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Vorlesung "Molekülphysik/Festkörperphysik"Wintersemester 2012/2013

Prof. Dr. F. KremerÜbersicht der Vorlesung am 21.01.2013

• Fluoreszenz• Phosphoreszenz• Interkombinationsübergang • FRET (Fluoreszenz-Resonanz EnergieTransfer)• Konfokalmikroskopie• Einzelmolekülspektroskopie • STED (Stimulated Emission Depletion)• FCS (Fluoreszenz-Correlations-Spektroskopie)

•Lichtabsorption regt Elektron an zu einem höheren Vibrationszustand auf den Energieniveaus S1 oder S2.

•Bis auf wenige Ausnahmen relaxieren die Elektronen in kondensierter Materie (angekoppeltes Wärmebad) in den niedrigsten Vibrationszustand des S1 Niveaus. Die geschieht gewöhnlich in weniger als 10-12s.

•Nach einer Abklingdauer von ca. 10-8s kehrt das Elektron wieder in das S0 Niveau zurück, dabei kann (-> Quantenausbeute) es Licht (gewöhnlich mit größerer Wellenlänge) emittieren.

Ablauf der Fluoreszenz

Alexander Jablonski (1898–1980)

•Fluoreszenz ist die kurzzeitige, spontane Emission von Licht beim Übergang eines elektronisch angeregten Systems in einen Zustand niedrigerer Energie.

• Im Gegensatz zur Phosphoreszenz sind Fluoreszenzübergänge spinerlaubt, d. h. sie gehorchen der Auswahlregel ΔS = 0, erfolgen also zwischen Zuständen gleichen Spins.

Fluoreszenz

•Es kommt nach etwa 10-8 Sekunden zu einem weiteren Quantensprung der Elektronen in ein metastabiles Energieniveau. Es ändert sich hierbei der Spin der Elektronen, wodurch das Molekül unter Änderung der Multiplizität von einem Singulett- in einen Triplettzustand übergeht (Interkombinationsübergang - Intersystem Crossing).

•Die Verweildauer in diesem Zustand beträgt Millisekunden bis hin zu Stunden.

•Das Molekül ist in diesem angeregten Zustand „gefangen“, da eine Abgabe der Energie an die Umgebung nicht möglich ist (Spinumkehr nicht möglich).

•Ausnahme: erneuter Interkombinationsübergang. Durch ihn kann eine schwache Strahlung emittiert werden.

Phosphoreszenz

• Elektrische Dipolübergänge erfolgen besonders gut, wenn die Multiplizität erhalten bleibt (z. B. Fluoreszenz). Prozesse, bei denen sich die Multiplizität ändert (Interkombination), sind verboten(Interkombinationsverbot), d. h. sie finden meist nur in geringem Ausmaß bzw. statistisch selten statt. (~langsam)

• Wenn jedoch die Kernladungszahl Z stark zunimmttritt jj-Kopplung auf. Dabei ist die Wechselwirkungsenergie zwischen dem magnetischen Bahnmoment und dem magnetischen Spinmoment groß gegen die Kopplungsenergien zwischen den magnetischen Bahnmomenten und zwischen den Spinmomenten. -> Interkombinationsverbot gilt nicht mehr (streng), da keine Unterscheidung der Atomterme in S, P, D –Terme und in Singulett, Dubletts und Tripletts.

Interkombinationsübergang

Gesamtbahndrehimpuls: nicht definiert

Gesamtspin: nicht definiert

Gesamtdrehimpuls: mit

Übergang von LS- zu jj-Kopplung

i i ij l s= +ii

J j=∑

LS jj

ii

L l=∑

ii

S s=∑

J L S= +

Gesamtbahndrehimpuls:

Gesamtspin:

Gesamtdrehimpuls:

leichte Atome schwere Atome

Es existiert eine Reihe von Effekten, die zur Fluoreszenzlöschung führen können, beispielsweise:

• Komplex-Bildung• interne Konversion• Energie-Übertragung auf andere Moleküle, sogenannte Quencher

Zu den Quenching-Effekten gehören alle Vorgänge, die entweder den angeregten Zustand des Fluorophors strahlungslos in den Grundzustand überführen oder aber verhindern, dass der Fluorophor in den angeregten Zustand übergehen kann.

