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Phytohormone 2
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WWU-MünsterProf. Jörg Kudla
Aufbau-Modul:
Zellbiologie, Physiologie und Genetik
Vorlesung:
Phytohormone: Wirkung und Signaltransduktion
Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption und primären Signalweiterleitung
• Auxin (ähnliche Mechanismen bei GA und JA)
• Cytokinin
• Brassinosteroid
• Abscisinsäure
• Ethylen
Phytohormone 2
2
Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Auxin, Jasmonat und Gibberellin
Auxin
GAJA
Degradation von negativen Regulatoren resultiert in derTranskription von Antwortgenen
Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Auxin Signalweg – Das Prinzip
Inhibition von
Transkriptionsfaktoren
durch Interaktion mit
negativen Regulatoren
Degradation der
negativen Regulatoren
hebt die Transkriptions-
faktorinhibiton auf
Transkription der
Auxinantwort Gene
Keine Auxinantwort
Auxinkein Auxin
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• TIR1: Transport Inhibitor Response 1
(Rezeptor, F-box Protein)
• AUX/IAAs: Auxin/Indole-3-Acetic Acid Proteins
(TF-Inhbitoren)
• SCF: Ubiquitinligase Komplex (markiert Proteine
für folgende Degradation)
• Ub: Ubiquitin (Degradationssignal)
• 26S: 26S Proteasome
Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Auxin Signalweg – Abkürzungen
K: Lysine
Ub: Ubiqitin
• Das stark konservierte Ubiquitin Protein (Ub) dient als wiederverwendbares Signal
für gezielten Proteinabbau
• Ubiquitinierung: kovalente Bindung von Ub an ein freies Lysin des Zielproteins
• Ub-Zielprotein Fusionen werden durch das 26S Proteasom erkannt
• 26S Proteasom degradiert die Ub-markierten Zielproteine
• Endprodukte: Aminosäuren und Ub
Ub-target conjugate
Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Der Ubiquitin / 26S Proteasom Weg: Das Prinzip
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Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Der Ubiquitin / 26S Proteasom Weg:
Ub-Bindung und Wiederverwendung
• E1: Ub-aktivierendes Enzym
(ATP abhängige Ub-“Aktivierung”)
• E2: Ub-Bindungs Enzym
(liefert Ub zu Zielprotein und nutzt
E3 als Katalysator)
• E3: Ub-Protein Ligase
(Substraterkennung und Initiation
der Bindung)
• DUBs: Deubiquitinierendes Enzym
• Fünf E3 Arten wurden identifiziert (hier: SCF)
• SCF E3 ist ein Komplex aus vier Proteinen die
zusammen Ub-Ligaseaktivität besitzen
• RBX1 vermittelt Bindung von E2-Ub an den SCP
Komplex
• E3 hat eine Gerüstfunktion und bringt E2-Ub in
räumliche Nähe zum Zielprotein
• E2 transferiert Ub an freie Lysine des Zielproteins
Zielprotein ist durch Ub für die Degradation markiert
Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Der Ubiquitin / 26S Proteasom Weg:
Ub – Bindung durch den SCF Komplex
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TIR1
Aux/ IAA
TIR1Auxinrezeptor
AUX/IAATF-Inhibitoren der Auxin-antwort
= SCF complex
Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Der Ubiquitin / 26S Proteasom Weg und Auxin
Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Details des Auxin Signalwegs
TIR1: Transport Inhibitor Response 1
• Auxinrezeptor (Tasche an der Oberfläche für
Auxin)
• F-Box Protein welches SCFTIR1/AFBs bildet
AFB1-5: Auxin-Signaling F-Box Proteins
• Auxinrezeptoren
• F-Box Proteine
• TIR1 Homologe
AFB1-5
Auxin
Rezeptoren
an SCF
gebunden
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AUX/IAAs: Auxin/Indol-3-Essigsäure-Proteine
• Negative Regulatoren von Transkriptionsfaktoren
• Bindet alleine kein Auxin, bindet nur Auxin, das
