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Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorkommen von Shigatoxin-bildenden und
enteropathogenen Escherichia coli in
deutschen Streichelzoos
INAUGURAL - DISSERTAION
Zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet)
vorgelegt von
Tanja Bauer
Bad Säckingen
Hannover 2013
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. P. Valentin-Weigand
Institut für Mikrobiologie und Tierseuchen,
Tierärztliche Hochschule Hannover
Prof. Dr. G.-F. Gerlach
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. P. Valentin-Weigand
Prof. Dr. G.-F. Gerlach
2. Gutachter: Univ.-Prof.Dr. L. Kreienbrock
Tag der mündlichen Prüfung: 21.05.2013
Meinen Eltern
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis ....................................................................................................... 5
Abbildungsverzeichnis ................................................................................................ 9
Tabellenverzeichnis .................................................................................................. 11
Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................. 13
1 Einleitung ........................................................................................................... 17
2 Literatur ............................................................................................................. 19
2.1 Escherichia coli .......................................................................................... 19
2.1.1 Taxonomie .......................................................................................... 19
2.1.2 Epidemiologie und Bedeutung ............................................................ 19
2.1.3 Pathogene Escherichia coli ................................................................. 20
2.2 STEC/VTEC und EHEC ............................................................................. 21
2.2.1 Virulenzfaktoren .................................................................................. 22
2.2.2 Nachweis von STEC ........................................................................... 25
2.2.3 Epidemiologie von STEC/EHEC beim Menschen ............................... 28
2.2.4 EHEC-Erkrankungen beim Menschen ................................................ 31
2.2.5 Epidemiologie von STEC bei Tieren ................................................... 33
2.2.6 EHEC/STEC in Streichelzoos ............................................................. 35
2.3 Haltung von Tieren in Streichelzoos ........................................................... 37
2.3.1 Zoologische Gärten, Tierparks, Tiergärten .......................................... 37
2.3.2 Wildparks, Wildgehege ....................................................................... 38
2.3.3 Freizeitparks mit Tieranteil .................................................................. 39
2.3.4 Streichelzoos, Streichelgehege ........................................................... 39
3 Material und Methoden ...................................................................................... 41
3.1 Material ...................................................................................................... 41
3.1.1 Geräte und Verbrauchsmaterialien ..................................................... 41
3.1.2 Chemikalien und Reagenzien ............................................................. 42
3.1.3 Nährmedien ......................................................................................... 44
3.1.4 Puffer und Lösungen ........................................................................... 45
3.1.5 Herkunft des Untersuchungsmaterials und Probennahme .................. 47
Inhaltsverzeichnis
3.2 Methoden ................................................................................................... 49
3.2.1 STEC-Isolierung .................................................................................. 49
3.2.2 Herstellen der PCR-Sonde .................................................................. 51
3.2.3 Präparation chromosomaler DNA ....................................................... 54
3.2.4 Testen der Sensitivität für die stx1-, stx2- und eae-Sonden ................ 55
3.2.5 Colony-Blot.......................................................................................... 56
3.2.6 Southern-Hybridisierung ..................................................................... 57
3.2.7 DNA-Analyse mittels Multiplex-PCR ................................................... 58
3.2.8 Gelelektrophorese ............................................................................... 61
4 Ergebnisse ........................................................................................................ 63
4.1 Charakterisierung der beprobten Parks ...................................................... 63
4.1.1 Gehaltene Tierarten ............................................................................ 63
4.1.2 Ställe und Gehege .............................................................................. 64
4.1.3 Gehegehygiene und Management ...................................................... 65
4.1.4 Weitere Angaben zu den beprobten Gehegen .................................... 66
4.1.5 Statistische Auswertung der Fragebögen ........................................... 66
4.2 Nachweis von STEC aus Proben des Jahres 2008 .................................... 66
4.2.1 Nachweis von STEC aus Kaninchen (Wildpark 105) .......................... 67
4.2.2 Nachweis von STEC aus Ziegen (Wildpark 107) ................................ 68
4.2.3 Nachweis von STEC aus Schafen (Wildpark 110) .............................. 68
4.2.4 Isolation von STEC mittels verschiedener Anzucht-Methoden ............ 69
4.3 Nachweis von STEC/EPEC aus Proben des Jahres 2009 ......................... 70
4.3.1 Auswertungen auf Probenebene ......................................................... 72
4.3.2 Auswertungen auf Parkebene ............................................................. 75
4.3.3 Serotypisierung von STEC Isolaten .................................................... 75
4.3.4 Virulenzgene in STEC Isolaten ........................................................... 78
4.3.5 Auswertung auf Isolatebene ................................................................ 88
4.3.6 Vergleich des STEC/EPEC Nachweises zwischen der ersten
Beprobung der Zoos und der Nachuntersuchung .............................................. 89
4.4 Auswertung der Parkarten und Regionen .................................................. 92
4.4.1 Jahr 2008 ............................................................................................ 92
Inhaltsverzeichnis
4.4.2 Jahr 2009 ............................................................................................ 93
5 Diskussion ......................................................................................................... 95
5.1 Material und Methoden ............................................................................... 95
5.2 Parkmanagement ....................................................................................... 98
5.3 STEC/EPEC Prävalenz ............................................................................ 101
5.4 Vorkommen von Serogruppen ................................................................. 104
5.5 Vorkommen von Virulenzgenen ............................................................... 106
5.6 Wiederfindungsrate einzelner Serogruppen in Streichelgehegen ............ 109
5.7 Parkarten und Regionen .......................................................................... 110
5.7.1 Jahr 2008 .......................................................................................... 110
5.7.2 Jahr 2009 .......................................................................................... 111
6 Schlussfolgerung ............................................................................................. 113
7 Zusammenfassung .......................................................................................... 117
8 Summary ......................................................................................................... 121
Literaturverzeichnis ................................................................................................ 127
Danksagung ........................................................................................................... 145
Anhang I (Statistische Auswertung der Fragebögen) ............................................. 147
Anhang II (Deskriptive Auswertung der Fragebögen) ............................................. 151
Abbildungsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Schichtung Deutschlands in drei Regionen .............................................. 48
Abb. 2: Untersuchter Probenumfang im Jahr 2008 ............................................... 67
Abb. 3: Untersuchter Probenumfang im Jahr 2009 ............................................... 71
Abb. 4: Anzahl positiver Proben der einzelnen Tierarten sowie aller Proben in
Prozent der einzelnen Parks. ................................................................... 72
Abb. 5: Die häufigsten vorkommenden Serogruppen prozentual in 32
beprobten Zoos. ....................................................................................... 77
Abb. 6: Die häufigsten vorkommenden Serogruppen prozentual in 32
beprobten Zoos bei Ziegen, Schafen und Schweinen .............................. 78
Abb. 7: Verteilung der Virulenzmuster der im Jahr 2009 getesteten Zoos. ........... 80
Abb. 8: Die häufigsten Serogruppen bezogen auf die serotypisierte
Gesamtprobenzahl ................................................................................... 84
Abb. 9: Die am häufigsten vorkommenden Serogruppen in den jeweiligen
Postleitzahlengebieten. ............................................................................ 86
Abb. 10: Serogruppenverteilung bei den Tierarten Ziege, Schaf und Schwein ....... 87
Abb. 11: Verteilung der Virulenzmuster anhand der 256 in der Kontroll-PCR
untersuchten Proben ................................................................................ 88
Abb. 12: Anzahl der Isolate der häufigsten Serogruppen ....................................... 89
Tabellenverzeichnis
Tabellenverzeichnis
Tab. 1: Verwendete Primer (FRANCK et al. 1998): .............................................. 51
Tab. 2: Verwendete Primer ................................................................................... 58
Tab. 3: Tier- und Zoozahlen der Jahre 2008 und 2009. ....................................... 64
Tab. 4: Detektierte STEC im Jahr 2008 ................................................................ 69
Tab. 5: Übersicht STEC-Isolate aus im Jahr 2008 beprobten Streichelgehegen .. 69
Tab. 6: Anzahl STEC Isolate nach verschiedenen Isolierungs-Methoden ............ 70
Tab. 7: Wiederfindungsrate des Virulenzgens stx1 in PCR 1 vs. PCR 2 .............. 73
Tab. 8: Wiederfindungsrate des Virulenzgens stx2 in PCR 1 vs. PCR 2 .............. 74
Tab. 9: Wiederfindungsrate von eae in PCR 1 vs. PCR 2 .................................... 74
Tab. 10: Anzahl positiver Zoos je Serogruppe und Tierart ..................................... 76
Tab. 11: Virulenzgenkombinationen der Serogruppen ........................................... 82
Tab. 12: Auftreten der Serogruppen in geographischer Abhängigkeit. ................... 85
Tab. 13: Übersicht zum Verlauf des STEC/EPEC-Nachweises in der ersten und
zweiten Beprobung in ausgewählten Gehegen. ....................................... 90
Tab. 14: Übersicht zur Wiederfindungsrate einzelner Serogruppen in den
Tierarten ................................................................................................... 92
Tab. 15: Statistische Auswertung der Fragebögen mit Hilfe des Fisher’s exact
test .......................................................................................................... 147
Tab. 16: Deskriptive Auswertung der Fragebögen ............................................... 151
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
μl Mikroliter
μM Mikromolar
A Adenin
APEC Aviär-pathogene Escherichia coli
Aqua bidest Aqua bidestillata
bp Basenpaare
C Cytosin
cDNA complementary DNA
cm Zentimeter
d Tag
DIN Deutsches Institut für Normung e.V.
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
dNTP Desoxynucleotidtriphosphat
eae (eae) Intimin (kursiv: Genbezeichnung)
EAEC Enteroaggregative Escherichia coli
E. coli Escherichia coli
EDEC Edema Disease Escherichia coli
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EHEC Enterohämorrhagische Escherichia coli
EIEC Enteroinvasive Escherichia coli
EPEC Enteropathogene Escherichia coli
espP Gen für Serinprotease
et al. (lat. et alli) und andere
etp Gencluster für Typ II- Sekretionssystem
evtl. eventuell
ExPEC extraintestinale pathogene Escherichia coli
FAE Follikel-assoziiertes Gewebe
g Gramm
Abkürzungsverzeichnis
G Guanin
GALT gut associated lymphoid tissue
Gb3 Globotriacylceramid-Rezeptor
GKZ Gesamtkeimzahl
GN gram-negativ
h Stunde
ha Hektar
HC Hämorrhagische Colitis
H-Antigene Geißel-Antigene
HlyA (hlyA) Hämolysin A (kursiv: Genbezeichnung)
HUS Hämorrhagisches Urämisches Syndrom
i.d.R. in der Regel
Ig Immunglobulin
IMS Immunomagnetische Separation
katP Gen für Katalase-Peroxidase
kb Kilobase(n)
KbE Kolonien bildende Einheiten
kDa Kilodalton
KOH Kalium-Hydroxid
LB lysogeny broth
LEE locus of enterocyte effacement
LFGB Lebensmittel- und Futtermittelgesetzbuch
LPS Lipopolysaccharide
mg Milligramm
min Minuten
ml Milliliter
mm Millimeter
mM Millimolar
MNEC Meningitis-assoziierte Escherichia coli
MRB modifizierte Rappaport-Bouillon
mRNA messenger Ribonukleinsäure
Abkürzungsverzeichnis
mTSB modifizierte Trypton-Soja-Bouillon
n absolute Zahl
ng Nanogramm
O-Antigene Oberflächenantigene
o.ä. oder Ähnliches
PBS phosphate buffered saline (Phosphatgepufferte
Kochsalzlösung)
PCR Polymerase chain reaction
(Polymerasekettenreaktion)
PLZ Postleitzahl
PSB peptone-sorbitol-bile
RKI Robert- Koch Institut
RNA Ribonukleinsäure
rRNA ribosomale Ribonukleinsäure
rpm revolutions per minute (Umdrehungen pro Minute)
RT reverse transcription
s Sekunde
SDS Sodiumdodecylsulfat
SF Sorbitol fermentierend
SMAC Sorbitol-MacConkey
sog. sogenannte(r)
ssp. Subspezies
STEC Shigatoxin-bildende Escherichia coli
Stx (stx) Shigatoxin (kursiv: Genbezeichnung)
T Thymin
TA Tierarzt
Taq Thermus aquaticus
TBA Tris-Bor-EDTA-Puffer
TSA Trypton-Soja-Agar
TSB Tryptone-Soja-Bouillon
TTP trombotisch-trombozytopenische Purpura
Abkürzungsverzeichnis
U Unit
u.a. unter anderem
UPEC Uropathogene Escherichia coli
Urea Harnstoff
Ure Urease
UV-Licht Ultraviolettes Licht
V Volt
v.a. vor allem
VTEC Verotoxin-bildende Escherichia coli
vWF von-Willebrand-Faktor
WHO World Health Organization
z.B. zum Beispiel
z.T. zum Teil
Einleitung 17
1 Einleitung
Escherichia coli ist Teil der natürlichen Mikroflora des Intestinaltraktes von Säugern
und Vögeln. Einige Stämme jedoch sind in der Lage, ernsthafte Erkrankungen in
Mensch und Tier auszulösen. Diese pathogenen Stämme werden in sechs
Pathogenitätsgruppen unterteilt, abhängig von ihren Virulenzeigenschaften.
Die 1977 erstmals von KONOWALCHUK et al. (1977) beschriebenen Shiga Toxin-
bildenden Escherichia coli (STEC) sind eine Gruppe davon. In Zusammenhang mit
menschlichen Erkrankungen wurden STEC erstmals 1983 von RILEY et al. (1983)
beschrieben, als 47 Personen bei einem Ausbruch in Oregon und Michigan an
hämorrhagischer Colitis erkrankten. Enterohämorrhagische Escherichia coli (EHEC)
stellen eine Untergruppe der STEC dar, welche in der Lage ist, aufgrund ihrer
Virulenzfaktoren hämorrhagische Colitis (HC) und das hämolytisch urämische
Syndrom (HUS) im Menschen hervorzurufen. Die meisten Ausbrüche sind mit der
Serogruppe O157 assoziiert, aber auch so genannte non-O157 Stämme wurden aus
an HUS Erkrankten isoliert (MELLMANN et al. 2008).
Infektionen mit EHEC/STEC erfolgen meist über kontaminierte Lebensmittel oder
durch Mensch zu Mensch Übertragungen (BOUDAILLIEZ et al. 1997). Vor allem
rohe oder ungenügend erhitzte Fleischprodukte von Wiederkäuern, wie Hack oder
Mett, und Rohmilchprodukte führen immer wieder zu EHEC-Ausbrüchen (RANGEL
et al. 2005). STEC wurde bereits in verschiedenen Haus- und Wildtieren
nachgewiesen, kleine und große Wiederkäuer jedoch stellen das
Erregerhauptreservoir da. WERBER et al. (2007) publizierten den Kontakt von
Kindern mit Wiederkäuern als prinzipielles Infektionsrisiko. In North Carolina, Florida
und Arizona (DEBROY u. ROBERTS 2006) sowie in den Niederlanden (HEUVELINK
et al. 2002) konnten Erkrankungen bei Kindern auf den Besuch im Streichelzoo, und
dem damit verbundenen Streicheln von kleinen Wiederkäuern, zurückgeführt
werden. In wieweit STEC in deutschen Streichelzoos verbreitet ist, ist nicht bekannt,
da repräsentative epidemiologische Untersuchungen zuvor noch nicht durchgeführt
wurden.
Ziel dieser vom Zoonoseverbund FBI-Zoo geförderten Arbeit war es, eine
flächendeckende, deutschlandweite Prävalenzerhebung von STEC in Streichelzoos
18 Einleitung
durchzuführen. Gleichzeitig wurde durch Erhebung eines Fragebogens versucht,
potentielle Faktoren, die ein vermehrtes STEC/EPEC-Vorkommen in deutschen
Streichelzos begünstigen und somit eine potenielle Übertragungsgefahr auf den
Menschen erhöhen könnten, zu eruieren.
Literatur 19
2 Literatur
2.1 Escherichia coli
2.1.1 Taxonomie
Escherichia coli aus der Familie der Enterobacteriaceae wurde 1885 erstmalig von
dem Kinderarzt Dr. Theodor Escherich aus dem Stuhl Neugeborener isoliert. Es
handelt sich um ein gramnegatives, fakultativ anaerobes Stäbchenbakterium,
welches zwischen 2,0-6,0 µm lang und 1,1-1,5 µm breit ist. Auf einfachem Columbia-
Schafblutagar wachsen E. coli in Form relativ großer (2-5 mm), grauer, feucht-
glänzender Kolonien mit glattem Rand (smooth-[S]-Form). Es kommen jedoch auch
Formen, die trockene Kolonien mit einem gezahnten Rand aufweisen (rough-[R]-
Form) oder schleimproduzierende Formen vor (ROLLE u. MAYR 2002). Alle E. coli
sind Oxidase negativ, Katalase positiv und in der Lage, Glukose unter Säurebildung
abzubauen. In der Regel können sie Laktose, Sorbitol und weiterhin Arabinose,
Maltose, Trehalose, Mannit und Glycerin verstoffwechseln. E. coli werden anhand
ihrer Oberflächen (O)-, Kapsel (K)- sowie Geißel (H)-Antigene nach einem
modifizierten Kaufmann-Schema in verschiedene Serovare eingeteilt. Mittlerweile
sind 181 verschiedenen O-Antigene bekannt. Die O-Antigene definieren die
Serogruppe, während die verschiedenen Kombinationen aus O- und H-Antigenen
den Serotyp eines E. coli Isolates festlegen (NATARO u. KAPER 1998). E. coli
Erreger sind gegenüber horizontalem Gentransfer sehr empfänglich, weshalb sie
eine große phänotypische und genetische Variabilität aufweisen.
2.1.2 Epidemiologie und Bedeutung
Escherichia coli treten als Kommensalen in der menschlichen und tierischen Flora
des hinteren Dünndarms sowie des Dickdarms (mit Ausnahme von
Meerschweinchen, Chinchillas und körnerfressenden Ziervögeln) auf und haben
neben der Beteiligung an Abbauprozessen auch in der Produktion von Vitaminen
ihre physiologische Aufgabe (ROLLE u. MAYR 2002). Davon abzugrenzen sind
Isolate, die aufgrund der Ausbildung verschiedener Faktoren als virulent angesehen
werden müssen. Bestimmte Serogruppen treten zwar gehäuft mit bestimmten
20 Literatur
klinischen Syndromen auf, jedoch ist nicht das serologisch reaktive Antigen per se
für die Virulenz des Isolates verantwortlich.
2.1.3 Pathogene Escherichia coli
Die Virulenz bestimmter E. coli-Isolate ist v.a. auf Endo-, Entero- und Cytotoxine
sowie Adhäsionsfaktoren zurückzuführen und nur Isolate mit bestimmten
Kombinationen von Virulenzfaktoren (Pathotyp) können persistieren und klinische
Erkrankungen auch in nicht vorgeschädigten Individuen auslösen. Dazu gehören
Pathotypen, welche Darm- und Durchfallerkrankungen, Harnwegsinfektionen sowie
Sepsis und Meningitis auslösen.
Bei den humanpathogenen Darm- und Durchfallerregern sind bisher sechs
Kategorien bekannt: Die enteropathogenen E. coli (EPEC), die
enterohämorrhagischen E. coli (EHEC), enterotoxische E. coli (ETEC),
enteroaggregative E. coli (EAEC) sowie enteroinvasive E. coli (EIEC) und diffus
adhärente E. coli (DAEC). E. coli-Pathotypen, welche mit extraintestinalen
Infektionen in Zusammenhang stehen, werden allgemein als ExPEC bezeichnet,
wovon uropathogene E. coli (UPEC) am frequentesten vorkommen. Immer häufiger
werden jedoch auch mit Sepsis und Meningitis assoziierte E. coli (MNEC)
diagnostiziert.
EPEC, ETEC und EHEC können nicht nur im Menschen, sondern auch in Tieren
klinisch apparente Infektionen auslösen, wobei vorrangig Jungtiere betroffen sind. Im
Einzelnen können bei Tieren die Colienteritis, die Colidiarrhoe sowie die
Coliseptikämie und die Ödemkrankheit der Schweine unterschieden werden.
Zusätzlich sind geflügelpathogene E. coli (APEC) bekannt, die v.a. bei Puten und
Hühnern zu Septikämien, Perikarditiden und primären Atemwegsinfektionen sowie
der Coligranulomatose führen können (KAPER et al. 2004).
Die Colienteritis wird durch enteropathogene E. coli (EPEC) und Shigatoxin-bildende
E. coli (STEC) durch das Anheften und Zerstören der Mikrovilli, sowie bei STEC
durch das Freisetzten von Toxinen ausgelöst. Es kommt zu schleimigen, evtl.
Blutbeimengungen aufweisenden, Durchfällen mit fibrinös-hämorrhagischer
Entzündung des Darms. Meist handelt es sich bei den STEC-Stämmen um die
Literatur 21
Serogruppe O118 (ERWIN DAHME u. EUGEN WEISS 2007). Auf STEC, eine
Gruppe, der die EHEC untergeordnet sind, wird später noch genauer eingegangen.
Die Colidiarrhoe tritt meist in den ersten Lebenswochen bei Kälbern, Lämmern und
Ferkeln auf und wird durch enterotoxische E. coli verursacht. Die ETEC exprimieren
Adhäsionsfaktoren, mit deren Hilfe sie sich an die Enterozyten anheften können. Des
Weiteren bilden sie sog. hitzelabile (LT) und/ oder hitzestabile (ST) Enterotoxine, die
zu einer sekretorischen Diarrhö führen (ERWIN DAHME u. EUGEN WEISS 2007;
ROLLE u. MAYR 2002).
Die Coliseptikämie kommt besonders bei Kälbern, Lämmern, Ferkeln, Fohlen und
Welpen in den ersten Lebenstagen vor. Durch bestehende Abwehrschwäche verläuft
die Infektion mit septikämischen E. coli-Stämmen (meist der Serogruppen O26, O86,
O115 und O78) akut oder perakut (ERWIN DAHME u. EUGEN WEISS 2007).
Die Ödemkrankheit der Schweine wird von einer eigenen Gruppe STEC-Stämmen
ausgelöst, die auch als EDEC (Edema Disease E. coli) bezeichnet wird und denen
die Bildung des Shigaoxin-Typs 2e (Stx 2e) sowie die Ausbildung adhäsiver F18
Fimbrien gemein ist. Das Stx 2e gelangt über die Darmschleimhaut in den
Blutkreislauf und schädigt die Endothelzellen der kleinen Arterien und Arteriolen, was
zur erhöhten Gefäßpermeabitität und schließlich zu Ödemen führt. Nicht selten
bilden sie zusätzlich zu Stx 2e auch α-Hämolysin und andere Enterotoxine. Die am
häufigsten mit diesem Krankheitsbild assoziierten Serogruppen sind O138, O139 und
O141 (ERWIN DAHME u. EUGEN WEISS 2007; ROLLE u. MAYR 2002).
2.2 STEC/VTEC und EHEC
Im Jahr 1977 beschrieben KONOWALCHUK et al. (1977) erstmals das Vorkommen
eines Toxins in cytotoxischen E. coli, welches Vero-Zellen in Kultur beeinflusste und
deshalb von ihm als Verotoxin bezeichnet wurde. O’BRIEN et al. zeigten, dass sich
Verotoxin mit Antitoxin gegen Shigella dysenteriae, Shigatoxin 1, neutralisieren lässt
(O'BRIEN et al. 1982) und schließlich publizierten O’BRIEN et al., dass beide Toxine
identisch sind (O'BRIEN u. LAVECK 1983). Demzufolge wird heutzutage in der
Nomenklatur STEC und VTEC synonym verwendet. STEC sind meldepflichtig nach
der Verordnung über meldepflichtige Tierkrankheiten.
22 Literatur
EHEC sind im Gegensatz zu STEC nicht direkt über das Vorliegen bestimmter
Virulenzgene definiert, vielmehr wird diese Untergruppe der STEC vorrangig durch
das im Menschen hervorgerufene Krankheitsbild definiert. Aufgrund der hohen
genetischen Variabiliät der E. coli Isolate empfiehlt das RKI auf nationaler Ebene
jedes STEC-Isolat als potentiellen EHEC anzusehen. Als EHEC definitiv bezeichnet
werden sollen jedoch nur Isolate, welche aus erkrankten Menschen isoliert wurden
(KARCH, persönliche Mitteilung). Die infektiöse Dosis von STEC/EHEC für den
Menschen ist extrem gering und liegt bei 10-100 Bakterien (KAPER et al. 2004).
EHEC sind nach §7 Infektionsschutzgesetz meldepflichtig.
2.2.1 Virulenzfaktoren
In den Untersuchungen der letzten Jahre zur Virulenz von STEC wurde das
Augenmerk vermehrt auf die Kombination von Virulenzgenen und Mechanismen
gelegt, die ein STEC-Isolat zu einem hochpathogenen, humanen EHEC-Isolat
machen. Unbestritten bleibt, dass die Produktion von Shigatoxinen zwar essentiell
ist, nicht aber allein für die Virulenz verantwortlich gemacht werden kann. Eine große
Anzahl weiterer Virulenzfaktoren wurde beschrieben; die meisten von ihnen sind auf
mobilen genetischen Elementen, wie z.B. Plasmiden, Pathogenitätsinseln oder
temperenten lambdoiden Phagen kodiert (CAPRIOLI et al. 2005).
2.2.1.1 Shigatoxine
Zur Familie der Shigatoxine gehören die beiden nicht immunologisch kreuzreaktiven
Hauptgruppen Shigatoxin 1 (Stx 1) und Shigatoxin 2 (Stx 2), deren Strukturgene im
ca. 60 kb großen Genom lambdoider Phagen, lokalisiert liegen. Stx 1 ist zu 98%
identisch mit dem von S. dysenteriae produzierten Toxin, während Stx 2 nur zu 55%
Homologie zeigt. Während Stx 1 nur geringe Sequenzvariationen aufweist, wurden
von Stx 2 bereits die Varianten Stx 2c, Stx 2d, Stx 2e sowie Stx 2f mit jeweils
modifizierten antigenetischen oder biologischen Eigenschaften beschrieben. So ist
z.B. bekannt, dass Stx 2 und Stx 2c vermehrt von Isolaten produziert werden, welche
aus HUS-Patienten stammen (KARCH 2001). Stx 2e und Stx 2f hingegen werden
häufig von Tierisolaten gebildet, welche in diesen Fällen für den Menschen selten
pathogen sind. In der Pathogenese der Ödemkrankheit der Schweine spielt Stx 2e
Literatur 23
eine wichtige Rolle, Stx 2f-produzierende Isolate stammen meist vom Geflügel
(CAPRIOLI et al. 2005).
Die Shigatoxine zählen zu den Ribosomen-inaktivierenden Proteinen und bestehen
aus einer A- und einer B-Untereinheit. Die 32 kDa große A-Untereinheit besteht aus
einem 28 kDa großen A1-Peptid und einem 4 kDa großen A2-Peptid, welche über
eine Disulfidbrücke verbunden sind. Das A1-Peptid besitzt enzymatische Aktivität,
während das A2-Peptid für die Bindung an die B-Untereinheit zuständig ist. Die B-
Untereinheit besteht aus einem Pentamer von fünf identischen, 7,7 kDa großen
Einheiten und bindet das Toxin an den Globotriasylceramid-Rezeptor (Gb3) auf
eukariotischen Zelloberflächen. Das Holotoxin wird über Endocytose in die Zelle
geschleust und verhindert dort die Proteinbiosynthese der Zelle, was schließlich zu
deren Tod führt (FRIEDRICH 2002).
2.2.1.2 EHEC-Hämolysin
Aus pathogener Sicht für den Menschen am bedeutendsten ist die O157-
Serogruppe. Fast alle EHEC O157-Stämme besitzen ein großes Virulenzplasmid
(pO157) von 90 kb, auf dem die unterschiedlichsten zusätzlichen Virulenzfaktoren
lokalisiert sind. Unter anderem trägt es das EHEC hly Gen für das EHEC-Hämolysin,
das katP Gen für eine bifunktionelle Katalase-Peroxidase (BRUNDER et al. 1996),
das espP Gen kodierend für eine Serinprotease und das etp Gencluster, welches für
ein Typ-II-Sekretionssystem kodiert (KARCH 2001). Im Gegensatz zu dem
Virulenzplasmid der O157:H7-Stämme besitzen jene der non-O157-Stämme meist
nicht das komplette Spektrum an Virulenzgenen (KARCH 2001).
Bei dem EHEC-Hämolysin handelt es sich um ein 107 kDa großes porenbildendes
Zytotoxin der RTX-Familie (repeats in toxin), das im Wildtyp sowohl frei als auch
zellassoziiert vorkommt (KARCH et al. 1996a). Seine definitive Rolle in der
Pahogenese von EHEC-Infektionen ist noch nicht ganz geklärt. Es ist jedoch
denkbar, dass durch die Lyse der Erythrozyten in vivo Hämoglobin freigesetzt wird
und E. coli als Eisenquelle dient und somit wachstumsfördernd auf diese wirkt.
Ebenso kann das Toxin bovine Leukozyten lysieren, jedoch nicht humane (NATARO
u. KAPER 1998).
24 Literatur
2.2.1.3 EAST1
Bei EAST1 handelt es sich um ein Toxin, welches erstmals in einem
enteroaggregativen E. coli-Stamm (EAEC) eines an Diarrhö erkrankten Kindes
entdeckt wurde (SAVARINO et al. 1991). Mittlerweile wurde EAST1 jedoch auch in
anderen pathogenen E. coli wie EHEC, EPEC, DAEC oder ETEC und in Salmonellen
gefunden. Auch in Nutztieren, v.a. in Schweinen und Rindern konnten EAST1-
positive Isolate bereits detektiert werden. Das kodierende Gen astA liegt entweder
direkt im Bakterienchromosom oder auf einem Plasmid, häufig in mehreren Kopien.
EAST1 ist ein 4,1 kDa großes Molekül, das aus 38 Aminosäuren besteht (VEILLEUX
u. DUBREUIL 2006). Das hitzestabile Toxin EAST1 weißt 50% Identität mit der
enterotoxischen Dömane des hitzestabilen Toxins STa auf, jedoch sind die beiden
Toxine immunologisch gesehen verschieden (SAVARINO et al. 1991). Welche Rolle
EAST1 in der Pathogenese von EHEC-Infektionen spielt ist noch nicht geklärt,
allerdings ist es möglich, dass nichtblutige Durchfallerkrankungen, wie sie bei einigen
EHEC-Patienten auftreten, durch EAST1 bedingt sind (NATARO u. KAPER 1998).
2.2.1.4 Adhäsionsfaktoren
Für die Adhärenz von EHEC an das Darmepithel sind zahlreiche Faktoren mit ihren
zuständigen Genen beschrieben. Am besten untersucht und in fast allen EHEC-
Stämmen vorkommend ist die 43 kb große Pathogenitätsinsel LEE (locus of
enterocyte effacement). Durch die auf ihr kodierten Proteine sind EHEC in der Lage
sich sehr fest an die Darmepithelzellen anzuheften und dort typische A/E-Läsionen
(„attaching and effacing“) zu verursachen. Die A/E-Läsionen sind durch
zytoskelettalen Umbau, der Zerstörung der Mikrovilli und einer engen Bindung
zwischen Bakterium und Epithelzellmembran gekennzeichnet (CAPRIOLI et al.
2005). Der LEE besitzt drei funktionale Regionen. Auf der ersten Region sind Gene
für ein Typ-III-Sekretionssystem lokalisiert. Die mittlere Region beherbergt das eae-
Gen. Das eae-Gen kodiert für das 94 bis 97 kDa große Außenmembranprotein
Intimin, welches den EHEC zur Adhärenz dient. Gleichzeitig ist auf diesem
funktionalen Modul das tir-Gen lokalisiert, welches den Translokationsrezeptor für
Intimin (Tir) stellt. Der Rezeptor wird über das Typ-III-Sekretionssystem in die
Literatur 25
Plasmamembran der Zielzelle verbracht, so dass das Intimin daran binden kann. Das
dritte funktionelle Modul codiert für die Sekretionsproteine EspA, EspB und EspD,
welche Teil des Typ-III-Sekretionssystems sind (CAPRIOLI et al. 2005; KARCH
2001).
