Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADNMaxam y Gilbert

Sanger

Ronaghi et. al.

454

Illumina

Secuenciación química

Secuenciación durante la síntesis

Métodos para secuenciar el

ADN

Primera Generación

Helicos

Secuenciación durante la síntesis

Secuenciación de una única moléculaSecuenciación masiva en paralelo

Secuenciación en tiempo real

Nanopores

VisiGen

Segunda Generación

Tercera Generación

Secuenciación de una única molécula

Métodos para secuenciar el ADN

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

Walter Gilbert (1932)

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

Marcaje radiactivo y separación de las hebras del ADN

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

Rompe el ADN mediante 4 reacciones químicas específicas

C only: Hydrazine in 1.5 M NaCl, piperidine

G only: DMS, piperidine

A + G: DMS, formic acid, piperidine

C+T: Hydrazine, piperidine

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

Detalles sobre las rupturas químicas específicas

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

Electroforesis y reconstrucción de la secuencia

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

¿Cómo se reconstruye la secuencia?

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

Esquema general del proceso

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

Frederick Sanger: el genio de las secuencias

Frederick Sanger (1918-2013)

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

Artículo donde publica su método

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

El método de Sanger

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

1.- Preparación de los 4 tubos

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

2.- Polimerización y terminación de la cadena (ddT)

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

3.- Electroforesis y reconstrucción de la secuencia

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

El Premio Nobel de Química (1980)

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

Secuenciación automatizada del ADN

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

Kary B. Mullis (1944)

+

Secuenciación cíclica del ADN = Sanger + PCR

Frederick Sanger (1918-2013)

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

AdR6G (570 nm)

GdROX (620 nm) CdR110 (540 nm)

TdTAMRA (600 nm)

4 ddNTPs fluorescentes distintos

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

CR-110

AR6G

TTAMRA

GROX

Cada ddNTP emite una fluorescencia de distinto color

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

template

Se puede hacer la reacción en un solo tubo, no en 4

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

Los productos de la PCR terminan con un ddNTP fluorescente

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

Cada color representa a un nucleótido terminal

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

Electroforesis y reconstrucción de la secuencia

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

Electroferograma

La electroforesis capilar es mucho más rápida

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

La electroforesis capilar se hace a gran escala

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

Electroferograma

Cada electroferograma secuencia entre 400 y 900 bases

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

Y esto … ¿para cuándo?

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

Pirosecuenciación

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

Artículo donde se publica el método

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

Las reacciones de la pirosecuenciación

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

1. Hibridación del cebador

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2. Liberación de pirofosfato (o no)

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

3. Pirofosfato + APS ATP + luciferina luz

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

4. La apirasa degrada todos los nucleótidos (reset)

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

5. Los dNTP se van añadiendo de forma secuencial

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

Reconstrucción de la secuencia (hasta 700 pb)

Pirograma

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

Y esto … ¿para cuándo?

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

Secuenciación masiva en paralelo

Secuenciación de una única molécula

(sin tener que amplificarla)

Clonación in vitro (ePCR y bridge PCR)

Secuenciación en tiempo real

Nanotecnología

Sistemas de flujo continuo

Métodos de segunda generación

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

The Roche-454 GS-FLX Pyrosequencer

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

1.- DNA library preparation (t = 4,5 hours)

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

2.- Emulsion PCR (t = 8 hours)

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

3.- Pyrosequencing (t = 7,5 hours)

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

Massive parallel sequencing (high-throughput)

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

Procesamiento de la imagen y lectura de las secuencias

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

Y esto … ¿para cuándo?

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

Pirosecuenciación de un genoma completo

James Watson (1928)

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

Fragment DNA into a random library of 100-300 base-pair long fragments. After fragmentation the ends of the DNA-fragments are repaired and an A-overhang is added at the 3'-end of each strand. Afterwards, adaptors which are necessary for amplification and sequencing are ligated to both ends of the DNA-fragments. These fragments are then size selected and purified.

1.- Library preparation

1.- Fragment DNA

2.- Repair ends

4.- Ligate adapters3.- Add A

overhangs

5.- Select ligated DNA

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

2.- Attach library fragments to flow cell

2.- Los fragmentos de la genoteca se unen por

complementariedad de bases entre el adaptador y los

oligos de la celda de flujo

1.- Celda de flujo

3.- Síntesis de la hebra complementaria

(reverse), que se queda unida covalentemente a

la celda de flujo

4.- Desnaturalización de la doble la hebra

5.- Lavado de la hebra forward,

que no está unida covalentemente a la celda de flujo.

RESULTADO: Las moléculas de ADN complementarias a

los fragmentos de la genoteca (reverse

strand) se unen aleatoriamente a la

celda de flujo y están muy separadas unas

de otras

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

3.- Bridge amplification and cluster generation

1.- Se forma un “puente” cuando el extremo de la hebra reverse hibrida con el segundo tipo de oligonucleótido de la celda de flujo

2.- Se sintetiza la hebra “forward”, cuya secuencia coincide con la del fragmento de la genoteca original. Al desnaturalizar la doble

hebra quedan dos hebras unidas covalentemente a la celda de flujo

3.- Cada una de las hebras (forward y reverse) forma un puente con un oligo complementario

para sintetizar una nueva hebra.

4.- Se repite el proceso y en cada ciclo se dupica el número de hebras (tanto las forward como las reverse). A partir de cada molécula se genera un grupo (cluster).

5.- Se desnaturalizan las dobles hebras y se escinden enzimáticamente las hebras reverse, que se eliminan mediante un lavado.

6.- Cada hebra forward ha formando un grupo

de moléculas idénticas, listas para ser

secuenciadas.

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN1.- Se añade un cebador y 4 dNTP fluorescentes y bloqueados en 3’. Sólo se podrá incorporar un

nucleótido. La fluorescencia que emita nos permite saber cuál. Se toma una imagen.

2.- Se elimina el fluoróforo y se desbloquea el extremo 3’ del nucleótido. Tras un lavado se añaden de nuevo los 4 dNTP fluorescentes y bloqueados en 3’. Uno de ellos se unirá. Su

fluorescencia permite identificarlo. Se toma una nueva imagen.

3.- Se repiten los ciclos: adición de los 4 dNTP, incorporación, emisión de fluorescencia, eliminación del fluoróforo, desbloqueo del extremo 3’ y lavado. El número de ciclos determina la longitud

del fragmento secuenciado. Se hace un mínimo de 50 ciclos.

4.- Se secuencian decenas de millones de secuencias en paralelo.

4.- Sequence by synthesis

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

Nucleótidos utilizados para la secuenciación

Extremo 3’ bloqueado de forma reversible

Fluoróforo asociado al nucleótido trifosfato (NTP)

mediante un brazo conector. El fluoróforo se puede separar del NTP mediante escisión química.

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

Y esto … ¿Para cuándo?

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

Una comparación entre diversos métodos para secuenciar el ADN

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

Evolución del coste de secuenciar 1 megabase de ADN

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

Evolución del coste de secuenciar un genoma humano

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

Ya se están desarrollando métodos de 3ª generación

Secuenciación de ADNSecuenciación de ADN

¿Para cuándo?: En menos de un día y por menos de 1000 $