapłodnienia oocytów bydlęcych przez plemniki żubra

AA – zygota z 2 ciałkami kierunkowymi BB – zygota prawidłowa (2 przedjądrza)

B

AA – zygota nieprawidłowa (polispermia ,7 przedjądrzy)B – zygota nieprawidłowa (3 przedjądrza)

A B

50m

50m

50m

50m

2-bl (2 dpi) 6-8bl (3 dpi)

morula (5 dpi) wyrośnięta blastocysta (7dpi)

Stadia przedimplantacyjnego rozwoju zarodków bydła w warunkach invitro 2-7 dni po inseminacji (dpi) oocytów

Rozwój zarodkowy (proces bruzdkowania) podejmowało zaledwie 20% (90/450) inseminowanych oocytów (w przypadku buhaja 60-70%) , większość zarodków degenerowała przed osiągnięciem stadium 8-16 blastomerów. Nieliczne (2 zarodki na 90) osiągnęły stadium wczesnej

moruli wykazując liczne zaburzenia morfologii

Pozyskiwanie zarodkPozyskiwanie zarodkóów hybrydowych w hybrydowych wynikiwyniki

Zarodki hybrydowe, 2 dzień po inseminacji (pi)

stadium 2-blastomerowe ( ciałka kierunkowe)

100µm

Zarodki hybrydowe, 3 dzień po inseminacji (pi)A) stadium 3-4-blastomerowe

B) stadium 5-6-blastomerowe (widoczna wakuolizacja cytoplazmy)

100µmA B

Zarodki hybrydowe, 5 dzień pi

15-20 blastomerów, komórki luźno ułożone, brak kompakcji, blastomer wcześniej zahamowany w rozwoju

100µm

Podsumowanie

1. Najądrzowe nasienie żubrów analizowane w niniejszej pracy charakteryzowało się wyższą częstością występowania zmian morfologicznych (16%) w porównaniu z ejakulowanym nasieniem żubra (10.7%)

2. Również procenty plemników żywych (28.8%) oraz posiadających funkcjonalną błonę komórkową (26.6%) były niższe w porównaniu z nasieniem ejakulowanym (44.5%).

3. Niski procent zygot hybrydowych podejmujących rozwój zarodkowy (20%) z jednej strony może świadczyć o obniżonej jakości nasienia pochodzącego z najądrzy (nasienie ejakulowane 63%), a z drugiej o konieczności optymalizacji warunków konserwacji nasienia oraz inseminacji oocytów i hodowli zarodków in vitro

Podziękowania

1. Dr hab. Zygmunt Giżejewski

Stacja badawcza PAN Popielno, Instytut Rozrodu Zwierząt i BadańŻywności PAN Olsztyn (pobieranie nasienia z najądrzy , ocena, mrożenie, współtwórca idei utworzenia banku nasienia żubra)

2. Dr hab. Wanda Olech-Piasecka

SGGW Warszawa, główny koordynator hodowli żubrów w Polsce, współtwórca idei utworzenia banku nasienia żubra

3. Badania prowadzone w ramach tematu badań własnych WHiBZnr 373/Z/34/W