2.2.2 Nachweis von STEC
Zum Nachweis von STEC stehen heutzutage kulturelle, molekularbiologische und
immunologische Verfahren mit etlichen Vor- und Nachteilen zur Verfügung, von
denen nachfolgend nur einige wichtige exemplarisch erwähnt werden. Während man
nach bekannt werden des ersten EHEC-Ausbruches primär die Diagnostik von
O157-Serovaren vorantrieb, ist man mittlerweile daran interessiert, eine praktikable
Serovar-übergreifende Diagnostikmethode zu etablieren. Dies jedoch erschwert
einen traditionell kulturellen Nachweis, da STEC eine hohe biochemische Ähnlichkeit
zur physiologischen Darmflora aufweisen und sowohl in klinisch Erkrankten wie auch
in Reservoirwirten nur einen kleinen Anteil der vorhandenen E. coli ausmachen
(1/300 Bakterien) (KARCH et al. 1996a). Somit stößt auch der Einsatz von
Selektivmedien aufgrund des starken Überwiegens der Begleitflora in Stuhl- und
Kotproben an Grenzen.
2.2.2.1 Direkter Erregernachweis
Eine beliebte Diagnostikmethode, die i.d.R. zum Nachweis von O157:H7 genutzt wird
stützt sich auf die Tatsache, dass dieser Serotyp im Gegensatz zu 95% der
physiologischen E. coli-Flora kein Sorbit verstoffwechseln kann. So wachsen Sorbitol
negative STEC-Stämme auf dem altbewährten Sorbitol-McConkey-Agar, der als
einzige Kohlenhydratquelle Sorbit enthält, als farblose bis graue Kolonien, während
Sorbitol positive Stämme als pink-farbene Kolonien erscheinen. Um die Spezifität
des Nährmediums zu steigern werden diesem häufig zusätzlich Antibiotika, wie z.B.
Cefixim und Tellurit zugesetzt, welche das Wachstum der Begleitflora hemmen
(ZADIK et al. 1993). Allerdings sind mittlerweile eine große Anzahl an
sorbitfermentierenden STEC-Serovare bekannt, welche sich auf dem beschriebenen
Nährmedium von komensaler Darmflora nicht unterscheiden, was die kulturelle
26 Literatur
Identifikation solcher Stämme auf diesem Nährboden unmöglich macht (KARCH et
al. 1996a).
Eine Alternative stellt der Enterohämolysin-Agar dar, bei dem man sich die
Ausprägung des enterohämolytischen Phänotyps zu Nutze macht. Die meisten non-
O157-STEC-Stämme hämolysieren, ebenso wie das Serovar O157:H7, gewaschene
Schaf- oder Humanerythrozyten in Abhängigkeit von Calcium und bilden auf dem
Enterohämolysin-Agar eine inkomplette Hämolysezone um die Bakterienkolonie. Da
laut BETTELHEIM (1995) und BEUTIN (1989) eine enge Assoziation zwischen
Shigatoxin- und Enterohämolysinproduktion besteht, sieht BETTELHEIM in dem
Enterohämolysin-Agar eine adäquate Diagnostikmethode zur Identifizierung von
STEC-Isolaten. Allerdings prägt nur jedes vierte EHEC-Isolat den hämolytischen
Phänotyp aus, die anderen sind oft Träger des sog. „stillen“ EHEC-Hämolysin Gens
und zeigen auf dem Enterohämolysin-Agar deshalb keine Hämolysezone. Sie
entziehen sich somit der Detektion (KARCH et al. 1996a).
Des Weiteren stehen heutzutage sog. chromogene Nährmedien zur Verfügung, die
neben Sorbit chromogene Substrate für ß-D-Glucuronidase und/oder ß-D-
Galactosidase als Marker einsetzten. Allerdings sind diese Nährmedien sehr teuer,
was den Einsatz beschränkt.
2.2.2.2 Immunomagnetische Separation (IMS)
Bei der immunomagnetische Separation (IMS) handelt es sich eher um eine
Anreicherungsmethode als um ein Nachweisverfahren. Für die IMS werden
magnetische Partikel, die mit Antikörper gegen spezifische Oberflächenantigene
behaftet sind, sog. immunomagnetische Beads, eingesetzt. Diese Beads binden an
das entsprechende O-Antigen und lassen sich durch Anlegen eines magnetischen
Feldes separieren. Durch mehrmaliges Waschen werden begleitende Keime entfernt.
Mit dem sehr sensitiven Verfahren ist es möglich 100 EHEC pro Gramm Stuhl in
Gegenwart von 107 nicht enterohämorrhagischen E. coli zu detektieren. Jedoch kann
man auch mit dieser Methode keine EHEC-Reinkultur gewinnen, so dass der Einsatz
eines Selektivmediums auch hier nicht ausbleibt (KARCH et al. 1996a; KARCH et al.
1996b). Waren bis vor kurzem nur immunomagnetische Beads für
Literatur 27
Oberflächenantigene der O157-Serogruppe kommerziell erhältlich, so sind
mittlerweile auch Beads für die Serovare O111, O145, O26 und O103 im Handel.
2.2.2.3 Toxinnachweis
Die Bildung von Shigatoxinen ist allen STEC gemein, weshalb der Toxin- bzw. der
Toxingennachweis von größtem diagnostischem Interesse ist. Ziel ist es deshalb,
eine Erregerisolierung kombiniert mit einem Toxin- und/ oder Toxingennachweis zu
liefern (www.rki.de, Informationsblätter für Ärzte). Zur Detektion von Shigatoxin bzw.
stx stehen folgende gut etablierte Methoden zu Verfügung:
Verozelltoxizitätstest: Verozellen werden hierbei mit dem Kulturüberstand
überschichtet und nach ca. 48-72 h Inkubation die cytotoxischen Effekte an den
Verozellen beurteilt. Der Test ist in Kombination mit einem Neutralisationstest sehr
sensitiv und spezifisch, allerdings auch sehr zeitintensiv (FRIEDRICH et al. 2002).
Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)/ Enzymimmunoassay (EIA): ELISA-
oder EIA-Testsysteme sind in großer Variation kommerziell erhältlich. Sie sind
schnell und einfach anzuwenden und weisen in Kombination mit anderen
Screeningverfahren (PCR, Verozelltoxizitätstest) oder einem kulturellen Nachweis
eine ausreichende Sensitivität und Spezifität auf. Die meisten erhältlichen
Testsysteme arbeiten mit zwei monoklonalen Stx-Antikörpern. Der erste ist fest auf
dem Testsystem fixiert, an ihm bindet das Antigen. Der zweite Antikörper ist mit
einem Enzym (Meerrettich-Peroxidase oder Alkalische Phosphatase) gekoppelt, was
nach Bindung mit dem Antigen und nach Zugabe eines spezifischen Substrates zu
einer Farbreaktion führt. Die Toxine Stx 1 und Stx 2 können von den meisten
Testsystemen getrennt voneinander nachgewiesen werden.
Colonyblot: Der Colonyblot eignet sich sowohl zum Toxingen-Nachweis als auch
gleichzeitig zum Erregernachweis. Mittels einer Shigatoxin-spezifischen Gensonde
kann auf Nitrocellulosemembran gebundene, stx-tragende Bakterien-DNA sichtbar
gemacht werden. Dies geschieht durch radioaktive Markierung oder enzymatische
Reaktionen (HULL et al. 1993; KARCH H. et al. 1986). Die als stx-positiv
identifizierten Kolonien können von der geblotteten Agarplatte isoliert werden. Das
Verfahren ist sensitiv, jedoch auch recht zeitintensiv und deshalb für die
Routinediagnostik nur bedingt geeignet.
28 Literatur
Polymerase-Kettenreaktion (PCR): Die PCR ist eine weitverbreitete, nicht nur in der
STEC-Diagnostik genutzte Methode, die in den meisten Diagnostiklaboren
routinemäßig eingesetzt wird. Ebenso wie der ELISA oder EIA kann die PCR zur
Serovar- unabhängigen Toxingen-Diagnostik eingesetzt werden. Diverse Protokolle
wurden zu diesem Zweck bereits etabliert (FRANCK et al. 1998a; MONDAY et al.
2007; PATON u. PATON 1998; WANG et al. 2002).
Da die EHEC/STEC-Diagnostik bundesweit nicht einheitlich geregelt ist, wurde im
Jahre 2000 ein sog. Stufenplan der EHEC-Diagnostik vom Arbeitskreis „EHEC“ des
Robert-Koch Instituts (RKI), dem Bundesinstitut für gesundheitlichen
Verbraucherschutz und Veterinärmedizin (BgVV) mit Unterstützung der Fachgruppe
„Gastrointestinale Infektionen“ der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und
Mikrobiologie (DGHM) entwickelt (FRUTH et al. 2000). Der Plan sieht folgende drei
Diagnostikstufen vor:
Stufe 1: Screening auf Shigatoxinbildner durch Anreicherung der Probe in einem
EHEC-Direktmedium mit anschließendem Toxinnachweiß mittels ELISA. Im positiven
Fall wird eine Verdachtsdiagnose an das zuständige Gesundheitsamt gestellt und
Stufe 2 des Plans wird eingeleitet.
Stufe 2: Isolierung und Charakterisierung der EHEC-Bakterien. Der ELISA-Befund
wird durch PCR bestätigt und durch einen Colony-Immunoblot wird das
entsprechende Agens isoliert. Eine Serotypisierung folgt.
Stufe 3: Typisierung der Erregerisolate zu epidemiologischen Zwecken durch
Lysotypie, Bestimmung des Pulsefeld-Gelelektrophoresemusters, Bestimmung
weiterer Virulenzfaktoren oder Antibiotikaresistenzbestimmungen etc.
2.2.3 Epidemiologie von STEC/EHEC beim Menschen
Aufmerksam auf STEC/EHEC beim Menschen wurde man erstmals 1982 während
eines Ausbruches in Oregon und Michigan, USA, als 47 Menschen nach einem
Besuch in einer Fastfoodkette an abdominalen Krämpfen, anfänglich wässriger und
später blutiger Diarrhö litten. Aus ihren Stühlen konnten Shigatoxin-produzierende E.
coli des Serotyps O157:H7, der EHEC-Prototyp, isoliert werden (RILEY et al. 1983).
Seitdem werden immer wieder Ausbrüche mit diesem Zoonoseerreger verzeichnet.
E. coli O157:H7 ist deutschlandweit mit fast 50% der am häufigsten ursächlich mit
Literatur 29
der Erkrankung Hämolytisch urämisches Syndrom (HUS) assoziierte Serotyp (Gerber
et al. 2002; Karch et al. 2005). In den USA ist dieser Serotyp laut Untersuchungen
sogar an ca. 95% der HUS-Fälle beteiligt (Karch et al. 2005). O157:H7 ist mittlerweile
weltweit Ursache für diverse EHEC-Ausbrüche v.a. in Industrieländern wie
Nordamerika, Japan und Europa. Einer der bisher größten war der von FUKUSHIMA
et al. (1999) in Sakai City beschriebene Fall, bei dem es zu über 12.000 erkrankten
Schulkindern kam.
Der neuste und bisher schwerste EHEC-Ausbruch in Deutschland wurde im Frühjahr
2011 verzeichnet. Von Mai bis Juli wurden insgesamt 3842 offizielle Erkrankungsfälle
gemeldet, die mit dem EHEC-Serotyp O104:H4 in Verbindung standen, wobei 2987
Fälle akuter Gastroenteritis sowie 855 HUS-Fälle dokumentiert wurden. Gemessen
an den HUS-Erkrankungszahlen handelt es sich um den bisher größten Ausbruch
weltweit. Anders als bei den bisherigen Ausbrüchen waren v.a. Erwachsene,
darunter vermehrt Frauen betroffen. Die Mortalität der HUS-Erkrankten betrug 4,1%
(35), die der Gastroenteritis-Erkrankten 0,6% (18). Der Ausbruch fand v.a. in den
nördlichsten fünf Bundesländern Deutschlands statt, obwohl Infektionen aus allen
Bundesländern berichtet wurden. Als Infektionsvehikel konnten
Bockshornkleesprossen aus einem Betrieb in Niedersachsen identifiziert werden
(RKI EHEC-ABSCHLUSSBERICHT 2011).
In den meisten Fällen sind die Infektionen nahrungsmittelassoziiert, wobei
Rindfleischprodukte, insbesondere unzureichend erhitztes Hack und Mett, im
Fordergrund stehen (GRIFFIN u. TAUXE 1991a). Ausbrüche wurden allerdings auch
durch Rohmilch und Rohmilchprodukte, Kopfsalat, Kartoffeln und unpasteurisierten
Apfelsaft verursacht (ARMSTRONG et al. 1996; CODY et al. 1999). Im Jahr 1994
erkrankten 20 Menschen in Washington und Kalifornien nach dem Verzehr von
geräucherter, vorgeschnittener Salami, woraufhin E. coli O157:H7 aus zwei der
Charge entnommenen Salamiproben isoliert werden konnte. Untersuchungen
zeigten, dass der Räuchervorgang zwar die Vermehrung von EHEC in der Salami
verhindert, die vorhandenen Mikroorganismen jedoch nicht abgetötet werden
(ALEXANDER 1995). Der größte mit Trinkwasser in Verbindung stehende Ausbruch
ereignete sich im Jahr 2000 in Kanada. Etwa 2300 Menschen infizierten sich mit
30 Literatur
O157:H7 verseuchtem Wasser, wovon sieben starben (HOLME 2003). Auch hier ist
bekannt, dass E. coli O157:H7 nach einer 12-wöchigen Wasserpassage lediglich
seine Kultivierbarkeit, jedoch nicht seine Infektiösität verliert (KARCH et al. 1999).
Der bis 2011 größte europäische Ausbruch ereignete sich 1996 in Schottland, bei
dem 20 Menschen starben, nachdem sie alle Fleisch aus derselben Fleischerei
konsumiert hatten (DUNDAS et al. 2001). BOUDAILLIEZ et al. (1997) beschrieben
die zwischenmenschliche Infektion durch klassische Schmierinfektionen bei einem
O111-EHEC-Stamm als durchaus ernstzunehmendes, potentielles Risiko.
Obwohl die meisten EHEC-Ausbrüche mit den genannten Risikofaktoren in
Verbindung stehen und schlussendlich darauf zurückzuführen sind, treten bis zu 80%
der diagnostizierten O157-STEC-Infektionen sporadisch. In einer Fall-Kontrollstudie
untersuchten WERBER et al. (2007) neben kontaminierten Lebensmitteln weitere,
mögliche Infektionsquellen, die mit sporadischen EHEC-Infektionen im Menschen in
Zusammenhang stehen. Sie kamen zu dem Schluss, dass sowohl Risikofaktoren als
auch die Verteilung der Serotypen abhängig von der Altersgruppe differieren. So
stellen der Verzehr von Rohmilch und das Spielen im Sandkasten ebenso wie das
Streicheln von großen und kleinen Wiederkäuern bei Kindern unter drei Jahren ein
erhöhtes Risiko dar, wohingegen sich bei Kindern zwischen drei und neun Jahren
eine Korrelation zwischen Erkrankung und Schwimmen in nicht gechlortem Wasser
(Teich, See, privater Swimmingpool) zeigte. Bei Kindern ab zehn Jahren konnte der
Konsum von Lammfleisch und Streichmettwurst als hauptsächlicher Risikofaktor
identifiziert werden (WERBER et al. 2007). O’BRIEN et al. (2001) befragten in einer
englischen Fall-Kontrollstudie 369 Patienten nach ihren Expositionen im Beruf,
Haushalt und Freizeit in den letzten fünf Tagen vor ihrer EHEC-Erkrankung. Sie
kamen zu dem Ergebnis, dass die Gefahr einer STEC-O157-Infektion signifikant
höher war, wenn die Patienten Kontakt zu landwirtschaftlicher Umgebung, mit oder
ohne Tierkontakt, hatten.
Bei E. coli O157:H7 handelt es sich um jenen Serotypen, der am häufigsten mit
schweren Erkrankungen in Verbindung steht, inzwischen jedoch sind eine Vielzahl
weiterer Serogruppen bekannt, welche aufgrund ihrer Virulenzfaktoren zu
pathogenen Veränderungen beim Menschen führen. Die große Variabilität der
Literatur 31
STEC-Serovare, welche in Europa mit Erkrankungen assoziiert sind, konnte in
anderen Kontinenten und Gebieten bisher nicht nachgewiesen werden. Zirka 80%
der durchfallassoziierten STEC gehören sog. non-O157 Serogruppen an,
hauptsächlich O26, O103, O111, O113 und O145. Der O26:H11/ NM-Serotyp ist
nach O157 derjenige in Europa, welcher am häufigsten in Verbindung mit
Erkrankungen nachgewiesen wird. Eine Studie in Deutschland zeigte, dass rund 1/7
aller EHEC-Isolate, welche von HUS-Patienten isoliert werden, diesem Serotyp
angehören (GERBER et al. 2002). Bei der zweithäufigsten non-O157 EHEC
Serogruppe handelt es sich in Deutschland um die O145-Serogruppe. Zusammen
mit EHEC O26 waren diese beiden Serogruppen in den Jahren 1997-2005 für rund
88% der HUS-Fälle in Deutschland verantwortlich (Stand 2005). Die Rolle der non-
O157-Stämme wird jedoch wahrscheinlich immer noch unterschätzt, da die meisten
Labore routinemäßig nicht auf non-O157 Serogruppen untersuchen und auch
sorbitolfermentierende Isolate (wie z.B. SF EHEC O157:NM) auf Sorbitol-McConkey-
Selektivagar selten oder gar nicht diagnostiziert werden (KARCH et al. 1999).
2.2.4 EHEC-Erkrankungen beim Menschen
In den letzten 30 Jahren konnten sich EHEC weltweit und kontinuierlich ausbreiten
und treten mittlerweile nach Salmonellen, Campylobacter und Yersinien als
vierthäufigster bakterieller Enteritiserreger in Erscheinung
(http://www3.rki.de/SurvStat/QueryForm.aspx, letzter Zugriff 30.03.2013). Oft
verlaufen EHEC-Infektionen asymptomatisch und unbemerkt, nicht selten jedoch
sind sog. YOPIs (young, old, pregnant, immunosuppressed), d.h. junge, alte,
schwangere sowie immunsupprimierte Menschen von intestinalen und
extraintestinalen Folgekomplikationen betroffen. Das Krankheitsbild entwickelt sich
nach einer Inkubationszeit von 3-4 Tagen, abhängig von der Infektionsdosis (KARCH
et al. 2005).
2.2.4.1 Hämorrhagische Colitis (HC)
Die HC ist eine Dickdarmentzündung mit zunächst wässriger, später wässrig-blutiger
Diarrhö, die bei 20% der infizierten Kinder und der infizierten über 65-Jährigen auftritt
und als Risikofaktor für weitere Komplikationen gilt. Sie ist neben der Diarrhö durch
32 Literatur
abdominale Krämpfe, Übelkeit, Erbrechen und Fieber gekennzeichnet (KARMALI
1989).
2.2.4.2 Hämolytisch-Urämisches Syndrom (HUS)
Das HUS ist eine extraintestinale Folgekomplikation der HC, die sich bei 5-10% der
manifest Erkrankten entwickelt. Die Inzidenz liegt in Deutschland und Österreich
zwischen 0,7 bis 1,0/100.000 Kinder unter 15 Jahren. In Argentinien liegt diese bei
über 20/100.000. Erfahrungsgemäß treten die meisten HUS-Fälle bei Kindern
zwischen dem ersten und fünften Lebensjahr auf, obwohl die Erkrankung generell
jede Altersgruppe betreffen kann (ZIMMERHACKL et al. 2002).
Das sich zunächst bessernde klinische Erscheinungsbild der anfänglichen Diarrhö
entwickelt sich bei einem kompletten HUS binnen einer Woche zu einem
Symptomtrias, welcher aus einer hämolytischen Anämie, akutem Nierenversagen
und einer Thrombozytopenie besteht (TARR et al. 2005). Die Letalität liegt bei 1-3%,
zwei Drittel der Erkrankten werden dialysepflichtig und bei bis zu 50% kommt es
noch nach 10 bis 15 Jahren zu Folgeerkrankungen wie z.B. chronischer
Niereninsuffizienz, arterieller Hypertonie oder Proteinurie. Neben dem kompletten
HUS werden auch inkomplette Verläufe in Form von isolierter hämolytischer Anämie
mit Pankreatitis oder nicht selten zentralnervösen Störungen als Folge gesehen
(ZIMMERHACKL et al. 2002).
Hauptauslösender Faktor für das HUS sind die von STEC gebildeten Shigatoxine.
Über die Darmwandbarriere gelangen sie in den Blutstrom und mit diesem
schließlich zur Niere. Shigatoxine binden an Glykosphingolipid-Rezeptoren der
Zielzelle, in erster Linie an Globotriaosylzeramid (Gb3), welches in
Nierenendothelzellen besonders präsent ist und hemmen somit die
Proteinbiosynthese der Zelle. Die Endothelzellen werden geschädigt und der von-
Willebrand-Faktor (vWF) wird freigesetzt, was zur Aktivierung der
Gerinnungskaskade führt. Zusammen mit der Endothelschädigung und Freilegung
der Basalmembran werden Thrombozyten verbraucht und es kommt zu einer
generalisierten Thrombozytopenie. Durch das lokale Wirken der Toxine an den
Nierenepithelzellen werden diese ebenfalls zerstört, wodurch es zu tubulären
Nekrosen und somit zu einer eingeschränkten Nierenfunktion kommt.
Literatur 33
2.2.4.3 Thrombotisch-thrombozytopenische Purpura (TTP)
Die TTP, nach ihrem Erstbeschreiber auch Morbus Moschkowitz genannt, weist
klinisch sehr viele Gemeinsamkeiten mit dem HUS auf. In beiden Fällen handelt es
sich um eine mikrovaskuläre Störung aufgrund von Thrombozytenaggregationen,
welche jedoch mit großer Wahrscheinlichkeit auf unterschiedlichen pathologischen
Auslösern beruht. Bei der thrombotisch-thrombozytopenischen Purpura aggregiert
freigesetzter von-Willebrand-Faktor. Der für die Proteolyse zuständige „vWF-
cleavage factor“ wird allerdings durch Antikörper gehemmt, so dass es zur lokalen
Thrombenbildung kommt (FURLAN et al. 1998). Die beschriebene Symptomtrias
besteht aus einer Thrombozytopenie und damit verbundenen Hautpetechien sowie
durch die mechanische Schädigung und Zerstörung der Erythrozyten aus einer
Anämie. Im Gegensatz zum HUS sind von der TTP häufiger Erwachsene betroffen,
deren Krankheitsbild von neurologischen Dysfunktionen (z.B. Ausfälle der Motorik,
Sensibilität, des Bewusstseins, der Sprache sowie der Sehkraft) dominiert wird.
Trotzdem treten immer wieder Formen der TTP auf, bei denen es zu
schwerwiegenden Nierenproblematiken kommt und gleichzeitig werden auch immer
wieder Formen des HUS mit extrarenalen Komplikationen beschrieben, weshalb eine
exakte Trennung der Syndrome oft schwer ist (GRIFFIN u. TAUXE 1991b).
2.2.5 Epidemiologie von STEC bei Tieren
Shigatoxin-produzierende Escherichia coli wurden bereits in vielen unserer Haus-
und Wildtiere, sowie in deren Produkten nachgewiesen. Untersuchungen zu
Übertragungswegen und den Ursachen menschlicher Infektionen mit STEC haben
gezeigt, dass eine Übertragung auf den Menschen durch Kontakt zu Tieren und
deren Umwelt möglich ist (HEUVELINK et al. 2002; O'BRIEN et al. 2001). Als
wichtigste Infektionsquelle werden große und kleine Wiederkäuer angesehen, welche
in großer Zahl asymptomatische Ausscheider sind (BLANCO et al. 2003b; ORDEN et
al. 2003). Die Zahl von STEC in Wiederkäuerexkrementen variiert unter Umständen
abhängig vom Alter der Tiere. In Infektionsversuchen mit O157 konnte gezeigt
werden, dass die Ausscheidungsrate bei Kälbern höher und länger andauernd war
als in erwachsenen Rindern und dass die Ausscheidungsrate nach dem Absetzen
34 Literatur
überwiegend anstieg (CRAY, JR. u. MOON 1995). Die Prävalenz von STEC in
Rindern ist ebenso abhängig von der Jahreszeit. Höhere Ausscheidungsraten
wurden in den warmen Sommermonaten verzeichnet, ebenso wie höhere
Erkrankungsraten beim Menschen (CHAPMAN et al. 1997). Prävalenzstudien über
das Vorkommen von STEC in europäischen Rinderbständen sprechen von bis zu
83% positiv getesteter Herden. Die dabei am häufigsten isolierten Serovare waren
O8, O20, O22, O77, O113, O126 und O162 (CAPRIOLI et al. 2005). BEUTIN et al.
veröffentlichten 1993 eine Studie über die Prävalenz von STEC rund um Berlin in
sieben verschiedenen, gesunden Haustierarten. Von 720 Tieren waren 208 (28,9%)
STEC positiv, das entsprach 66% der untersuchten Schafe, 56,1% der Ziegen,
21,1% der Rinder, 7,5% der Schweine sowie 13,8% der Katzen, 4,8% der Hunde und
<0,7% der Hühner (BEUTIN et al. 1993). In einer Veröffentlichung aus dem Jahre
2000 sprechen ZSCHOCK et al. (2000) von einer STEC-Prävalenz in Hessen von
18,0% bei Rindern, 32,1% bei Schafen und 75,3% bei Ziegen (ZSCHOCK et al.
2000). Eine Prävalenzstudie von OPORTO et al. (2008) in Nordspanien an 345
Viehherden (17 Schweineherden, 122 Milchschafherden, 124 Mastrinderherden und
82 Milchkuhherden) ergab eine Prävalenz des Serotyps O157:H7 von 8,7% der
Schafherden, 7,0% der Milchkuhherden sowie 1,6% der Mastrinderherden. Das
Vorkommen von non-O157 STEC-Stämmen war vergleichbar mit den Ergebnissen
von ZSCHOCK et al. (in Schafherden 50,8%, in Milchkuhherden 20,7%, in
Mastrinderherden 46,0%). Bei den Schweinen konnten weder O157:H7 positive noch
non-O157 positive Herden identifiziert werden. Um die Präsenz von Shigatoxin-
produzierenden E. coli in Legehennen zu evaluieren, untersuchten DIPINETO et al.
(2006) vier intensiv geführte Legehennenbetriebe in Süditalien. Zwischen November
2004 und November 2005 wurden die Betriebe dreimal beprobt und 720 Proben mit
Hilfe der immunomagnetischen Separation und einer Multiplex-PCR auf STEC
untersucht. Von den 720 untersuchten Proben waren lediglich 26 (3,6%) positiv,
welche aus 50% der Betriebe (2 von 4) stammten. Dennoch sehen DIPINETO et al.
in Hühnern eine neue potentielle Quelle für EHEC-Übertragungen auf den
Menschen. In einem Infektionsversuch konnten SCHOENI und DOYLE (1994) die
Langzeitkolonisation und Langzeitausscheidung von O157:H7 in Hühnern zeigen,
Literatur 35
sowie die Kontamination der Eierschalen mit O157:H7 belegen. Dementsprechend
gehen auch diese Autoren davon aus, dass Hühner möglicherweise neue Überträger
dieses Humanpathogens sein könnten. HOGG und Kollegen (2009) beschrieben in
einem Fallbericht STEC-Übertragungen von Hunden auf Menschen, nachdem diese
mit den Hunden intensiven Kontakt hatten. Aus ihren Stühlen konnten nicht-
sorbitolfermentierende STEC der Seroguppe O157 isoliert werden, ebenso wie aus
Kotproben der zwei Hofhunde. Dieser Report zeigte, dass auch Haustiere, die nicht
zu den klassischen Reservoirtieren gehören, sondern nur als Kurzzeitvektoren
angesehen werden, durchaus STEC auf den Menschen übertragen können. Im
Gegensatz dazu publizierten PIERARD et al. (1999) eine negative Korrelation
zwischen Kontakt zu Hunden und STEC-Infektionen. Die Autoren diskutierten eine
mögliche Immunität, die durch die Langzeitexposition mit geringen Dosen
niedrigpathogener STEC (z.B. Intimin negative Stämme) ausgehend von den
Hunden erlangt werden könnte. Als neues Reservoirtier für STEC beschrieben
GARCIA und FOX (2003) Hauskaninchen, erworben von einem kommerziellen
Händler, sowie SCAIFE et al. (2006) Wildkaninchen. Ausschlaggebend für die
Untersuchungen von SCAIFE et al. waren Besucher eines Wildtierparks, die sich im
Sommer 2001 mit EHEC O157 infizierten. Die Wildkaninchen im Park teilten sich das
Gehege mit O157 positiven Rindern und so untersuchte SCAIFE et. al. 16
Rinderherden, die eng zusammen mit Wildkaninchenpopulationen lebten. In sieben
der 16 Farmen waren die Rinder O157 positiv und in sechs dieser sieben konnten
auch die Wildkaninchen als positiv identifiziert werden. Da Kaninchen oft als
Streicheltiere in Zoos gehalten werden, oder aber Wildkaninchen in Tierparks oft
Zugang zu Picknickwiesen haben, könnten auch Kaninchen potentielle STEC-
Überträger sein.
2.2.6 EHEC/STEC in Streichelzoos
Immer wieder wird von EHEC-Ausbrüchen durch Tierkontakt, insbesondere durch
große und kleine Wiederkäuer, in Streichelzoos und durch Tierkontaktzonen auf
Bauernhöfen berichtet. Trotzdem gibt es bisher nur wenige flächendeckende
epidemiologische Studien über die potentielle Gefahr der Streichelzoos als
Übertragungsweg. HEUVELINK et al. (2002) beschrieben 2002 den Zusammenhang
36 Literatur
eines 17-Monate alten, an HUS erkrankten Jungen mit einem vorangegangenen
Besuch eines Streichelzoos. STEC O157-Stämme konnten aus drei Ziegen und drei
Schafen dieses Zoos isoliert werden. Durch Pulsfeld-Gelelektrophorese konnte
gezeigt werden, dass sich die Isolate weder untereinander noch von dem
Humanisolat des Jungen unterschieden. Daraufhin untersuchten HEUVELINK zwölf
weitere niederländische Streichelzoos und identifizierte drei davon als STEC-positiv.
Eine epidemiologische Studie führten ebenfalls HEUVELINK und Kollegen (2007)
durch, als sie zwischen 2002 und 2004 307 Streichelzoos in den Niederlanden auf
darmpathogene Erreger untersuchten. Als STEC-O157 positiv erwiesen sich rund
12% der untersuchten Institutionen. Allein in den Jahren 2004 und 2005 wurden in
North Carolina, Florida und Arizona drei EHEC-Ausbrüche beschrieben, die jeweils
mit dem Besuch von Streichelzoos und dem damit verbundenen Wiederkäuerkontakt
assoziiert waren. Infektionsquellen waren Ziegen, Schafe und Rinder. In North
Carolina erkrankten 108 Menschen, in Florida handelte es sich um 63 Erkrankte und
zwei Erkrankungen traten in Arizona auf (DAVIES 2005). Im Jahre 2009
veröffentlichte der Morbidity and Mortality Weekly (ALELIS 2009) einen Bericht über
einen STEC-O157 Ausbruch in einem Streichelzoo in Florida im Jahr 2007. Sieben
Kinder einer Tagesferienfreizeit zeigten intestinale Symptome, nachdem sie Kontakt
zu den Streicheltieren hatten. Bei nachfolgenden Untersuchungen konnten aus
Stuhlproben von vier der Patienten ebenso wie aus Ziegenkot und Bodenproben aus
dem Streichelzoo O157-STEC mit identischem Pulsfeld-Gelelektrophorese Profil
isoliert werden (ALELIS 2009). Auch WERBER et al. (2007) identifizierte in seiner
Fall-Kontrollstudie das Streicheln von Wiederkäuern als potentielle Gefahrenquelle.