sich bereits in TIR1 Auxinbindetaschen befindet
Auxin
Ubiquitinierung von AUX/IAA Proteinen (im
Komplex mit SCFTIR1) markiert diese negativen
Transkriptionsregulatoren für die Degradation
durch den 26S Proteasom Weg
Für Degradation markiert
Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Details des Auxin Signalwegs
Ohne Auxin:
• Transkriptionsfaktoren sind durch
physikalische Interaktion mit Repressoren
(AUX/IAA) inaktiviert
Auxin-Antwortgene werden nicht transkribiert
Nach Auxinbindung an Rezeptor (TIR1):
• Repressoren (AUX/IAA) werden degradiert
• Transkriptionsfaktoren werden nicht mehr
inaktiviert
Auxin-Antwortgene werden transkribiert
Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Auxin - Effekte auf das Transkriptom
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Auxin-binding protein 1 (ABP1):
• ER-lokalisiertes Protein
• geringe Mengen ABP1 wirken an der PM als Auxin Rezeptor
• Auxin blockt ABP1 vermittelt Endocytose von PIN-Proteinen
• Der ABP1 Signalweg aktiviert K+ Kanäle und H-ATPasen
• Der ABP1 Signalweg aktiviert des weiteren Rho GTPasen, welche Auxin Signale weiterleiten
Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:ABP1: ein weiterer Auxin-Rezeptor
Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption Jasmonat Signalweg - Abkürzungen
• COI1: Coronatine Insensitive 1
(Rezeptor, F-box Protein)
• JAZs: Jasmonat ZIM-Domänen
Proteine (Transkriptionsfaktor-
Inhibitoren)
• SCF: Ubiquitinligase Komplex
JA
Jasmonatrezeptor
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Ohne Jasmonat:
• Transkriptionsfaktoren sind durch physikalische
Interaktion mit Repressoren (JAZ) inaktiviert
Jasmonat-Antwortgene werden nicht transkribiert
Nach Jasmonatbindung an Rezeptor (COI1):
• Repressoren (JAZ) werden degradiert
• Transkriptionsfaktoren werden nicht mehr inaktiviert
Jasmonat-Antwortgene werden transkribiert
Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption Jasmonat – Effekte auf das Transkriptom
• GID1: “GA Insensitive Dwarf 1”
(GA Rezeptor aus Reis, kein F-Box
Protein)
• DELLA: Aminosäuresequenz einer
charakteristischen N-terminalen
Domäne (Inhibitor von
Transkriptionsfaktoren)
• SCF: Ubiquitinligase Komplex
(markiert Proteine für folgende
Degradation)
• SCF complex F-box proteins :
• GID2: “GA Insensitive Dwarf 2”
SLY1: SLEEPY1 (Arabidopsis)
GA
Gibberellinrezeptor
Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption Gibberellin Signalweg - Abkürzungen
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Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption Gibberellin – Effekte auf das Transkriptom
Ohne Gibberellin:
• Transkriptionsfaktoren sind durch physikalische
Interaktion mit Repressoren (DELLA) inaktiviert
Gibberellin-Antwortgene werden nicht
transkribiert
Nach Gibberellinbindung an Rezeptor (GID1):
• Repressoren (DELLA) werden degradiert
• Transkriptionsfaktoren werden nicht mehr
inaktiviert
Gibberellin-Antwortgene werden transkribiert
Molekulare Mechanismen der HormonperzeptionUnterschiede in der SCF-Komplex Bildung
Direkte Interaktion zwischen Rezeptor undSCF-Komplex möglich, da der Rezeptorselbst ein F-Box Protein ist
Rezeptor
Gerüstprotein (F-Box Protein)vermittelt SCF Interaktion
Rezeptor
Jasmonat GibberellinAuxin
GID2: Reis
SLY1: Arabidopsis
TF-Inhibitor
TF-Inhibitor
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Jasmonat GibberellinAuxin
* **
* = F-box Protein
Rezeptor = F-box Protein Rezeptor ǂ F-box Protein
Durch austauschen der F-Box Untereinheit kann ein SCF-E3 Komplex spezifisch verschiedene Zielproteine erkennen und ubiquitinieren.