Dynamisches Quenching: Energie des angeregten Fluorophores wird durch den Zusammenstoß mit einem Quenchermolekül auf dieses Quenchermolekül übertragen, wobei die Energie letztlich in Wärme übergeht.

Statisches Quenching: Fluorophor und Quenchermolekül bilden einen Komplex, dessen Fluoreszenz verringert ist oder ganz ausbleibt. Resonanz-Energie-Transfer

Beim Resonanz-Energie-Transfer wird die Energie des angeregten Zustandes des Fluorphors D (Donor) strahlungslos durch Resonanzeffekte auf ein zweites Molekül A (Akzeptor) übertragen.

Fluoreszenzlöschung

FRET (Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer)

Förster-Resonanzenergietransfer kann zwischen zwei Farbstoffen, die als Moleküle, Komplexe oder Nanopartikel vorliegen, beobachtet werden.

Dabei wird die Energie eines angeregten Donorfarbstoffs nicht in Form eines Photons abgegeben, sondern strahlungslos über Dipol-Dipol-Wechselwirkungen auf einen Akzeptorfarbstoff übertragen.

Der Energietransfer folgt dabei dem Coulombschen Gesetz. Demnach induziert der angeregte Donor D* eine Oszillation im Akzeptor A.

Charakteristisch für den Förster-Resonanzenergietransfer ist auch, dass die quantenmechanische Eigenschaft des Spins von Donor- und Akzeptorfarbstoff erhalten bleibt. Daher tritt der Förster-Resonanzenergietransfer in der Regel als sogenannter Singulett-Singulett-Transfer auf.

kT: TransferrateτD: Lebensdauer Donorr: Abstand Donor AkzeptorR0: Försterradius

Photolumineszenz

Bsp.: Fluoreszierende Minerale

Photolumineszenz

oben: Nilrot bei Tageslicht (obere Reihe) und UV-Licht (366 nm, untere Reihe) in verschiedenen Lösungsmitteln. V.l.n.r.: 1. Wasser, 2. Methanol, 3. Ethanol, 4. Acetonitril, 5. Dimethylformamid, 6. Aceton, 7. Ethylacetat, 8. Dichlormethan, 9. n-Hexan, 10. tert-Butylmethylether, 11. Cyclohexan, 12. Toluol.links: Uranglas unter Tages- und UV-Licht

Querschnitt durch eine "weiße" LED

(blaue LED + gelber Fluoreszenzfarbstoff)

Anwendungsbeispiele

Phosphoreszierende Leuchtziffern

(ggf. mit Tritium Anregung)

Mit Ethidiumbromid gefärbtes Agarose-Gel

Niederdruck-Gasentladungslampe, die Ultraviolettstrahlung wird

von der Leuchtstoff-Beschichtung in sichtbares Licht umgewandelt.

Konfokalmikroskopie

Konfokalmikroskope erlauben durch ihre hohe axiale Auflösung die Aufnahme von vielen Bildern in verschiedenen Schärfeebenen und somit die Erstellung eines scharfen, dreidimensionalen Bilds.

a,d: menschliches Knochenmark

b,e: Muskelzelle

c,f: Pollen einer Sonnenblume

konf

ocal

"n

orm

al"

• Lichtmikroskop

• nicht das gesamte Präparat beleuchtet

• ein beugungsbegrenzter Lichtfleck

• Besonderheit besteht darin, dass im Strahlengang des detektierten Lichts eine Lochblende angebracht ist, die Licht, welches von außerhalb der Schärfeebene kommt, blockieren kann.

Konfokalmikroskopie

Einzelmolekülspektroskopie

• Ein abbildendes Fluoreszenzmikroskop; hier werden mit Hilfe einer sehr rauscharmen und empfindlichen CCD-Kamera Bilder aufgenommen, die Signale der einzelnen Emitter enthalten.

• Ein konfokales Mikroskop mit einem mehrkanaligen Detektorsystem, das einzelne Photonen mit sehr hoher Zeitauflösung registrieren kann.

• Ein abbildendes Fluoreszenzmikroskop; hier werden mit Hilfe einer sehr rauscharmen und empfindlichen CCD-Kamera Bilder aufgenommen, die Signale der einzelnen Emitter enthalten.