Im Gegensatz dazu untersuchten KEEN et al. (2007) in den Sommern 2003 und
2004 Streichelzoos in durch die Association of Zoos and Aquariums (AZA)
akkreditierten Zoos in den USA und kamen zu einer nur sehr geringen STEC-O157
Prävalenz von 0,1% der Proben (1 aus 997). Dies erklärten sie unter anderem mit
dem standardisierten Management, den hohen Hygienestandards, routinemäßiger
Quarantäne der Tiere sowie dem geringeren Infektionsdruck durch das Fehlen
angrenzender Landwirtschaft der AZA-akkreditierten Zoos.
Literatur 37
Da die Tiere in der Regel symptomlose Reservoire der Erreger sind, ist es für
Tierparkbetreiber besonders schwer, infizierte Tiere zu identifizieren, weshalb
Besucher auf die bestehende Transmissionsgefahr hingewiesen werden und zur
Vermeidung von Risikoverhalten angehalten werden sollten. Inwiefern Besucher
solches Risikoverhalten ausüben, haben MCMILLIAN et al. (2007) und WEESE et al.
(2007) in ihren Beobachtungsstudien untersucht. Sie fanden heraus, dass nur ca.
38% der Besucher die vorhandenen Händedesinfektionsmittel bzw.
Handwaschbecken benutzen, und dass dies abhängig von der Lokalität dieser war.
Erfreulicherweise verhielten sich Kinder vorbildlicher als Erwachsene. Trotzdem
stellten MCMILLIAN et al. (2007) fest, dass 49% der Besucher unmittelbar nach dem
Streicheln der Tiere mit den Händen auch ihr Gesicht berührten sowie 22% in den
Gehegen aßen oder tranken. Einige Eltern gaben ihren Kindern im Gehege sogar
Babyfläschchen (in 50% der Zoos), Schnuller (in 71% der Zoos) oder Trinklerntassen
(in 56% der Zoos). Aufgrund des fehlenden Bewusstseins der Bevölkerung im
Hinblick auf die Zoonosegefahr ist eine Sensibilisierung sowohl der Besucher als
auch der Parkbetreiber indiziert und nötig.
2.3 Haltung von Tieren in Streichelzoos
2.3.1 Zoologische Gärten, Tierparks, Tiergärten
Die Bezeichnungen Zoo (Kurzform für Zoologischer Garten), Tierpark oder
Tiergarten werden heutzutage größtenteils synonym verwendet, eine klare
Abgrenzung bzw. Definition der einzelnen Begriffe gestaltet sich schwierig. Verstand
man früher unter dem Begriff Tiergarten eine Art Oberbegriff für Schautierhaltungen,
benutzt das Gesetz seit Einführung der EU-Zoorichtlinien 1999 den Begriff Zoo als
Sammelbegriff für Schautierhaltungen, die länger als sieben Tage im Jahr in einer
festen Einrichtung bestehen und eine adäquate Anzahl lebender Wildtiere aufweisen
(EU-Richtlinie [1999/22/EG] über die Haltung von Wildtieren in Zoos, Art. 2).
Dementsprechend können heutzutage laut EU-Zoorichtlinie auch kleinere Betriebe
ohne beachtlich großen Wildtierbestand, den man früher unmittelbar mit jenem
Begriff verband, den Namen Zoo führen (Deutsche Tierparkgesellschaft,
www.deutsche-tierparkgesellschaft.de, letzter Zugriff 15.05.2011). Aufgrund des
38 Literatur
geschichtlichen Hintergrunds versteht man unter einem Zoo jedoch primär einen
wissenschaftlich geführten Park, wobei sich solche Einrichtungen heutzutage ebenso
auch als Tierpark oder Tiergarten benennen (Deutsche Tierparkgesellschaft,
www.deutsche-tierparkgesellschaft.de letzter Zugriff 15.05.2011, Wikipedia,
http://de.wikipedia.org/wiki/Zoo, letzter Zugriff 15.05.2011).
Im Verband deutscher Zoodirektoren (VDZ), der Deutschen Tierpark-Gesellschaft
(DTG) sowie im Deutschen Wildgehege-Verband (DWV) sind deutschlandweit rund
200 Zoos, Tier- und Wildparks organisiert. Hinzu kommen schätzungsweise über 500
kleine, öffentliche Tierhaltungen, von denen ca. 400 Zoos im Sinne der EU-
Zoorichtlinien darstellen. Die jährlichen Besucherzahlen können aufgrund der
zahlreichen nicht in Verbänden organisierten Einrichtungen nur grob geschätzt
werden. Der Verband deutscher Zoodirektoren schätzt die bundesweite
Besucheranzahl auf ca. 60 Millionen pro Jahr, womit Tierparks zu den beliebtesten
Freizeiteinrichtungen mit Bildungsauftrag gehören (VDZ, Verband deutscher
Zoodirektoren, www.zoodirektoren.de, letzter Zugriff 15.05.2011).
Ein Zoo hat sich durchaus als Bildungsstätte zu verstehen, dessen Aufgabe die
Aufklärung der Besucher über die verschiedensten Tierarten und ihre Vielfalt sowie
ökologische und biologische Zusammenhänge sein sollte. Ein weiteres Aufgabenfeld
ist das Betreiben und Vermitteln von Arten- und Naturschutz und dem damit
verbundenen Erhalten bedrohter Tierarten im Rahmen koordinierter
Nachzuchtprogramme. Forschung wird in zoologischen Einrichtungen im Rahmen
der Möglichkeiten v.a. in den Bereichen Tiergartenbiologie vorgenommen, wobei hier
mit Universitäten, Hochschulen und anderen Tierparks kooperiert wird. Nicht zuletzt
sollen Zoos jedoch immer noch Erholungsstätten und Orte der Freizeitgestaltung
sein, an denen Menschen, die sonst keine Möglichkeit zu Tierkontakten haben,
dieser ermöglicht wird (VDZ, Verband deutscher Zoodirektoren,
www.zoodirektoren.de, letzter Zugriff 15.05.2011).
2.3.2 Wildparks, Wildgehege
Die Begriffe Wildpark oder Wildgehege lassen sich im Vergleich zu den
vorhergenannten Begrifflichkeiten recht gut definieren und von Zoos, Tierparks oder
Tiergärten abgrenzen. Während Letztgenannte meist ein weites, durchaus auch
Literatur 39
exotisches Artenspektrum aufweisen, werden in Wildparks und Wildgehegen meist
oder sogar ausschließlich heimische Wildtiere und/oder Haustierrassen gehalten.
Allerdings sind viele dieser Parks trotzdem Zoos im Sinne der EU-Zoorichtlinien
(Deutsche Tierparkgesellschaft, www.deutsche-tierparkgesellschaft.de, letzter Zugriff
15.05.2011). Im Deutsche Wildgehege Verband (DWV) sind zurzeit etwa 150
Einrichtungen organisiert, die eine Gesamtfläche von ca. 25.000 ha und rund 8,8
Millionen Besucher jährlich aufweisen (Deutscher Wildgehege Verband,
www.wildgehege-verband.de, letzter Zugriff 15.05.2011).
2.3.3 Freizeitparks mit Tieranteil
Die meisten Freizeitparks sind definiert als dauerhaft angelegte Vergnügungsparks,
in denen Fahrgeschäfte, Shows, Ausstellungen etc. angeboten werden (Wikipedia,
http://de.wikipedia.org/wiki/Freizeitpark, letzter Zugriff 15.05.2011). Ein weites
Tierartenspektrum weisen solche Parks in der Regel nicht auf, da es sich aus
juristischer Sicht bei Freizeitparks lediglich um Spielplätze, welche auch für die
Erwachsenenwelt angedacht sind, handelt (Wikipedia,
http://de.wikipedia.org/wiki/Freizeitpark, letzter Zugriff 15.05.2011). Nicht wenige
Freizeitparks bieten jedoch zur Steigerung der Parkattraktivität neben
Fahrgeschäften, Shows o.ä. auch Streichelgehege, die eine geringe Auswahl an
Tieren, wie z.B. Ziegen, Schafe oder andere Haustiere beherbergen. Konkrete
Zahlen über die Tierhaltung in Freizeitparks sind nicht bekannt.
2.3.4 Streichelzoos, Streichelgehege
Als sog. Streichelzoos oder Streichelgehege versteht man Tierhaltungen, in denen
Tiere von Besuchern gestreichelt und oftmals auch gefüttert werden können. Sie sind
zumeist Teil größerer Einrichtungen wie Zoos, Wildgehege oder Freizeitparks. Die
ersten Streichelgehege gab es bereits in den 30er Jahren des 20. Jahrhunderts. Der
Begriff Streichelzoo wurde jedoch erst durch den Veterinär Wolfgang Salzert geprägt
(Wikipedia, http://de.wikipedia.org/wiki/Streichelzoo, letzter Zugriff 15.05.2011).
Streichelzoos sind besonders bei Kindern sehr beliebt, v.a. weil nur wenige Kinder
heutzutage noch die Möglichkeit haben, mit Nutztierrassen in so engen Kontakt zu
treten. Kinder, denen eine eigene Tierhaltung verwehrt bleibt, lernen so die
40 Literatur
Bedürfnisse anderer Lebewesen kennen und respektieren. Für viele Stadtkinder ist
ein Streichelgehege die einzige Möglichkeit, Tiere hautnah zu erleben.
Als Bewohner solcher Gehege werden meist Tierarten gewählt, die ruhig und robust
im Umgang mit Besuchern sind, die Kontakt mit Menschen nicht scheuen und von
denen keine ausgesprochene Verletzungsgefahr für die Besucher ausgeht
(Wikipedia, http://de.wikipedia.org/wiki/Streichelzoo, letzter Zugriff 15.05.2011). Dazu
gehören vor allem kleine Wiederkäuer wie Ziegen und Schafe der
unterschiedlichsten Rassen, Kaninchen und Meerschweinchen, aber auch Ponies,
Esel und Rinder erfreuen sich immer größerer Beliebtheit.
In modernen, tiergerechten Streichelgehegen verfügen die Tiere über ein
Rückzugsgebiet, zu dem der Besucher keinen Zutritt hat. Auch das Füttern der Tiere
durch den Besucher geschieht in fast allen Streichelzoos mit streichelzooeigenem,
vom Betreiber zur Verfügung gestelltem Futter.
Material und Methoden 41
3 Material und Methoden
3.1 Material
3.1.1 Geräte und Verbrauchsmaterialien
A
Analysewaage, (80-400g) Sartorius (Hannover)
Analysewaage, BA 61 (0-60g) Sartorius (Hannover
B
Bio-Linker®BLX (cross linker) über LTF-Labortechnik (Wasserburg)
Blotpapier, Whatman (3mm) Schleicher&Schuell (Dassel)
Bunsenbrenner FIREBOY plus Integra Bioscience (Gießen)
E
Eismaschine, SPR 75 Nordcap New Brunswick Scientific (Edison,
USA)
Elektrophoresekammer (DNA) OWL (Porthmouth, USA)
F
Filterspitzen TipOne® (steril 0,1-1000µl) Starlab (Ahrensburg)
G
Gefrierschrank (-80°C), Sorvall® Heraeus, Kendro (Hanau)
Geldokumentationsgerät, IMAGO B&L Systems (Marsen, Niederlande)
H
Hybridisierungsofen/-flasche Biometra (Göttingen)
K
Kühlbox Cool Fun AS-15 Waeco (Emsdetten)
Kühlschrank (4,0°C) Liebherr
Kühlzentrifuge, Sorvall® RC6 Du Pont (Bad Homburg) mit Rotor SA600
M
Magnethalterung IBA (Göttingen)
Magnetrührer, LR 12, Mettler Landgraf (Hannover)
Mikrowelle Panasonic (Hannover)
42 Material und Methoden
Mikrotiterplatte (96-well) Sarstedt (Nümbrecht)
N
Nitrocellulosemembran, Protran BA85 Schleicher & Schuell (Dassel)
P
Pipetteboy TECNOMARA (Fernwald)
Pipetten Eppendorf (Tespe)
Pipetten Gilson (Frankreich)
R
Reagenzglas-Rotator GFL (Burgwedel)
Reaktionsgefäße 1,5ml, 2,0ml Sarstedt (Nümbrecht)
Reaktionsgefäße 0,2ml mit Deckel Bioplastics (Niederlande) (Thin-wall 8-tube strip)
S
Schüttelinkubator, Innova 4000 New Brunswick Scientific
Slot-Blot-Apparatur Hybri.Slot 24 Biometra (Göttingen)
Spannungsgerät, PowerPac 300 Biorad (München)
Sterilbank, NUAIRE® Biologial Zapf Instrumente (Sarstedt) Safety Cabinets
Sterilfilter (0,45µm) Millipore (Eschborn)
T
Thermocycler, Mastercycler Eppendorf (Tespe)
Tischzentrifuge, Centrifuge 5415 C Eppendorf (Tespe)
V
Vortex Heidolph (Hannover)
W
Wasserbad (Schüttel-) GFL (Burgwedel)
Z
Zentrifugenröhrchen (PP 15ml) Greiner Bio-One (Frickenhausen)
3.1.2 Chemikalien und Reagenzien
A
Agar Agar Oxoid (Hampshire, England)
Material und Methoden 43
Agarose Biozym Scientific (Hess. Oldendorf)
Albumin-Fraktion V (BSA) Roth (Karlsruhe)
A. bidest (DNase/RNase u. Endotoxin-frei) Sigma (Deisenhofen)
Anti-Digoxigenin-POD (poly), Fab Fragments Roche (Mannheim)
B
Bacto®-Trypton Becton Dickson (Heidelberg)
Borsäure Roth (Karlsruhe)
Bromphenolblau Merck (Darmstadt)
C
Cefixime-Tellurite selective supplement Oxoid (Hampshire, England)
Chloroform Roth (Karlsruhe)
Citronensäure-Monohydrat Merck (Darmstadt)
CTAB Sigma (Deisenhofen) (Hexadexyltrimethylammoniumbromid, 99%)
D
Digoxigenin-11-dUTP Roche (Mannheim)
DNA-Marker 100 bp Roth (Karlsruhe)
Dynabeads Invitrogen (Karlsruhe)
E
EDTA Sigma (Deisenhofen)
Ethanol abs. Roth (Karlsruhe)
Ethidiumbromid Sigma (Deisenhofen)
F
Ficoll® 400 Sigma (Deisenhofen)
G
Glycerin Roth (Karlsruhe)
H
Hefeextrakt Oxoid (Hampshire, England)
I
Isoamylalkohol Merck (Darmstadt)
Isopropanol Roth (Karlsruhe)
44 Material und Methoden
K
Kaliumchlorid Roth (Karlsruhe)
L
Lysozym Roth (Karlsruhe)
M
Magermilchpulver Sucofin (EDAKA, Hannover)
N
Natriumchlorid Roth (Karlsruhe)
Natriumacetat Merck (Darmstadt)
Natriumhydroxid Plätzchen Merck (Darmstadt)
Nucleotidtriphosphate (dNTPs) Roth (Karlsruhe)
P
Phenol Roth (Karlsruhe)
Polyvinylpyrrolidon Roth (Karlsruhe)
Proteinase K Merck (Darmstadt)
R
RNase A Sigma (Deisenhofen)
S
Salzsäure Sigma (Deisenhofen)
SDS (Sodiumdodecylsulfat) Roth (Karlsruhe)
T
TMB ready-to-use substrate Serva (Heidelberg)
Tri-Natriumcitrat-Dihydrat Merck (Darmstadt)
Tris (hydroxylmethyl)-aminomethan Roth (Karlsruhe)
Tween®20 Roth (Karlsruhe)
3.1.3 Nährmedien
Columbia-Schafsblut-Agar Oxoid (Hampshire, England)
Gassner-Selektivagar Oxoid (Hampshire, England)
SMAC-Agar Oxoid (Hampshire, England)
CT-SMAC-Agar Oxoid (Hampshire, England)
Material und Methoden 45
LB-Agar-Platten 1% (w/v) Bacto®-Trypton
0,5% (w/v) Hefeextrakt
1% (w/v) NaCl
1,5% Agar Agar
LB-Medium 1% (w/v) Bacto®-Trypton
0,5% (w/v) Hefeextrakt
1% (w/v) NaCl
GN-Bouillon Merck (Darmstadt)
3.1.4 Puffer und Lösungen
Blockpuffer 5% Magermilchpulver (w/v)
9,9 mM Tris
150 mM NaCl
0,005% Tween 20 (v/v)
pH 8,0
CTAB 4,1g NaCl
10g CTAB
A. dest ad 100ml
100x Denhardt’s Lösung 2% (w/v) Ficoll
2% (w/v) Polyvinylpyrrolidon
2% (w/v) BSA Fraktion V
Die Lösung wurde steril filtriert (Filter 0,45µm) und bei -20°C gelagert.
Denaturierungspuffer 0,5 N NaOH
1,5 M NaCl,
autoklaviert
Hybridisierungspuffer SSC 6x
Denhardt’s Lösung 5 x
SDS 0,5% (w/v)
EDTA pH 7,5 2mM
46 Material und Methoden
IMS-Waschpuffer 0,138 M NaCl
0,0027 M KCl
0,05% Tween 20
pH 7,4, autoklaviert
6 x Ladepuffer für DNA 0,25% (w/v) Bromphenolblau
0,25% (w/v) Xylencyanol
30% (v/v) Glyzerin
Neutralisierungspuffer 1,5M NaCl
0,5 M Tris/HCl (pH 7,4)
autoklaviert
20x SSC 3 M NaCl
0,3 M Natriumcitrat
autoklaviert
10 x TBE 0,9 M Tris-HCl (pH 7,5)
0,9 M Borsäure
20 mM Na-EDTA (pH 8,0)
pH 7,5, autoklaviert
10 x TBST 0,1 M Tris
1,5 M NaCl
0,05% (v/v) Tween 20
pH 8, autoklaviert
TEN-Puffer 100µl Lysozym (100mg/ml)
50 µl Tris 1 M (pH 8,0)
2 µl EDTA 0,5 M (pH 8,0)
25 µl NaCl 4M
823 µl A. dest.
TMB-Puffer 0,82% (w/v) Natriumacetat
0,315% (w/v) Citronensäure-
Monohydrat pH 5,0
Material und Methoden 47
Waschlösungen für Colony Blots
Waschlösung 1 SSC 2 x
SDS 0,1% (w/v)
autoklaviert
Waschlösung 2 SSC 1 x
SDS 0,1% (w/v)
autoklaviert
Waschlösung 3 SSC 0,2 x
SDS 0,1% (w/v)
autoklaviert
3.1.5 Herkunft des Untersuchungsmaterials und Probennahme
Für die epidemiologische Studie wurden insgesamt 126 zoologische Gärten,
Wildparks und Freizeitparks mit Tieranteil ausgewählt. Die Einrichtungen wurden mit
Hilfe des Internets ausfindig gemacht und schriftlich um eine Teilnahme gebeten.
Eine besondere Hilfestellung gab die Internetseite www.zoo-infos.de der
Zoodatenbank Bielefeld, erstellt von der Zoo-AG-Bielefeld der Universität Bielefeld.
Eine Zusage erteilten 56 Einrichtungen, 13 Einrichtungen erteilten eine Absage und
57 Einrichtungen gaben keine Rückmeldung. Die 56 teilnehmenden Betriebe wurden
anhand ihrer Betriebsstruktur in zoologische Parks (Zoo), Wildtierparks und
Freitzeiteinrichtungen mit Tieranteil geschichtet. Da rund 40% der angeschriebenen
Parks ihre Teilnahme an der Studie zusagten, wurde die zweite Schichtung der
Stichprobengröße „Parks“ so vorgenommen, dass Deutschland zunächst anhand der
Parkdichte in drei geographische Teile (Region 1, Region 2 und Region 3) unterteilt
wurde (Abbildung 1). Aufgrund der relativ hohen Parkdichte in Nordrhein-Westfalen
und der gleichzeit relativ geringen Parkdichte in Baden-Württemberg wurden diese
beiden in geographisch unterschiedlichen Bereichen Deutschlands liegende
Regionen in dieser Studie zu einer Region zusammengefasst.
48 Material und Methoden
Abb. 1: Schichtung Deutschlands in drei Regionen
In jeder Region sollte von jeder Parkart ein Anteil von 40% beprobt werden. Jeder
Park wurde im Abstand von 14 Tagen zweimal beprobt. Im Beprobungszeitraum von
Mai bis Ende August 2008 wurden 24 Parks beprobt, von April bis Mitte Oktober
2009 wurden 32 Parks beprobt. Die Kotproben aus den Streichelgehegen selbst
stammten von Tierarten, die von den Besuchern gefüttert und/oder angefasst werden
konnten. Dies +waren zum größten Teil Ziegen und Schafe aber auch Schweine,
Kaninchen, Meerschweinchen, Pferde und Ponies, Esel, Rinder, Lamas, Damwild,
Geflügel und Kängurus. Des Weiteren wurde in jedem Park, soweit möglich, ein
Fliegenfänger aufgehängt und davon jeweils zehn Fliegen zur mikrobiologischen
Untersuchung herangezogen. Die Ermittlung des Stichprobenumfangs pro
Streichelzoo erfolgte vor dem Hintergrund einer Auswahl ohne Zurücklegen bei
endlichen Gesamtheiten mit Hilfe des Models der Hypergeometrischen Verteilung.
Bei vorgegebener Größe des Streichelzoos wurde dazu die Prävalenz von 20% mit
einer relativen Genauigkeit von 10%, d.h. absolut zwei Prozentpunkte, vorgegeben
und somit für jeden Streichelzoo individuell ein erforderlicher Stichprobenumfang bei
einer Sicherheitswahrscheinlichkeit von mindestens 95% festgelegt. Die Realisierung
erfolgte unter Verwendung des Statistikprogrammpakets R (www.r-project.org/).
Insgesamt wurden somit im Jahr 2008 566 Kotproben und 17 Fliegenproben
Material und Methoden 49
untersucht. Im Jahre 2009 waren dies 951 Kotproben und 24 Fliegenproben. Die
Kotproben wurden als Sammelkotproben vom Gehegeboden in sterilen
Plastikröhrchen gesammelt. Bevorzugt wurde frisch abgesetzter Kot gesammelt,
wobei die Zuordnung zu einem bestimmten Individuum nicht gegeben war. Die
Proben wurden bis zur Aufarbeitung und Untersuchung im Institut für Mikrobiologie
der Stiftung Tierärztliche Hochschule bei 4 °C transportiert und gelagert. Zusätzlich
wurden von den Parks Fragebögen zu den Themen Gehege- und
Gesundheitsmanagement der Tiere sowie Hygiene und Besucherverpflegung
beantwortet. Die Auswertung der Fragebögen in Zusammenhang mit dem
Erregervorkommen erfolgte mit Hilfe des Fisher’s exact test in dem
Statistikprogramm SAS 9.3. Bei dem Fisher’s exact test handelt es sich um einen
Signifikanztest auf Unabhängigkeit in der Kontingenztafel welcher auch bei kleinen
Stichprobenzahlen verlässliche Ergebnisse liefert.
3.2 Methoden
Direkt nach Ankunft wurden die einzelnen Kotproben jeweils mit 3 ml steriler
physiologischer Kochsalzlösung versetzt und homogenisiert. Falls eine
Weiterverarbeitung am selben Tag nicht möglich war, wurden die Proben bei 4 °C bis
zum darauf folgenden Tag gelagert.
Von den Fliegenfängern wurden 10 Fliegen je Fänger entnommen und in 2 ml
physiologische Kochsalzlösung verbracht. Auch diese wurden, falls eine
Weiterverarbeitung am selben Tag nicht möglich war, bei 4 °C gelagert. Die Fliegen
wurden vor der Weiterverarbeitung zusammen mit 4-6 Glaskugeln homogenisiert.
Dieses Homogenat wurde bei Raumtemperatur abzentrifugiert und der Überstand
verworfen.
3.2.1 STEC-Isolierung
3.2.1.1 Bearbeitung der 583 Proben von 2008
Die Isolierung mittels immunomagnetischer Separation (IMS) erfolgte sowohl 2008
als auch 2009 nach KARCH et al. (1996b). Von der zu untersuchenden Kotprobe/
Fliegenprobe wurden ca. 1 g Kot bzw. 1 ml Fliegensuspension in 10 ml GN-Bouillon
50 Material und Methoden
überführt. Die Proben wurden bei 37 °C und 150 Umdrehungen pro Minute (rpm) für
4 h schüttelnd inkubiert. Anschließend wurden 100 µl der GN-Bouillon direkt auf einer
SMAC-Platte fraktioniert ausgestrichen. Weiterhin wurden die STEC mittels
immunomagnetischer Separation isoliert. Dazu wurden die 566 Kotproben und 17
Fliegenproben wie folgt bearbeitet: Es wurden 20 µl der Anti-O157-Dynabeads in
einem 1,5 ml Reaktionsgefäß vorgelegt und 1000 µl der inkubierten GN-Bouillon
hinzu pipettiert. Die Reaktionsgefäße wurden bei Raumtemperatur für 10 min im
Reagenzglas-Rotator schwenkend inkubiert. Anschließend wurden sie in eine
Magnethalterung gestellt und 3 min ohne Rotation inkubiert. Die Dynabeads hafteten
sich nun zusammen mit den an ihnen gebundenen Bakterien an die
Reaktionsgefäßwand an. Der Überstand wurde abgenommen und 1000 µl IMS-
Waschpuffer dazugegeben. Nach der Entfernung des Magneten erfolgte eine
dreiminütige Inkubation, worauf sich erneut eine Inkubation mit Magneten anschloss.
Der Waschvorgang wurde insgesamt dreimal wiederholt und die an den Dynabeads
gebundenen Bakterien schließlich in 50 µl IMS-Waschpuffer aufgenommen, von
denen 25 µl auf einer SMAC-Platte und 25 µl auf einer CT-SMAC-Platte fraktioniert
ausgestrichen wurden. Die Platten wurden bei 37 °C für 18-24 h bebrütet. Nach der
Bebrütungszeit wurden STEC-verdächtige Kolonien, d.h. Bakterien die auf SMAC
und CT-SMAC-Platten sorbitolnegativ wuchsen (auf SMAC gräulich-farbloses
Wachstum, auf CT-SMAC gräuliches Wachstum mit dunkelgrauem bis schwarzem
Zentrum) auf Columbia-Schafsblut-Agar, Gassner-Selektivagar und CT-SMAC-Agar
subkultiviert und bei 37 °C für 18-24 h bebrütet. Je nach Anzahl STEC-verdächtiger
Kolonien wurden bis zu 20 Einzelkolonien subkultiviert. Zeigten die Subkulturen
sowohl auf der CT-SMAC als auch auf Gassner-Selektivagar STEC typisches
Wachstum und wuchsen sie auch auf Columbia-Schafsblut-Agar in E.coli-typischen
Kolonien, wurden die Subkulturen in einem Gemisch aus gleichen Teilen LB-Medium
und 50%igem Glycerin bei -70 °C in Mikrotiterplatten eingefroren. Die Isolate wurden,
bevor sie in Form von Tupfern zur Serotypisierung an das Robert Koch-Institut nach
Wernigerode geschickt wurden, mittels einer Multiplex-PCR auf die Virulenzgene
stx1, stx2, eae und hlyA getestet (siehe 3.2.7).
Material und Methoden 51
3.2.1.2 Bearbeitung der 975 Proben von 2009
Zunächst wurden auch hier 1 g Kot bzw. 1 ml Fliegensuspension in 10 ml GN-
Bouillon überführt und bei 37 °C und 150 rpm für 4 h schüttelnd inkubiert. Die
immunomagnetische Separation erfolgte jedoch zusätzlich zu O157 Dynabeads mit
O103, O145, O111 und O26 erweiterten Dynabeads. In 1,5 ml Reaktionsgefäßen
wurden jeweils 5 µl O103, O145, O111, O26 und O157 Dynabeads vorgelegt und
250 µl GN-Bouillon dazu pipettiert. Ab hier wurde die Separation wie oben
beschrieben durchgeführt. Allerdings wurden nach der Bebrütungszeit keine
Einzelkolonien subkultiviert. Die Platten wurden komplett mit insgesamt 1 ml LB-
Bouillon abgeschwemmt und im Verhältnis 1:1 mit 50%igem Glycerin bis zur
Weiterverarbeitung eingefroren.
3.2.2 Herstellen der PCR-Sonde
Zur Detektion der im Genom evtl. vorhandenen Virulenzgene wurde zunächst eine
Gensonde erstellt. Die Herstellung der DIG-11-UTP markierten Sonde erfolgte mittels
einer Multiplex-Polymerase-Kettenreaktion, wobei die Reagenzien laut
Herstellerangaben (Roche diagnostics mbH Deutschland) eingesetzt bzw. auf einen
50 µl PCR-Ansatz umgerechnet wurden. Als Template dienten 50 ng chromosomale
DNA des Referenzstammes EDL933.
Tab. 1: Verwendete Primer (FRANCK et al. 1998b):
Virulenzfaktor Primersequenz 5’-3’ Produktgröße
(bp)
GenBank
Nummer
Stx1 (forward) TTCGCTCTGCAATAGGTA 555 Z36899
Stx1 (reverse) TTCCCCAGTTCAATGTAAGAT
Stx2 (forward) GTGCCTGTTACTGGGTTTTTCTTC 118 L11078
Stx2 (reverse) AGGGGTCGATATCTCTGTCC
Intimin (forward) ATATCCGTTTTAATGGCTATCT 425 Z11541
Intimin (reverse) AATCTTCTGCGTACTGTGTTCA S90827
52 Material und Methoden
Die Primer für die DIG-Sonde wurden von der Firma Biomers.net (Ulm) synthetisiert
und als Lyophilisate geliefert. Die Primer wurden in Wasser gelöst (jeweils 100 µM)
und bei -20 °C gelagert.
Material und Methoden 53
Der Primer-Mix wurde wie folgt zusammengesetzt:
Primer-Mix DIG1 Primer-Mix DIG2
dH2O 70 µl dH2O 70 µl
stx1-1 10 µl stx1-2 10 µl
stx2-1 10 µl stx2-2 10 µl
eae-1 10 µl eae-2 10 µl
Der DIG-dNTP-Ansatz wurde folgendermaßen hergestellt:
dATP (25 µmol/100 mM) 5 µl
dCTP (25 µmol/100 mM) 5 µl
dGTP (25 µmol/100 mM) 5 µl
dTTP (25 µmol/100 mM) 4,75 µl
DIG-11-UTP (1 mM) 25,0 µl
Der Mastermix wurde in 0,2 ml Reaktiongefäßen nach folgendem Pipettierprotokoll in
angegebener Reihenfolge hergestellt:
Reagenz Menge/Einzelansatz
dH2O 27,0 µl
10xPCR-Puffer (-MgCl2) 5,0 µl
MgCl2 (1,5 mM) 1,5 µl
DIG-dNTP-Mix (1 mM) 5,0 µl
Primer-Mix 1 (10 µM) 5,0 µl
Primer-Mix 2 (10 µM) 5,0 µl
Taq-Polymerase (5 U/µl) 0,5 µl
Template-DNA (50 ng) 1,0 µl
Gesamtmenge/Einzelansatz 50,0 µl
54 Material und Methoden
Die Ziel-DNA wurde in einem Thermocycler der Firma Eppendorf nach folgendem
Programm amplifiziert:
initiale Denaturierung 94 °C 5:00 min
Denaturierung 94 °C 1:00 min
Anlagerung 57 °C 1:15 min 29 Zyklen
Extension 72 °C 1:45 min
finale Extension 72 °C 5:00 min
Nach Beendigung des Programms wurden die Ansätze im Thermocycler auf 7 °C
gehalten.
Zur Kontrolle der Sonde wurden vor dem Einsatz im Hybridisierungsschritt aus jedem
Ansatz jeweils 5 µl für 90 min bei 130 V in einem 2%igen Agarosegel aufgetrennt
(siehe 3.2.8) und dokumentiert.
