VU AKM viruso pernesimas galutine AKM...Nuo 2014 met ų AKM virusas paplito Baltijos šalyse ir Lenkijoje (EFSA, 2015), 2017 metais virusas aptiktas Čekijoje ir Rumunijoje, 2018 metais

VILNIAUS UNIVERSITETAS

TVIRTINU: ……………………… Pareigos Vardas, Pavardė

2019 m. ……………………mėn. …..d.

ŽEMĖS, MAISTO ŪKIO, ŽUVININKYSTĖS IR KAIMO PLĖTROS

MOKSLINIŲ TYRIMŲ IR EKSPERIMENTINĖS PLĖTROS 2015–2020 METŲ

PROGRAMA

KRAUJASIURBIŲ IR KITŲ VABZDŽIŲ ĮTAKA MECHANINIAME AFRIKINIO

KIAULIŲ MARO VIRUSO PERNEŠIME Į KIAULIŲ LAIKYMO VIETAS IR

ŠERNŲ POPULIACIJOJE

2019 M. GALUTINĖ ATASKAITA

Tyrimo vadovas

Jurga Turčinavičienė

Vilnius

2019

2

ĮVADAS

Afrikinis kiaulių maras (toliau - AKM) yra viena iš labiausiai užkrečiamų ir

letalių kiaulių bei šernų ligų. Lietuva yra viena iš šalių, kurioje dėl šios ligos

kiaulininkystės sektorius patiria didžiulius ekonominius nuostolius, todėl žinios apie šios

ligos sukėlėją, jo plitimo kelius, gamtinius židinius ir galimus vektorius yra būtinos norint

sumažinti šios ligos riziką. Nuo 2014 metų AKM virusas paplito Baltijos šalyse ir

Lenkijoje (EFSA, 2015), 2017 metais virusas aptiktas Čekijoje ir Rumunijoje, 2018

metais – Vengrijoje (EFSA, 2018). Virusu užkrėstos teritorijos plečiasi toliau į pietryčių

Europos šalis, todėl viruso plitimo būdų nustatymas leistų naudoti prevencines priemones

ir neleisti virusui plisti (EFSA, 2019).

Šiuo metu bandoma nustatyti, kur turi krypti AKM moksliniai tyrimai, ir kurioje

srityje yra mažiausiai žinoma. Identifikuotos tokios žinių spragos: pirmiausia, kokį

vaidmenį vaidina šernai šio viruso pernešime ir platinime, antra, kaip virusas išlieka ir yra

pernešamas gamtoje, trečia, kokios biosaugos priemonės yra efektyviausios. Svarbiausia,

reikalingos geresnės žinios ir išsamesni tyrimai, kaip virusas plinta ir išlieka tiek

aplinkoje, tiek laukinėse šernų populiacijose ir kaip virusas patenka į kiaulių laikymo

vietas. Taip pat pabrėžiama, kad būtina ištirti ir nariuotakojų vaidmenį šios ligos sukėlėjų

transmisijoje (EFSA, 2019). Gilesni moksliniai tyrimai padėtų sukurti tikslesnius

biosaugos protokolus ir aiškesnius epidemiologinius veiksmus dar neužkrėstose

teritorijose.

Baltijos šalyse virusas cirkuliuoja tarp naminių kiaulių (Sus scrofa domesticus) ir

šernų (Sus scrofa), sukeldamas panašius klinikinius požymius abiejų rūšių gyvūnuose,

todėl visos apsaugos priemonės yra skirtos viruso transmisijos tarp šernų ir naminių

kiaulių apribojimui. Manoma, kad taikomos priemonės yra pakankamai efektyvios, tačiau

virusas patenka ir į kiaulių fermas, kuriose yra laikomasi griežčiausių biosaugos

reikalavimų. Tokiais atvejais viruso patekimo keliai yra nežinomi.

2018 metais vykdydami projektą “Vabzdžių įtaka afrikinio kiaulių maro viruso

plitimui“ iškėlėme pagrindinę hipotezę, kuri teigia, kad AKM protrūkiai yra susiję su

kraujasiurbių vabzdžių, potencialiai galinčių pernešti AKM, gyvybiniu ciklu ir aplinkos

sąlygomis (temperatūra, drėgme ir kt.). Toliau tęsdami pradėtą darbą bei remdamiesi jau

atliktais kitų mokslininkų darbais, šio projekto rėmuose tikrinome keletą darbinių

hipotezių apie tai, kad musė kandiklė Stomoxys calcitrans yra galimas mechaninis viruso

3

pernešėjas. Dar 1987 metais buvo nustatyta, kad mechaniškai virusą pernešti gali musės

kandiklės Stomoxys calcitrans (Mellor ir kt., 1987). Be to, Olesen ir kt. (2018) patvirtino,

kad S. calcitrans gali perduoti virusą ne tik besimaitindamos gyvulio krauju, bet ir

atsitiktinai patekusios į kiaulės virškinimo traktą. Antra hipotezė buvo tokia, kad sparvos

(Diptera: Tabanidae) galėtų perduoti virusą besimaitindamos gyvulių krauju, o trečioji -

vabzdžiai, kurių lervinės stadijos maitinasi gaišenomis, tokie kaip mėsmusės (Diptera:

Calliphoridae) bei tikrosios musės (Muscidae), galėtų pernešti virusą nuo kritusių šernų

sveikiems žvėrims ir kiaulėms.