• Ein konfokales Mikroskop mit einem mehrkanaligen Detektorsystem, das einzelne Photonen mit sehr hoher Zeitauflösung registrieren kann.




Surface-tethered DNA in shear flow – observation of dynamic cyclic motion

End-specific DNA-immobilisation

Time- & flow-dependent coordinates

Experimental set-up

Q-dot

DNA

*1 0.2H ≈*1 0.3H >

Response of doubly-tethered DNA to shear flow

Complexation of two DNA fragments by a genetically modified TetR protein

(with W. Hillen, Erlangen)

Manipulation of doubly-tethered DNA by molecular motors & hydrodynamic flow

DNA-protein interaction

Motor-induced DNA stretching

TU Dresden / AG Mertig


The experiment: semiflexible actin filaments in parabolic microflow10µm

10µm

actin in microchannels:

length L ~ 8µmpersistence length

LP ~ 13µmpressure flow – parabolic flow

profile


“stretched”

“tumbling”

“U-form”

Dagmar Steinhauser and Thomas Pfohl

STED (Stimulated Emission Depletion)

•bietet aber bessere Auflösung als in einem herkömmlichen Laser-Raster-Mikroskop möglich, da der Bereich, aus dem die Fluoreszenz emittiert wird, bedeutend verkleinert wird, als der Bereich, der von dem Laserstrahl beleuchtet wird.

•Dies wird durch gezieltes Ausschalten der Farbstoffmoleküle im Außenbereich des Fokus erreicht.

STED (Stimulated Emission Depletion)

•Konfokalmikroskop, das nach dem RESOLFT-Prinzip (REversible Saturable OpticaL (Flurorescence) Transitions) arbeitet

•baut auf Fluoreszenz-Laser-Raster-Mikroskopen auf

FCS (Fluoreszenz-Correlations-Spektroskopie)

Die Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (fluorescence correlation spectroscopy, FCS) ist eine höchstempfindliche optische Messmethode, die aus Fluktuationen in der Fluoreszenzintensität Informationen gewinnt. Mit FCS werden in der Regel Diffusionskonstanten, Konzentrationen und Bindungen zwischen verschiedenen diffundierenden Spezies gemessen. Die Methode wurde in den 1970er Jahren von W. W. Webb, et al. entwickelt.


Die Theorie der FCS beruht auf der Poisson-Statiastik:

( , )!

nNNP n N e

n−= (1)

P(n,N) ist die Wahrscheinlichkeit, dass n Fluorophore in dem Beobachtungsvolumen vorhanden sind, wenn die mittlere Zahl der Moleküle in dem Volumen N ist.

Beispiel: Wenn N=0,6 so ist die Wahrscheinlichkeit 55%, dass das Beobachtungsvolumen kein Fluorophor enthält33%, dass es einen Fluorophor und10%, dass es Fluorophore enthält.

Es ist evident, dass die Diffusionsrate der Fluorophore eine wichtige Rolle spielen muss. Darum wird die Intensität zu einer Zeit t verglichen mit der zu einer Zeit t+τ.


Korrelationsfunktion K(s)

(2)

Von Interesse sind die Fluktuationen von um einen mittleren Wert

(3)

Normalisierung der Autokorrelationsfunktion für die Fluoreszensintensität liefert

(4)

(5)

0

( ) ( ) ( )

1 ( ) ( )T

K F t F t

F t F t dtT

τ τ

τ

= ⟨ + ⟩

= +∫

( ) ( )F t F F tδ = ⟨ ⟩ −

( ) ( )( ) F t F tGF F

ττ ⟨ + ⟩=

⟨ ⟩ ⋅ ⟨ ⟩

2

(0) ( )( ) 1 F FGF

δ δ ττ ⟨ ⟩= +

⟨ ⟩

( )F t


Beweis: Einsetzen von (3) in (5) liefert

(6)

Die Hauptanwendung der FCS sind Diffusionsmessungen. Die Theorieder Diffusion in drei Dimensionen liefert für die Korrelationsfunktion

(7)

wobei D der Diffusionskoeffizient ist.