3.2.3 Präparation chromosomaler DNA
Um die Sensitivität der einzelnen Sonden testen zu können, wurde aus dem
Referenzstamm EDL933 nach folgendem Protokoll chromosomale DNA präpariert:
Der Referenzstamm EDL933 wurde 8-12 h bei 37 °C auf einer Blutplatte
angezüchtet. Material von einer Kolonie wurde in 6 ml LB-Medium überführt und 8-12
h schüttelnd bei 37 °C inkubiert. Von dieser Bakteriensuspension wurden 5 ml in ein
Zentrifugenröhrchen pipettiert und für 10 min bei 4 °C und 8000 rpm (Kühlzentrifuge,
Sorvall® RC6, Rotor SA600) zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und das
Pellet bei Raumtemperatur getrocknet. Das Pellet wurde in 275 µl TEN-Puffer
resuspendiert. Nach Zugabe von 10 µl RNAse und 275 µl A.dest. inkubierte der
Ansatz für 30 min bei 37 °C im Wasserbad. Im Anschluss wurden 15 µl 20%iges
SDS sowie 10 µl Proteinase K (20 mg/ml) zugesetzt. Der Ansatz wurde gut gemischt
und erneut bei 37 °C für 1 h im Wasserbad inkubiert. In dieser Zeit wurde das CTAB
auf 50 °C erwärmt. Der Probe wurden nun 125 µl 4 M NaCl zugegeben, der Ansatz
gut gemischt und schließlich 80 µl CTAB hinzugefügt. Der Ansatz wurde für 10 min
im Wasserbad bei 65 °C erwärmt. Nach Ablauf der Inkubationszeit erfolgte eine
Extraktion mittels Zugabe von 780 µl Chloroform/Isoamylalkohol (24:1). Die Probe
wurde vorsichtig gemischt. Die entstehende milchig-trübe Suspension wurde für 8
Material und Methoden 55
min bei 12000 rpm zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurden 2 flüssige Phasen
und eine feste Interphase sichtbar, von denen lediglich die oberste (wässrige) Phase
in ein neues Reaktionsgefäß überführt wurde; der Rest wurde verworfen. Es folgte
eine weitere Extraktion mit 780 µl Phenol/Chlorophorm/Isoamylalkohol (25:24:1) und
ein weiterer Zentrifugationsschritt (8 min, 12000 rpm). Die oberste Phase wurde in
ein neues Reaktionsgefäß pipettiert. Die DNA wurde durch Zugabe von 500 µl
Isopropanol präzipitiert und durch nachfolgende Zentrifugation bei 12000 rpm für 30
min pelletiert. Die DNA wurde durch Zugabe von 500 µl 80%igen Ethanols und
anschließende Zentrifugation gewaschen und das DNA-Pellet bei Raumtemperatur
über Nacht getrocknet. Zur Lagerung wurde das Pellet in TE-Puffer oder A. dest
resuspendiert und bei -20 °C eingefroren.
3.2.4 Testen der Sensitivität für die stx1-, stx2- und eae-Sonden
Da zur Sensitivität der in dieser Arbeit eingesetzten Sonden in einer DIG-markierten
Southern-Hybridisierung keinerlei Daten vorlagen, wurde dies zunächst experimentell
untersucht. Dazu wurden Verdünnungsreihen der chromosomalen DNA des
Referenzstammes EDL933 mit den Konzentrationen 500 ng, 250 ng, 100 ng, 50 ng,
25 ng und 12,5 ng sowie mit 100 ng, 50 ng, 25 ng, 12,5 ng, 6,25 ng und 3,125 ng
hergestellt. Eine Nitrocellulosemembran wurde auf die Größe der Slot-Blot-Apparatur
Hybri.Slot 24 zugeschnitten und in 20 x SSC für 5-10 min äquilibriert. In dieser Zeit
wurden die DNA-Verdünnungen in 10 µl A. dest. aufgenommen und jeweils mit 30 µl
Denaturierungspuffer versetzt. Diese Ansätze wurden für 15 min bei 100 °C
denaturiert, anschließend direkt auf Eis gestellt und jeweils 40 µl 20 x SSC hinzu
gegeben. An die Hybri.Slot-Apparatur wurde ein Vakuum angelegt, die
Nitrocellulosemembran eingespannt und die Slots mit je 80 µl 20 x SSC gespült.
Nachdem in den Vertiefungen keine Flüssigkeit mehr zu sehen war, wurde das
komplette Volumen der DNA-Verdünnungen in die Slots pipettiert und gewartet, bis
das Vakuum die gesamte DNA-Menge auf die Membran gezogen hatte. Die Slots
wurden erneut mit 80 µl 20 x SSC gespült und das Vakuum final für 5 min
aufrechterhalten. Die Membran wurde aus der Apparatur entfernt und auf Whatman
Filterpapier getrocknet. Die DNA wurde im Crosslinker mit UV-Licht auf der Membran
fixiert. Anschließend wurde die Membran wie unter 3.2.6 beschrieben
56 Material und Methoden
weiterverarbeitet. Die niedrigste DNA-Konzentration, bei der eine enzymatische
Farbreaktion sichtbar war, wurde dokumentiert.
3.2.4.1 Prinzip der enzymatischen Farbreaktion
Um virulenzgentragende Bakterien-DNA, welche auf einer Nitrocellulosemembran
fixiert ist, sichtbar machen zu können, bedient man sich der Bindung einer markierten
Sonde an die DNA; die Sonde wird anschließend durch Antikörper detektiert und
durch eine enzymatische Farbreaktion sichtbar gemacht. Die DNA-Sonde wurde wie
bereits in 3.2.2 beschrieben hergestellt, wobei die beiden konkurrierenden Nukleotide
dTTP und DIG-11-dUTP im Verhälnis 65% zu 35% vorlagen und in die Sonde
eingebaut wurden. Die Sonde wurde in der Southern-Hybridisierung an die Ziel-DNA
gebunden. Der im Anschluss benutzte polyklonale Schaf-Anti-Digoxigenin-
spezifische Antikörper war Meerrettichperoxidase-gekoppelt. Durch dreimaliges
Waschen nach der Antikörperreaktion wie in 3.2.6 beschrieben wurde nicht
gebundenes Konjugat entfernt. Das chromogene Substrat Tetramethylbenzidin
(TMB) wurde hinzugegeben. Dessen enzymatische Umsetzung resultierte in einer
blauen Farbreakion.
3.2.5 Colony-Blot
Die Proben aus dem Jahr 2009 wurden mittels Colony-Blot weiterverarbeitet. Dazu
wurden die Bakterienabschwemmungen aufgetaut und gevortext. 2 µl der
Abschwemmung wurden in ein mit 2,5 ml sterilem NaCl gefülltes Flachbodenglas
gegeben und die Trübung wurde auf McFarland 0,5 eingestellt. Aus dieser
Suspension wurden 10 µl in 10 ml steriles NaCl überführt und gut gevortext. Daraus
wurden nun 10 µl mit einem Einmalspatel auf LB-Platten ausplattiert und über 8-12 h
bei 37 °C bebrütet. Drei Plastiktabletts (ca. 30 x 40 cm) wurden mit 3 mm Whatman
Filterpapier ausgelegt und mit Denaturierungspuffer, Neutralisierungspuffer und 2 x
SSC durchtränkt. Als nächstes wurden runde Nitrocellulosemembranen beschriftet
und auf die bewachsenen LB-Platten aufgelegt. Die Position der Membranen wurde
durch einen Kanüleneinstich markiert. Die Membranen wurde für 5 min auf den
Platten belassen und anschließend mit einer Pinzette luftblasenfrei, mit dem
anhaftenden Koloniematerial nach oben, auf den mit Denaturierungspuffer
Material und Methoden 57
durchtränkten Filter verbracht und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der
Inkubationszeit wurde die Nitrocellulosemembran auf das mit Neutralisierungspuffer
getränkte Filterpapier gelegt und ebenfalls 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Als
letztes wurde die Membran auf den mit 2 x SSC getränkten Filter gelegt und
ebenfalls 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Nitrocellulosemembranen wurden
abschließend auf trockenem Filterpapier für mindestens 30 min getrocknet. Die DNA
wurde nach dem Trocken durch UV-Bestrahlung im Crosslinker auf der Membran
fixiert.
3.2.6 Southern-Hybridisierung
Vor der eigentlichen Hybridisierung wurden die Membranen in A.bidest angefeuchtet
und für 2 min in 2 x SSC äquilibriert. Anschließend wurden gläserne
Hybridisierungsröhren mit 10 ml Hybridisierungspuffer und den Membranen bestückt
und bei 65 °C 2 h im Hybridisierungsofen unter ständiger Rotation prähybridisiert. 30
µl der PCR-Sonde wurden zur Denaturierung 15 min bei 100 °C in einem
Reaktionsgefäß gekocht und anschließend 5 min auf Eis gestellt. Nach Ablauf der
Prähybridisierungszeit wurde der Hybridisierungspuffer abgegossen und 3 ml frischer
Hybridisierungspuffer zusammen mit 30 µl denaturierter DNA-Sonde in die
Hybridisierungsröhre gegeben. Über Nacht wurden die Sonden bei 65 °C im
Hybridisierungsofen unter ständiger Rotation an die DNA hybridisiert. Am nächsten
Tag wurden die Membranen drei Mal für jeweils 30 min mit Waschpuffer 1,
Waschpuffer 2 und Waschpuffer 3 mit absteigender Salzkonzentration gewaschen.
Anschließend wurden die Membranen mit 50 ml Blockpuffer für eine Stunde
geblockt. Dem folgte dreimaliges Waschen für jeweils 5 min mit 1 x TBST. Nach dem
Waschen wurden 10 µl Anti-Digoxigenin-Antikörper vom Schaf, konjugiert mit
polymerisierter Merrettichperoxidase, und 10 ml 1 x TBST in die Glasröhren gegeben
und bei Raumtemperatur unter ständiger Rotation inkubiert. Nach einer Stunde
wurde zweimal für 5 min mit 50 ml 1 x TBST und anschließend für 5 min mit 50 ml
TMB-Puffer gewaschen. Danach wurde mit 10 ml gebrauchsfertiges TMB-Substrat
unter Sichtkontrolle inkubiert, bis sich eine blaue Farbreaktion der gebundenen DNA
zeigte. Die Reaktion wurde mit A.bidest abgestoppt, die Membranen aus der
Glasröhre entnommen und zwischen zwei Filterpapieren getrocknet. Von den
58 Material und Methoden
hybridisierenden Kolonien (Farbreaktion im Colony-Blot) wurde Material von den
ursprünglichen LB-Platte entnommen (maximal fünf Kolonien pro Platte), und in
Mikrotiterplatten in 200 µl eines Gemisches aus gleichen Teilen LB-Mediums und
50%igem Glycerin eingefroren. Zu einem späteren Zeitpunkt wurden diese Isolate in
einer Multiplex-PCR auf die drei Virulenzgene stx1, stx2 und eae hin untersucht.
3.2.7 DNA-Analyse mittels Multiplex-PCR
3.2.7.1 PCR-Kontrolle der Isolate 2008
Die 2008 gewonnenen Isolate wurden in einer Multiplex-PCR (modifiziert nach
[FRANCK et al. 1998a]) auf die Virulenzgene stx1, stx2, eae und hlyA getestet. Die
dafür verwendeten Primer wurden bereits in Punkt 3.2.2 Tabelle 1 aufgelistet. Das
zusätzlich an dieser Stelle getestete Hämolysin A so wie die interne
Amplifikationskontrolle für das Enzym Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase
(gapdh) sind in Tabelle 2 dargestellt.
Tab. 2: Verwendete Primer
Virulenzfaktor Primersequenz 5’-3’ Produktgröße
(bp)
GenBank
Nummer
hlyA-F (forward) ACGATGTGGTTTATTCTGGA 165 NC_009602
hlyA-R (reverse) CTTCACGTGACCATACATAT
gapdh-F (forward) AAAGGCGCTAACTTCGACAA 359 NC_000913
gapdh-R (reverse) GCAGCTTTTTCCAGACGAA
Für die mPCR wurden zunächst die tiefgefrorenen Isolate aufgetaut und auf
Columbia-Schafblutagar über Nacht bei 37 °C angezüchtet. Für die mPCR wurden
die Primer auf eine Endkonzentration von 100 µM eingestellt. Es wurden folgende
Primermischungen hergestellt:
Material und Methoden 59
Primermix 1: Primermix 2:
dH2O 187,5 µl dH2O 187,5 µl
stx1-1 12,5 µl stx1-2 12,5 µl
stx2-1 12,5 µl stx2-2 12,5 µl
eae-1 12,5 µl eae-2 12,5 µl
hlyA-F 12,5 µl hlyA-R 12,5 µl
gapdh-F 12,5 µl gapdh-R 12,5 µl
Zur Erstellung des Templates wurden 100 µl dH2O in einem Eppendorfgefäß
vorgelegt und mit einer Pipettenspitze voll Koloniematerial (max. ½
stecknadelkopfgroße Menge) eine homogene Bakteriensuspension hergestellt.
Dieses Homogenat wurde später als Template in der mPCR verwendet.
Der Mastermix wurde nach folgendem Pipetierschema erstellt:
Reagenz Menge/Einzelansatz
dH2O 10,625 µl
10xPCR-Puffer 2,5 µl
MgCl2 1,0 µl
dNTPs 0,625 µl
Primer-Mix1 2,5 µl
Primer-Mix2 2,5 µl
Taq-Polymerase 0,25 µl
Template 5,0
Gesamtmenge/Einzelansatz 25,0 µl
Die Ziel-DNA wurde in einem Thermocycler nach folgendem Programm amplifiziert:
initiale Denaturierung 94 °C 5:00 min
Denaturierung 94 °C 1:00 min
Anlagerung 57 °C 1:15 min 29 Zyklen
Extension 72 °C 1:45 min
finale Extension 72 °C 5:00 min
60 Material und Methoden
Danach wurde mit den Proben wie in Abschnitt 3.2.8 verfahren.
3.2.7.2 PCR- Kontrolle der Isolate 2009
Zur Kontrolle der mit Hilfe des Colony-Blots identifizierten Isolate wurde eine
Multiplex-PCR zur Detektion der Virulenzgene stx1, stx2, und eae durchgeführt
(modifiziert nach [FRANCK et al. 1998c]). Die dafür verwendeten Primer wurden
bereits in Punkt 3.2.2 aufgelistet. Zusätzlich wurden Primer für das Enzym
Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase als interne Amplifikationskontrolle
eingesetzt (GenBank Accession number: NC_000913). Als Template-DNA diente
lysiertes Koloniematerial der eingefrorenen Isolate, welche zuvor in 100 µl LB-
Medium für 8-12 h bei 37 °C angezüchtet wurden. Als Postitivkontrolle diente auch
hier lysiertes Koloniematerial des Isolates E. coli EDL933.
Die einzelnen Primer wurden auf eine Endkonzentration von 100 µM eingestellt und
der Primermix wie folgt zusammengesetzt:
Primermix 1: Primermix 2:
dH2O 214,2 µl dH2O 214,2 µl
stx1-1 25,0 µl stx1-2 25,0 µl
stx2-1 3,6 µl stx2-2 3,6 µl
eae-1 3,6 µl eae-2 3,6 µl
gapdh-L 3,6 µl gapdh-R 3,6 µl
Material und Methoden 61
Der Mastermix wurde in 0,2 ml PCR-Gefäßen nach folgendem Pipettierschema in
angegebener Reihenfolge hergestellt:
Reagenz Menge/Einzelansatz
dH2O 13,625 µl
10xPCR-Puffer 2,5 µl
MgCl2 1,0 µl
dNTPs 0,625 µl
Primer-Mix1 2,5 µl
Primer-Mix2 2,5 µl
Taq-Polymerase 0,25 µl
Template 2,0 µl
Gesamtmenge/Einzelansatz 25,0 µl
Die Ziel-DNA wurde in einem Thermocycler nach folgendem Programm amplifiziert:
initiale Denaturierung 94 °C 5:00 min
Denaturierung 94 °C 1:00 min
Anlagerung 57 °C 1:15 min 29 Zyklen
Extension 72 °C 1:45 min
finale Extension 72 °C 5:00 min
Auch hier wurden nach Ablauf des Programms die Amplifikate im Thermocycler auf 7
°C gehalten.
3.2.8 Gelelektrophorese
Mit Hilfe der Gelelektrophorese werden DNA-Moleküle entsprechend ihrer Größe
aufgetrennt und können nach Anfärbung mit Ethidiumbromid mit einem
Geldokumentationsgerät unter UV-Licht sichtbar gemacht werden. Im Falle dieser
Arbeit wurden die Amplifikate zunächst mit einem Ladepuffer beschwert und jeweils
11 µl des Ansatzes anschließend in einem 2%igen Agarosegel bei 130 V für 90 min
aufgetrennt. Zur Herstellung des Agarosegels wurde 0,9 g Agarose in 90 ml 1 x TBE
62 Material und Methoden
gelöst und mit 25 ng Ethidiumbromid/ml versetzt. Als Laufpuffer diente 1 x TBE. Die
Geldokumentation erfolgte in dem Geldokumentationsgerät IMAGO.
Die Isolate, welche mindestens eines der Virulenzgene im Bandenmuster erkennen
ließen, wurden zur Serotypisierung an das Robert-Koch Institut nach Wernigerode
geschickt.
Ergebnisse 63
4 Ergebnisse
4.1 Charakterisierung der beprobten Parks
4.1.1 Gehaltene Tierarten
Um das Vorkommen von STEC in deutschen Streichelzoos zu untersuchen wurden
in den Jahren 2008 und 2009 insgesamt 56 Parks mit Streichelgehegen beprobt. Bei
der Auswahl der Parks wurde darauf geachtet, dass diese einer der drei folgenden
Kategorien zugeordnet werden konnten: Zoologischer Garten, Wildpark oder
Freizeitpark mit Tieranteil. Mit der Einteilung der Parks in die verschiedenen
Kategorien sollten eventuelle Unterschiede im Management sowie der
Tierartenvariabilität im Hinblick auf das Erregervorkommen beleuchtet werden.
Insgesamt wurden aus 37 Zoos, 12 Wildparks und 7 Freizeitparks mit Tieranteil
Proben entnommen. Die am häufigsten gehaltene Tierart in deutschen
Streichelgehegen ist die Ziege bzw. Zwergziege, die in 52 der 56 entsprechenden
Parks (93%) angetroffen wurde. Im Durchschnitt lebten in den untersuchten
Gehegen 17,4 Ziegen (Std.-Abw. 10,3). Neben den Ziegen wurden häufig Schafe
gehalten. Die insgesamt 31 schafhaltenden Betriebe (55%) hatten dabei eine
durchschnittliche Herdengröße von 11,0 Tiere (Std.-Abw. 8,3), die sowohl alleine als
auch in Vergesellschaftung mit Ziegen gehalten wurden. Die dritthäufigste Tierart in
den Parks waren Schweine (12 Gehege; 21%). Schweine wurden in der Regel nicht
in von Besuchern begehbaren Gehegen angetroffen, was höchstwahrscheinlich mit
dem im Vergleich zu Schaf und Ziege höherem Unfall- und Verletzungsrisiko der
Besucher zusammenhängt. Allerdings konnten alle in diese Studie miteinbezogenen
Schweine durch Absperrungen hindurch gestreichelt oder gefüttert werden, so dass
die Besucher intensiven Kontakt zu den Tieren haben. Die Schweinehaltungen
wiesen eine durchschnittliche Herdengröße von 6,7 Tieren (Std.-Abw. 5,0) auf.
Weitere häufiger auftretende Tierarten waren Pferde und Ponies (10 Betriebe; Ø 3,6
Tiere) und Kaninchen (8 Betriebe; Ø 20,4 Tiere). Nur vereinzelt in den
Streichelgehegen gehaltene und daher nicht den klassischen Streicheltieren
zuzurechnende Arten waren Rinder, Meerschweinchen, Esel, Geflügel, Damwild,
64 Ergebnisse
Lamas und Kängurus. In Tabelle 3 sind die Tier- und Zoozahlen für die Jahre 2008
und 2009 einzeln sowie insgesamt aufgeführt.
Tab. 3: Tier- und Zoozahlen der Jahre 2008 und 2009.
Tierart Anzahl
Zoos
gesamt
n=56
(%)
Anzahl
Zoos
2008
n=24 (%)
Anzahl
Zoos
2009
n=32 (%)
Tierzahl
gesamt
Tierzahl
2008
Tierzahl
2009
Ziege 52 (93) 20 (83,3) 32 (100) 903 420 483
Schaf 31 (55) 14 (58,3) 17 (53,1) 339 144 195
Schwein 12 (21) 5 (20,8) 7 (21,9) 80 30 50
Rind 4 (7) 1 (4,1) 3 (9,4) 22 1 21
Pferd / Pony 10 (18) 4 (16,6) 6 (18,8) 36 16 20
Esel 8 (14) 3 (12,5) 5 (15,6) 25 4 21
Kaninchen 8 (14) 3 (12,5) 5 (15,6) 163 111 52
Meerschweinchen 3 (5) 2 (8,3) 1 (3,1) 31 9 22
Lama 2 (4) 0 (0) 2 (6,3) 3 0 3
Damwild 3 (5) 2 (8,3) 1 (3,1) 34 20 14
Känguru 1 (2) 1 (4,2) 0 (0) 4 4 0
Geflügel 2 (4) 2 (8,3) 0 (0) 14 14 0
4.1.2 Ställe und Gehege
In fast allen Einrichtungen wurden die Tiere in einer ganzjährigen Offenstallhaltung
gehalten, d.h. die Tiere konnten unabhängig von der Jahreszeit selbst wählen, ob sie
sich im Stall oder im Freigehege aufhielten. Lediglich fünf Betriebe hielten ihre Tiere
während der Wintermonate ausschließlich im Stall. Der Stall diente in der Regel auch
als Rückzugsbereich für die Streicheltiere, da dieser für die Besucher meist nicht
zugänglich war. Die durchschnittliche Größe der Streichelgehege betrug 1.273 qm,
wobei das Minimum bei 20 qm und das Maximum bei 10.000 qm lag. Mit
eingerechnet wurde hierbei die komplette Fläche, die allen im Park lebenden
Ergebnisse 65
Streicheltieren zur Verfügung stand. Das Maximum von 10.000 qm in einem Park
errechnete sich somit aus den Gehegen für Ziegen, Schafe, Schweine, Kaninchen
und Meerschweine sowie Kängurus und dem Damwild, welchem ein erheblicher Teil
der Fläche zustand. In allen Betrieben war die Belegzahl der jeweiligen
Gehegegröße angepasst, so dass den Tieren die Möglichkeit gegeben war, sich
sowohl von Besuchern als auch Artgenossen zurückzuziehen.
4.1.3 Gehegehygiene und Management
Die untersuchten Streichelzoos waren grundsätzlich sehr ähnlich aufgebaut. Der
Untergrund der Stallungen war zumeist gepflastert oder betoniert, wohingegen die
Ausläufe oft unbefestigt waren und aus Wiese, Schotter oder Kies bestanden. In
92,9% der Parks wiesen die Streicheltiergehege einen nur teilweise oder nicht
befestigten Bodenbelag auf. Nur in vier Betrieben (7,1%) war der Bodenbelag des
kompletten Geheges, d.h. Stallbereich und Auslaufbereich befestigt. Im Fall der
teilweise befestigten Bodenbeläge wiesen meist nur der Stallbereich und kleine Teile
des Auslaufbereiches einen befestigten Stein- oder Betonboden auf.
Ein unbefestigter Sand-, Kies oder Wiesenboden erschwert die
Reinigungsbedingungen enorm. Eine Nassreinigung sowie eine regelmäßige
Desinfektion sind auf solchen Böden nicht möglich. Aufgrund dessen gaben 47
(83,9%) der 56 Parks an, ihre Ställe lediglich trocken zu säubern. Auch die Ausläufe
wurden von 49 Betrieben (87,5%) ausschließlich trocken gereinigt. Die Ausläufe
wurden von 49 Zoos täglich, von drei Betrieben wöchentlich und von vier bei Bedarf
gereinigt. Außerdem gaben 16 (28,6%) der 56 Gehegebetreiber an, nach der
Reinigung zu desinfizieren. Die Desinfektion beschränkte sich aufgrund der
Praktikabilität jedoch rein auf das Ausbringen von Brandkalk in maximal jährlichem
Turnus. Das Wechseln des unbefestigten Bodenbelages, vor allem im Bereich der
Ausläufe, nahmen laut Umfrage 18 Parks (32,1%) vor, wobei häufig nicht der
gesamte Belag gewechselt, sondern Sand oder Rollsplitt etc. nachgestreut wird.
Bei der Verwendung der Werkzeuge, wie Schaufel, Harke oder Schubkarre im
Streichelgehege, fiel auf, dass 28 Parks (50%) die Werkzeuge außer im
Streichelbereich auch in anderen Tiergehegen verwendeten. Allerdings führte nur
einer dieser Parks immer eine Reinigung der Werkzeuge zwischen der Nutzung in
66 Ergebnisse
den jeweiligen Gehegen durch. Eine unregelmäßige Reinigung der Werkzeuge
zwischen der Nutzung in den jeweiligen Gehegen fand bei elf der 28 Parks (39%)
statt. In 16 dieser Parks (57%) fand nie eine Reinigung zwischen den
Gehegewechseln statt. Eine regelmäßige Desinfektion der Geräte vor dem
Gehegewechsel wurde in keinem der Parks durchgeführt.
In den meisten Anlagen (96%) waren die Tierpfleger neben den Streicheltieren
zusätzlich auch für andere Tierarten zuständig. Eine Reinigung der Hände vor dem
Gehegewechsel erfolgte jedoch nur in 20 Zoos (35,7%), eine Desinfektion der Hände
sogar nur in acht Parks (14,3%). Stiefel wurden vor einem Gehegewechsel in sieben
Zoos (12,5%) gereinigt und in fünf Zoos (8,9%) desinfiziert.
4.1.4 Weitere Angaben zu den beprobten Gehegen
Die deskriptive Auswertung aller Fragebogenantworten kann dem Anhang (Tabelle
16) entnommen werden.
4.1.5 Statistische Auswertung der Fragebögen
Die statistische Auswertung erfolgte mit Hilfe des Softwareprogramms SAS 9.3. Als
statistischer Test wurde der Fisher’s exact test für kleine Stichprobenanzahlen
gewählt. Aufgrund der geringen Anzahl an STEC/EPEC negativen Parks errechnet
sich in nur einem Fall ein signifikantes Ergebnis. So lassen sich ein Zusammenhang
zwischen landwirtschaftlicher Tierhaltung der Tierpfleger und ein geringerer
Nachweis an STEC/EPEC feststellen (p=0,0033). Die komplette statistische
Auswertung kann der Tabelle 15 im Anhang entnommen werden
4.2 Nachweis von STEC aus Proben des Jahres 2008
Im Jahr 2008 wurden insgesamt 24 Streichelgehege untersucht, wovon 15 Betriebe
der Kategorie „Zoo“, 7 der Kategorie „Wildpark“ und 2 der Kategorie „Freizeitpark mit
Tieranteil“ zugeordnet wurden. Die Streichelgehege beherbergten insgesamt 11
unterschiedliche Tierarten. Zusätzlich zu den untersuchten Ziegen, Schafen,
Schweinen, Kaninchen, Meerschweinchen, Pferden/ Ponies, Eseln, Rindern,
Damwild, Kängurus und Geflügel wurden aus 17 Betrieben (71%) Insektenproben in
Ergebnisse 67
die Untersuchung auf STEC mit einbezogen. In Abbildung 2 ist der Probenumfang
aus dem Jahr 2008 dargestellt.
Die Sammelkotproben und auch die Insektenproben wurden nach einer
Anreicherung sowohl auf Sorbitol MacConkey-Selektivagar (SMAC-Agar)
angezüchtet als auch mit der immunomagnetischen Separation mit Hilfe O157-
spezifischer Antikörper bearbeitet. Hiernach konnten STEC-verdächtige Keime
kulturell isoliert werden. Anschließend wurden die Isolate mit Hilfe einer Multiplex
PCR (mPCR) auf die Virulenzgene eae, stx1, stx2 und hlyA untersucht und
anschließend vom Robert-Koch Institut (RKI) serotypisiert. Aus 566 untersuchten
Sammelkotproben konnten sieben Proben (1,2% der gesammelten Proben) als
STEC-positiv identifiziert werden. Die positiven Proben stammten aus drei
verschiedenen Betrieben (12,5%), die alle der Kategorie „Wildpark“ angehörten. Aus
den 17 Insektenproben konnten keine STEC-positiven Isolate gewonnen werden.
Probenumfang 2008 (n=583) Ziege
Schaf
Damwild
Rind
Schwein
Kaninchen
Meerschweinchen
Pony/ Pferd
Esel
Känguru
Geflügel
Insekten
Abb. 2: Untersuchter Probenumfang im Jahr 2008, n=583
4.2.1 Nachweis von STEC aus Kaninchen (Wildpark 105)
Eine STEC-positive Probe stammte von einem Kaninchen aus Wildpark 105. Dies
entspricht 20% der kaninchenhaltenden Zoos (n=5) und 3,7% der insgesamt in 2008
von Kaninchen gesammelten Proben (n=27; Tabelle 4). Während bei der ersten
Beprobung von Wildpark 105 eine von fünf Proben (20%) STEC-positiv getestet
68 Ergebnisse
wurde, konnte aus den fünf bei der zweiten Beprobung genommenen Proben kein
STEC isoliert werden. Ebenso wurde kein STEC von den in Wildpark 105 gehaltenen
Ziegen (insgesamt vier Proben), Schafen (10) und Schweinen (9), Meerschweinchen
(9), Damwild (10) und Känguru (4) isoliert.
Aus der positiven Kaninchenprobe konnte ein Isolat gewonnen werden. Das Isolat
konnte vom RKI der Serogruppe O157:H- zugeordnet werden und trug alle vier
getesteten Virulenzgene (eae, stx1, stx2 und hlyA; Tabelle 5).
4.2.2 Nachweis von STEC aus Ziegen (Wildpark 107)
In einem weiteren Wildpark (Wildpark 107) konnte aus insgesamt fünf von Ziegen
gesammelten Proben STEC isoliert werden. Dies entspricht 4,8% der
ziegenhaltenden Zoos (n=21) und 2,0% der in 2008 untersuchten Ziegenproben
(n=245; Tabelle 2). In der ersten Beprobung von Wildpark 107 konnten aus vier der
sieben gesammelten Ziegenproben (57%) insgesamt 39 STEC-Isolate angezüchtet
werden, während in der zweiten Beprobung nur noch in einer der sieben Proben
(14%) ein einzelnes STEC-Isolat gefunden wurde. Wildpark 107 hielt keine weiteren
Streicheltiere, von denen STEC hätte isoliert werden können.
Die insgesamt 40 STEC-Isolate wiesen alle dasselbe Virulenzgen-Muster auf (positiv
für stx1, stx2 und hlyA, negativ für eae) und waren serologisch nicht typisierbar (Ont;
Tabelle 5).
4.2.3 Nachweis von STEC aus Schafen (Wildpark 110)
Eine positive Probe stammte von einem Schaf aus Wildpark 110. Dies entspricht
6,7% der schafhaltenden Zoos (n=15) und 0,7% der in 2008 untersuchten
Schafproben (n=142; Tabelle 2). Die positive Probe stammte aus der ersten
Probennahme des Zoos (fünf Schafproben), während bei der zweiten Beprobung
(vier Schafproben) kein STEC detektiert wurde. Von den weiteren in Park 110
gehaltenen Tierarten (Ziegen, 10 Proben) konnte bei keiner der beiden Beprobungen
STEC isoliert werden.
Alle sechs aus der positiven Probe angezüchteten Isolate wiesen dasselbe
Virulenzgen-Muster (positiv für stx2 und hlyA, negativ für stx1 und eae) auf und
waren serologisch nicht typisierbar (Ont; Tabelle 5).
Ergebnisse 69
Tab. 4: Detektierte STEC im Jahr 2008
Tierart Anzahl
Betriebe
(%)
Anzahl
STEC pos.
Zoos (%)
Anzahl STEC-
pos. Proben in
allen Zoos (%)
Anzahl STEC-pos.