Šio projekto tikslas - tęsti 2018 metais pradėtą mokslinį tiriamąjį darbą apie

kraujasiurbių ir kitų rūšių vabzdžių, kaip galimų AKM mechaninių pernešėjų, įtaką AKM

plitime, viruso mechaninio pernešimo iš gamtinių židinių į kiaulių fermas galimybes ir

galimą platinimą šernų populiacijoje. Šiam tikslui įgyvendinti buvo iškelti tokie

uždaviniai:

1. Vykdyti pagrindinių kraujasiurbių ir kitų vabzdžių rūšių, galimai galinčių

mechaniškai pernešti AKM, metinio skraidymo aktyvumo analizę Lietuvoje;

2. Nustatyti kraujasiurbių ir kitų galimų pernešėjų rūšinę sudėtį kiaulių laikymo

patalpose AKM protrūkių metu tiek komerciniuose, tiek ir nekomerciniuose kiaulių

ūkiuose ir atlikti AKM viruso paieškas juose;

3. Atlikti kraujasiurbių ir kitų galimų vabzdžių - pernešėjų rūšinę sudėtį šernų

gaišimo vietose ir atlikti AKM viruso paieškas juose;

4. Nustatyti, ar AKM virusas išlieka šernų gaišenomis besimaitinančių mėsmusių

lervose, lėliukėse ir išsiritusiuose suaugėliuose;

5. Parengti rekomendacijas kiaulių augintojams dėl vabzdžių įtakos AKM plitimui

ir galimų prevencinių priemonių.

TYRIMO OBJEKTAS IR METODAI

Kraujasiurbių vabzdžių rūšių, potencialiai galinčių dalyvauti AKM viruso

transmisijoje metinio aktyvumo dinamikai stebėti buvo statomos NZI mėlyno audinio

gaudyklės (1 priedas, 1 pav.), kurios pasižymi efektyvesniu kraujasiurbių vabzdžių

priviliojimu nei kitos vabzdžių gaudyklės (Mihok, 2002; Van Hennekeler ir kt., 2008).

Tyrimai, atlikti kitose pasaulio šalyse parodė, kad šios gaudyklės yra efektyvios gaudant

muses kandikles Stomoxys calcitrans, kuriose, kaip rodo pastarųjų metų tyrimai (Olesen

4

ir kt., 2018), gali išsilaikyti AKM virusu užkrėstas kraujas, bei sparvas (Tabanidae) (Van

Hennekeler ir kt., 2008).

Gaudyklės buvo pastatytos dviejose vietose, apie 5-20 metrų atstumu nuo kiaulių

laikymo vietos. Vietos buvo pasirinktos AKM užkrėstose teritorijose, kuriose buvo

nustatyti AKM užsikrėtę šernai. Pirmoji vieta buvo kiaulių fermų kompleksas

Poškaičiuose, Gaukštonių g. 79, Nemenčinės sen., Vilniaus raj. (54.891858, 25.429798

(WGS)). Aplink kompleksą auginamos įvairios žemės ūkio kultūros, kuriose buvo

stebimi šernai. Antroji vieta buvo prie stambaus kiaulių auginimo komplekso Sirvyduose,

Lekėčių sen., Šakių raj (55.009557, 23.458766 (WGS)).

Šiose vietose buvo vykdomi pagrindinių kraujasiurbių vabzdžių rūšių: musės

kandiklės (Stomoxys calcitrans) (1 priedas, 2 pav.), sparvų (Tabanidae, Haematopota,

Hybomitra), bei kitų vabzdžių – Calliphoridae (Lucilia), Muscidae (Musca) sezoninės

dinamikos stebėjimai surenkant gaudyklių medžiagą kiekvieną savaitę nuo gegužės 10 d.

(gaudyklių pastatymo data) iki spalio 31 d.

Po masinių AKM atvejų Ąžuolų Būdoje, Marijampolės sav., ir netolimose

teritorijose, liepos 24 d. NZI gaudyklė buvo pastatyta Ąžuolų Būdos kaime netoli (apie

10-15 m) kiaulių tvarto, kurio šeimininkė buvo susijusi su prieš tai Ąžuolų Būdoje

buvusiu AKM židiniu. Po savaitės ir tvarte, netoli kurio buvo atliekami vabzdžių tyrimai,

buvo nustatytas AKM židinys. Tokiu būdu buvo patikrinta, ar vabzdžiuose, kurie

potencialiai galėtų pernešti AKM virusą, buvo AKM viruso laikotarpiu tarp dviejų AKM

židinių.

Nustatant kraujasiurbių vabzdžių paplitimą kiaulių laikymo patalpose AKM

židinyje, entomologinė medžiaga buvo rinkta dviejų protrūkių metu, (liepos 15 ir 31

dienomis) Ąžuolų Būdos kaime. Vabzdžiai buvo gaudomi entomologiniais tinkleliais

kiaulų laikymo vietų viduje bei išorėje, nuo pastato sienų ir šalia esančių daiktų,

fiksuojami 96 proc. etanolyje arba DNR fiksavimo tirpale tolimesniems laboratoriniams

tyrimams. Vėliau vabzdžiai buvo identifikuojami iki rūšies arba genties lygmens.