Molekulare Mechanismen der HormonperzeptionUnterschiede in der SCF-Komplex Bildung
Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Cytokinin, Brassinosteroid und Abscisinsäure Signalwege
Signalweiterleitung geschieht durch reversible Phosphorylierungskaskaden, die die Regulation von Transkriptionsfaktoren
steuern
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Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Cytokinin Signalweg – das Prinzip
Signal Perzeption
• Phosphorylierung einer Histidin Kinase
Phosphorylierung von Transkriptionsfaktoren (TFs)
Phosphorylierte TFs steuern die Expression von Cytokinin Antwortgenen
receptor
• AHK: Arabidopsis Histidin Kinase
• AHPs: Arabidopsis Histidin
Phosphotransfer Proteine
• ARRs: Arabidopsis Response Regulators
(Transkriptionsfaktoren)
• CRF: Cytokinin Response Factors
(Transkriptionsfaktoren)
receptor
Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Cytokinin Signalweg – Abkürzungen
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Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Cytokinin Signalweg Teil 1: Phosphotransfer
• AHK bindet über die CHASE Domäne
Cytokinin
• Cytokinin Bindung führt zur Phosphorylierung
von AHK
• AHPs (5 in Arabidopsis)
• Positive Regulatoren des Signalwegs
• Können zwischen Cytoplasma und Zellkern
pendeln
• Bringen das Phosphat zu ARRs im Zellkern
• ARRs (durch Phosphotransfer aktiviert)
• Typ B: aktivieren Cytokinin Antwortgene
• Typ A: inhibieren Typ-B ARRs
P = Phosphorylierung
receptor
cytosol
nucleus
+ -
• Durch B-ARRs positiv regulierte Gene:
1) A-ARRs
2) CRFs
3) andere Cytokinin Antwortgene
• CRFs regulieren Cytokinin-vermittelte Antworten
der Pflanze positiv
• A-ARRs
• Regulieren Cytokinin Antwortgene negativ
• Inhibition von B-ARRs (negative
Rückkopplung)P = Phosphorylierung
cytosol
nucleus
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Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Cytokinin Signalweg Teil 1: Regulation der Transkription
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inaktiv
kein Cytokinin Cytokinin Bindungkein Cytokinin:
• Rezeptorkinase inaktiv, kein Phosphotransfer
• TF nicht phosphoryliert (inaktiv)
Antwortgene werden nicht transkribiert
Cytokinin Bindung durch Rezeptor (AHK):
• Rezeptorkinase ist aktiv, Phosphotransfer
zum Zellkern
• TFs werden phosphoryliert
Antwortgene werden transkribiert
cytosol
nucleus
Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Cytokinin Signalweg: Effekt auf das Transkriptom
Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Brassinosteroid Signalweg – Das Prinzip
BR bindet an eine Rezeptor ähnliche Kinase
Heteromerisierung, Phosphorylierungen
Nicht phosphorylierte TFs aktivieren BR Antwortgene
Freisetzung der BR-Signalkinase
Phosphorylierungen / Dephosphorylierungen
BAK1
PM
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• BRI1: Brassinosteroid Insensitive 1
(Rezeptor-ähnliche-Kinase)
• BKI1: BRI1 Kinase Inhibitor
• BAK1: BRI1-Assoziierter Rezeptor
Kinase 1 (Positiv regulierende Komponente
des Rezeptors)
• BSK: BR-Signal Kinase
(vermittelt die Signaltransduktion in den
Zellkern)
BAK1
BRI1 = BR-Rezeptor
Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Brassinosteroid Signalweg Teil 1 – Abkürzungen
• BR Bindung an den Rezeptor initiiert
die Dissoziation des Kinase
Inhibitors BKI1
• Anschließend interagiert der positive
Regulator BAK1 mit dem Rezeptor
• Zahlreiche Phosphorylierungs-
ereignisse führen letztendlich zur
Phosphorylierung und Freisetzung
der Kinase BSK1
BAK1
BRI1 = BR-Rezeptor
inhibiert BRI1
aktiviert BRI1BAK1
P = Phosphorylierung
Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Brassinosteroid Signalweg Teil 1: Freisetzen der Kinase
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• BSK: BR-Signalkinase
• BSU1: BRI1 Supressor (Phosphatase)
• BIN2: Brassinosteroid Insensitive 2
(Kinase)
• BES1: BRI1-EMS Suppressor
• BZR1: Brassinazole Resistant 1
(TFs, positive Regulatoren der BR Antwort)
• PP2A: Protein Phosphatase 2A
TF aktiv TF inaktiv
TF = Transkriptionsfaktor
Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Brassinosteroid Signalweg Teil 2 – Abkürzungen
• BSK bindet an die Phosphatase BSU1
• Anschließend dephosphoryliert und
inaktiviert BSU die Kinase BIN2
• Die Inaktivierung von BIN2 führt zur
Akkumulation der nicht
phosphorylierten und damit aktiven
TFs BES1/BZR1 (PP2A dephos-
phoryliert diese TFs zusätzlich)