Proben im STEC-
pos. Zoo (%)
Anzahl
STEC
Isolate
Ziege 21 (87,5) 1/21 (4,8) 5/245 (2,0) 5/14 (35,7) 40
Schaf 15 (62,5) 1/15 (6,7) 1/142 (0,7) 1/9 (11,1) 6
Kaninchen 5 (20,8) 1/5 (20,0) 1/27 (3,7) 1/10 (10,0) 1
Tab. 5: Übersicht STEC-Isolate aus im Jahr 2008 beprobten Streichelgehegen
Zoo
Nr.
Tierart Anzahl Virulenzgene Serogruppe
Proben Isolate stx1 stx2 eae hlyA
107 Ziege 5 40 + + - + Ont
110 Schaf 1 6 - + - + Ont
105 Kaninchen 1 1 + + + + O157
4.2.4 Isolation von STEC mittels verschiedener Anzucht-Methoden
Die Anzucht von STEC aus den untersuchten Proben erfolgte 2008 mit und ohne
vorherige O157-spezifische immunomagnetische Seperation (IMS). Der Präpara-
tionsanatz ohne vorherige IMS wurde auf SMAC-Agar kultiviert, die Präparation mit
vorangegangener IMS wurde auf SMAC- und CT-SMAC-Agar kultiviert.
Insgesamt wurden 13 der 40 Ont Isolate aus Ziegen (32,5%) auf SMAC-Platten ohne
vorherige IMS isoliert, 15 (37,5%) der Isolate konnten von einer SMAC-Platte nach
IMS gewonnen werden und die verbleibenden 12 Isolate (30,0%) stammten von CT-
SMAC-Platten nach Durchführung der IMS. Die sechs Schafisolate (alle Ont) wurden
alle nach Durchführung einer IMS isoliert, wobei ein Isolat auf CT-SMAC-Agar und
die verbleibenden fünf Isolate auf SMAC-Agar angezüchtet wurden. Das einzige
Kaninchen-Isolat (O157) stammte von einer SMAC-Platte ohne vorangegangene IMS
(Tabelle 6).
70 Ergebnisse
Tab. 6: Anzahl STEC Isolate nach verschiedenen Isolierungs-Methoden
Park Tierart Isolate Sero-
gruppe
ohne IMS mit IMS
SMAC SMAC CT-SMAC
105 Kaninchen 1 O157 1 - -
107 Ziege 40 Ont 13 15 12
110 Schaf 6 Ont - 5 1
4.3 Nachweis von STEC/EPEC aus Proben des Jahres 2009
Im Jahr 2009 wurden im Zeitraum April bis Mitte Oktober 32 Streichelgehege
beprobt. Insgesamt wurden 975 Proben untersucht, wobei es sich um 951
Sammelkotproben und 24 Insektenproben handelte. Die Anzahl der gesammelten
Kotproben variierte je nach Herdengröße und wurde für jeden Park basierend auf der
Hypergeometrischen Verteilung berechnet. Dafür wurde eine Innerherdenprävalenz
von 20% sowie eine Sicherheitswahrscheinlichkeit (1-α) von 95% festgelegt. Der
Probenumfang für das Jahr 2009 ist in Abbildung 3 dargestellt. Auch hier wurden die
Proben zunächst angereichert, um sie anschließend mit der IMS zu bearbeiten. Im
Vergleich zu 2008 wurde die IMS um Antikörper gegen die O-Serogruppen O103,
O145, O111 und O26 erweitert. Nach der IMS wurde das Probenmaterial auf SMAC-
und CT-SMAC-Platten kultiviert. Nach 24 Stunden Inkubation wurde das gesamte
Kulturmaterial abgeschwemmt und mittels mPCR auf Vorhandensein der
Virulenzgene stx1, stx2 und eae getestet („Screening-PCR“, PCR 1). Alle Proben, die
in der mPCR für zumindest eines dieser Virulenzgene positiv getestet wurden,
wurden für die weitere Anzucht ausgewählt. Hierfür wurde verdünntes
Abschwemmungsmaterial auf LB-Platten ausgestrichen und einer Colony-Blot-
Hybridisierung mit Sonden für alle drei Virulenzgene unterzogen. Positive
Einzelkolonien wurden subkultiviert und mit einer weiteren mPCR („Kontroll-PCR“,
PCR 2) auf die Virulenzgene stx1, stx2 und eae geprüft. Neben ausgewählten STEC-
Isolaten wurden aufgrund des humanpathogenen Potentials auch EPEC-Isolate, die
nur Intimin (eae) als Virulenzgen aufwiesen, zur Serotypisierung an das Robert-Koch
Institut geschickt und somit in die Auswertungen miteinbezogen.
Ergebnisse 71
Probenumfang 2009 (n=975) Ziege
Schaf
Damwild
Rind
Lama
Schwein
Kaninchen
Meerschweinchen
Pony/ Pferd
Esel
Insekten
Abb. 3: Untersuchter Probenumfang im Jahr 2009, n=975
Wie viele der untersuchten Proben in den 32 Zoos der einzelnen Tierarten positiv
getestet wurden ist in Abbildung 4 dargestellt. In den einzelnen Parks waren 0% bis
über 80% der Proben für STEC/EPEC positiv. Bei den kleinen Wiederkäuern waren
in einem Zoo sowohl bei der Ziege als auch beim Schaf mehr als 87% der Proben
positiv. Beim Rind dagegen waren maximal 39% der Proben positiv und beim
Damwild 11%. Die Schweineproben waren zwischen 0% und 45% positiv.
72 Ergebnisse
Abb. 4: Anzahl positiver Proben der einzelnen Tierarten sowie aller Proben in
Prozent der einzelnen Parks.
4.3.1 Auswertungen auf Probenebene
Von den 2009 insgesamt untersuchten 951 Kotproben und 24 Insektenproben waren
in der Screening-PCR insgesamt 309 Proben (31,7%) positiv für mindestens eines
der drei getesteten Virulenzgene. Am häufigsten wurde dabei das stx1 Gen detektiert
(66,7%), während das stx2 Gen (33,9%) und das eae Gen (32,0%) weniger oft in der
Screening-PCR nachgewiesen wurden.
Die 309 positiv getesteten Proben wurden weiterführenden Untersuchungen
unterzogen. Da zur Weiterverarbeitung eine stark verdünnte Menge der
Abschwemmungen verwendet wurde, konnten im Colony-Blot nicht alle zuvor in der
Screening-PCR positiven Proben als positiv bestätigt werden. Eine komplette
Übereinstimmung in allen Virulenzgenen zeigten 123 (39,8%) Proben. Eine
Übereinstimmung in mindestens einem detektierten Virulenzgen zeigten 73 (23,6%)
Proben, deren Isolate nachfolgend ebenfalls serotypisiert wurden. Weitere sechs
Proben stimmten in ihrem Virulenzmuster in PCR 1 und PCR 2 zwar nicht überein,
wiesen jedoch in beiden PCR-Reaktionen mindestens ein Virulenzgen auf und
wurden somit auch in die Serotypisierung miteinbezogen. Proben, die zwar in der
Ergebnisse 73
Screening-PCR für ein oder mehrere Virulenzgene positiv waren, deren im Colony-
Blot gewonnene Isolate in der Kontroll-PCR jedoch negativ waren, wurden nicht
serotypisiert.
In 123 (39,8%) der 309 Proben konnten in der Kontroll-PCR die gleichen
Virulenzgene nachgewiesen werden wie in der vorangegangenen Screening-PCR
der Abschwemmung. Betrachtet man die Wiederfindungsrate der einzelnen
Virulenzgene in der Kontroll-PCR (PCR 2) versus der Screening-PCR (PCR 1) so
stellt sich dies für stx1 folgendermaßen dar:
Tab. 7: Wiederfindungsrate von Isolaten mit dem Virulenzgen stx1 in mit der
Screening-PCR (PCR 1) positiv auf stx1 getesteten Proben.
PCR 1
+ - Total
PC
R 2
(Iso
late
) + 137 12 149
- 69 91 160
T 206 103 309
Von den 206 in der Screening-PCR (PCR 1) positiv auf stx1 getesteten Proben
konnten aus 137 Proben (66,5%) E. coli isoliert werden, die mit Hilfe der Kontroll-
PCR (PCR 2) als stx1 positiv bestätigt wurden. Darüber hinaus wurden 103 Proben
weiter untersucht, die in der Screening-PCR negativ für stx1 getestet wurden, jedoch
positiv für mindestens eines der beiden weiteren untersuchten Virulenzgene stx2 und
eae waren. Dabei konnten aus 12 (11,7%) dieser Proben stx1 positive Stämme
isoliert werden.
74 Ergebnisse
Übereinstimmungen des Virulenzgens stx2 sowohl in der Screening-PCR als auch in
der Kontroll-PCR sind in Tabelle 8 dargestellt.
Tab. 8: Wiederfindungsrate des Virulenzgens stx2 in PCR 1 vs. PCR 2
PCR 1
+ - Total
PC
R 2
(Iso
late
) + 61 26 87
- 43 179 222
T 104 205 309
Von den 206 in der Screening-PCR (PCR 1) positiv auf stx2 getesteten Proben
konnten aus 61 (58,7%) Isolate isoliert werden, die mit Hilfe der Kontroll-PCR (PCR
2) als stx2 positiv bestätigt wurden. Des Weiteren konnten aus 12,7% der in der
Screening-PCR negativ für stx2 getestete Proben in der Kontroll-PCR stx2 positive
Isolate bestätigt werden.
Die Übereinstimmungsrate des eae-Gens in PCR1 vs. PCR2 ist in Tabelle 9
dargestellt.
Tab. 9: Wiederfindungsrate von eae in PCR 1 vs. PCR 2
PCR 1
+ - Total
PC
R 2
(Iso
late
) + 48 19 67
- 51 191 242
T 99 210 309
Von den 206 in der Screening-PCR (PCR 1) positiv auf eae getesteten Proben
konnten aus 48 Proben (48,5%) Isolate isoliert werden, die mit Hilfe der Kontroll-PCR
(PCR 2) als eae positiv bestätigt wurden. Des Weiteren konnten aus 9,0% der in der
Ergebnisse 75
Screening-PCR negativ für eae getestete Proben in der Kontroll-PCR eae positive
Isolate bestätigt werden.
4.3.2 Auswertungen auf Parkebene
In 27 der 32 im Jahr 2009 beprobten Parks wurde STEC/EPEC in Kotproben
detektiert, was einer Prävalenz von 84,4% (α=0,05 CI: 71,8%-97,9%) entspricht.
4.3.3 Serotypisierung von STEC Isolaten
Die Serotypisierung der STEC Isolate am Robert-Koch Insitut ergab das
Vorhandensein 32 verschiedener Serogruppen sowie der Gruppe Orauh
(Serogruppe aufgrund Autoagglutination nicht weiter bestimmbar) und weiterer
Isolate, deren Oberflächenantigene nicht typisierbar waren (Ont). Die Isolate
stammten aus Ziegen, Schafen, Rindern, Schweinen, Lamas und Damwild. Die
Anzahl positiver Zoos für die jeweiligen Serogruppen und Tierarten sind in Tabelle 10
einzeln aufgeführt.
Die insgesamt am häufigsten detektierten Serogruppen waren O76 (40,6% der
Zoos), O26 (31,3%) sowie O5 und O103 (jeweils 28,1%). Weitere häufig isolierte
Serogruppen sind in Abbildung 5 dargestellt.
76 Ergebnisse
Tab. 10: Anzahl positiver Zoos je Serogruppe und Tierart
Sero-
gruppe
pos. Zoos
(n=32)
(%)
Anzahl positive Zoos nach Tierart (%)
Ziege
(n=30)
Schaf
(n=17)
Rind
(n=3)
Schwein
(n=7)
Lama
(n=1)
Damwild
(n=1)
O3 1 (3,1) - 1 (5,9) - - - -
O5 7 (21,9)) 6(20,0) 2(11,8) - 1 (14,3) - -
O8 1 (3,1) 1 (3,3) - - - - -
O15 1 (3,1) 1 (3,3) - - - - -
O21 2 (6,3) 2 (6,7) - - - - -
O23 1 (3,1) 1 (3,3) - - - - -
O25 1 (3,1) 1 (3,3) - - - - -
O26 4 (12,5) 2 (6,7) 2 (11,8) 1 (33,3) 1 (14,3) - -
O39 1 (3,1) - 1 (5,9) - - - -
O43 2 (6,3) 2 (6,7) 1 (5,9) - - - -
O55 2 (6,3) 1 (3,3) 1 (5,9) - - - -
O75 2 (6,3) 1 (3,3) 1 (5,9) - - - -
O76 10 (31,7) 8 (26,7) 3 (17,6) - - - -
O83 1 (3,1) 1 (3,3) - - - - -
O84 1 (3,1) 1 (3,3) - - - - -
O91 3 (9,4) 2 (6,7) - - - - 1 (100)
O103 5 (15,6) 4 (13,3) 1 (5,9) - 2 (28,6) 1 (100) -
O113 7 (21,9) 4 (13,3) 3 (17,6) - - - -
O128 2 (6,3) 1 (3,3) 1 (5,9) - - - -
O132 1 (3,1) - - 1 (33,3) - - -
O135 1 (3,1) - 1 (5,9) - - - -
O142 1 (3,1) - - 1 (33,3) - - -
O145 4 (12,5) 3 (10,0) 1 (5,9) - 1 (14,3) - -
O146 6 (18,8) 3 (10,0) 4 (23,5) - - - -
O148 1 (3,1) - 1 (5,9) - - - -
O153 2 (6,3) - 1 (5,9) - - 1 (100) -
Ergebnisse 77
Tab. 10: Anzahl positiver Zoos je Serogruppe und Tierart (Fortsetzung)
Sero-
gruppe
pos. Zoos
(n=32)
Anzahl positive Zoos nach Tierart (%)
Ziege
(n=30)
Schaf
(n=17)
Rind
(n=3)
Schwein
(n=7)
Lama
(n=1)
Damwild
(n=1)
O156 5 (15,6) 3 (10,0) 4 (23,5) - - - -
O157 2 (6,3) 1 (3,3) 1 (5,9) 1 (33,3) - - -
O159 1 (3,1) 1 (3,3) - - - - -
O174 1 (3,1) 1 (3,3) 1 (5,9) - - - -
O176 1 (3,1) - 1 (5,9) - - - -
O179 1 (3,1) 1 (3,3) - - - - -
Orauh 3 (9,4) 3 (10,0) - - - - -
Ont 13 (40,6) 8 (26,7) 9 (52,9) 1 (33,3) 2 (28,6) - 1 (100)
Abb. 5: Die häufigsten vorkommenden Serogruppen prozentual in 32 beprobten
Zoos.
78 Ergebnisse
Die größte Serogruppenvariabilität konnte bei Ziegen und Schafen mit je 22
verschiedenen Serogruppen festgestellt werden, gefolgt vom Schwein mit sieben
Serogruppen. Die vorherrschende Serogruppe bezogen auf die die jeweilige Tierart
haltenden Parks war bei der Ziege O76 (26,7%), beim Schaf O146 und O156 (je
23,6%) und beim Schwein O103 (28,6%). Die jeweils vier am häufigsten detektierten
Serogruppen bei diesen drei Tierarten sind in Abbildung 6 dargestellt.
Abb. 6: Die häufigsten vorkommenden Serogruppen prozentual in 32 beprobten
Zoos bei Ziegen (n=30 Zoos), Schafen (n=17 Zoos) und Schweinen (n=7
Zoos)
4.3.4 Virulenzgene in STEC Isolaten
Die im Jahr 2009 angezüchteten E. coli Isolate wurden mittels mPCR auf das
Vorhandensein der Virulenzgene stx1, stx2 und eae getestet. Aus den untersuchten
Proben konnten Isolate mit allen sieben möglichen Kombinationen dieser
Virulenzgene detektiert werden (Abbildung 7A). Am häufigsten konnten dabei
Stämme mit den Virulenzgenen eae (69%), stx1 (65%) oder stx1/stx2 (47%)
Ergebnisse 79
festgestellt werden. Kombinationen von stx-Genen mit eae (stx1/eae, stx2/eae oder
stx1/stx2/eae) traten dagegen nur in 3 bis 6% der Zoos auf.
Die Parks waren in der Regel positiv für mehrere Virulenzgen-Kombinationen.
Lediglich aus einem Park konnten ausschließlich Isolate gewonnen werden, die nur
das Virulenzgen eae trugen. Die Probe stammte von einem Lama.
80 Ergebnisse
Abb. 7: Verteilung der Virulenzmuster der im Jahr 2009 getesteten Zoos. (A) alle
Zoos; n=32; (B) Zoos mit Ziegenhaltung, n=30; (C) Zoos mit Schafhaltung;
n=17; (D) Zoos mit Schweinehaltung; n=7
Abbildung 7B bis 7D vergleicht die Verteilung der Virulenzgen-Muster in den drei im
Rahmen dieser Studie am häufigsten STEC/EPEC-positiv getesteten Tierarten
Ziege, Schaf und Schwein. Die in dieser Arbeit untersuchten Ziegenproben wiesen
alle sieben möglichen Virulenzgen-Muster auf. Das alleinige Vorkommen von stx1
Ergebnisse 81
war jedoch das am häufigsten detektierte Muster (63,3%) bezogen auf die Ziegen
haltende Gesamtstreichelzooanzahl. Bei den Schafproben konnten sechs
Virulenzmuster nachgewiesen werden, wobei hier eae als alleiniges Virulenzgen am
häufigsten vorkam (64,7%). Beim Schwein wurden insgesamt nur drei verschiedene
Virulenzmuster festgestellt. Dabei handelte es sich um die jeweils einzeln
auftretenden Virulenzgene stx1 (28,6%), stx2 (14,3%) oder eae (42,9%).
Kombinationen dieser Gene konnten beim Schwein im Rahmen dieser Studie nicht
nachgewiesen werden.
Die auftretenden Virulenzgenkombinationen der einzelnen Serogruppen sind in
Tabelle 11 dargestellt.
82 Ergebnisse
Tab. 11: Virulenzgenkombinationen der Serogruppen
Serotyp auftretende Genotypen
stx1 stx1 stx1 - stx1- - -
stx2 stx2 - stx2 - stx2 -
eae - - - eae eae eae
O3 x
O5 x x
O8 x
O15 x
O21 x
O23 x
O25 x
O26 x x
O39 x x
O43 x x
O55 x
O75 x x
O76 x x
O83 x
O84 x
O91 x x x
O103 x x
O113 x x
O128 x
O132 x
O135 x
O142 x
O145 x x x
O146 x x x
O148 x
Ergebnisse 83
Tab. 11: Virulenzgenkombinationen der Serogruppen (Fortsetzung)
Serotyp auftretende Genotypen
stx1 stx1 stx1 - stx1- - -
stx2 stx2 - stx2 - stx2 -
eae - - - eae eae eae
O153 x
O156 x x x
O157 x x
O159 x
O174 x
O176 x
O179 x
Orauh x x x x
Ont x x x x x x
Von den 201 serotypisierten Proben wurde die Serogruppe O146 in 34 (16,9%)
Proben als häufigste Serogruppe detektiert. In 33 (16,4%) Proben wurden E. coli der
Serogruppe O76 nachgewiesen. O157 konnte lediglich in sieben (3,5%) Proben
detektiert werden. Eine Übersicht der häufigsten Serogruppen bezogen auf die
serotypisierte Gesamtprobenzahl ist in Abbildung 8 dargestellt.
84 Ergebnisse
Abb. 8: Die häufigsten Serogruppen bezogen auf die serotypisierte
Gesamtprobenzahl, n=201
Betrachtet man das Auftreten der Serogruppen geographisch unterteilt nach
Postleitzahlengebieten, so wurde die Serogruppe O76 in 50% (5) der PLZ-Gebiete
gefunden. In 30% (3) handelt es sich sogar um die häufigste Serogruppe. In weiteren
30% wurde die Serogruppe O146 detektiert. Das Auftreten der Serogruppen in
geographischer Abhängigkeit ist in Abbildung 9 und Tabelle 12 dargestellt. Die
Unterteilung erfolgte nach Postleitzahlengebieten. Die Serogruppenverteilung
innerhalb der einzelnen Tierarten Ziege, Schaf und Schwein ist in Abbildung 10
dargestellt.
Ergebnisse 85
Tab. 12: Auftreten der Serogruppen in geographischer Abhängigkeit.
PLZ Untersuchte
Zoos (n)
Untersuchte
Proben (n)
pos. Proben
insgesamt (n)
Serogruppenauftreten
in% aus pos. Proben
0 6 186 23 30% O76
26% O146
8,7%O103
1 3 82 9 44% O76
33% O157
22% O23
2 0 - - -
3 1 33 4 75% O156
25% O113
4 1 24 3 100% O76
5 1 37 0 0
6 5 118 54 44% O146
20% O76
13% O21
7 6 182 38 26% O5
18% O76
13% 156
8 3 138 43 40% O26
21% O43
19% O103
9 6 175 28 14% O145
14% O146
11% O5
86 Ergebnisse
Abb. 9: Die am häufigsten vorkommenden Serogruppen in den jeweiligen
Postleitzahlengebieten.
Ergebnisse 87
Abb. 10: Serogruppenverteilung bei den Tierarten Ziege, Schaf und Schwein in%
bezogen auf die serotypisierte Gesamtprobenzahl, n= 201
Das Vorkommen der verschiedenen Genotypen in den untersuchten Proben ist in
Abbildung 11 dargestellt. Shigatoxin 1 wurde in 96 Proben detektiert, Shigatoxin 1
und Shigatoxin 2 in Kombination sowie Intimin als alleiniges Virulenzgen wurden
jeweils in 59 der Proben detektiert. Lediglich in zwei Proben konnten alle drei
Virulenzgene gleichzeitig detektiert werden.
88 Ergebnisse
Abb. 11: Verteilung der Virulenzmuster anhand der 201 in der Kontroll-PCR
untersuchten Proben
4.3.5 Auswertung auf Isolatebene
Eine Auswertung der Serogruppen- und Genotypverteilung auf Isolateebene
erscheint in dieser Studie nur bedingt sinnvoll, da die mittels PCR typisierte
Isolateanzahl aus den Colony-Blots aus Kostengründen auf maximal fünf Kolonien je
Probe begrenzt wurde und mögliche weitere positive Kolonien nicht bearbeitet
wurden. Insgesamt wurden 1222 Isolate nach der Southern Hybridisierung gepickt
und in einer weiteren Kontroll-PCR auf ihre Virulenzgene hin untersucht. Aus jeder
Probe wurden diejenigen Isolate serotypisiert, die unterschiedliche Virulenzmuster
aufwiesen. Es handelte sich dabei um insgesamt 296 Isolate. Bei 64 Isolaten war der
O-Serotyp nicht typisierbar, bei sechs Isolaten entsprach er Orauh. In Abbildung 12
sind die häufigsten Serotypen auf Isolatebene dargestellt.
Ergebnisse 89
Abb. 12: Anzahl der Isolate der häufigsten Serogruppen, serotypisierte
Gesamtisolatanzahl n= 296.
4.3.6 Vergleich des STEC/EPEC Nachweises zwischen der ersten Beprobung
der Zoos und der Nachuntersuchung
Mit der Probennahme in den Zoos im zweiwöchigen Abstand sollte analysiert
werden, inwiefern die einzelnen Serotypen bei der zweiten Beprobung in derselben
Tierart wieder zu finden waren, und ob diese Serotypen auch aus anderen Tierarten
des gleichen Geheges isoliert werden konnten. Durch dieses Verfahren konnte
gezeigt werden, dass einige Streichelgehege lediglich bei einer der zwei
Beprobungen positiv für STEC/EPEC waren, was die These der intermittierenden
Ausscheidung erhärtet (ROBINSON et al. 2004).
4.3.6.1 Verlauf des EPEC-Nachweises in ausgewählten Streichelgehegen.
In den Zoos Nr. 19, 41 sowie 43, welche nur Ziegen hielten, waren die Proben und
somit der Zoo jeweils nur bei einer Beprobung positiv. In Zoo 42 waren die
Damwildproben sowie die Schaf- und Ziegenproben lediglich bei der ersten
90 Ergebnisse
Beprobung positiv, bei der zweiten waren alle Proben der drei Tierarten negativ.
Ebenso verhielt es sich bei Zoo 72, welcher in der ersten Beprobung negativ war, in
der zweiten jedoch sowohl positive Schaf- als auch Ziegenproben aufwies.
Tab. 13: Übersicht zum Verlauf des STEC/EPEC-Nachweises in der ersten und
zweiten Beprobung in ausgewählten Gehegen.
Zoo Tierart Beprobung vorhandene Genkombinationen in den Proben
1 2 stx1 stx2 stx1 /stx2 eae
19 Ziege + - x x
41 Ziege + - x x x
42 Ziege + - x
Schaf + - x x
Damwild + - x
43 Ziege + - x
72 Ziege - + x x
Schaf - + x
4.3.6.2 Wiederfindungsrate der Serogruppen in ausgewählten Zoos:
Zoo 22: In Zoo 22 wurden Kotproben von Schafen, Ziegen und Schweinen
untersucht. Beim ersten Besuch wurde die Serogruppe O26 bei allen drei Tierarten
nachgewiesen. Die Serogruppe O103 wurde zu beiden Beprobungszeitpunkten bei
Schaf und Ziege nachgewiesen, beim Schwein jedoch nur bei der zweiten
Beprobung. Die Serogruppe O43 wurde beim Schaf sowohl in der ersten als auch in
der zweiten Beprobung isoliert, bei der Ziege nur zum ersten Beprobungszeitpunkt.
Zoo 47: In Zoo 47 konnten die Serogruppen O76 und O146 sowohl bei der ersten als
auch der zweiten Probennahme aus Schafkot isoliert werden. Auch in Zoo 73 wurde
O76 und Orauh in beiden Beprobungen aus dem Ziegenkot isoliert.
Die Ziegenkotproben aus Zoo 81 wiesen zu beiden Beprobungszeitpunkten die
Serogruppe O76 auf.
Ergebnisse 91
Zoo 82: In Zoo 82 wurde die Serogruppe O26 und O146 beide Male aus den
Ziegenkotproben isoliert.
Zoo 84: Aus dem Ziegenkot des Zoos 84 wurde sowohl zum Zeitpunkt der ersten
Beprobung als auch zwei Wochen später die Serogruppe O5 isoliert.
Zoo 88: Die Serogruppen O21 und O146 wurden aus den Ziegenproben des Zoos
88 bei beiden Beprobungen isoliert. In der ersten Beprobung waren vier der acht
Proben für O21 positiv, drei der acht für O146. In der zweiten Beprobung waren drei
der acht Proben für O21 positiv, vier der acht für O146.
Zoo 92: In Zoo 92 wiesen nur die Ziegenproben positive Isolate für beide
Beprobungen auf. Sowohl in der ersten als auch zweiten Beprobung konnte O76
detektiert werden. Aus den Schaf- und Schweinekotproben konnte zu keinem der
beiden Zeitpunkte E.coli mit Virulenzgenen isoliert werden.
Zoo 95: Die Ziegenkotproben aus Zoo 95 wiesen sowohl in der ersten als auch in
der zweiten Beprobung je eine positive Probe für O23 und jeweils eine bzw. drei
positive Proben für O76 auf.
Zoo 97: Zoo 97 war beide Male mit je einer Ziegenprobe positiv für die Serogruppe
O21. Tabelle 14 zeigt einen Überblick zu der Wiederfindungsrate einzelner
Serugruppen in einzelnen Tierarten zum Zeitpunkt der ersten und zweiten
Beprobung.
92 Ergebnisse
Tab. 14: Übersicht zur Wiederfindungsrate einzelner Serogruppen in den Tierarten
Zoo Serogruppe Tierart
Beprobung 1 Beprobung 2
22 O26 Schaf, Ziege -
O103 Schaf, Ziege Schaf, Ziege, Schwein
O43 Schaf, Ziege Schaf
47 O76 Schaf Schaf
O146 Schaf Schaf
73 O76 Ziege Ziege
Orauh Ziege Ziege
81 O76 Ziege Ziege
82 O26 Ziege Ziege
84 O5 Ziege Ziege
88 O21 Ziege Ziege
O146 Ziege Ziege
92 O76 Ziege Ziege
95 O23 Ziege Ziege
O76 Ziege Ziege
97 O21 Ziege Ziege
4.4 Auswertung der Parkarten und Regionen
4.4.1 Jahr 2008
Im Jahr 2008 wurden 24 Streichelgehege beprobt, von denen 15 (62,5%) den
zoologischen Gärten, sieben (29,2%) den Wildparks und zwei (8,3%) den
Freizeitparks mit Tieranteil zugeordnet waren. Die drei 2008 STEC/EPEC positiv
getesteten Parks gehörten alle der Kategorie Wildpark an. In den getesteten Zoos
und Freizeitparks ließen sich keine STEC/EPEC nachweisen. Bei der Auswertung
der positiven und negativen Parks anhand der Zookategorien mit dem Fishers exact
Ergebnisse 93
test zeigte sich ein signifikanter Zusammenhang zum Vorkommen von STEC/EPEC
in Wildparks verglichen mit zoologischen Gärten (p=0,0227).
Des Weiteren wurden im Jahr 2008 alle drei Regionen (Region 1, 2 und 3) beprobt.
Sieben mal (29,2%) wurden Parks aus der Region 1, acht mal (33,3%) Parks aus
Region 2 und neun mal (37,5%) Parks aus Region 3 beprobt. Die STEC/EPEC
positiven Wildparks stammten zweimal aus der Region 3 und einmal aus Region 2.
Ein signifikanter Zusammenhang zwischen Region und STEC/EPEC-Vorkommen
konnte jedoch nicht nachgewiesen werden.
4.4.2 Jahr 2009
Im Jahr 2009 wurden 32 Parks beprobt, wovon 23 (71,9%) der Kategorie
zoologischer Garten, fünf (15,6%) der Kategorie Wildpark und vier (12,5%) der
Kategorie Freizeitpark mit Tieranteil angehörten. In 21 Zoos, drei Wildparks sowie
drei Freizeitparks mit Tieranteil konnten STEC/EPEC nachgewiesen werden. Es ließ
sich allerdings kein signifikanter Zusammenhang zwischen Zookategorie und
STEC/EPEC-Vorkommen aufzeigen.
Auch im Jahr 2009 wurden Parks in allen drei geographischen Regionen beprobt.
Zehn Parks (31,3%) lagen in Region 1, elf Parks (34,4%) in Region 2 und ebenfalls
elf Parks (34,4%) in Region 3. STEC/EPEC positive Parks konnten in allen drei
geographischen Regionen nachgewiesen werden. Ein signifikanter Zusammenhang
zwischen geographischer Region und STEC/EPEC-Vorkommen bestand nicht.
94 Ergebnisse
Diskussion 95
5 Diskussion
Shigatoxin produzierende Escherichia coli (STEC) spielen vor allem in
Industrieländern eine immer größer werdende Rolle bei epidemisch auftretenden,
schweren Durchfallerkrankungen. Nicht selten fordern solche Epidemien Todesopfer
oder verursachen Folgeerkrankungen wie HUS oder TTP, die zu Spätschäden wie
Bluthochdruck und Niereninsuffizienz führen können. Die Ansteckung erfolgt meist
über kontaminierte Lebensmittel, welche für den Rohverzehr gedacht sind. Oft
handelt es sich um Lebensmittel tierischen Ursprungs wie Hackfleisch, Mett
(GRIFFIN u. TAUXE 1991b) oder Rohmilch (GUH et al. 2010), aber auch
Übertragungen durch roh verzehrtes Gemüse, Salat, Apfelsaft oder Sprossen sind
beschrieben (ARMSTRONG et al. 1996; BUCHHOLZ et al. 2011; CODY et al. 1999;
FRANK et al. 2011). Kleine und große Wiederkäuer wurden schon vor einiger Zeit als
STEC/EHEC-Reservoir und potenzielle Infektionsquelle für den Menschen
beschrieben (BLANCO et al. 2003a; BLANCO et al. 2003b; HEUVELINK et al. 2002;
O'BRIEN et al. 2001; ORDEN et al. 2003). Weiter besteht der Verdacht, dass der
Erreger nicht nur durch Verzehr kontaminierter Lebensmittel sondern auch durch
direkten Kontakt zu infizierten Tieren übertragen werden kann. Da von einigen
Autoren der Kontakt zu Tieren in Streichelgehegen oder ähnlichen Einrichtungen als
Infektionsquelle und Risikofaktor beschrieben wurde (DEBROY u. ROBERTS 2006;
GOODE et al. 2009; HEUVELINK et al. 2002; WERBER et al. 2007), war es Ziel
dieser Arbeit, das Vorkommen von STEC in deutschen Streichelzoos zu untersuchen
und Risikofaktoren für die Übertragung auf den Menschen zu beschreiben.