( )( )

( )

2

2 2

2

2 2

2

( ) ( )1

( ) ( ) ( ) ( )

2 2 ( ) ( )

F F F F t F F tF

F F F F t F t F t F tF

F F F F t F tF

τ

τ τ

τ

⟨ ⟩ ⋅ ⟨ ⟩ + ⟨ ⟨ ⟩ − ⟨ ⟩ − + ⟩+

⟨ ⟩

⟨ ⟩ + ⟨ ⟩ − ⟨ ⟩⟨ ⟨ + ⟩ + ⟨ ⟩ + ⟨ ⋅ + ⟩=

⟨ ⟩

⟨ ⟩ − ⟨ ⟩ ⋅ ⟨ ⟩ + ⟨ ⋅ + ⟩=

⟨ ⟩

23

2 '( ,0) ( ', ) (4 ) exp 4r rc r c r c D Dδ δ τ π τ τ

⎡ ⎤−⟨ ⟩ = −⎢ ⎥⎢ ⎥⎣ ⎦


Vergleich mit der FCS-Messung unter Berücksichtigung eines Gauss'schen Strahlprofils liefert

(8)

Dabei sind s und n die Parameter des Strahlprofils.Für die Diffusionszeit τD gilt

(9)

wobei D der Diffusionskoeffizient ist.

11 2

2 2

4 4( ) (0) 1 1

(0) ( )

D DG Gs n

G G

τ ττ

τ

− −⎛ ⎞ ⎛ ⎞= + ⋅ +⎜ ⎟ ⎜ ⎟⎝ ⎠ ⎝ ⎠

=

2

4DsD

τ =


Fluktuation in Anzahl an Flourophoren im Beobachtungsvolumen


Poisson-Verteilung in einem ellipsoidalen Beobachtungsvolumen für verschiedene Fluorophore

Simulierte Autokorrelationsfunktion für Diffusion in 3-Dimensionen von einer Mischung aus zwei diffundierenden Spezien


Anwendung: Diffusionsanalyse in Abhängigkeit vom MolekulargewichtPack CG, Nishimura G, Tamura M, Aoki K, Taguchi H, Yoshida M, Kinjo M. 1999. Analysis of interaction between chaperonin GroELand its substrate using fluorescence correlation spectroscopy. Cytometry 36:247–253.


Anwendung: laterale Diffusion in MembranenKorlach J, Schwille P, Webb WW, Feigenson GW. 1999. Characterization of lipid bilayer phases by confocal microscopy and fluorescencecorrelation spectroscopy. Proc Natl Acad Sci USA 96:8461–8466.


Anwendung: Bestimmung molekularer Wechselwirkungen (gebundene Liganden sind langsamer) Schwille P,


Anwendung: Konformationsänderung von Polyelektrolyten führt zu unterschiedlichen Diffusionsgeschwindigkeiten Schwille P,


Anwendung: Protein-BindungPack CG, Nishimura G, Tamura M, Aoki K, Taguchi H, Yoshida M, Kinjo M. 1999. Analysis of interaction between chaperonin GroELand its substrate using fluorescence correlation spectroscopy. Cytometry 36:247–253.


Anwendung: 2D-FCS in MembranenSchwille P, Haupts U, Maiti S, Webb WW. 1999. Molecular dynamics in living cells observed by fluorescence correlation spectroscopywith one- and two- photon excitation. Biophys J, 77:2251–2265.

Kontrollfragen zur Vorlesung am 21.1.2013

124. Was besagt ein Jablonski-Diagramm125. Was ist der Unterschied zwischen Fluoreszenz und Phosphoreszenz?126. Durch welche Mechanismen kann die Fluoreszenz unterdrückt werden?127. Was ist das Prinzip der konfokalen Mikroskopie?128. Welche Auflösung lässt sich mit einem konfokalen Mikroskop realisieren?129. Was ist das Prinzip der Stimulated Emission Depletion (STED) Mikroskopie. Welche laterale Auflösung kann damit erreicht werden?130. Was ist eine Correlationsfunktion? Welche Eigenschaften hat sie?131. Was ist das Prinzip der Fluoreszenz- Correlations- Spektroskopie (FCS)?

•Fluoreszenz ist die kurzzeitige, spontane Emission von Licht beim Übergang eines elektronisch angeregten Systems in einen Zustand niedrigerer Energie.

• Im Gegensatz zur Phosphoreszenz sind Fluoreszenzübergänge spinerlaubt, d. h. sie gehorchen der Auswahlregel ΔS = 0, erfolgen also zwischen Zuständen gleichen Spins.