Iš visų sugautų vabzdžių buvo išskirta DNR naudojant DNeasy Blood&Tissue Kit

(QIAGEN, Germany) pagal gamintojo instrukcijas. AKM nustatymui vabzdžiuose buvo

panaudota optimizuota diagnostinė polimerazės grandininė reakcija (PGR) su specifiniais

pradmenimis (Luo ir kt., 2017). Gauti 326 bp DNR fragmentai buvo sekvenuoti

(Macrogen, Olandija) ir sekos palygintos su Genų banke deponuotomis sekomis. Dalis

mėginių buvo patikrinta Nacionaliniame maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo instituto

5

Molekulinės biologijos ir genetiškai modifikuotų organizmų skyriaus laboratorijoje

nustatant AKM virusą tikro laiko PGR metodu.

Viruso išlikimas šernų gaišenomis besimaitinančių musių lervose ir suaugėliuose

buvo nustatomas tiriant lervas surinktas iš šerno gaišenos. Kritęs nuo AKM šernas buvo

izoliuotas tinkline tvora nuo aplinkos (Ilgakiemis, Kauno apskritis, 54.76593, 23.83296

(WGS)). Tyrimas buvo suderintas su NMVT Skubios veiklos skyriumi. Surinktų lervų

auginimas vykdytas NMVRVI laboratorijoje. Iš kritusio šerno paimama 20 III-IV ūgio

lervų (1 priedas, 3 pav.): 10 lervų nuplaunama steriliu fosfatiniu buferiu ir paliekama

vystytis indeliuose laboratorijoje apie savaitę, o kitos10 lervų nenuplaunamos ir

paliekamos vystytis indeliuose laboratorijoje tokiomis pat sąlygomis. Po vidutiniškai7

parų kambario temperatūroje lervos paprastai virsta lėliukėmis. Iš dviejų tiriamų musių

grupių (nuplautų buferiu ir neplautų) paimama po 5 lėliukes viruso nustatymui PGR būdu

(kiekviena lėliukė analizuojama atskirai), o kitos lėliukės paliekamos indeliuose

laboratorijoje tolesniam vystymuisi. Po DNR išskyrimo išsaugomi po lizavimo likę

lėliukių likučiai (užpilti 70% spiritu) morfologiniam lervų identifikavimui. Maždaug po 7

dienų (14 dienų nuo lervų paėmimo iš šerno) kambario temperatūroje lėliukės virsta

suaugėliais. Iš dviejų tiriamų grupių paimami 5 suaugėliai viruso nustatymui PGR būdu,

o po DNR išskyrimo išsaugomi vabzdžio likučiai anksčiau nurodytu būdu, kiekvienas

vabzdys analizuojamas atskirai.

Tam, kad patikrintume, kaip virusas išsilaiko AKM užkrėstoje šerno gaišenoje

besivystančiose musių lervose natūraliomis sąlygomis, iškasėme 6 šių vabzdžių lėliukes

aplink gaišeną esančioje miško paklotėje ir laboratorijoje iš jų išauginome muses. Iš

imago buvo iškirta DNR ir patikrinta, ar musėse išlieka AKM virusas.

REZULTATAI

KRAUJASIURBIŲ IR KITŲ VABZDŽIŲ RŪŠIŲ, GALIMAI GALINČIŲ

MECHANIŠKAI PERNEŠTI AKM, METINIO AKTYVUMO ANALIZĖ LIETUVOJE

Sezoninė kraujasiurbių ir kitų vabzdžių skraidymo aktyvumo dinamika buvo

nustatyta analizuojant NZI gaudyklėmis (1 priedas, 1 pav.) surinktus duomenis. Šiais

metais surinktų vabzdžių skraidymo aktyvumas buvo palygintas su 2018 metų

duomenimis. Viso buvo surinkti ir apibūdinti 1806 vabzdžiai, tame tarpe kraujasiurbiai

6

vabzdžiai: 45 sparvos Haematopota sp. (Tabanidae), 1012 sparvų Hybomitra sp.

(Tabanidae), 366 musės kandiklės S. calcitrans (Muscidae), 58 kraujasiurbiai uodai

(Culicidae). Per tyrimų laikotarpį buvo pagautos tik 8 Chrysops genties ir 2 Tabanus

genties sparvos (Tabanidae), o taip pat lavonmusių (Sarcophagidae).

Apskaičiuotas santykinis kiekvieno taksono gausumas kaip procentinė išraiška

nuo visų sugautų to taksono vabzdžių. Sparvų Haematopota gausiausiai buvo pagauta

Sirvyduose birželio ir rugpjūčio mėnesiais, tačiau Poškaičiuose jų gausumo dinamika

buvo visiškai kitokia – šie vabzdžiai buvo sugauti tik liepos viduryje ir rugpjūčio

pradžioje (1 pav.). Gegužės paskutinę savaitę šie vabzdžiai taip pat buvo fiksuoti, tačiau

tuo metu gaudyklė Sirvyduose dar nebuvo pastatyta, todėl duomenų apie šios genties

musių skraidymą gegužės mėnesį palyginti negalime (1 pav.). Hybomitra genties sparvos

buvo gausiausiai pagauta Tabanidae šeimos sparvų grupė Sirvyduose, kur jų didžiausias

gausumas buvo nustatytas birželio mėnesį. Tuo tarpu Poškaičiuose sugauti vos keli

Hybomitra genties individai (2 pav.). Po rugpjūčio paskutinės savaitės nebuvo pagauta

nei viena Tabanidae šeimai priklausanti musė.

Tuo tarpu S. calcitrans musės buvo aptinkamos visu tyrimų metu (nuo gegužės

paskutiniosios savaitės iki spalio antros savaitės), tačiau jų gausumas ryškiai išauga

liepos antroje pusėje ir išliko aukštas iki spalio mėnesio vidurio (3 pav.).