5.1 Material und Methoden
Um unter den teilnehmenden Zoos vergleichbare Populationen zu erhalten, wurde
zunächst eine geographische Schichtung Deutschlands in drei Regionen (Region 1,
Region 2 und Region 3) sowie eine Schichtung der Zoos anhand der Betriebsstruktur
vorgenommen. Ziel war die Beprobung von mind. 40% aller angefragten Parks. In
jeder Region sollten 40% jeder Parkart (Zoo, Wildpark, Freizeitpark mit Tieranteil)
vertreten sein. Dadurch sollte eine Aussagekraft der Ergebnisse für
Gesamtdeutschland erreicht werden.
96 Diskussion
Die Parks wurden in logistisch sinnvoller Reihenfolge angefahren. Mit der im ersten
Jahr angewandten Methodik wurden die Proben selektiv für O157-positive E. coli
Isolate angereichert und ausschließlich sorbitolnegativen Isolate wurden
weitergehend untersucht. Im zweiten Jahr konnte die Anreicherung auf weitere
Serogruppen erweitert werden, da ein entsprechendes Testsystem kommerziell
erhältlich war. Da in diesem Zeitraum auch schwere EHEC-Ausbrüche durch
sorbitolpositive Isolate bekannt geworden waren, wurde das Untersuchungsverfahren
auch auf sorbitolpositive Isolate hin erweitert.
Aufgrund der unbedingten Notwendigkeit, die Untersuchungstechnik an den
Erkenntnisfortschritt anzupassen, musste die Auswertung des STEC/EPEC
Aufkommens in den Jahren 2008 und 2009 getrennt ausgewertet werden. Damit
wurde die Wahrscheinlichkeit, statistisch signifikante Risikofaktoren anhand der
Fragebögen zu ermitteln, verringert.
Bei der Untersuchung von Kotproben auf STEC spielt die Entnahmetechnik eine
bedeutende Rolle zur Prävalenzerhebung. So zeigten PHILLIPS et al. (2000), dass
ein gewisser Gewebetropismus von O157:H7 zu follikelassoziiertem Gewebe,
insbesondere den Peyer’schen Platten des Rektums, besteht. Dies könnte der Grund
sein, weshalb in einigen Arbeiten, in denen Rektaltupfer untersucht wurden, höhere
Nachweisraten gezeigt werden konnten als im Falle der Untersuchung von
Sammelkotproben (BLANCO et al. 2003b; STIRLING et al. 2008; ZSCHOCK et al.
2000). Darüber hinaus besteht bei der Entnahme von Rektaltupfern eine geringere
Kontaminationsgefahr durch Umweltkeime. Bei dem großen Tierkollektiv in dieser
Studie war aufgrund des hohen Zeitaufwandes und der Notwendigkeit einer weiteren
Hilfsperson zur Fixierung der Tiere eine rektale Probennahme nicht möglich, wobei
bei einem Teil der Tiere die rektale Beprobung aufgrund fehlender Kooperation
ohnehin nicht möglich gewesen wäre (Känguru, Lama). Trotzdem wurde in dieser
Studie ein Prozentsatz STEC/EPEC positiver Parks von 12,5% im Jahr 2008 (nur
O157) und 84,4% im Jahr 2009 (O157 und andere Serogruppen) festgestellt. Dass
diese Prävalenz trotz der Untersuchung von Sammelkotproben ermittelt wurde,
könnte mit der doppelten Beprobung jedes Zoos im Abstand von 2 Wochen
Diskussion 97
zusammenhängen. So wurden intermittierende Ausscheider mit einer höheren
Wahrscheinlichkeit entdeckt (ROBINSON et al. 2004).
Um eine höhere Nachweisrate zu erlangen, wurden sowohl im Jahr 2008 als auch im
Jahr 2009 die gewonnenen Proben vorangereichert wie in anderen Studien
beschrieben (SANDERSON et al. 1995). In beiden Jahren wurde als Teil der
Voranreicherung die immunomagnetische Separation (IMS) angewandt, welche laut
KARCH et al. (1996b) eine 100-fach höhere Sensititvität gegenüber anderen
Anreicherungsmethoden aufweist. Mit Hilfe der IMS ist es möglich 100 KbE E. coli
O157 pro Gramm Kot zu detektieren. Auch für die im Jahr 2009 erweiterte IMS sind
ähnliche Nachweisgrenzen genannt (Mellmann, persönliche Mitteilung). Diese Werte
beziehen sich allerdings auf menschliche Stuhlproben. Es wäre möglich, dass die
Nachweisgrenze in tierischem Kot, v.a. in faserreichem Pflanzenfresserkot, etwas
geringer ausfällt, da pathogene Keime evtl. trotz mehrmaligem Waschen an den
Pflanzenfasern haften bleiben und somit nicht detektiert werden. Hinweise auf eine
Reduktion der Sensitivität der erweiterten Anreicherung gegenüber der O157-
spezifischen Anreicherung gab es nicht. So erbrachte die erweiterte IMS im Jahr
2009 ähnliche Nachweisraten für O157 (6,3%) wie die O157-spezifische
Anreicherung im Jahr 2008 (4,2%).
Im Jahr 2009 wurden häufig Serogruppen identifiziert, die nicht spezifisch durch die
O-spezifischen Antikörper der IMS erfasst wurden. Dies beruht vermutlich auf einer
geringeren Spezifität der erweiterten IMS und der nachfolgenden Abschwemmungs-
methode mit anschließender Colony-Hybridisierung. So waren im Jahr 2008 maximal
20 morphologisch verdächtige STEC-Kolonien auf CT-SMAC-Agar, Gassner-Agar
und Schafblut-Agar subkultiviert worden und nur bei STEC-typischem Wachstum auf
allen drei Platten fand eine Weiterbearbeitung statt. Trotz der insgesamt deutlich
verbesserten Sensitivität wird auch mit der im Jahr 2009 eingesetzten Methodik die
Prävalenz möglicherweise unterschätzt, da aus der abgeschwemmten
Bakteriensuspension lediglich 2 µl entnommen und die Abschwemmung somit um
den Faktor 106 verdünnt wurde, um für die Colony-Hybridisierung in Einzelkolonien
bewachsene Agarplatten zu erhalten. Zwar sind Verdünnungen dieser Art durchaus
üblich (SCHILLING et al. 2012), allerdings muss eine niedrigere Sensititvität in Kauf
98 Diskussion
genommen werden. In der darauf folgenden Hybridisierung wurde zunächst ein
Sondengemisch aus Shigatoxin 1-, Shigatoxin 2- und Intiminsonden zu gleichen
Teilen eingesetzt. Das Blotverfahren zeigt im Vergleich zur später eingesetzten
Kontroll-PCR eine relativ gute Sensitivität (stx1: 90,6%, stx2: 82,6%, eae: 73,5%)
jedoch eine nur sehr mäßige Spezifität (stx1: 50,4%, stx2: 34,1%, eae: 35,7%). Da
laut Literatur in der Regel keine Sondengemische eingesetzt werden, ist über
Sensitivität und Spezifität dieser Gemische nichts bekannt. Problematisch bei
Sondengemischen ist, dass die für die Spezifität maßgeblichen Waschbedingungen
nicht sondenspezifisch optimiert werden können. Auch sehr kurze Sonden können
vermehrt zu unspezifischen Bindungen führen. Da die stx2-Sonde lediglich 118 bp
lang war, könnte dies für die geringe Spezifität von 34,1% mit verantwortlich sein. Die
Colony-Hybridisierung wurde trotz der geringen Spezifität eingesetzt, da sie als
Screening-Methode diente, um die Zahl der erforderlichen PCR-Untersuchungen zu
reduzieren. So wurden abschließend bis zu fünf im Colonyblot postive Isolate in einer
Multiplex-PCR mit guter Sensitivität und Spezifität auf das Vorhandensein der
Virulenzgene getestet (FRANCK et al. 1998a). Die Detektion von insgesamt 32
verschiedenen Serogruppen mit unterschiedlichen Virulenzgenkombinationen war
bezeichnend für die gute Sensitivität der Gesamtmethodik.
5.2 Parkmanagement
Streichelgehege, in denen Besucher direkten Kontakt zu Wiederkäuern und anderen
Streicheltieren pflegen können, erfreuen sich immer größer werdender Beliebtheit.
Jedoch standen solche Einrichtungen schon des Öfteren mit STEC/EHEC-
Erkrankungen in Verbindung (DEBROY u. ROBERTS 2006; HEUVELINK et al. 2002)
weshalb sich ein Teil dieser Arbeit mit Unterschieden im Parkmanagement und dem
gleichzeitigen Mehr- oder Mindervorkommen von STEC/EPEC beschäftigt.
Im Allgemein kann gesagt werden, dass die hier untersuchten Streichelgehege sehr
ähnlich aufgebaut waren und sich auch im Gehegemanagement nur unwesentlich
unterschieden. So standen allen Streicheltieren ein Freilauf sowie ein Stallgebäude,
welches gleichzeitig als Rückzugsort diente, zur Verfügung. Die meisten
Streichelgehege wiesen einen unbefestigten Untergrund auf, welcher in der Regel
nicht nass gereinigt wurde. Ein signifikant erhöhtes STEC-Vorkommen konnte im
Diskussion 99
Vergleich zu Parks mit befestigtem Untergrund und regelmäßiger nasser Reinigung
zwar nicht festgestellt werden, eine geringere Infektionsgefahr kleiner Kinder ist
trotzdem wahrscheinlich, da eine nasse Reinigung i.d.R. gründlicher ist als eine
Säuberung durch Besen oder Harke. Ebenso führte eine regelmäßige Erneuerung
der Bodenbeläge oder eine regelmäßige Desinfektion der Böden mittels Brandkalk
zu keiner signifikant niedrigeren STEC-Detektionsrate. Es ist jedoch davon
auszugehen, dass die Re-Infektion der Tiere in solchen Gehegen gemindert wird,
was wiederum die Ausscheidungsrate und somit die Infektionsgefahr der Besucher
senkt (CRAY, JR. u. MOON 1995; KUDVA et al. 1995). Des Weiteren gaben 50%
der Parkbetreiber an, Reinigungswerkzeuge wie Schaufel oder Harke außer im
Streichelgehege auch in anderen Gehegen zu benutzen. Doch nur rund 4% (1) der
28 Zoos nehmen eine regelmäßige und 39% (11) eine unregelmäßige Reinigung der
Werkzeuge vor. Eine Verschleppung der Erreger in andere Tiergehege ist daher
durchaus denkbar und birgt Infektionsrisiken für Tierarten, welche empfindlicher
gegenüber STEC/EPEC sein könnten. Gerade in Zoologischen Gärten sind somit die
wertvollen, exotischen Tierbestände besonders gefährdet. Eine gründliche Reinigung
zwischen der Nutzung in unterschiedlichen Gehegen oder eigenes Werkzeug für
jedes Gehege würde dieses Risiko zweifelsohne verringern.
Ein weiteres potentielles Verschleppungsrisiko entsteht durch das
Tierpflegerpersonal selbst, denn in 96% der Parks sind die Tierpfleger neben dem
Streichelbereich zusätzlich noch für andere Tierarten zuständig. Eine Reinigung der
Hände vor Gehegewechsel erfolgt aber lediglich in 35,7% der Zoos, eine
Händedesinfektion nur in 14,3%. Stiefel werden sogar nur von 12,5% des Personals
gereinigt und von 8,9% desinfiziert. Ein signifikant höheres Erregervorkommen in
Parks, in denen Hände und Stiefel nicht gereinigt oder desinfiziert werden, konnte
jedoch nicht bestätigt werden, da die zusätzlich vom Tierpfleger versorgten
Tiergehege in dieser Studie nicht auf das Vorhandensein von STEC/EPEC
untersucht wurden. Erstaunlicherweise wurde in jenen Parks, in denen die
Tierpfleger selbst landwirtschaftliche Tierhaltung zu Hause betrieben, signifikant
weniger STEC/EPEC (P= 0,0033) detektiert. Möglicherweise ist dies damit zu
erklären, das solche Pfleger eher mit der Thematik der Infektionsgefahren und ihrer
100 Diskussion
Vermeidung vertraut sind, was zu sorgfältigerem Hygienemanagement und somit
geringerer Reinfektion der Streicheltiere führt.
Zwar werden in rund 79% der Parks Speisen und Getränke im Umkreis von 100 m
verkauft, das Verpflegungspersonal steht aber nur in 5,4% der Zoos in direktem
Kontakt zu den Tieren. Somit ist eine Kontamination der Speisen durch
Küchenpersonal sehr unwahrscheinlich. Das mögliche Kontaminationsrisiko der
Speisen durch Fluginsekten wird in dieser Studie ebenso als gering eingeschätzt, da
in keiner der untersuchten Fliegen STEC/EPEC detektiert wurde. Der an anderer
Stelle (BUTIKOFER et al. 2005) beschriebene Zugang der Streicheltiere zu
Picknickwiesen spielt in dieser Studie kaum eine Rolle. In 96,4% der Zoos hatten die
Tiere keinen Zugang zu Picknickplätzen.
In 31 (55,4%) der Parks dürfen die Besucher die Streicheltiere füttern. Häufig (24/31;
77,4%) verfüttern die Besucher energiereiches, pelletiertes Mischfutter.
Energiereiche Fütterung führt zu einem Absenken des pH-Wertes im Magen-Darm-
Trakt der Wiederkäuer, was zwar die Vermehrung der STEC hemmt, die
Ausscheidung säureresistenter STEC allerdings fördert. STEC bilden ebenso wie
andere E. coli Resistenzmechanismen gegen eine zu hohe Protonenkonzentration in
ihrer Umgebung aus. Diese Säureresistenz ist auch nach der Ausscheidung
vorhanden, was dazu führt, dass säureresistente STEC auch durch die
Magenpassage nach humaner Infektion nicht inaktiviert werden (BALJER u. WIELER
1999). Eine rohfaserreiche, energiearme Fütterung in Form von z.B. Heucobs o.ä.
durch die Besucher wäre somit empfehlenswerter.
In nur 53,6% der Parks stehen den Besuchern Handwaschbecken mit fließend
Wasser in unmittelbarer Nähe (10 m) zum Streichelgehege zur Verfügung. Allerdings
wird nur in 12,5% der Parks auf diese hingewiesen. Dementsprechend muss davon
ausgegangen werden, dass längst nicht alle Besucher des Geheges eine
anschließende Händehygiene durchführen. Nach WEESE et al. (2007) hängt die
Händehygiene nach dem Streicheln der Tiere wesentlich mit der Entfernung der
Sanitäranlagen zusammen. Je weiter diese vom Streichelgehege entfernt liegen,
desto weniger werden sie in Anspruch genommen. Dies ist in Anbetracht der
Tatsachen, dass lediglich 41% der Zoos in dem Fragebogen angeben, dass das
Diskussion 101
Essen im Streichelbereich untersagt ist, aber nur neun Zoos (39%) mündlich oder
durch Schilder darauf auch hinweisen, kritisch zu sehen. Es muss davon
ausgegangen werden, dass die Besucher in vielen Streichelzoos Essen zu sich
nehmen, ohne zuvor eine adäquate Händereinigung durchgeführt zu haben. Eine
Infektion der Besucher während des Essens mit kontaminierten, ungewaschenen
Händen ist daher durchaus denkbar. Bereits MCMILLIAN et al. (2007), WEESE et al.
(2007) und BUTIKOFER et al. (2005) konnten in ihren Untersuchungen eine
mangelhafte Aufklärung der Besucher in Form von Informationstafeln etc. feststellen.
In einer Studie von LOCKING et al. (2001) konnte ein signifikanter Zusammenhang
zwischen dem Kontakt mit Tierexkrementen und sporadischen EHEC O157:H7
Infektionen festgestellt werden. Der Kontakt der Besucher mit Tierexkrementen z.B.
durch kotkontaminiertes Fell der Tiere kann so gut wie nicht verhindert werden.
Deshalb wäre die wichtigste und sinnvollste Maßnahme zur Vermeidung von
Infektionen der Besucher mit STEC/EPEC durch Streichelzootiere die Installation
geeigneter Sanitäranlagen direkt am Streichelgehege, sowie eine verbesserte
Aufklärung und Sensibilisierung der Besucher und der Betreiber über
Hygienemaßnahmen und potentielle Zoonosegefahren. Die englische „Farming and
Countryside Education (FACE)“ (Stiftung, welche Kinder und Jugendliche über
nachhaltig gewonnene Lebensmittel und Landwirtschaft aufklärt) reagierte bereits
darauf und erstellte eine Hygieneleitlinie zur Minimierung des Infektionsrisikos der
Besucher (http://www.face-online.org.uk, letzter Zugriff 15.10.2012). Nach dem
EHEC-Ausbruch 2011 in Deutschland verfasste auch das Bundesinstitut für
Risikobewertung (BfR) ein Verbraucherinformationsblatt, in dem neben Hinweisen
zur Vermeidung von lebensmittelassoziierten Übertragungen, auch auf die
Vermeidung von Schmierinfektionen durch Tiere oder erkrankte Mitmenschen
eingegangen wird (http://www.bfr.bund.de, letzter Zugriff 15.10.2012).
5.3 STEC/EPEC Prävalenz
Neben Rindern sind unlängst auch kleine Wiederkäuer wie Schafe und Ziegen als
Erregerreservoir für STEC identifiziert worden. In Streichelgehegen sind diese
Spezies überdurchschnittlich häufig repräsentiert, was sie zu potentiellen
Überträgern der STEC auf die Risikogruppe „Kleinkinder“ macht. In diversen Studien
102 Diskussion
wurde von Herdenprävalenzen für non-O157-STEC für Schafe und Ziegen von bis zu
100% berichtet (ZSCHOCK et al. 2000). Innerherdenprävalenzen betragen
durchschnittlich ~36% bei Schafen und ~75 % bei Ziegen (BLANCO et al. 2003b;
ZSCHOCK et al. 2000), doch nur selten werden die angegebenen Prävalenzen in der
Literatur in Herden- und Innerherdenprävalenzen unterteilt. So detektierten WANI et
al. (2006) in Indien in 275 Ziegenkotproben 37 virulenzgentragende Stämme, was
einer Gesamtprävalenz von 16,8% entspricht. Die STEC/EPEC-Prävalenz der
untersuchten Stallziegen betrug 13,6% (28/206) und die der Wanderziegen 13,0%
(9/69). Allerdings wurden die Kotproben in dieser Arbeit nicht vorangereichert, bzw.
einer IMS unterzogen. PRITCHARD et al. (2009) hingegen untersuchten in einem
Zeitraum von zehn Jahren insgesamt 1715 Kotproben von Tieren aus 31 öffentlichen
Freizeiteinrichtungen und konnte mittels Voranreicherung und IMS in 61,3% der
untersuchten Einrichtungen O157-STEC nachweisen. Die Gesamtprävalenzen
betrugen für Rinder 29,0%, für Schafe 24,4%, für Esel 14,6%, für Schweine 14,3%,
für Pferde 12,3% und für Ziegen 9,9%. Auch ORDEN et al. (2003) beschreiben eine
STEC-Gesamtprävalenz von 24,4% bzw. 16,2% bei Schafen und Ziegen, allerdings
ohne Voranreicherung. In der vorliegenden Arbeit konnten für das Jahr 2009
Gesamtprävalenzen in ähnlichen Größenordnungen ermittelt werden (Rind 34,6%,
Schaf 31,2%, Ziege 29,0% und Schwein 18,8%). Bei einer Untersuchung klinisch
gesunder Haustiere auf STEC konnten allerdings deutlich höhere Prävalenzen von
66,6% bei Schafen und 56,1% bei Ziegen festgestellt werden (BEUTIN et al. 1993).
Die in BEUTINS Studie ermittelte Prävalenz für Rinder lag jedoch nur bei 21,1%, die
für Schweine bei 7,5% und die für Katzen und Hunde bei 13,8% bzw. 4,8%.
Möglicherweise sind die von ihm benutzen Rektaltupfer (ohne Voranreicherung) eine
sensitivere Probenentnahmetechnik als von der Erde aufgenommene
Sammelkotproben. Allerdings verwendet auch er zur Isolierung der Bakterienstämme
eine Colony-Blot-Hybridisierung mit DIG-markierten Sonden, allerdings ohne
anschließende PCR, wodurch ein Teil der Methodik mit der hier angewandten
vergleichbar ist.
Bereits 2003 beschrieben GARCIA u. FOX (2003) Kaninchen als neues Reservoir
und potentielle Infektionsquelle von STEC. Sie untersuchten 34 Kotproben der Rasse
Diskussion 103
Holländerkaninchen sowie 15 Proben der Rasse Weiße Neuseeländer. Obwohl keine
Voranreicherung durchgeführt sondern lediglich Selektivmedien verwendet wurden,
wurden in 25% (7/28) der Holländerkaninchenproben stx1 und eae nachgewiesen.
Intimin als alleiniges Virulenzgen konnte in 39% (11/28) der Proben detektiert
werden. Die sechs Holländerkaninchen aus einem weiteren Bestand waren
STEC/EPEC negativ. Aus den Proben der Weißen Neuseeländer Kaninchen konnte
in 9% (1/11) das Stx1-Gen nachgewiesen werden, vier weitere Proben aus einem
Streichelzoobestand waren negativ für alle getesteten Virulenzgene. Somit liegt die
in der vorliegenden Studie im Jahr 2008 ermittelte Prävalenz für STEC in Kaninchen
mit 3,7% (1/27) zwar deutlich unter der von GARCIA u. FOX (2003), trotzdem konnte
gezeigt werden, dass Kaninchen als Reservoir und somit als Infektionsquelle für
Menschen auch in Deutschland in Betracht gezogen werden müssen. Des Weiteren
konnten in der vorliegenden Studie zusätzlich die Serogruppe O157 aus Kaninchen
isoliert werden, was die Untersuchung von SCAIFE et al. (2006) bestätigt wonach
nicht nur domestizierte Kaninchen sondern auch Wildkaninchen als Vektoren
anzusehen sind und auch Träger der Serogruppe O157 sein können.
Die Familie der Kamele gehört zwar nicht direkt zu den klassischen
Streichelzootieren, ist mittlerweile aber in immer mehr Streichelgehegen anzutreffen.
Im Jahr 2009 konnten in diesen Untersuchungen drei von vier Lamaproben in einem
Zoo als STEC/EPEC positiv identifiziert werden. Bei der ersten Beprobung wurde
eine von zwei Proben eae positiv getestet. Die vier Isolate gehörten der Serogruppe
O153 an. In der darauf folgenden Beprobung zwei Wochen später wurden 10 stx1
positive Isolate aus zwei von zwei Proben der Serogruppe O103 isoliert. Im Jahre
2001 wurden Lamas erstmals auf E.coli O157 hin untersucht. Im Rahmen dieser
Untersuchung wurden Kotproben von 354 Lamas aus 33 verschiedenen
Einrichtungen analysiert, allerdings konnten nach Anreicherung in modifizierter
Trypton-Soja-Bouillon, Anzucht auf McConkey-Agar und anschließender
Immunfluoreszenzmikroskopie keine E.coli der Serogruppe O157 identifiziert werden
(RULOFSON et al. 2001). Hingegen gelang wenige Jahre später die Isolierung von
E.coli der Serogruppe O26:H11 aus einer Kotprobe eines an Diarrhoe erkrankten
Guanako (Lama guanicoe), der Stammform des domestizierten Lamas. Das Isolat
104 Diskussion
wies die typischen Virulenzgene stx1 und eae des Ehly-Phänotyps auf (MERCADO
et al. 2004). Kürzlich veröffentlichten FEATHERSTONE et al. (2011) die Ergebnisse
einer zwölfmonatigen Studie, in der sie Kamele, Lamas und Alpakas auf E. coli O157
untersuchten. Dazu wurden 168 Alpakakotproben, 18 Lamakotproben und zwei
Kamelkotproben aus insgesamt 96 verschiedenen Betrieben analysiert. Insgesamt
konnten drei O157-positive Alpakaproben mit den Virulenzgenen stx2 und eae (aus
einem Bestand stammend) isoliert werden, sowie zwei shigatoxin-negative O157-
positive Isolate aus zwei unterschiedlichen Alpakabeständen, die lediglich das
Intimingen beherbergten. Die hier vorliegende Studie bestätigt damit, dass
STEC/EPEC auch in Schwielensohlern zu finden sind. Streichelgehege, welche
solche halten, sollten sich der Zoonosegefahr bewusst sein und den Besuchern
entsprechende Hygienehinweise an die Hand geben.
5.4 Vorkommen von Serogruppen
Die in dieser Arbeit untersuchten Isolate weisen eine große Serogruppendiversität
auf. Unter allen untersuchten Tierarten konnten 32 verschieden Serogruppen
identifiziert werden. In Ziege und Schaf, den beliebtesten Tierarten in deutschen
Streichelgehegen, traten jeweils 22 unterschiedliche Serogruppen auf. Die häufigsten
Serogruppen, die in dieser Studie detektiert wurden, waren die Serogruppe O146
(34/201) und O76 (33/201). O76 konnte in insgesamt 10 (31,7%) der im Jahr 2009
untersuchten Zoos nachgewiesen werden, O146 in 6 Zoos (18,8%). In 26,7% der
Ziegen haltenden und 17,6% der Schafe haltenden Parks konnte E. coli O76 aus 33
Proben isoliert werden. Auch geographisch betrachtet, ist O76 am weitesten
verbreitet. In 50% der Postleitzahlengebiete trat diese Serogruppe in den
Streichelgehegen auf. ORDEN et al. (2003) isolierten in ihren Untersuchungen
ebenfalls etliche unterschiedliche Serogruppen (13 aus gesunden Ziegen, 12 aus
gesunden Schafen). Sie isolierten O76 jedoch nur einmal aus Ziegenkot und nicht
aus Schafkotproben. In Spanien untersuchten REY et al. (2003) 697 Rektaltupfer von
Schafen und isolierten dabei ebenfalls 22 unterschiedliche Serogruppen. Die
Serogruppe O76 wurde dabei achtmal gefunden. In einer weiteren spanischen Studie
wurden gesunde Milchziegen auf STEC und EPEC untersucht und dabei 25
verschieden Serotypen identifiziert (CORTES et al. 2005). Am häufigsten wurde
Diskussion 105
unter anderem der Serotyp O76:H19 ermittelt. Weiterhin wurde E. coli O76 in Ziegen
in Indien identifiziert (WANI et al. 2006). Betrachtet man weiterhin die Parkprävalenz
der Serogruppen, so wurden in der vorliegenden Arbeit O5 und O113 als
zweithäufigste Serogruppen identifiziert. Sieben der 32 Parks aus dem Jahr 2009
waren für diese Serogruppen positiv, welches die Untersuchung von CORTES et al.
(2005) bestätigt.
Um die Ausbeute an ausgewählten, häufig mit humanen Erkrankungen in
Zusammenhang stehende Serogruppen zu maximieren, kamen in vorliegender Arbeit
diverse Anreicherungsmethoden, u.a. die immunomagnetische Separation (IMS) zum
Einsatz. In Studien in denen keine serogruppenspezifische magnetische Beads zum
Einsatz kamen (BEUTIN et al. 1993; REY et al. 2003), fiel der Nachweis von O26,
O145, O111, O103 und O157 deutlich geringer aus als in der vorliegenden Arbeit.
BEUTIN et al. (1993) serotypisierten 208 Isolate, konnten jedoch keine der oben
genannten Serogruppen identifizieren. Auch ZSCHOCK et al. (2000) konnten ohne
Voranreicherungen lediglich ein bovines Isolat der Serogruppe O26 isolieren, die
Serogruppen O111 und O157 konnten nicht nachgewiesen werden. Im Gegensatz
dazu wurden in der hier vorliegenden Untersuchung mit Hilfe der Dynabeads die
Serogruppe O26 in 10,4% (21) der Proben, O103 in 7,0% (14), O157 in 3,5% (7) und
O145 in 3,0% (6) der Proben detektiert. Andererseits fanden SCHILLING et al.
(2012) in einer Untersuchung ohne Voranreicherung STEC in 100% der beprobten
Parks. Bei den insgesamt 193 serotypisierten Isolaten handelte es sich in 14% (27)
um O157. Drei der Isolate (1,6%) gehörten der Serogruppe O26 an und sechs Isolate
(3,1%) wurden der Serogruppe O103 zugeordnet. Die in dieser Studie beschriebene
Häufung von O157 in Schafen und Ziegen konnte bisher jedoch von keiner anderen
Studie und auch von der vorliegenden nicht bestätigt werden. Allerdings existieren
momentan nur wenige groß angelegte Untersuchungen über das Vorkommen von
STEC-Serogruppen in Ziegen und Schafen und in keiner der aktuellen Studien wurde
eine serogruppenerweiterte IMS durchgeführt, so dass eine abschließende
vergleichende Bewertung nicht möglich ist.
Um das Serovarvorkommen in humanen Krankheitsfällen zu eruieren, wurden von
BEUTIN et al. über 700 Stuhlproben analysiert. Die Charakterisierung der
106 Diskussion
STEC/EPEC-Isolate zeigte einerseits, dass die klassischen EHEC wie O145, O111,
O103, O26 und O157 zwar überwiegend in Patienten mit HUS oder blutiger Diarrhö
vorkamen, andererseits aber auch, dass Serovare wie O118 oder O121 von den
Patienten isoliert werden konnten (BEUTIN et al. 1998; BEUTIN et al. 2004). Des
Weiteren wurden in den Stuhlproben auch STEC mit den O-Antigenen O146, O76,
O5 oder O113 detektiert, welche in der vorliegenden Studie gehäuft in Streichelzoos
nachgewiesen werden konnten. Somit wurden in gegenwärtiger Arbeit STEC und
EPEC Serogruppen erfasst, welche bereits im Zusammenhang mit humanen
Krankheitsfällen beschrieben wurden (BEUTIN et al. 1998; BEUTIN et al. 2004;
GERBER et al. 2002) und somit durchaus humanpathogenes Potential besitzen
könnten. Deshalb sei an dieser Stelle erneut auf die Notwendigkeit hingewiesen,
Besucher von Streichelgehegen über potentielle Infektionsrisiken in Kenntnis zu
setzen und Maßnahmen zu ergreifen, die die Wahrscheinlichkeit einer zoonotischen
Übertragung minimieren.
5.5 Vorkommen von Virulenzgenen
Die im Jahr 2008 gewonnen 47 Isolate entstammten sieben unterschiedlichen
Proben aus drei Tierarten (Ziege, Schaf, Kaninchen). Ein Isolat wurde als E. coli
O157 identifiziert, die anderen 46 Isolate waren nicht typisierbar. Alle 40
Ziegenisolate aus Park 107 trugen die Virulenzgene stx1 und stx2. Die sechs nicht
typisierbaren Schafisolate wiesen die Virulenzgene stx2 und hlyA auf. Das
Kaninchenisolat der Serogruppe O157 beherbergte sogar alle vier getesteten
Virulenzgene stx1, stx2, eae und hlyA. In einer Studie von GARCIA u. FOX (2003), in
der ebenfalls Kaninchen auf STEC untersucht wurden, konnten keine Gene für stx2
oder Varianten davon nachgewiesen werden. Allerdings trugen sieben der in der
Studie untersuchten Kaninchen Isolate mit den Virulenzgenen stx1 und eae sowie
ein Tier ein Intimin-positives Isolat. Da das in vorliegender Studie gewonnene
Kaninchenisolat alle vier Gene trägt, welche maßgeblich für die Virulenz
humanpathogener Isolate verantwortlich sind, ist davon auszugehen, dass ein
potentielles Risiko der Übertragung auf Besucher oder auf im Gehege lebende
Wiederkäuer durch Kaninchen vorhanden ist.