• Aktive BES1/BZR1 rekrutieren weitere
TF-Proteins und induzieren die
Expression von Antwortgenen
TF aktiv TF inaktiv
Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Brassinosteroid Signalweg Teil 2 – Regulation der Transkription
TF = Transkriptionsfaktor
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Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Brassinosteroid - Effekt auf das Transkriptom
Kein Brassinosteroid:
• Rezeptor-ähnliche-Kinase ist inaktiv, “Signalkinase” (BSK) wird
nicht freigesetzt
• Transkriptionsfaktoren sind phosphoryliert (inaktiv)
Brassinosteroid-Antwortgene werden nicht transkribiert
Brassinosteroid Bindung an den Rezeptor(BRI1):
• Rezeptor-ähnliche-Kinase ist aktiv, “Signalkinase” (BSK)
wird freigesetzt
• Transkriptionsfaktoren sind nicht phosphoryliert (aktiv)
Brassinosteroid-Antwortgene werden transkribiert
P
inaktiv
aktiv
Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption Ethylen Signalweg – Das Prinzip
Rezeptor bindet Ethylen
Inhibition der Ethylenantwort durch den Rezeptor wird aufgehoben
Unbekannte Mechanismen steuern die Transkriptionskaskade
Transkription von Ethylen Antwortgenen
Die Degradation positiver Regulatoren durch das 26S Proteasom wird inhibiert
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Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption Ethylen Signalweg - Abkürzungen
• ETR1: Ethylene Response 1 (Rezeptor)
• CTR1: Constitutive Triple Response
(MAPKK Kinase)
• EIN2: Ethylene Insensitive 2 (überaus
mysteriöses Transmembranprotein)
• EIN3: Ethylene Insensitive 3 (TF)
• EIL1: EIN3-Like Protein (TF)
• SCF Komplex Komponenten:
• ETP1+2: EIN2 Targeting Protein 1/2
• EBF1+2: EIN3 Binding F-Box 1/2
integral membraneprotein
Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Der Ethylen Signalweg – ETR1 wirkt als negativer Regulator
• Der Ethylen Rezeptor ETR1 bindet CTR1
(MAPKKK) und inhibiert EIN2
• ETR1 wirkt als konstitutiv aktiver negativer
Regulator, wenn kein Ethylen gebunden ist
• Proteinmengen von EIN2 und von
Signalweg TFs EIN3/EIL1werden durch
26S Proteasom Degradation reduziert
• Keine Transkription von Antwortgenen
Kein Ethylen
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Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Ethylen Signalweg – ETR1 ist ein negativer Regulator
• Ethylenbindung durch ETR1 führt zur
Dissoziation und Inaktivierung von CTR1
• Inhibition der 26S Proteasom vermittelten
Degradation von EIN2 und TFs sowie
Aufhebung der Inhibition von EIN2
• Aktiviertes EIN2 wirkt als positiver
Regulator von EIN2/EIL1 (TFs)
• EIN3/EIL1 aktivieren “downstream”
Signalkomponenten sowie spezifische TFs
für die Transkription weiterer Antwortgene
TF
Ethylen an ETR1 gebunden
Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption: Ethylen Signalweg – EIN2 C-Terminus wird nach Proteolyse in den Zellkern
transportiert
- Ethylen + Ethylen
• ETR1 bindet CTR1 (MAPKKK)
und inhibiert EIN2
• Phosphorylierung des EIN2 C-
Terminus erfolgt durch CTR1
• Phosphoryliertes EIN2 ist inaktiv
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Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption: Ethylen Signalweg – EIN2 C-Terminus wird nach Proteolyse in den Zellkern
transportiert
- Ethylen + Ethylen
• Ethylenbindung an ETR1 führt
letztendlich zur
Dephosphorylierung vom EIN2
C-Terminus
• Proteolytische Spaltung des C-
Terminus erfolgt an einer
dephosphorylierten Position
• EIN2 C-Terminus wird vom ER in
den Nukleus transportiert uns ist
an der Transkriptionsaktivierung
beteiligt
Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Ethylen Signalweg – Effekt auf das Transkriptom
Kein Ethylen:
• ETR1 (Rezeptor) reprimiert die Ethylenantwort
• 26S Proteasome degradiert positive Regulatoren
Antwortgene werden nicht transkribiert
Ethylen bindet an den Rezeptor (ETR1):
• ETR1-Ethylenbindung hebt die Repression von
Signalwegkomponenten auf
• Degradation von positiven Regulatoren durch das 26S
Proteasome wird reduziert
Transkription von Antwortgenen
Kein Ethylen Ethylene gebunden
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Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Abscisinsäure wird durch verschiedene Rezeptoren gebunden
• GTG1+2: GPCR-Typ G-Protein
• PYR: Pyrabactin Resistant
• PYL: Pyrabactin Resistant Like
• RCAR: Regulatory Component of
ABA Receptors
• ABAR: “ABA Receptor“
• CHlH: Chelatase H Subunit
Plasma-membran
Nucleo/Zyto-plasmatisch
Chloroplast
???