Literatūros duomenimis šios rūšies musės pietvakarių Prancūzijoje bei Danijoje

turi du skraidymo aktyvumo pikus: vasaros pradžioje ir vasaros pabaigoje - rudenį

(Jacquiet ir kt., 2014, Skovgard ir kt., 2012). Tai, kad nemaža dalis musių kandiklių buvo

pagautos gegužės (Poškaičiai) ir birželio (Sirvydai) mėnesiais, rodo, kad Lietuvoje S.

calcitrans musių skraidymo aktyvumas gali būti panašus, t.y. turintis du skraidymo

aktyvumo pikus.

Gaudyklė Ąžuolų Būdoje buvo pastatyta tik liepos mėnesio viduryje, todėl

neturime duomenų apie galimą S. calcitrans musių skraidymo aktyvumą gegužės-birželio

mėnesiais šioje tyrimų vietovėje. Stomoxys calcitrans gausumas Ąžuolų Būdos

gaudyklėje yra labai aukštas palyginus su kitomis tyrimų vietomis – per savaitę buvo

pagaunama iki 46 šios rūšies musių . Viena iš šio musių kandiklių gausumo priežasčių

galėtų būti tai, kad gyventojai augina nemažai karvių, o S. calcitrans paprastai maitinasi

galvijų krauju. Šis priežastinis ryšys buvo pastebėtas ir tiriant AKM viruso plitimo

priežastis - tikimybė plisti virusui didesnė ten, kur kiaulės laikomos tame pačiame tvarte

7

su karvėmis (A. Malakauskas, žodinis pranešimas). Be to, šio vabzdžio sezoninis

skraidymo aktyvumas iš esmės koreliuoja su AKM protrūkiais Ąžuolų Būdoje (3 pav.).

1 pav. Sparvų Haematopota santykinis gausumas NZI gaudyklėse tirtose AKM

teritorijose 2019 m.

2 pav. Sparvų Hybomitra santykinis gausumas NZI gaudyklėse tirtose AKM teritorijose

2019 m.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

III IV I II III IV I II III IV I II III IV I II III IV I II

Gegužė Birželis Liepa Rugpjūtis Rugsėjis Spalis

Haem

ato

pota

mus

iųsa

ntyk

inis

ga

usum

as (

%)

Poškaičiai Sirvydai

0

5

10

15

20

25

30

35



Hyb

om

itra

mus

ių s

anty

kini

s ga

usum

as

(%)

Poškaičiai Sirvydai

8

3 pav. Stomoxys calcitrans gausumo dinamika NZI gaudyklėse tirtose AKM teritorijose

2019 m. Rodyklėmis pažymėtos AKM protrūkių datos.Gaudyklė Ąžuolų Būdoje

pastatyta tik liepos mėnesio viduryje.

VIRUSO DNR NUSTATYMAS NZI GAUDYKLĖMIS SUGAUTUOSE

VABZDŽIUOSE

Iš 366 NZI gaudyklėse sugautų S. calcitrans, 80 vabzdžių buvo patikrinta dėl AKM

viruso DNR. Išskyrus vabzdžių DNR, buvo atlikta specifinė PGR reakcija AKM viruso

identifikavimui. Šešiuose iš jų rasta viruso DNR (4 pav.).

Viruso DNR buvo nustatyta dar viename kraujasiurbyje vabzdyje – uode

(Culicidae), o taip pat musėje M. domestica bei viename voragyvyje (Pseudoscorpiones).

Nei sparvose, nei gaudyklėmis pagautose mėsmusėse nebuvo aptikta AKM viruso DNR.

Tai, kad iš gaudyklėmis pagautų musių kandiklių net 7,5% buvo aptikta AKM viruso

DNR rodo, kad šioms musėms turėtų būti skirtas didesnis dėmesys kuriant apsaugos nuo

AKM viruso priemones.

Atlikus gautų p72 geno fragmentų sekoskaitą, pastebėtas kintamumas 104059

saite (palyginus su visu viruso genomu) (5 pav.). Vieno nukleotido pakaita nustatyta

AKM viruso sekose rastose dviejuose gaudyklėse sugautuose S. calcitrans ir viename

Pseudoscorpiones individe. Nors šios sekos priskiriamos II genotipo sekoms, tačiau tai

rodo ir viruso kintamumą vieno genotipo viduje, kas buvo pastebėta ir pirmo AKM

viruso genotipo atveju (Gallardo ir kt., 2009)

02468

101214161820



Sto

moxy

sm

usių

san

tyki

nis

gaus

umas

(%

)

Poškaičiai Sirvydai Ąžuolų Būda

9

4 pav. AKM viruso DNR paieškos rezultatai gaudyklėmis sugautuose vabzdžiuose.

1 -GTCTGGAAGAGCTGTATCTCT-










11 -GTCTGGAAAAGCTGTATCTCT-










5 pav. p72 geno fragmento kintamumas 104059 saite (rėmelyje). 1-4 ir 7-20 iš mūsų

mėginių gautos sekos, 5-6 sekos MH713612.1ir LC322016.1 iš Genų banko

(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/).