Diskussion 107
Betrachtet man die Genvariationen der aus Ziege und Schaf gewonnen Isolate, so
konnten in einer ähnlichen Untersuchung, im Gegensatz zu dieser Arbeit, nur in
einem von 70 untersuchten Ziegenisolaten stx1 in Kombination mit stx2
nachgewiesen werden (ZSCHOCK et al. 2000). In der angesprochenen Studie waren
jedoch 67 Isolate positiv für stx1 und hlyA und ein Isolat für stx1, eae und hlyA. Auch
in den Schafisolaten unterscheidet sich das 2008 am häufigsten gefundene
Virulenzgenmuster von dem ZSCHOCKS et al (2000). In vorliegender Studie trugen
die sechs Isolate die Virulenzgene stx2 und hlyA, während ZSCHOCK et al. (2000)
stx1 und hlyA als häufigste Virulenzgenkombination dokumentierten. Andere
Untersuchungen hingegen zeigen, dass 50,4% der untersuchten Ziegen- und
Schafisolate stx1-positiv und 47,8% stx1- sowie stx2-positiv waren. Das Gen für hlyA
war in 58,7% der Isolate nachweisbar, eae jedoch nur in 3,7% (ORDEN et al. 2003).
Die in dieser Arbeit ermittelten Virulenzgenkombinationen von stx1, stx2 und hlyA bei
Ziegen sowie stx2 und hlyA bei Schafen wurden in anderen Studien so bisher nicht
beschrieben (ORDEN et al. 2003; ZSCHOCK et al. 2000).
Betrachtet man die Genotypvarianzen der in der vorliegenden Studie isolierten E. coli
aus dem Jahr 2009, so konnte Intimin in 69% der Parks als häufigstes Virulenzgen in
deutschen Streichelgehegen detektiert werden. Stx1 alleine wurde in 65% der Zoos
und stx1 in Kombination mit stx2 in 47% der Zoos detektiert. Wertet man das
Vorkommen der Virulenzgene auf Probenebene aus, so sind 37,5% der Proben stx1-
positiv und jeweils 23% positiv für das eae-Gen alleine sowie für die Kombination aus
stx1 und stx2. In den Untersuchungen von ZSCHOCK et al. (2000) in hessischen
Rinder-, Ziegen- und Schafherden konnten in 53,6% der beprobten Betriebe
Shigatoxine nachgewiesen werden. Von den untersuchten Schafproben trug jedoch
nur eines der neun STEC-Isolate das alleinige Gen für Stx1. Die Kombination des
stx1 Gen und dem Gen für Enterohämolysin A trat bei fünf Isolaten auf. Auch in 96%
der Ziegenproben konnte diese Kombination detektiert werden. Dagegen trug nur ein
Ziegenisolat das Gen für stx1 und stx2.
Kürzlich wurde das Vorkommen u.a. von STEC auf sieben Stadtbauernhöfen und
einem Abenteuerspielplatz in Bayern und Baden-Württemberg untersucht
(SCHILLING et al. 2012). Auf allen acht Höfen und Spielplätzen konnten
108 Diskussion
shigatoxinbildende E. coli nachgewiesen werden. Die Schafproben waren zu 100%
(20/20), die untersuchten Ziegenproben zu 89,3% (25/28) STEC-positiv. Die
Kombination von stx1 und stx2 Genen konnten SCHILLING et al. (2012) in rund zwei
Dritteln (63,2%) der Isolate nachweisen, während stx1 allein in 34,4% und stx2 allein
nur in 2,4% der Isolate auftraten. Hämolysin A konnte, häufiger als in anderen
Studien, in 73,6% der Isolate detektiert werden. Des Öfteren war hlyA mit
Shigatoxingenen vergesellschaftet (35/48), wohingegen das Intimingen nur in zwei
Proben (4,2%) nachgewiesen werden konnte (SCHILLING et al. 2012).
Das Vorkommen der einzelnen Virulenzgenkombinationen in vorliegender Arbeit
unterscheidet sich somit deutlich von vorangegangenen Studien (SCHILLING et al.
2012; ZSCHOCK et al. 2000). Allerdings differieren sowohl die Methoden von
SCHILLING et al. (2012) als auch von ZSCHOK et al. (2000) insofern, als dass in
beiden Arbeiten keine Voranreicherung und keine IMS durchgeführt wurden.
Entweder wurden Colony-Hybridisierungen direkt von McConkey-Agarplatten
angefertigt und die positiven Isolate nachfolgend einer PCR-gestützten Kontrolle
unterzogen oder die Proben wurden auf Gassner-Agar kultiviert und Lactose-positive
Isolate mittels PCR auf Virulenzgene hin untersucht (SCHILLING et al. 2012;
ZSCHOCK et al. 2000). Durch die hier angewandte IMS wurden zwar einerseits
ausgewählte Serogruppen angereichert und somit auch häufiger detektiert,
andererseits waren, v.a. aufgrund der nachfolgenden Colony-Hybridisierung,
mehrere Passageschritte nötig, was zu einem eventuellen Verlust der
phagenvermittelten Shigatoxine geführt haben könnte. Auch BEUTIN et al. (1993)
untersuchten unter anderem das Auftreten unterschiedlicher Virulenzgene in einigen
Haustierarten und konnte aus Ziegenproben v.a. E. coli Isolate isolieren, die stx1 und
stx2 positiv waren. Allein stx1 positive E. coli konnten in Ziegenkotproben am
seltensten nachgewiesen werden. Auch in den Schafproben wurden primär E. coli
mit der Kombination von stx1 und stx2 detektiert, das Vorhandensein von Intimin
wurde allerdings nicht untersucht (BEUTIN et al., 1993). Im Gegensatz dazu konnte
in den eigenen Untersuchungen Intimin als häufigstes Virulenzgen bei den isolierten
E. coli nachgewiesen werden. Wie in anderen Studien (BEUTIN et al. 1993;
BOTTELDORN et al. 2003) beschrieben, wurde auch in den eigenen
Diskussion 109
Untersuchungen in Schweinekotproben kein E. coli mit einer Kombination der
Shigatoxine nachgewiesen. BOTTELDOORN et al. (2003) isolierten vom Schwein
am häufigsten E. coli mit stx2 Gen oder mit der Genvariante stx2e, welche für die
Ödemkrankheit der Ferkel verantwortlich ist (ROLLE u. MAYR 2002). Isolate, die
ausschließlich dieses Gen tragen, sind für den Menschen i.d.R. apathogen, da sie
nicht in der Lage sind den menschlichen Verdauungstrakt zu besiedeln
(BOTTELDOORN et al. 2003). In der eigenen Studie wurden nur wenige stx2-
positive E. coli aus Schweinekotproben isoliert. Obwohl in den meisten EHEC-Fällen,
die mit HUS und blutiger Diarrhö einhergehen, stx2 nachgewiesen werden kann
(CAPRIOLI et al. 2005), sind die hier gewonnenen Schweineisolate als nicht
humanpathogen anzusehen, da humanpathogene EHEC zusätzlich zu den
Shigatoxingenen i.d.R. noch weitere Virulenzgene wie z.B. Intimin- und/oder
Hämolysingene tragen (CAPRIOLI et al. 2005).
Auch wenn sich das in dieser Studie nachgewiesene Muster des
Virulenzgenvorkommens sowohl in Ziegen als auch in Schafen und Schweinen von
denen anderer Publikationen (BEUTIN et al. 1993; BOTTELDOORN et al. 2003;
SCHILLING et al. 2012) unterscheidet, unterstreicht die vorliegende Arbeit, dass
sowohl in kleinen Wiederkäuern als auch anderen Streicheltieren deutscher
Streichelzoos STEC in großer Anzahl nachgewiesen werden kann. Da die Isolate
teilweise zusätzlich zu den Shigatoxinen weitere Virulenzgene tragen, ist ein
potentielles Infektionsrisiko für die Besucher somit nicht völlig von der Hand zu
weisen.
5.6 Wiederfindungsrate einzelner Serogruppen in Streichelgehegen
Mit der zweimaligen Beprobung der einzelnen Gehege jeweils im Abstand von zwei
Wochen sollte zum einen erreicht werden, dass auch intermittierende Ausscheider
mit höherer Sicherheit detektiert werden, zum anderen konnte untersucht werden,
inwiefern Serogruppen in Tierarten persistieren und somit auch nach zwei Wochen
noch nachweisbar sind.
In vier Gehegen konnten STEC/EPEC jeweils nur in der ersten Beprobung
nachgewiesen werden, in der zweiten Beprobung waren diese vier Streichelgehege
negativ für STEC/EPEC. Ein weiterer Streichelzoo wiederum war in der ersten
110 Diskussion
Beprobung negativ für STEC/EPEC, jedoch waren in der zweiten Beprobung sowohl
die Ziegen als auch die Schafe positiv für STEC/EPEC. Da die beschriebene
Methode zur Ermittlung der Stichprobenanzahl sicherstellt, dass die jeweiligen
Stichproben ausreichend groß waren, unterstreicht das Ergebnis die Notwendigkeit
der mindestens zweimaligen Beprobung und die Annahme der intermittierenden
Ausscheidung auch bei kleinen Wiederkäuern sowie Damwild.
Die vorliegenden Untersuchungen zeigen, dass mit der angewandten Methodik in
beiden Beprobungen STEC/EPEC-Stämme übereinstimmender Serogruppen in den
Streichelgehegen nachgewiesen werden konnten. In neun Zoos waren die
nachgewiesenen Serogruppen in beiden Beprobungen jeweils in der gleichen Tierart
zu detektieren. Lediglich in einem Zoo konnte die Serogruppe O26 in der zweiten
Beprobung in keiner der Tierarten nachgewiesen werden. Die Serogruppe O43, die
bei der ersten Probenentnahme zuerst in Schafen und Ziegen auftrat, war in der
Nachbeprobung nur noch aus Schafkotproben isolierbar. Die Serogruppe O103 aus
demselben Gehege wurde hingegen in der Nachbeprobung neben Schaf und Ziege
zusätzlich in Schweinekot nachgewiesen. Der wiederholte Nachweis der
Serogruppen in 10 der untersuchten Zoos ist zum einen bezeichnend für eine gute
Gesamtmethodik, zum anderen konnte gezeigt werden, dass auch unter kleinen
Wiederkäuern sowohl intermittierende als auch Langzeitausscheider von
STEC/EPEC zu finden sind. Für große Wiederkäuer sind intermittierende sowie
persistierende Ausscheider von STEC bereits beschrieben (ROBINSON et al. 2004),
eine groß angelegte Studie über das Ausscheidungsmuster von STEC in kleinen
Wiederkäuern fehlt bisher in der Literatur.
5.7 Parkarten und Regionen
5.7.1 Jahr 2008
Die 24 beprobten Streichelgehege gehörten zu 62,5% den zoologischen Gärten, zu
29,2% den Wildparks und zu 8,3% den Freizeitparks mit Tieranteil an. Die Wildparks
waren 2008 signifikant häufiger von STEC/EPEC betroffen als die zoologischen
Gärten (p= 0,0227). Allerdings muss bedacht werden, dass sich die Methodik im Jahr
2008 lediglich auf Isolate der Serogruppe O157 stützte und somit auch
Diskussion 111
sorbitolpositive Isolate nicht weiter bearbeitet wurden. Weshalb nur Wildparks
betroffen waren bleibt spekulativ. Da sich das Gehege- und Hygienemanagement im
vergleich zu Zoos und Freizeitparks nicht unterschied, bleibt zu überlegen, ob sich im
Park frei bewegende Wildwiederkäuer (z.B. Rehwild) eventuell zu einer Übertragung
und stärkeren Belastung des Streichelgeheges geführt haben könnte.
Untersuchungen an Rehwild in Hessen zeigten, dass 19,2% der auf Jagden erlegten
und untersuchten Tiere positiv für STEC waren (A.BARTELS; 2012, Tagungsband
11. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Zootier-, Wildtier- und
Exotenmedizin (DVG)). Für die drei beprobten Regionen konnten keinerlei
Signifikanzen im Hinblick auf das Erregervorkommen aufgezeigt werden.
5.7.2 Jahr 2009
Die 32 beprobten Parks gehörten zu 71,9% den zoologischen Gärten, zu 15,6% den
Wildparks und zu 12,5% den Freizeitparks mit Tieranteil an. In 27 Parks (84,4%)
konnte STEC/EPEC mit Hilfe der Serogruppen erweiterten IMS nachgewiesen
werden. Ein signifikant höheres Vorkommen in einer der Parkkategorien ist bei einer
solch allgemein hohen Prävalenz nicht zu erwarten. Auch signifikante Unterschiede
in den geographischen Regionen waren im Jahr 2009 nicht gegeben.
112 Diskussion
Schlussfolgerung 113
6 Schlussfolgerung
In der in den Jahren 2008 und 2009 durchgeführten Prävalenzstudie zum
Vorkommen von STEC/EPEC in deutschen Streichelzoos wurden insgesamt 1511
Kotproben sowie 43 Insektenproben untersucht. Die Proben stammten aus 56
Einrichtungen, die anhand des Parkmanagements in die Gruppen zoologischer
Garten, Wildpark sowie Freizeitpark mit Tieranteil unterteilt wurden. Zusätzlich zur
bakteriologischen Untersuchung wurden von den Parks anhand von Fragebögen
Angaben zu Futter- und Hygienemanagement, Besucherverpflegung und
Tiergesundheit ermittelt.
Die Parkprävalenz beider Beprobungsjahre für das Vorkommen von STEC lag
zusammen bei 54% (30/56). Dabei wurden im Jahr 2008 die Proben nur auf STEC
der Serogruppe O157 untersucht und die Prävalenz von O157-positiven Parks betrug
12,5%. Im Jahr 2009 stand eine serotyperweiterte IMS zur Verfügung, mit der vier
weitere Serogruppen detektiert werden konnten (O26, O103, O111, O145). Mit
dieser neuen Methode untersucht betrug die Parkprävalenz 84,4%. Gelang 2008
bedingt durch die Methodik der Nachweis von nur einer Serogruppe, konnten 2009
22 unterschiedliche STEC/EPEC-Serogruppen identifiziert werden. Der Nachweis
von STEC/EPEC gelang insgesamt aus sieben verschiedenen Tierarten, darunter
auch Kaninchen, Damwild und Lama, aus welchen bisher relativ selten STEC/EPEC
isoliert wurde. Die Prävalenz von E. coli O157 war mit 5,4% der Zoos relativ gering
und entspricht den Angaben aus anderen Veröffentlichungen.
Die Auswertung der Fragebögen sollte auf mögliche Risikofaktoren hinweisen, die zu
einer erhöhten Erregerprävalenz führen könnten und Indizien für mögliche
Übertragungswege auf den Menschen liefern. Allerdings waren aufgrund des
Methodenwechsels und der damit verbundenen Stichprobenmenge bei einer
Gesamtprävalenz von 54% keine Signifikanzen erkennbar. Lediglich Parks, deren für
den Streichelbereich zuständige Pfleger selbst landwirtschaftliche Nutztierhaltung zu
Hause betrieben, waren signifikant weniger häufig von STEC/EPEC betroffen (p =
0,0033). Weiterhin konnte in der deskriptiven Auswertung der Fragebögen gezeigt
werden, dass in Fragestellungen, welche die STEC/EPEC-Übertragung auf Besucher
betrifft, einige Zoos zu Lösungsansätzen beitragen. So ist z.B. das Essen in
114 Schlussfolgerung
Streichelgehegen in vielen Parks untersagt und Streicheltiere haben keinen Zugang
zu Picknickwiese oder Restaurantbereich, so dass die Besucher während der
Mahlzeiten keinen Kontakt zu den Tieren haben. Ebenso erfreulich ist, dass das
Personal, welches für die Tierpflege verantwortlich ist, nicht gleichzeitig im Bereich
der Besucherverpflegung (Kiosk, Restaurant etc.) tätig ist. Somit wird das Risiko
einer Übertragung durch infiziertes Personal bei der Zubereitung und Abgabe von
Lebensmitteln minimiert.
Um die Übertragung von STEC/EPEC-Erregern auf den Menschen und
insbesondere auf die Risikogruppen (Kinder, Schwangere, immunsuppremierte und
ältere Personen) zu minimieren, ist eine praktizierte Händehygiene oberstes Gebot
(http://www.bfr.bund.de; http://www.face-online.org.uk, letzter Zugriff 15.10.2012). Zu
diesem Zwecke ist es unbedingt erforderlich, dass in direkter Nähe zum
Streichelgehege Handwaschvorrichtungen mit Seife und Trockentüchern angebracht
sind. Diese Maßnahme wurde in vielen deutschen Streichelgehegen bereits
getroffen. Ein Großteil der Besucher ist sich jedoch des Zoonoserisikos nicht
bewusst und geht wenig sorgsam mit der Händehygiene um. Daher sollte
insbesondere die Sensibilisierung der Besucher aber auch die der Parkbetreiber für
Zoonosen verbessert werden. Eine Aufklärung mithilfe von Schildern oder
entsprechend gestaltete Unterrichtsstunden in Zooschulen wären denkbar. Auch
sollte das Pflegerpersonal über entsprechende zwischentierartliche
Weiterverbreitung von Krankheitserreger, z.B. über Schuhwerk oder
Reinigungswerkzeug aufgeklärt werden, um die Infektion wertvoller Tierbestände, die
möglicherweise wesentlich empfindlicher auf STEC/EPEC reagieren, zu vermeiden.
Abschließend bleibt zu sagen, dass Streichelgehege in der immer urbaner lebenden
Gesellschaft oftmals die einzige Möglichkeit für einen intensiveren Mensch-
Tierkontakt bieten. Vor allem Stadtkindern ist es nicht immer möglich, ein eigenes
Haustier zu halten; es ist jedoch gesellschaftlich von großer Bedeutung, dass Kinder
lernen auch Bedürfnisse anderer Lebewesen zu akzeptieren und respektieren.
Streichelgehege bieten diese Möglichkeit und vergleicht man die jährlichen
Besucheranzahlen mit den wenigen nachgewiesenen EHEC-Infektionen die auf
einen Besuch im Streichelgehege zurückzuführen sind, stellen diese trotz hoher
Schlussfolgerung 115
Prävalenz, ein geringes Risiko für die Übertragung auf den Menschen dar, solange
grundlegende Hygieneregeln beachtet werden.
116 Schlussfolgerung
Zusammenfassung 117
7 Zusammenfassung
Bauer, Tanja:
Vorkommen von Shigatoxin-bildenden und enteropathogenen Escherichia coli
in deutschen Streichelzoos
Unter den humanpathogenen Darm- und Durchfallerregern spielen STEC/EPEC
mittlerweile v.a. in den Industriestaaten eine immer größer werdende Rolle. Bei
STEC/EPEC handelt es sich um den Darmkomensalen Escherichia coli, der jedoch
im Fall von STEC/EPEC oder EHEC durch das Beherbergen von Virulenzfaktoren zu
einem pathogenen Erreger wurde. Unzählige, meist durch diverse Lebensmittel
ausgelöste Epidemien, die nicht selten Todesopfer fordern, sind in der Literatur
beschrieben. Häufig liegt der Ursprung solcher Krankheitsausbrüche jedoch auch im
engen Kontakt des Menschen zu großen und kleinen Wiederkäuern. Diese
Tierspezies gelten als symptomlose Reservoirtiere und können STEC/EPEC auf den
Menschen übertragen. Besonders gefährdet an schweren Folgeerkrankungen wie
HUS (hämolytisch urämisches Syndrom) oder TTP (Thrombotisch-
thrombozytopenische Purpura) zu erkranken sind sog. YOPIs (junge, alte,
schwangere und immunsuppremierte Menschen). Da in Streichelzoos v.a. die
Risikogruppe der Kinder vertreten ist, sollte in dieser Studie das Vorkommen in
solchen Einrichtungen untersucht werden. Ziel dieser Arbeit war eine
Prävalenzerhebung von STEC/EPEC in deutschen Streichelzoos sowie das Eruieren
von eventuellen Faktoren, die das STEC-Vorkommen in den Reservoirtieren erhöhen
bzw. Risikofaktoren welche eine Übertragung auf den Menschen potenzieren.
Dazu wurden zunächst 126 Tierparks um ihre Teilnahme an dem Projekt gebeten.
Aus arbeitstechnischen, personellen sowie Kostengründen konnte ein Maximum von
50 Zoos (40% der angeschriebenen Zoos) deutschlandweit beprobt werden. Von den
angefragten Parks nahmen 56 teil, somit wurde das mögliche Maximum deutlich
erreicht. Um die Ergebnisse später auf ganz Deutschland zu projizieren und
eventuelle Störvariablen zu kontrollieren, wurden die Parks, nach Ermittlung der
118 Zusammenfassung
regionalen Zoodichte, je nach Betriebsstruktur in zoologische Gärten, Wildparks und
Freizeitparks mit Tieranteil unterteilt. Außerdem wurde Deutschland in drei Regionen
(Region 1, 2 und 3) unterteilt. Von jeder Parkart sollten nun 40% in jeder der drei
Regionen beprobt werden. Die Beprobungen begannen für das Jahr 2008 im Mai
und endeten Ende August (24 Zoos). Im Jahr 2009 dauerten sie von April bis Mitte
Oktober (32 Zoos) an. Alle Parks wurden zweimal im Abstand von zwei Wochen
beprobt. Die zu ziehende Stichprobengröße wurde individuell anhand der
hypergeometrischen Verteilung mit einer Sicherheitswahrscheinlichkeit (1-α) von
95% und einer angenommenen Prävalenz (P) von 20% berechnet. Die insgesamt
1558 Proben (1517 Kotproben und 41 Insektenproben) aus beiden Jahren wurden im
Institut für Mikrobiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover weiter bearbeitet.
Zusätzlich wurden die Parkbetreiber mittels eines Fragebogens über die
Gehegehygiene und das Gehegemanagement, den Gesundheitsstatus der Tiere
sowie der Besucherverpflegung befragt. Die Fragebögen wurden anschließend mit
Hilfe des Statistikprogramms SAS ausgewertet.
Die Proben aus dem Jahr 2008 wurden mittels immunomagnetischer Separation mit
O157 serogruppenspezifischen Beads und mPCR auf die Virulenzgene Intimin
(eaeA), Hämolysin A (hlyA), Shigatoxin 1 (stx1) sowie Shigatoxin 2 (stx2) untersucht.
Von den 566 Sammelkotproben waren sieben Proben (1,2%) aus drei verschiedenen
Parks (12,5%) STEC positiv. Die 17 untersuchen Insektenproben waren
STEC/EPEC-negativ. Die vom Robert-Koch Institut vorgenommene Serotypisierung
der Isolate ergab die Serogruppe O157 eines Kaninchenisolates aus Park 105 mit
allen getesteten Virulenzgenen. Die Schafisolate aus Park 110 und die Ziegenisolate
aus Park 107 waren nicht typisierbar (Ont). Die Isolate aus Park 107 beherbergten
die Virulenzgene stx1, stx2 sowie hlyA. Die Isolate aus Park 110 trugen die
Virulenzfaktoren stx2 und hlyA. Alle STEC-positiven Parks waren der Kategorie
„Wildpark“ zugeordnet.
Die 975 Proben aus dem Jahr 2009 wurden ebenfalls mittels immunomagnetischer
Separation vorangereichert. Allerdings wurde die IMS aufgrund neuer
wissenschaftlicher Erkenntnisse um vier weitere serogruppenspezifische Beads
erweitert (O26, O103, O111 und O145). Nach einer Screening-PCR wurden die
Zusammenfassung 119
mittels Colony-Hybridisierung gewonnen Isolate in einer Kontroll-PCR auf die
Virulenzgene stx1, stx2 und eae getestet. Auch 2009 waren alle 24 Insektenproben
STEC-negativ. In 27 der 32 untersuchten Parks konnte STEC/EPEC in Kotproben
nachgewiesen werden, das entspricht einer Prävalenz von 84,4% der 2009
untersuchten Zoos. In der Screening-PCR waren 309 (31,7%)
Probenabschwemmungen positiv für mindestens eines der getesteten Virulenzgene.
Insgesamt wurden 297 Isolate aus 201 Proben zur Serotypisierung an das Robert-
Koch Institut weitergeleitet. Es konnten 32 verschiedene Serogruppen aus sechs
verschiedenen Tierarten (Ziege, Schaf, Rind, Schwein, Lama, Damwild) identifiziert
werden. Zu den häufigsten isolierten Serogruppen auf Probenebene gehörten O146
(16,9%), O76 (16,4%) und O26 (10,4%). Die größte Serogruppenvariabilität konnte
bei Ziegen und Schafen, sowie bei Schweinen aufgezeigt werden. Am häufigsten
wurde bei den Ziegen auf Probenebene O76 (13,9%), bei den Schafen O146 (5,5%)
und bei den Schweinen O103 (2,5%) detektiert. Betrachtet man die Virulenzgene der
gewonnen Isolate auf Probenebene, so konnte stx1 in 96 Proben als häufigstes
Virulenzgen, gefolgt von eae (59 Proben) sowie stx1 in Kombination mit stx2 (59
Proben), detektiert werden. Auf Zooebene wurde eae in 68,8% der Parks besonders
oft nachgewiesen. Das Vorkommen dieser Virulenzgene in dieser Häufigkeit und in
diesen Kombinationen konnte von anderen Studien bisher nicht aufgezeigt werden.
Sowohl 2008 als auch 2009 wurden jeweils zu etwa gleichen Teilen (ca. 30%) Parks
in der Region 1, 2 sowie Region 3 beprobt. Bei den 2008 als STEC-positiv
identifizierten Parks handelte es sich um drei Wildparks. Ein signifikanter
Zusammenhang zum Vorkommen von STEC/EPEC in Wildparks zeigte sich
verglichen mit zoologischen Gärten (p=0,0227). Die positiven Parks stammten aus
Region 2 und 3. Das Kaninchenisolat der Serogruppe O157 stammte aus der Region
2. Im Jahr 2009 konnten STEC/EPEC positive Parks in allen drei Regionen und in
jedem Zootyp detektiert werden. Somit konnten keine signifikanten Unterschiede
zwischen dem Vorkommen von STEC/EPEC und der Region oder dem Zootyp
festgestellt werden.
Das Gehegemanagement unterschied sich in allen 56 Parks nur unwesentlich und
hatte keinen Einfluss auf das Vorkommen von STEC/EPEC. Lediglich Parks, in
120 Zusammenfassung
denen der Tierpfleger selbst landwirtschaftliche Nutztierhaltung betrieb, waren 2009
signifikant (p=0,0033) weniger STEC/EPEC-positiv. Möglicherweise sind diese
Tierpfleger was die Infektions- und Seuchengefahr betrifft sensibilisierter, was evtl.
zu einer besseren Hygiene und somit geringerer Reinfektion der Tiere führt. Die
Gehege wurden zum größten Teil (87,5%) täglich, jedoch sowohl Ställe als auch
Ausläufe zu über 80% nur trocken gereinigt. Ein Handwaschbecken für Besucher in
unmittelbarer Nähe zum Streichelgehege gab es erfreulicherweise in über der Hälfte
(53,6%) der untersuchten Zoos, doch leider werden die Besucher nur in 12,5% auf
die Möglichkeit des Händewaschens hingewiesen. Allerdings ist eine abschließende
Beurteilung z.B. der Erregerverschleppung innerhalb des Zoos sowie die
Übertragung auf Besucher nicht möglich, da weder Nichtstreicheltiere noch Besucher
bezüglich STEC/EPEC untersucht wurden.
Abschließend bleibt zu sagen, dass in Anbetracht der jährlichen Besucherzahlen und
den bisher nur wenigen nachgewiesenen Infektionen, die tatsächlich auf einen
Besuch im Streichelgehege zurückzuführen sind, die Infektionsgefahr in deutschen
Streichelzoos trotz der hohen STEC/EPEC-Prävalenz relativ gering ist. Die
gewissenhafte Einhaltung einiger einfacher Hygieneregeln seitens der Besucher wird
dafür jedoch vorausgesetzt. Die sachliche Aufklärung und Sensibilisierung der
Besucher sowie Tierpfleger gegenüber Zoonoserisiken ist Aufgabe des
Parkbetreibers und sollte in den meisten deutschen Streichelzoos verbessert
werden. Die vorliegende Arbeit ist die bisher umfangreichste durchgeführte Studie
zur Erhebung des STEC/EPEC-Vorkommens in deutschen Streichelgehegen. Auch
wenn in diesen Untersuchungen keine signifikanten regionalen, den Zootyp
betreffenden oder Gehegemanagement bedingten Unterschiede bezüglich des
STEC/EPEC-Vorkommens belegt werden konnten, so sind die gewonnenen
Ergebnisse trotz des Methodenwechsels zumindest bedingt auf die STEC/EPEC-
Situation in den gesamten deutschen Streichelzoos übertragbar.
Summary 121
8 Summary
Bauer, Tanja:
Occurrence of shigatoxin-producing and enteropathogenic Escherichia coli in
German petting zoos
Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) and enteropathogenic E. coli (EPEC)
play an important role as causative agents of diarrhoea in humans with increasing
relevance particularly in the industrial states. STEC/EPEC are descendants of
commensal E. coli, which gained pathogenicity by acquisition of virulence factors.
The majority of outbreaks is considered to be food-associated and numerous
epidemics including fatal diseases in humans have been reported. In addition, close
contact to ruminants is described to be a potential source of STEC/EPEC infections.
Ruminants serve as clinically healthy reservoir hosts of these pathogens and may
transmit it to humans. Young, old, pregnant and immunocompromised patients
(YOPIs) are known to be at higher risk for exacerbated and often fatal courses of
STEC infections, such as the haemolytic-uraemic syndrome (HUS) or the thrombotic-
thrombocytopenic purpura (TTP). In petting zoos children may come into close
contact with STEC/EPEC reservoir species, such as sheep and goats. Thus, the aim
of the study was to determine the STEC/EPEC prevalence in petting zoos and to
analyse risk factors influencing its occurrence, as well as the possibility of
transmission.
For this purpose 126 animal parks were contacted. Due to restrictions in time and
financial capacities, a maximum of about 50 parks, equalling about 40% of the
originally contacted parks, was intended to be tested. In total, 56 parks participated in
the study. To control for interfering variables and to allow extrapolation of the results
for whole Germany, parks were divided into three categories: zoological gardens
(zoos), wild parks and amusement parks with animal husbandry. Furthermore,
Germany was divided into three regions (region 1, region 2 and region 3). The aim
for each region and category was to include 40% of the originally contacted zoos in
122 Summary
the study. The study was divided into two sampling periods, with period 1 (24 zoos)
ranging from May to August 2008 and period 2 (32 zoos) lasting from April to October
2009. Each park was sampled twice in an interval of two weeks. Pooled faecal
samples and insects were collected, cooled and transported to the laboratory of the
Institute for Microbiology, University of Veterinary Medicine Hanover, as quickly as
possible. Survey sample sizes were calculated for each park and animal species
according to the herd size, using the hypergeometric distribution with a level of
confidence (1-α) of 95% and an assumed prevalence (P) of 20%. In total, 1,558
samples (1,517 faecal samples and 41 insect samples) were analysed. The park
direction answered a questionnaire about the compound hygiene, the compound
management as well as the health situation of the petting animals and the attendees
fare. The questionnaires were analysed by the statistics program SAS.
In 2008 (sampling 1) E. coli cultures were enriched for serogroup O157 by
immunomagnetic separation with specific antibodies prior to cultivation. Selected
colonies were tested for the presence of intimin (eae), haemolysin A (hlyA),
shigatoxin 1 (stx1) and shigatoxin 2 (stx2) genes by multiplex polymerase chain
reaction (mPCR). STEC was isolated from seven out of 566 faecal samples (1.2%)
originating from three different parks (12.5%; n=24). No STEC was isolated from 17
insect samples. Serotypes of all Isolates were determined by the Robert-Koch
Institute (RKI). One isolate from a rabbit from park 105 was identified as serogroup
O157 and carried all virulence genes tested. Isolates from sheep from zoo 110 and
goats from park 107 were serologically not typeable. The isolates from zoo 110
possessed virulence genes stx2 and hlyA, while isolates from park 107 were positive
for stx1, stx2 and hlyA. All STEC positive parks belonged to the category “wild
parks”.