Jablonski Diagramm

Alexander Jablonski (1898–1980)

FluoreszenzlöschungDynamisches Quenching

Für die dynamische Fluoreszenzlöschung gilt folgendes Verhältnis:

Für die gleiche Konzentration des Quenchers wird bei der dynamischen Fluoreszenzlöschung bei steigender Temperatur der Wert für die Kd= KSV prinzipiell größer, d. h. der Quencher löscht bei höherer Temperatur stärker als bei niedrigerer Temperatur: die Diffusionsgeschwindigkeit des Quenchers - und damit auch der bimolekulare Ratenkoeffizient k0 - nimmt bei steigender Temperatur zu, wodurch die Anzahl der Stöße mit dem Fluorophor, und damit die Anzahl der Löschvorgänge, ebenfalls zunimmt.

Dabei ist kq die bimolekulare Quenchingkonstante und τ0 die Lebensdauer des angeregten Zustandes des Fluorophors in Abwesenheit des Quenchers.Die bimolekulare Quenchingkonstante kq kann aus der Lebenszeit τ0 des ungestörten Fluorophors ([Q]=0), und der Lebenszeit τ des Fluorophors für die Quencherkonzentration [Q]

[ ]0 0 1 d

F K QF

ττ

= = + ⋅

0d qK kτ=[ ] 0

1 1 1qk

Q τ τ⎛ ⎞

= ⋅ −⎜ ⎟⎝ ⎠

Dynamisches QuenchingHerleitung

Das Fluorophor F geht durch die Absorption eines Photons in den angeregten Zustand F* über:

Dabei ist ka die Geschwindigkeitskonstante der Absorption, mit der das Fluorophor vom Grundzustand in den angeregten Zustand wechselt. Aus diesem angeregten Zustand kann das Fluorophor über verschiedenen Wege in den Grundzustand zurückkehren:

In (A) geht das Fluorophor durch die Emission eines Photons in den Grundszustand über (Fluoreszenz), in (B) geht die Energie des angeregten Zustandes durch andere Prozesse strahlungslos in Wärme über und in (C) wird der angeregte Zustand durch den Quencher Q strahlungslos in den Grundzustand überführt. Dabei nimmt der Quencher die Energie des angeregten Zustandes des Fluorophors auf, symbolisiert durch Q'. Die drei Reaktionswege (A), (B) und (C) besitzen die jeweiligen Geschwindigkeitskonstanten kf, kw und kq.

*AbsorptionF F

ak

hν+ →

*

*

* '

(A) F F

(B) F F Wärme

(C) F +Q F Q

f

W

q

k

Emission

k

k

hν→ +

→ +

→ +


Die Fluoreszenz-Quantenausbeute ist definiert als:

Dabei ist Ie die Anzahl der durch Fluoreszenz emittierten Photonen pro Zeiteinheit und Ia ist die Anzahl der vom Fluorophor absorbierten Photonen pro Zeiteinheit.Die Anzahl der emittierten Photonen pro Zeiteinheit bestimmt sich mit (A) aus der Konzentration an angeregten Fluorophor [F * ] und kf :

Die Anzahl der absorbierten Photonen lässt sich, analog zu Ie, aus der Konzentration [F] des Fluorophors F und der Geschwindigkeitskonstante ka bestimmen. Da die angeregten Fluorophore F* durch die oben genannten Prozesse (A), (B) und (C) wieder in den Grundzustand zurückkehren, sind die beiden Prozesse Absorption und Verlust der Anregungsenergie durch die drei Prozesse (A), (B) und (C) imGleichgewichtszustand gleich groß:

e

a

II

Φ =

*[F ]e fI k= ⋅

[ ]* * *[F] [F ] [F ] Q [F ]a a f W qI k k k k= ⋅ = ⋅ + ⋅ + ⋅ ⋅


Durch Ersetzen von Ie und Ia wird die Quantenausbeute der Fluoreszenz nach Kürzung um [F * ] zu:

In der Abwesenheit des Quenchers - d.h. [Q] = 0 - ist die Quantenausbeute gleich:

Das Verhältnis (Φ0 / Φ) ist gleich:

Die Fluoreszenzlebensdauer τ des angeregten Zustandes in Abwesenheit des Quencher ist die inverse Summe der beiden Reaktionsgeschwindigkeiten:

[ ]Qf

f W q

kk k k

Φ =+ + ⋅

0f

f W

kk k

Φ =+

[ ] [ ]0Q Q

1f W q q

f W f

k k k kk k k k

+ + ⋅ ⋅Φ= = +

Φ + +

[ ]1

Qf W qk k kτ =

+ + ⋅


In der Abwesenheit des Quenchers - d.h. [Q] = 0 - ist die Fluoreszenzlebensdauer gleich:

Wird in das Verhältnis (Φ0/Φ) die Fluoreszenzlebenszeit τ0 eingesetzt, so sich ergibt nach Umstellung die Gleichung:

Wird dagegen τ und τ0 in das Verhältnis (Φ0/Φ) eingesetzt so ergibt sich:

Wegen der direkten Proportionalität der Quantenausbeute Φ der Fluoreszenz zur Intensität F der Fluoreszenz folgt:

und

0

1

f Wk kτ =

+

[ ]001 QqkτΦ

= + ⋅Φ

0 0ττ

Φ=

Φ

[ ]0 001 Qq

F kF

τΦ= = + ⋅

Φ0 0F

Fττ

=

FluoreszenzlöschungStatisches Quenching

Bei der statischen Fluoreszenzlöschung bildet sich aus dem Fluorophor F und dem Quencher Q ein Komplex FQ, der selbst nicht fluoresziert. Dies lässt sich anhand einer chemischen Gleichung beschreiben:

Das chemisches Gleichgewicht Ks zwischen dem Fluorophor, dem Quencher und dem Komplex aus Fluororphor und Quencher, wird nach dem Massenwirkungsgesetz gebildet und ist gleich der Stern-Volmer-Konstante KSV:

Dabei ist [FQ] die Konzentration des Komplexes aus Fluorophor und Quencher, [F] die Konzentration des ungebundenen Fluorophors und [Q] die Konzentration des ungebundenen Quenchers. Bei der statischen Fluoreszenzlöschung ist das Verhältnis aus τ0 und τ, im Gegensatz zur dynamischen Fluoreszenzlöschung, gleich eins, da bei der statischen Fluoreszenzlöschung lediglich die Anzahl der anregbaren Fluorophore reduziert wird.

F+Q FQ

[ ][ ][ ]

FQF QSV SK K= =

0 1ττ=

Statisches QuenchingHerleitung

Die Assoziationskonstante Ks lautet:

Die Gesamtkonzentration [F]0 des Fluorophors setzt sich additiv aus der Konzentration des ungebundenen Fluorophors [F] und der Konzentration des mit dem Quencher gebundenen Fluorophors [FQ] zusammen:

Wird diese Gleichung nach [FQ] umgestellt und dann in die Gleichung der Assoziationskonstante Ks eingesetzt, ergibt sich:

Diese Gleichung wird nun nach ([F]0 / [F]) umgestellt:

Wegen der direkten Proportionalität der Fluoreszenzintensität F des Fluorophors zu seiner Konzentration [F] folgt:

[ ][ ][ ]

FQF QSK =

[ ] [ ] [ ]0F F FQ= +

[ ][ ][ ] [ ]

0F 1

F Q QSK = −

[ ][ ] [ ]0F

1 QF SK= + ⋅

[ ][ ] [ ]00F

1 QF S

F KF

= = + ⋅

•Das Franck-Condon-Prinzipdass der Wechverschiedenen Zuständen in ca. 10statAnregung nicht ändert (Kerns10

•Die hohe Geschwindigkeit des elektronischen Übergadie gerzur Born-Oppe

•Wenn ein Molekül nun von einem elektronischen Zustand in einen anderen übergeht, so istÜbergaVibrations-Wellenfunktionen der beiden Zustände zueinander kompat

beruht auf der Tatsache, sel von Elektronen zwischen

−15 Sekunden tfindet, so dass sich der Kernabstand während der

chwingungsperiode ca. −13 s).

ngs gegenüber der Kernbewegung wird durch inge Masse der Elektronen ermöglicht (analog

nheimer-Näherung).

dieser ng umso wahrscheinlicher, je mehr die

ibel sind.

Franck-Condon-Prinzip

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