10

KRAUJASIURBIŲ IR KITŲ GALIMŲ PERNEŠĖJŲ RŪŠINĖ SUDĖTIS KIAULIŲ

LAIKYMO PATALPOSE AKM PROTRŪKIŲ METU IR AKM VIRUSO DNR

NUSTATYMAS

Šiais metais vabzdžiai buvo tirti dviejuose AKM židiniuose. Buvo surinkti

dvisparnių būriui priklausantys vabzdžiai, o vyraujančios dvisparnių vabzdžių šeimos –

Muscidae, Calliphoridae, Tabanidae. Musė kandiklė S.calcitrans (Muscidae) buvo gana

gausi gaudyklėse, tačiau tvartų viduje buvo sugauti tik pavieniai vabzdžiai. Panašiai

tvartuose buvo pagautos tik pavienės Haematopota sp. bei Hybomitra sp. (Tabanidae)

sparvos, nors gaudyklėse kai kada tai buvo dominuojantys vabzdžiai. Tiek viduje, tiek

išorėje buvo sugauta Musca (Muscidae) genties vabzdžiai bei pavienės Lucilia genties

mėsmusės. Rūšinė vabzdžių sudėtis gerokai skyrėsi nuo 2018 metų stambiose fermose

sugautų vabzdžių, nes buvo sugauta daugiau įvairių vabzdžių rūšių.

Iš visų surinktų vabzdžių buvo išskirta DNR bei atlikta PGR su specifiniais AKM

viruso pradmenimis. Vabzdžių, sugautų ir ištirtų kiaulių laikymo patalpose bei išorėje

dviejuose AKM židiniuose skaičius ir rūšinė sudėtis yra parodyta 1 lentelėje.

1 lentelė. Vabzdžiai AKM židiniuose

Vidus Tirtų individų

skaičius (rastas

AKMV)

Išorė Tirtų individų

skaičius

Hybomitra 2 Lucillia 1

Muscidae 4 (1) Haematopota 1

Stomoxys 3 (1) Muscidae 2

Stomoxys 5

Tvarto viduje sugautuose Stomoxys ir Muscidae vabzdžiuose buvo identifikuota

viruso DNR. Nusekvenavus gautus AKM viruso P72 geno DNR fragmentus, 326 bp ilgio

seka buvo palyginta su Genų banke deponuotomis sekomis. Buvo patvirtinta, kad visos

sekvenuotos sekos priklauso AKM viruso II genotipui ir yra beveik identiškos viruso

sekoms, kurių identifikavimo numeriai yra šie: MH713612, MH681419, LC322016,

LS478113. Tai, kad dalyje viduje sugautų vabzdžių buvo nustatyta viruso DNR, rodo kad

viruso plitimas lokaliai galėtų būti susijęs su šiais vabzdžiais.

11

Žinoma, kad iš kraujasiurbių vabzdžių būtent musė kandiklė Stomoxys calcitrans

gali mechaniškai perduoti AKM virusą maitindamasi tiek užkrėstų šernų, tiek kiaulių

krauju, nors labiau tikėtina, kad virusas patenka kiaulėms atsitiktinai suėdus muses

(Olesen ir kt., 2018). Be to, Stomoxys musės dažniausiai vystosi ir dauginasi ten, kur

auginami gyvuliai. Kita vertus, mokslininkų tyrimų duomenys rodo (Forth ir kt., 2017),

kad užkrėstoje virusu mėsoje besivystančios Lucilia sericata ir Caliphora vicina lervos

inaktyvuoja virusą, todėl vėliau išsiritusios musės jau nebeturi aktyvaus viruso ir viruso

rezervuaro vaidmens negalėtų atlikti. Vabzdžiuose, sugautuose tvarto išorėje nebuvo rasta

viruso DNR.

Buvo tikėtasi rasti AKM viruso DNR ir kitų kraujasiurbių vabzdžių mėginiuose,

tačiau sparvose Hybomitra ir Haematopota viruso DNR nebuvo aptikta. Sparvų

vystymasis nėra susijęs su fermos aplinka, tačiau jos vystosi drėgnose vietose, kuriose

galėtų kontaktuoti su AKM virusu užkrėstais šernais ir vėliau patekę į fermą pernešti

virusą.

AKM židinių vietoje, Ažuolų Būdos kaime po pirmojo protrūkio pastatytoje NZI

gaudyklėje buvo gaudomi vabzdžiai iki sezono pabaigos. Laikotarpiu po pirmojo

protrūkio (2019. 07.12) iki kito protrūkio (2019.07.29) buvo patikrintos tuo metu į

gaudyklę papuolusios S. calcitrans musės. Ištirta 19 vabzdžių ir nustatytas vienas S.

calcitrans individas, kuriame aptikta AKM viruso DNR (6 pav.).

6 pav. Elektroforezės nuotrauka po PGR atlikto su specifiniais AKM viruso

pradmenimis. 1 – DNR molekulinis žymuo (fragmentų ilgis (bp)), 2-9 neigiami mėginiai,

10 - Stomoxys calcitrans (326 bp fragmentas), 11 – neigiama kontrolė, 12- teigiama

kontrolė.