In 2009 (sampling 2) the immunomagnetic separation was modified to enrich for
serogroups O26, O103, O111 and O145 in addition to O157. STEC strains of these
genotypes are commonly associated with disease in humans and bead-conjugated
antibodies specific for their O-antigens had become commercially available. The
enriched cultures were screened for the presence of stx1, stx2 and eae by mPCR
(screening PCR). For PCR-positive samples individual STEC/EPEC colonies were
Summary 123
selected by colony-hybridisation for stx1, stx2 and eae genes. The presence of these
genes in the isolates was confirmed by mPCR (colony PCR). Again all insect
samples (n=24) were negative for STEC/EPEC. In contrast, 309 out of 975 faecal
samples (31.7%) were tested positive for at least one virulence gene in the screening
PCR. Positive samples originated from 27 out of 32 parks (84%) and six different
animal species (goat, sheep, cattle, pigs, lama and fallow deer). The maximal
proportion of positive samples within an individual park was as high as 80%. A total
of 291 STEC/EPEC isolates from 201 different samples were serotyped by the RKI
and at least 32 different serogroups were identified. Most prevalent serogroups were
O146 (16.9% of all samples with serotyped isolates; n=201), O76 (16.4%) and O26
(10.4%). Serogroup O76 had the broadest geographical distribution, since it was
present in five out of ten postal code zones in Germany and the predominant
serogroup in three of these areas. The highest serotypical variability was observed in
sheep and goats with 22 detected serogroups each. Seven different serogroups were
isolated from pigs. The predominant serogroups in goats, sheep and pigs were O76
(13.9% of all samples with serotyped isolates; n=201), O146 (5.5%) and O103
(2.5%), respectively. The virulence genes eae, stx1 and stx2 were detected in 68.8%,
65.6% and 46.9% of all parks, respectively. Isolates carrying only stx1 were detected
in 96 positive samples, followed by eae alone (59 samples) and the combination of
stx1 and stx2 (59 samples). This is the first study to report these high prevalences of
STEC/EPEC isolates with these virulence gene combinations.
Since STEC/EPEC are known to be shed intermittently by their reservoir host,
sampling of each park was repeated two weeks later to reduce false negative result.
In 2009 five out of 27 positive parks were found positive in only one of the two
samplings. Analysis of serotypes revealed repeated isolation of the same serotypes
in some of the parks, although sometimes in different host species. In some parks, in
which STEC/EPEC was isolated from some host species, other species kept in
parallel remained negative during both samplings.
In both sampling periods (2008 and 2009) approximately equal proportions of parks
from the three regions (about 30% each) were tested. All three parks tested STEC-
positive in 2008 belonged to the category “wild parks” and originated from regions 2
124 Summary
and 3. The STEC/EPEC detection rate in “wild parks” was significantly higher as
compared to zoological gardens during this sampling period. In contrast, in 2009
parks from all categories and regions were tested positive and no significant
differences in detection rates were observed. Serogroup O157 was detected in a
park in region 2 in 2008 and two parks in regions 1 and 3 in 2009.
No remarkable differences were observed between the petting zoo managements of
the tested parks, regardless of their affiliation to the categories of zoological gardens,
wild parks or amusement parks and factors determining the risk for STEC/EPEC
infections in a park were not identified. Only the employment of animal caretakers
which are privately keeping farming animals was significantly associated with a
decreased STEC/EPEC detection rate (p=0.0033). It may be speculated, that these
animal caretakers were more aware of the risks of infections and epidemic plaques.
This awareness may have improved hygiene measures and thereby reduced
STEC/EPEC re-infection rates. The petting zoo enclosures were cleaned daily in the
majority of parks (87.5%), but in more than 80% of the parks only dry cleaning of
both stables and outer parts of the enclosures was performed. Wash-hand basins
were available for the visitors in more than half of the petting zoos (53.6%). However,
the possibility of hand washing was announced to the visitors by signs in only 12.5%
of the parks. A final analysis of STEC/EPEC transmission within zoos or between
petting animals and visitors is not possible, since neither visitors nor zoo animals
other than those in the petting zoos were tested during this study.
Only few human STEC/EPEC infections related to petting animals have been
described so far. Thus, it can be concluded that the risk of transmission to visitors is
low, despite the high STEC/EPEC prevalence in petting animals in Germany
detected in this study. However, the careful performance of simple hygiene
measures, such as hand washing after contact to the animals, appears necessary to
maintain the low risk of transmission. To inform visitors and animal caretakers about
possible risks of zoonotic infections is part of the responsibility of the park direction.
The results of this study have shown that this communication needs to be improved
in most German petting zoos.
Summary 125
This work comprises the most extensive study performed on the presence of
STEC/EPEC in petting zoos in Germany. In summary, no significant differences
between prevalences in different park categories or German regions have been
observed. Management factors influencing the STEC/EPEC detection rates were not
observed. Nevertheless, the results of this study can be extrapolated to the
STEC/EPEC situation in petting zoos throughout Germany, despite the use of
different diagnostic methods during the two sampling periods of this study.
126 Summary
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144 Literaturverzeichnis
Danksagung 145
Danksagung
An dieser Stelle möchte ich Herrn Prof. Dr. P. Valentin-Weigand, Herrn Prof. Dr. G.-
F. Gerlach und Frau Dr. J. Verspohl für die Überlassung des interessanten Themas
sowie das entgegengebrachte Vertrauen und die wissenschaftliche Betreuung
danken. Des Weiteren möchte ich mich bei Frau Dr. P. Grüning für die gründliche
Einarbeitung in die labortechnischen Methoden bedanken. Mein weiterer Dank gilt
dem Zoonoseverbund FBI Zoo für die finanzielle Unterstützung dieses Projektes
sowie dem Robert-Koch Institut und Frau Dr. A. Fruth für die Serotypisierung der
gewonnenen Isolate.
Meinen Mitstreitern und Kollegen des Instituts für Mikrobiologie der Tierärztlichen
Hochschule Hannover danke ich für die tolle Zeit, viel Spaß und der fachlichen als
auch seelischen Unterstützung. Mein besonderer Dank gilt Anna Drees und Beatrice
Neise für die unermüdliche Hilfe bei der Bearbeitung der Probenmassen sowie
Kerstin Habighorst für die Hilfe im Labor und die aufbauenden Kaffeepausen.
Herrn Henstorf danke ich für das Gießen und Bereitstellen der Unmengen an
Agarplatten und Anzuchtbouillon. Herrn Merkel danke ich für die Hilfe bei sämtlichen
EDV-Problemen sowie Frau Baumert für die Unterstützung in allen organisatorischen
Dingen.
Den Mitarbeitern des Instituts für Biometrie, Epidemiologie und
Informationsverarbeitung der Tierärztlichen Hochschule Hannover, v.a. Frau Dr. M.
Heskamp und Frau Dr. A. Ovelhey, danke ich für die Hilfe bei der Erarbeitung und
Auswertung der Fragebögen sowie bei allen Epidemiologischen Fragestellungen.
Meinen Mädels aus Hannover (Caro, Christine, Emy, Isa, Linda, Svenja, Fabienne
und Betty) danke ich für die wunderschöne und lustige Zeit und für die immer wieder
aufbauenden Worte in teils schwierigen Zeiten. Vielen Dank v.a. Christine und Heike
für das schnelle und gründliche Korrekturlesen.
Mein größter Dank geht an Dennis Rubbenstroth, ohne ihn wäre diese Arbeit nie
fertig gestellt worden. Vielen Dank für die ehrlichen, nicht immer leicht zu
146 Danksagung
verdauenden Worte, die langen unermüdlichen Diskussionen und den nicht enden
wollenden Glauben an mich und diese Arbeit.
Mein besonderer Dank geht an meine Eltern. Durch euch war das alles hier erst
möglich und ohne euch wäre ich nicht das was ich jetzt bin.
Anhang I 147
Anhang I (Statistische Auswertung der Fragebögen)
Tab. 15: Statistische Auswertung der Fragebögen mit Hilfe des Fisher’s exact test
STEC total Two-tailed Fisher´s exact test (p value)
pos. neg.
n = (%) 26 (81,2) 6 (18,8) 32 (100)
Frage 1: Wie ist die Bodenbeschaffenheit des Geheges
befestigt/ teils befestigt 20 (62,5) 6 (18,8) 26 (81,3) 0,5645
unbefestigt 6 (18,8) 0 (0,0) 6 (18,8)
Frage 2: Welche Tränkeart wird im Streichelgehege verwendet?
Selbsttränke 12 (37,5) 1 (3,1) 13 (40,6) 0,3606
andere Tränke 14 (43,8) 5 (15,6) 19 (59,4)
Frage 3: Woher wird das Tränkewasser bezogen?
Brunnen/ Grundwasser 10 (31,3) 1 (3,1) 11 (34,4) 0,6367
Stadtwasser 16 (50,0) 5 (15,6 21 (65,6)
Frage 4: Haben die Tiere Zugang zu zusätzlichen Wasserquellen?
ja 26 (81,3) 6 (18,7) 32 (100) -
nein 0 0 0 (0)
Frage 5: Werden die Reinigungswerkzeuge noch in weiteren
Wiederkäuergehegen benutzt?
ja 7 (21,9) 1 (3,1) 8 (25,0) 1,0
nein 19 (59,4) 5 (15,6) 24 (75,0)
Frage 6: Werden die Werkzeuge vor der Benutzung gereinigt?
ja 9 (28,1) 0 (0,0) 9 (28,1) 0,1499
nein 17 (53,1) 6 (18,8) 23 (71,9)
Frage 7: Werden zugekaufte Tiere vorher gesundheitlich untersucht?
ja 23 (71,9) 5 (15,6) 28 (87,5) 1,0
nein 3 (9,4) 1 (3,1) 4 (12,5)
148 Anhang I
STEC total Two-tailed Fisher´s exact test (p value)
pos. neg.
n = (%) 26 (81,2) 6 (18,8) 32 (100)
Frage 8: Gibt es eine Quarantänephase für zugekaufte Tiere?
ja 17 (53,1) 4 (12,5) 21 (65,6) 1,0
nein 9 (28,1) 2 (6,3) 11 (34,4)
Frage 9: Wie oft werden die Streichelgehege gereinigt?
täglich 24 (75,0) 4 (12,5) 28 (87,5) 0,1504
nicht täglich 2 (6,2) 2 (6,2) 4 (12,5)
Frage 10: Wird das Streichelgehege nach der Reinigung desinfiziert?
ja 7 (21,9) 3 (9,4) 10 (31,3) 0,3461
nein 19 (59,4) 3 (9,4) 22 (68,8)
Frage 11: Wird der Bodenbelag in regelmäßigen Abständen erneuert??
ja 8 (25,0) 3 (9,4) 11 (34,4) 0,3897
nein 18 (56,3) 3 (9,4) 21 (65,6)
Frage 12: Betreibt das tierversorgende Personal selbst landwirtschaftliche
Nutztierhaltung?
ja 4 (12,5) 5 (15,6) 9 (28,1) 0,0033
nein 22 (68,8) 1 (3,1) 23 (71,9)
Frage 13: Wurden die Tiere in den letzten 4 Wochen medikamentös behandelt
(außer Antibiotika)?
ja 9 (28,1) 2 (6,3) 11 (34,4) 1,0
nein 17 (53,1) 4 (12,5) 21 (65,6)
Frage 14: Gibt es einen Vertragstierarzt oder einen festangestellten Tierarzt?
Vertragsttierarzt 13 (40,6) 4 (12,5) 17 (53,1) 0,6586
festangestellter Tierarzt 13 (40,6) 2 (6,3) 15 (46,9)
Frage 15: Gibt es landwirtschaftliche Nutztierhaltung im Umkreis von 5-10km?
ja 18 (56,3) 4 (12,5) 22 (68,8) 1,0
nein 8 (25,0) 2 (6,3) 10 (31,3)
Anhang I 149
STEC total Two-tailed Fisher´s exact test (p value)
pos. neg.
n = (%) 26 (81,2) 6 (18,8) 32 (100)
Frage 16: Gibt es Rinderhaltung im Umkreis von 5-10km?
ja 16 (50,0) 4 (12,5) 20 (62,5) 1,0
nein 10 (31,3) 2 (6,3) 12 (37,5)
Frage 17: Dürfen die Tiere durch die Besucher gefüttert werden?
ja 14 (43,8) 4 (12,5) 18 (56,3) 0,6722
nein 12 (37,5) 2 (6,3) 14 (43,8)
Frage 18: Mit was werden die Tiere von den Besuchern gefüttert
(Mehrfachnennung möglich)?
Mischfutter (Pellets) 14 (43,8) 2 (6,3) 16 (50,0) 0,6539
Rauhfutter (Heucobs, ect.) 12 (37,5) 4 (12,5) 16 (50,0)
Frage 19: Dürfen Besucher im Streichelbereich essen?
ja 16 (50,0) 3 (9,4) 19 (59,4) 0,6664
nein 10 (31,3) 3 (9,4) 13 (40,6)
Frage 20: Wird auf das Essensverbot im Streichelbereich hingewiesen?
ja 21 (65,6) 5 (15,6) 26 (81,3) 1,0
nein 5 (15,6) 1 (3,1) 6 (18,8)
Frage 21: Werden Snacks und Speisen im Umkreis von ca. 100m zum
Streichelgehege verkauft?
ja 18 (56,3) 4 (12,5) 22 (68,8) 1,0
nein 8 (25,0) 2 (6,3) 10 (31,3)
Frage 22: Gibt es ein Handwaschbecken in unmittelbarer Nähe des
Streichelgeheges?
ja 17 (53,1) 1 (3,1) 18 (56,3) 0,0636
nein 9 (28,1) 5 (15,6) 14 (43,8)
150 Anhang I
STEC total Two-tailed Fisher´s exact test (p value)
pos. neg.
n = (%) 26 (81,2) 6 (18,8) 32 (100)
Frage 23: Werden die Besucher auf die Möglichkeit zum Händewaschen
hingewiesen?
ja 5 (15,6) 2 (6,3) 7 (21,9) 0,5896
nein 21 (65,6) 4 (12,5) 25 (78,1)
Frage 24: Welche Tiere versorgt der für den Streichelbereich zuständige
Tierpfleger noch?
andere Nutztiere und/oder Vögel 18 (56,3) 5 (15,6) 23 (71,9) 0,6482
sonstige Tiere 8 (25,0) 1 (3,1) 9 (28,1)
Anhang II 151
Anhang II (Deskriptive Auswertung der Fragebögen)
Tab. 16: Deskriptive Auswertung der Fragebögen
Frage A1: Art und Anzahl der Tiere, die in den Streichelgehegen gestreichelt
werden können.
Tierart Anzahl Zoos (%)
n=56
Mittelwert
± Std.-Abw.
Minimum Maximum
Ziegen 52 (92,86) 17,37 ± 10,33 5,00 47,00
Schafe 31 (55,36) 11,03 ± 8,34 1,00 35,00
Schweine 12 (21,43) 6,67 ± 5,05 2,00 19,00
Pferde / Ponies 10 (17,86) 3,60 ± 2,63 1,00 8,00
Lamas 2 (3,57) 1,50 ± 0,71 1,00 2,00
Geflügel 2 (3,57) 7,00 ± 1,41 6,00 8,00
Kaninchen 8 (14,29) 20,38 ± 20,05 2,00 50,00
Meerschweinchen 3 (5,36) 10,33 ± 10,12 4,00 22,00
Sonstige Tiere 10 (17,86) 8,50 ± 8,14 2,00 24,00
Frage A2: Welche Tiere leben zusätzlich in den Streichelgehegen, lassen sich
jedoch nicht anfassen?
Tierart Anzahl Zoos (%)
n=56
Mittelwert
± Std-Abw.
Minimum Maximum
Geflügel 9 (16,07) 15,00 ± 17,27 5,00 58,00
Wildvögel 56 (100,00) k.A. k.A. k.A.
Sonstige Tiere 5 (8,93) 5,20 ± 3,42 1,00 10,00
152 Anhang II
Frage A3: Leben die Tiere ganzjährig in Offenstallhaltung?
Offenstallhaltung Anzahl Zoos (%) n=56
Ja 51 (91,07)
Nein 5 (8,93)
Frage A4: Wie groß ist ca. die Fläche der Streichelgehege?
Anzahl Zoos (%)
n=56
Mittelwert
± Std-Abw.
Minimum Maximum
Gehegegröße (qm) 53 (94,64) 1273,25 ± 1840 20,00 10000,00
Keine Angaben 3 (5,36)
Frage A5: Wie ist die Bodenbeschaffenheit der Gehege?
Bodenbeschaffenheit Anzahl Zoos (%) n=56
Befestigt 4 (7,14)
Teilweise befestigt 38 (67,86)
Unbefestigt 14 (25,00)
Frage A6: Wie viele Besucher haben die Zoos jährlich im Durchschnitt?
Anzahl Zoos (%)
n=56
Mittelwert
± Std-Abw.
Minimum Maximum
Zoo gesamt 55 (98,21) 274.164 ± 290.351 11.000 1.300.000
Keine Angaben 1 (1,79)
Streichelgehege 45 (80,35) 187.689 ± 205.061 8.000 1.100.000
Keine Angaben 11 (19,64)
Anhang II 153
Frage B1: Womit werden die Tiere gefüttert?
Zooeigenes Futter vom Tierpfleger verfüttert Anzahl Zoos (%) n=56
Heu 54 (96,43)
Stroh 31 (55,36)
Getreide 15 (26,79)
Pelletiertes Mischfutter 29 (51,79)
Brot 9 (16,07)
Obst/ Gemüse 30 (53,57)
Grünfutter 45 (80,36)
Küchenabfälle 1(1,79)
Zooeigenes Futter vom Besucher verfüttert Anzahl Zoos (%) n=56
Heu 21 (37,50)
Stroh 0 (0,00)
Getreide 3 (5,36)
Pelletiertes Mischfutter 23 (41,07)
Brot 3 (5,36)
Obst/ Gemüse 1 (1,79)
Grünfutter 0(0,00)
Küchenabfälle 0 (0,00)
Vom Besucher verfüttertes, mitgebrachtes Futter Anzahl Zoos (%) n=56
Heu 1 (1,79)
Stroh 0 (0,00)
Getreide 1 (1,79)
Pelletiertes Mischfutter 0 (0,00)
Brot 5 (8,93)
Obst/ Gemüse 4 (7,14)
Grünfutter 0 (0,00)
Küchenabfälle 2 (3,57)
154 Anhang II
Frage B2: Welche Tränkearten verwenden die Zoos? (Mehrfachnennungen
möglich)
Tränkeart Anzahl Zoos (%)
Tränkeeimer 17 (30,36)
Trog 19 (33,93)
Selbsttränke 25 (44,64)
Frage B3: Woher beziehen die Zoos das Tränkewasser?
Bezugsquelle Anzahl Zoos (%)
Stadtwasser/ Trinkwasser 39 (69,64)
Brunnen-/ Grundwasser 17 (30,36)
Frage B4: Haben die Tiere zusätzlich zu den Tränken noch Zugang zu anderen
Wasserquellen?
Zusätzliche Wasserquelle Anzahl Zoos (%)
n=56
Art der zus.
Wasserquelle
Anzahl Zoos (%)
n=9
Ja 9 (16,07) Bach 6 (10,71)
Teich 2 (3,57)
Sonstiges 1 (1,79)
Nein 46 (82,14)
Keine Angaben 1 (1,79)
Frage C1: Darf im Streichelbereich gegessen werden?
Anzahl Zoos (%) n=56
Ja 33 (58,93)
Nein 23 (41,07)
Anhang II 155
Frage C2: Wird darauf hingewiesen, wenn im Streichelbereich nicht gegessen
werden darf?
Anzahl Zoos (%) n=23 Hinweisart Anzahl Zoos (%) n=9
Ja 9 (39,13) Mündlich 6 (66,67)
Hinweisschilder 3 (33,33)
Nein 13 (56,52)
Nicht bekannt 1 (4,35)
Frage C3: Haben die Streicheltiere Zugang zum Restaurantbereich oder einer
Picknickwiese?
Anzahl Zoos (%) n=56
Ja 1 (1,79)
Nein 54 (96,43)
Keine Angaben 1 (1,79)
Frage C4: Werden Snack und Speisen im Umkreis von ca. 100 m zum
Streichelgehege verkauft?
Anzahl Zoos (%) n=56 Art der verk. Speisen Anzahl Zoos (%) n=44
Ja 44 (78,57) Kuchen 27 (61,36)
Warme Speisen 41 (93,18)
Belegte Brötchen 17 (38,64)
Kugeleis (offen) 13 (29,55)
Stieleis (verpackt) 40 (90,90)
Sonstiges 11 (25,00)
Nein 12 (21,43)
156 Anhang II
Frage C5: Hat das Personal, das für die Besucherverpflegung zuständig ist, Kontakt
zu den Tieren?
Anzahl Zoos (%) n=56
Ja 3 (5,36)
Nein 53 (94,64)
Frage D1: Werden dieselben Reinigungsgeräte außer im Streichelgehege auch bei
anderen Tieren des Parks benutzt? (Mehrfachnennung Tierart möglich)
Anzahl Zoos (%)
n=56
Tierart Anzahl Zoos (%)
n=28
Ja 28 (50,00) Wiederkäuer 13
Pferde 7
Schweine 5
Vögel 5
Sonstiges 0
Nein 28 (50,00)
Anhang II 157
Frage D2: Wenn Geräte in anderen Gehegen benutzt werden, werden diese Geräte
vor der Nutzung im Streichelbereich gereinigt/ desinfiziert?
Reinigung der Geräte Anzahl Zoos (%) n=28
Immer 1 (3,57)
Nicht immer 10 (35,71)
Nie 16 (57,14)
Nicht alle Geräte 1 (3,57)
Desinfektion der Geräte Anzahl Zoos (%) n=28
Nicht immer 4 (14,29)
Nie 22 (78,57)
Nicht alle Geräte 1 (3,57)
Keine Angaben 1 (3,57)
Frage D3: Wie lange bleiben Ziegen/ Schafe durchschnittlich im Streichelgehege?
Anzahl Zoos (%) n=56
Zeitlebens 22 (39,29)
Keine Angaben 34 (60,71)
Anzahl Zoos
(%)
Mittelwert (Jahre)
± Std.-Abw.
Minimum
(Jahre)
Maximum
(Jahre)
Verbleib Böcke 14 3,86 ± 1,83 2,00 9,00
Verbleib Jungtiere 23 0,71 ± 1,17 0,25 6,00
158 Anhang II
Frage D4: Werden Tiere zugekauft und wenn ja, wie viele pro Jahr?
Anzahl Zoos (%) n=56
Zukäufe 8 (14,29)
Keine Zukäufe 26 (46,43)
Austausch Böcke 19 (33,93)
Nicht bekannt 2 (3,57)
Keine Angaben 1 (1,79)
Anzahl Zoos (%)
n=56
Mittelwert ±
Std.-Abw.
Minimum Maximum
Zukauf Tiere 8 (14,29) 8,88 ± 16,87 1,00 50,00
Frage D5: Wenn Tiere zugekauft werden, werden diese zuvor gesundheitlich
untersucht?
Anzahl Zoos (%) n=56
Ja 30 (53,57)
Nein 6 (10,71)
Unterschiedlich 9 (16,07)
Nicht bekannt 1 (1,79)
Keine Angaben 1 (1,79)
Entfällt 9 (16,07)
Anhang II 159
Frage D6: Wenn Tiere zugekauft werden, gibt es eine Quarantänephase?
Anzahl Zoos (%) n=56
Ja 20 (35,71)
Nein 18 (32,14)
Unterschiedlich 3 (5,36)
Bei Bedarf 6 (10,71)
Keine Angaben 1 (1,79)
Entfällt 8 (14,29)
Frage D7: Ist ein Handwaschbecken in der unmittelbaren Nähe (10m) des
Streichelbereiches?
Waschbecken für
Besucher
Anzahl Zoos (%)
n=56
Ausstattung Anzahl Zoos (%)
n=30
Ja 30 (53,57) Fließend kaltes
Wasser
29 (96,67)
Fließend warmes
Wasser
5 (16,67)
Seife 12 (40,00)
Handtücher 7 (23,33)
Trockengebläse 6 (20,00)
Nein 26 (46,43)
160 Anhang II
Frage D8: Werden die Besucher auf die Möglichkeit zum Hände waschen
hingewiesen?
Anzahl Zoos (%) n=56 Hinweisart Anzahl Zoos (%) n=7
Ja 7 (12,50) Mündlich 2 (28,57)
Hinweisschilder 5 (71,43)
Nein 47 (83,93)
Keine Angaben 2 (3,57)
Frage D9: Wie oft werden die Ausläufe der Tiere gereinigt?
Anzahl Zoos (%) n=56
Täglich 49 (87,50)
Wöchentlich 3 (5,36)
Nach Bedarf 4 (7,14)
Frage D10: Wie werden die Ställe gereinigt?
Anzahl Zoos (%) n=56
Trocken 47 (83,93)
Trocken und Nass 9 (16,07)
Frage D11: Wie werden die Ausläufe gereinigt?
Anzahl Zoos (%) n=56
Trocken 49 (87,50)
Trocken und nass 6 (10,71)
Keine Angaben 1 (1,79)
Anhang II 161
Frage D12: Wird während/nach der Reinigung desinfiziert?
Anzahl Zoos (%)
n=56
Zu desinfizierender
Bereich
Anzahl Zoos (%) n=16
Ja 16 (28,57) Ställe 15 (93,75)
Ausläufe 4 (25,00)
Nein 38 (67,86)
Keine Angaben 2 (3,57)
Frage D13: Wird der Bodenbelag im Streichelgehege von Zeit zu Zeit gewechselt?
Anzahl Zoos (%) n=56
Ja 18 (32,14)
Nein 35 (62,50)
Nicht bekannt 2 (3,57)
Keine Angaben 1 (1,79)
Frage D14: Welche Tierart(en) versorgt der für den Streichelzoo zuständige
Tierpfleger noch?
Tierart Anzahl Zoos (%) n=56
Heimische Nutztiere 34 (60,71)
Heimische Wildtiere 29 (51,79)
Vögel 29 (51,79)
Nicht heimische Tiere 29 (51,79)
Sonstige Tiere 11 (19,64)
Keine weiteren Tiere 2 (3,57)
162 Anhang II
Frage D15: Hat das Personal, das Kontakt zu den Tieren hat selbst
landwirtschaftliche Tierhaltung zu Hause?
Anzahl Zoos (%) n=56
Ja 14 (25,00)
Nein 40 (71,43)
Nicht bekannt 2 (3,57)
Frage D16: Welche Art von Reinigung erfolgt zwischen dem Versorgen der
unterschiedlichen Gehege?
Reinigung Anzahl Zoos (%) n=56
Hände Stiefel
Ja 20 (35,71) 7 (12,50)
Nein 35 (62,50) 45 (80,36)
Nicht bekannt 1 (1,79) 2 (3,57)
Keine Angaben 0 (0,00) 2 (3,57)
Desinfektion Anzahl Zoos (%) n=56
Hände Stiefel
Ja 8 (14,29) 5 (8,93)
Nein 13 (23,21) 8 (14,29)
Weder Reinigung noch Desinfektion 35 (62,50) 43 (76,79)
Anhang II 163
Frage D17: Welche Berufsausbildung haben die für das Streichelgehege zuständigen
Tierpfleger?
Berufsausbildung Anzahl Zoos (%) n=56
Staatl. geprüfter (Zoo-)Tierpfleger 43 (76,79)
Andere Tierpflegerausbildung 12 (21,43)
Tierarzt 2 (3,57)
Schulung/ Seminar 2 (3,57)
Keine spez. Tierpflegerausbildung 19 (33,93)
Frage E1: Sind/ waren Tiere des Streichelzoos in den letzten vier Wochen erkrankt?
Anzahl Zoos (%) n=56
Ja 10 (17,86)
Nein 46 (82,14)
Frage E1-a: Welcher Art war die Erkrankung?
Erkrankung Anzahl Zoos (%) n=10
Abszess 1 (10,0)
CAE-Verdacht 1 (10,0)
Diarrhoe 2 (20,0)
Gastritis 1 (10,0)
Kokzidien 1 (10,0)
Koliken 1 (10,0)
Mastitis 1 (10,0)
Nasenausfluss, Hautkrusten 1 (10,0)
Todesfall bei Zwillingsgeburt 1 (10,0)
164 Anhang II
Frage E2: Um welche Tierart handelte es sich bei den erkrankten Tieren?
Tierart Anzahl Zoos (%) n=56
Ziegen 8 (14,29)
Schafe 2 (3,57)
Pferde/Ponies 1 (1,79)
Frage E3: Wurden Tiere des Streichelzoos in den letzten vier Wochen
medikamentös behandelt?
Medikamentenbehandlung Anzahl Zoos (%)
n=56
Medikament Anzahl Zoos (%)
n=25
Ja 25 (44,64) Antiparasitika 12 (48,0)
Antibiotika 2 (8,0)
Impfungen 12 (48,0)
Nein 29 (51,79)
Nicht bekannt 1 (1,79)
Keine Angaben 1 (1,79)
Frage E4: Werden die Tiere vom Tierarzt regelmäßig auf das Vorhandensein
bakterieller Erreger untersucht?
Untersuchung Anzahl Zoos (%)
n=56
Untersuchungshäufigkeit Anzahl Zoos (%)
n=43
Ja 43 (76,79) Regelmäßig 6 (13,95)
Nach Bedarf 35 (81,4)
Keine Angaben 2 (4,65)
Nein 13 (23,21)
Anhang II 165
Frage E5: Wenn ja, worauf werden die Tiere untersucht?
Erreger Anzahl Zoos (%) n=43
Salmonellen 13 (30,23)
Campylobakter 5 (11,63)
Yersinien 3 (6,98)
Andere bakt. Erreger 17 (39,53)
Nicht bekannt 18 (41,86)
Frage E6: Ist ein Tierarzt fest angestellt oder gibt es einen Vertragstierarzt?
Angestellter
Tierarzt
Anzahl Zoos (%),
n=56
Anstellungsart Anzahl Zoos (%),
n=53
Ja 53 (94,64) Festangestellter TA 21 (39,62)
Vertrags-TA 32 (60,38)
Nein 2 (3,57)
Keine Angaben 1 (1,79)
Frage E7: Gab es generell im Zoo schon einmal Probleme mit Salmonellen
und/oder EHEC?
Erregervorkommen Anzahl Zoos (%), n=56
Ja, bei Zootieren 20 (35,71)
Nein 30 (53,57)
Nicht bekannt 6 (10,71)
166 Anhang II
Frage F1: Gibt es landwirtschaftliche Nutztierhaltung in der näheren Umgebung
(Umkreis 5-10km)?
Nutztiere in
näherer
Umgebung
Anzahl Zoos (%),
n=56
Tierart Anzahl Zoos (%),
n=36
Ja 36 (64,29) Schweinehaltung 20 (55,56)
Geflügelhaltung 12 (33,33)
Rinderhaltung 31 (86,11)
Andere Nutztiere 7 (19,44)
Nein 13 (23,21)
Nicht bekannt 7 (12,50)
Frage F2: Wie häufig erfolgt eine Fliegenbekämpfung im Stall?
Fliegenbekämpfung Anzahl Zoos (%), n=56
Permanent 4 (7,14)
Bei starkem Befall 14 (25,00)
Nie 37 (66,07)
Nicht bekannt 1 (1,79)
Frage F3: Wie häufig erfolgt eine Nagerbekämpfung?
Nagerbekämpfung Anzahl Zoos (%), n=56
Permanent 31 (55,36)
Bei starkem Befall 9 (16,07)
Bei geringem Befall 3 (5,36)
Nie 11 (19,64)
Nicht bekannt 2 (3,57)