???
bestätigt
• ABA bindet an PYR/PYL/RCAR
• Nach der ABA Bindung interagiert der Rezeptor mit PP2Cs
(Protein Phosphatase 2C)
• Die Bildung des Rezeptor/ABA/PP2C Komplex hebt die
Phosphataseaktivität der PP2Cs auf, diese können SnRK2
Kinasen nicht mehr inhibieren
• Autophosphorylierung der SnRK2s ermöglicht die
Phosphorylierung von TFs
• Phosphorylierte TFs aktivieren die langfristige ABA Antwort
Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Abscisinsäure wird durch verschiedene Rezeptoren gebunden
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Ohne ABA:
• Ohne ABA können die PYR/PYL/RCAR
Rezeptoren PP2Cs nicht inhibieren, diese
inhibieren SnRK2 Kinasen
• TFs werden nicht phosphoryliert (inaktiv)
ABA Antwortgene werden nicht transkribiert
ABA wird vom Rezeptor gebunden
(PYR/PYL/RCAR):
• ABA bindet an Rezeptor und inhibiert PP2Cs, was zu
aktiven SnRK2s führt
• TFs werden phosphoryliert
Transkription der Antwortgene
inaktiv
inhibition inhibitionreleased
Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption Abscisinsäure wird durch verschiedene Rezeptoren gebunden
Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption:Stomata – molekulare Details einer kurzfristigen ABA Antwort
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ABA – schnelle und langfristige Antwort
Sowohl kurzfristige ABA-Antworten, wie der Stomataschlussbei Wassermangel (reguliert über Aktivität von Ionenkanälen),als auch langfristige Antworten, wie Keimungshemmung undWachstumsinhibition durch das Hormon (reguliert durchAktivität von Transkriptionsfaktoren), werden durch diegleichen Signalwegkomponenten vermittelt!
Beispiel:Die abi1-1 Phosphatase Mutante zeigt sowohl in kurzfristigenals auch in langfristigen Prozessen Phänotypen!
WT abi1-1
Molekulare Mechanismen der Hormonperzeption Subzelluläre Lokalisation von Phytohormonrezeptoren
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Integration von Hormonwegen
Hormonsignalwege beeinflussen sich gegenseitig!Ein Hormon kann den Signalweg eines anderen auf drei Arten regulieren:
1. Synthese des zweiten Hormons wird regulierta) Ethylen und Auxin kontrollieren für die Synthese des anderen Hormons kritische Gene
2. Transport des zweiten Hormons wird verändert b)Cytokinin inhibiert Expression von PIN Auxintransportern
3. Zwei Signalwege wirken parallel auf das gleiche Zielprotein c) die BR-regulierte BIN2 Kinase reguliert den eigentlich Auxin-regulierten TF ARF2)d) Die Stabilität der DELLA Proteine wird durch andere Hormonwege beeinflusst
d)
d)
d)
a)
a)
b)
c)
Integration von HormonwegenBeispiel: ABA inhibiert GA-induzierte DELLA Degradation
nach GA-Gabe werden DELLA:GFP Fusionsproteine abgebaut (links)durch Behandlung mit 20 µM ABA wird dieser Effekt aufgehoben
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Cytokinin:Durch Phosphotransfer vom Rezeptor am ER zu TFs im Zellkern wird das Signal weitergeleitet.
Auxin, Jasmonat, Gibberellin:Degradation negativer Regulatoren führt zur Transkription von Antwortgenen.
Brassinosteroid:Nach Hormonbindung an den Rezeptor and der PM wird eine Kinase freigesetzt, die eine Phosphorylierungs- / Dephosphorylierungskaskade startet, die schließlich TFs reguliert.
Abscisinsäure:ABA Bindung an den Rezeptor inhibiert eine Familie von Phosphatasen, die sowohl kurzfristige Antworten wie das Schließen von Stomata als auch langfristige Transkriptionsantworten steuern.
Ethylen:Ethylenbindung an den Rezeptor am ER hebt die Degradation positiver Regulatoren des Signalwegs auf und startet so die Transkription von Antwortgenen.
Molekulare Mechanismen der HormonperzeptionZusammenfassung