12

AKM VIRUSAS ŠERNŲ GAIŠENOMIS BESIMAITINANČIŲ VABZDŽIŲ

LERVOSE, LĖLIUKĖSE IR IŠSIRITUSIUOSE SUAUGĖLIUOSE

Viruso išlikimas šernų gaišenomis besimaitinančių musių lervose ir suaugėliuose

buvo nustatomas tiriant lervas iš šerno gaišenos. Kritęs nuo AKM šernas buvo izoliuotas

tinkline tvora nuo aplinkos (Ilgakiemis, Kauno apskritis). Lervos paimtos ir paruoštos

auginimui VMVTI laboratorijoje taip, kaip aprašyta metodų dalyje. Tyrimo metodus ir

objektus iliustruoja 5 paveikslas 1 priede. Iš 10-ties lervų, kurios buvo nuplautos

fosfatiniu buferiu, nei viena iš penkių išsiritusių musių Calliphora vomitoria neturėjo

AKM viruso DNR. Tokie patys rezultatai buvo gauti ir tiriant muses užaugintas iš

nenuplautų lervų. Šie rezultatai dar kartą patvirtino, kad mėsmusių lervos inaktyvuoja

virusą, todėl vėliau išsiritusios musės jau nebeturi aktyvaus viruso ir viruso rezervuaro

vaidmens negalėtų atlikti (Forth ir kt., 2017). Tokie rezultatai buvo auginant lervas

laboratorijoje ant substrato, kuriame nėra viruso, todėl tai nevisai atitinka natūraliomis

sąlygomis šerno gaišenose besivystančių musių aplinkos. Norint, kad eksperimentas

labiau atitiktų natūralias sąlygas, aplink gaišeną esančioje miško paklotėje buvo iškastos

ir iki suaugėlio stadijos laboratorioje išaugintos 6 mėsmusių lėliukės . Iš imago buvo

išskirta DNR ir individualiai patikrintas užsikrėtimas AKM virusu. Viruso DNR nebuvo

rasta nei viename tirtame mėginyje, kas patvirtina, kad lervos inaktivuoja virusą ir iš

tokių lervų išsiritę suaugėliai neturi AKM viruso DNR.

Norint nustatyti, kokie vabzdžiai skraido ir kokia jų skraidymo dinamika netoli

yrančios šerno gaišenos, NZI gaudyklė buvo pastatyta 3 m atsumu nuo aptvertos šerno

gaišenos. Gegužės – birželio mėnesiais gaudyklės turinys buvo išrenkamos kas savaitę, o

liepos ir rugpjūčio mėnesiais - kas dvi savaitės, nes tuo metu šerno gaišena jau buvo

stipriai apirusi, o vabzdžiai gaudyklėje buvo sugaunami itin negausiai.

Kaip ir buvo tikėtasi, gegužės-birželio mėnesiais tarp pagautų vabzdžių vyravo

mėsmusės Calliphoridae, kurioms buvo labai palankios sąlygos vystytis šerno gaišenoje

(7 pav.). Nuo birželio vidurio gausiai buvo sugaunamos Hybomitra genties sparvos, kurių

skraidymo aktyvumas Ilgakiemyje buvo panašus kaip ir vienoje iš fermų (Sirvyduose) –

skraidymo aktyvumo pikas registruotas birželio paskutiniąją savaitę (7 pav.). Šios genties

sparvos šiais metais Ilgakiemyje buvo sugaunamos trumpiau - tik iki liepos, o Sirvyduose

- iki rugpjūčio pabaigos. Liepos ir rugpjūčio mėnesiais aplink šerno gaišeną buvo labai

negausiai aptinkamos Hybomitra sparvos, mėsmusės bei Sarcophagidae šeimos

13

lavonmusės. Visu tyrimo metu gaudyklėje buvo aptinkami pavieniai kraujasiurbiai uodai

(Culicidae) (7 pav.).

7 pav. NZI gaudykle prie šerno gaišenos surinktų vabzdžių gausumas.

PROJEKTO REZULTATŲ VIEŠINIMAS

Lapkričio 6 d. perkaitytas pranešimas “Galimas AKM plitimas per vabzdžius” VMVT

Skubios veiklos skyriaus veterinarijos inspektoriams organizuotuose mokymuose

“AFRIKINIO KIAULIŲ MARO SITUACIJOS APŽVALGA”. LSMU Veterinarijos

akademija, Kaunas, 2019.

Tezės ASF-STOP COST konferencijoje (2020 m. sausis)

Turčinavičienė, J., Bernotienė, R., Petrašiūnas, A. Possible transmission of ASFV by

insects: studies in Lithuania.

LITERATŪROS SĄRAŠAS

EFSA Panel on Animal Health and Welfare. 2014. Scientific opinion on African swine

fever. EFSA Journal, 12 (3628), 1-77.

EFSA Panel on Animal Health and Welfare. 2015. Scientific opinion on African swine

fever. 13(4163), 1-92.

Risk assessment of African swine fever in the south-eastern countries of Europe. 2019.

EFSA Journal, 17(11):5861.

Research gap analysis on African swine fever. 2019. EFSA Journal, 17(8):5811.

0

20

40

60

80

100

120

140

23 30 6 13 19 28 11 31 14 22

gegužė birželis liepa rugpjūtisSur

inktų

mus

ių g

ausu

mas

(i

nd.)

Calliphoridae Sarcophagidae kitos sparvos Hybomitra Culicidae

14

Forth J.H., Amendt J., Blome S., Depner K., Kampen H. 2017. Evaluation of blowfly

larvae (Diptera: Calliphoridae) as possible reservoirs and mechanical vectors of African

swine fever virus. Transbound Emerg Dis. 65, e210-e213.

Gallardo C., Mwaengo D. M., Macharia J. M., Arias M., Taracha E. A., Soler A., Okoh

E., Martin E., Kasiti J., Bishop R.P. Enhanced discrimination of African swine fever virus

isolates through nucleotide sequencing of the p54, p72, and pB602L (CVR) genes. 2009.

Virus Genes, 38:85-95.

Jacquiet P., Rouet D., Boushira E., Salem A., Lienard E., Franc M. 2014. Population

dynamics of Stomoxys calcitrans (L.) (Diptera:Muscidae) in southwestern France. Revue

Med Vet. 165:9-10, 267-271.

Luo Y., Atim S., Shao L., Ayebazibwe Ch., Sun Y., Liu Y., Ji Sh., Meng X-Y., Li s., Li

Y., Masembe C., Stahl K., Widen F., Liu L., Qiu H-J., 2017. Development of an updated

PCR assay for detection of African swine fever virus. Arch Virol 162:191-199.

MacLeod J., Donnelly J., 1963. Dispersal and Interspersal of Blowfly Populations.

Journal of Animal Ecology 32 (1): 1–32.

Mellor P.S., Kitching R.P., Wilkinson P.J. 1987. Mechanical transmission of

capripoxvirus and African swine fever virus by Stomoxys calcitrans. Research in

Veterinary Science, 43, 109-112.

Mihok S. 2002. The development of a multipurpose trap (the Nzi) for tsetse and other

biting flies. Bulletin of Entomological Research, 92, 385-403.

Olesen A.S., Hansen M. F., Rasmussen T.B., Belsham G.J., Bodker R., Botner A. 2018.

Survival and localization of African swine fever virus in stable flies (Stomoxys

calcitrans) after feeding on viremic blood using a membrane feeder. Veterinary

Microbiology 222:25-29.

Olesen A.S., Lohse L., Hansen M. F., Boklund A., Halasa T., Belsham G.J., Rasmussen

T.B., Botner A., Bodker R. 2018. Infection of pigs with African swine fever virus via

ingestion of stable flies (Stomoxys calcitrans).Transbound Emerg Dis. 1-6.

Sanchez-Cordon

Skovgard H., Nachman G. 2012. Population dynamics of stable flies Stomoxys calcitrans

(Diptera: Muscidae) at an organic dairy farm in Denmark based on mark-recapture with

destructive sub-sampling. Environmental Entomology 41(1):20-29.

15

Van Hennekeler K ., Jones R . E ., Skerratt L. F., Fitzpatrick L. A ., Reid S. A . and

Bellis G. A. 2008. A comparison of trapping methods for Tabanidae (Diptera) in North

Queensland, Australia. Medical and veterinary Entomology, 22, 26-31.

IŠVADOS IR REKOMENDACIJOS

Sezoninės vabzdžių dinamikos duomenys rodo, kad Stomoxys aktyvumas gali

būti susijęs su AKM židinių atsiradimu. Šios musės gausiau aptinkamos netoli galvijų

laikymo vietų, todėl galvijų ir kiaulų laikymas toje pačioje patalpoje arba netoliese galėtų

būti rizikos veiksniu AKM viruso plitimui (Ąžuolų Būdos protrūkių atvejai).

Iš NZI gaudyklėmis surinktų vabzdžių daugiausia AKM viruso DNR aptikimo

atvejų nustatyta Stomoxys calcitrans musėse (7,5 %). Tai, kad iš gaudyklėmis šalia

kiaulių ūkių pagautų musių kandiklių net 7,5% buvo aptikta AKM viruso DNR rodo, kad

šioms musėms turėtų būti skirtas didesnis dėmesys kuriant apsaugos nuo AKM viruso

priemones.

Musėse Musca sp. (Muscidae) sugautose AKM židinio vietose buvo nustatyta

AKM viruso DNR, todėl prielaida, kad viruso plitimas galėtų būti susijęs su šiais

vabzdžiais negalėtų būti atmesta, nes šie vabzdžiai yra judrūs ir jų gausumas kiaulių

laikymo vietose yra didelis.

Per visą tyrimo laikotarpį (2018-2019) mėsmusėse Lucilia, Cynomyia

(Calliphoridae) ir Fannia (Fanniidae) genties musėse (AKM židinių vietose) buvo

nustatyta AKM viruso DNR, todėl viruso plitimas galėtų būti susijęs ir su šiais

vabzdžiais.

Kraujasiurbiuose vabzdžiuose – sparvose (Tabanidae) nebuvo aptikta AKM

viruso DNR.

Mėsmusių Calliphora (Calliphoridae) vystymosi AKM virusu užkrėstose

gaišenose metu AKM virusas neišlieka išsiritusiuose suaugėliuose, todėl mažai tikėtina,

kad musės išsivysčiusios kritusiuose šernuose dalyvauja AKM viruso pernešime.

AKM virusas buvo aptiktas viename Culex genties kraujasiurbiame uode. Tai

rodo, kad šios grupės kraujasiurbiai turėtų būti plačiau tiriami kaip galimi AKM viruso

pernešėjai.

16

REKOMENDUOTINA kiaulių laikymo vietose riboti vabzdžių patekimą, naudoti

nuo vabzdžių apsaugančius langų tinkliukus, užtikrinti jų sandarų įrengimą.

Atsižvelgiant į tai, kad AKM virusu kiaulės gali užsikrėsti ir suėdę tam tikrą kiekį

užkrėstų vabzdžių, ir nors šis užsikrėtimo kelias negalėtų būti tipiškas, tačiau siūlome

netaikyti cheminių priemonių suaugusių musių naikinimui kiaulių laikymo vietose.

Tokioms nugaišusioms musėms pakliuvus į pašarus, tikimybė užsikrėsti AKM išlieka.

Atsižvelgiant į tai, kad daugybinių židinių vietoje (Ąžuolų Būda) buvo

užfiksuotas palyginus didelis su kitomis vietomis Stomoxys calcitrans musių gausumas,

rekomenduotina nelaikyti galvijų vienoje patalpoje su kiaulėmis, nes tokiu būdu šie

vabzdžiai gali lengviau patekti į kiaulių laikymo vietas.

SUDERINTA: (Tyrimų priežiūros komisijos pirmininkas)

(Vardas, Pavardė)

(Data)

17

1 PRIEDAS

1 pav. NZI gaudyklė kiaulių komplekso teritorijoje Poškaičiuose, Nemenčinės sen., Vilniaus raj.

2 pav. Stomoxys calcitrans – musė kandiklė. Musės ilgis 5,5 – 7,2 mm, straublys ilgas,

čiuopikliai trumpi.

18

3 pav. Lervų, surinktų nuo kritusio šerno, auginimo schema.

4 pav. NZI gaudyklė ir izoliuotas kritęs šernas.

5 lervos qPGR

25 lervų šerno 10 lervų nuplaunama, auginama iki lėliukės (po 5 lervas į 2 ind.)

5 suaugėliai PGR

5 lėliukės PGR

10 lervų neplaunama, auginama iki lėliukės (po 5 lervas į 2 ind.)

5 suaugėliai PGR

5 lėliukės PGR

~ 1 savaitė ~ 2 savaitės

19

5 pav. AKM viruso paieška skirtingos vystymosi stadijos musėse.

1 lentelė. NZI gaudyklėse sugauti Stomoxys calcitrans, Hybomitra, Haematopota,

Calliphoridae ir Culicidae vabzdžių sezoniniai duomenys.

Mėnuo Stomoxys calcitrans diena Poškaičiai diena Sirvydai diena Ilgakiemis diena Ąžuolų Būda

Gegužė 20 23 27 1 30

Birželis 1 7 13 6 10 14 1 13 17 21 1 19 25 1 28 3 28

Liepa 8 2 5 9 15 1 12 11 22 19 29 2 26 2 31 31 46

Rugpjūtis 5 2 2 7 30 12 9 1 14 14 26 19 16 3 21 11 26 27 10 22 28 16

Rugsėjis 9 1 2 14 4 13 9 11 11 10 16 7 18 67 23 25 36 27

Spalis 4 1 2 18 9 7

VISO 8 78 0 280 366

Mėnuo Haematopota (Tabanidae) diena Poškaičiai diena Sirvydai diena Ilgakiemis diena Ąžuolų Būda

Gegužė 20 23 27 1 30

Birželis 1 7 4 6 10 14 2 13 1 17 21 1 19

20

25 28 3 28 4 Liepa 8 5 2

15 12 11 5 22 1 19 29 1 26 5 31 4 31

Rugpjūtis 5 1 2 3 7 12 9 1 14 1 14 19 16 2 21 1 26 27 2 22 28

Rugsėjis 9 2 4 9 11 16 18 23 25 27

Spalis 4 2 9

VISO 4 25 15 1 45

Mėnuo Hybomitra (Tabanidae) diena Poškaičiai diena Sirvydai diena Ilgakiemis diena Ąžuolų Būda

Gegužė 20 23 6 27 30 1

Birželis 1 7 34 6 20 10 14 31 13 39 17 2 21 108 19 96 25 28 204 28 131

Liepa 8 5 170 15 12 11 12 22 3 19 8 29 26 97 31 3 31

Rugpjūtis 5 2 22 7 12 9 14 14 14 19 16 3 21 26 27 8 22 28

Rugsėjis 9 2 4 9 11 16 18 23 25 27

Spalis 4 2 9

VISO 5 699 308 1012

Mėnuo Calliphoridae diena Poškaičiai diena Sirvydai diena Ilgakiemis diena Ąžuolų Būda

Gegužė 20 1 23 37 27 4 30 5

Birželis 1 1 7 6 74 10 2 14 13 11 17 12 21 19 8 25 28 28 14

Liepa 8 5 15 12 11 7 22 19 29 26 31 7 31

Rugpjūtis 5 2 7

21

12 9 14 4 14 19 16 21 3 26 27 33 22 2 28 2

Rugsėjis 9 6 2 17 4 1 9 8 11 1 16 4 18 23 25 1 27

Spalis 4 2 9

VISO 26 62 169 8 265

Mėnuo Culicidae diena Poškaičiai diena Sirvydai diena Ilgakiemis diena Ąžuolų Būda

Gegužė 20 23 5 27 30

Birželis 1 7 1 6 5 10 14 13 4 17 21 1 19 1 25 28 1 28 3

Liepa 8 5 15 12 11 1 22 1 19 6 29 26 2 31 31

Rugpjūtis 5 6 2 1 7 12 2 9 14 1 14 19 16 3 21 26 27 6 22 2 28

Rugsėjis 9 1 2 1 4 9 11 1 16 18 2 23 25 27

Spalis 4 2 1 9

VISO 10 22 22 4 58

Documents

VU AKM viruso pernesimas galutine AKM...Nuo 2014 met ų AKM virusas paplito Baltijos šalyse ir Lenkijoje (EFSA, 2015), 2017 metais virusas aptiktas Čekijoje ir Rumunijoje, 2018 metais