8/8/2019 VOGELSTEIN Purification of DNA From Agarose

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8/8/2019 VOGELSTEIN Purification of DNA From Agarose

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6 1 6 B i o c h e m i s t r y : V o g e l s t e i n a n d G i l l e s p i ec i p i t a t e w a s d i s s o l v e d i n 1 0 - 2 5 t i l o f 7 0 % ( v o l / v o l ) f o r m -a m i d e / 0 . 2 M p o t a s s i u m p h o s p h a t e a t pH 6 . 8 c o n t a i n i n g l a b e l e dp r o b e . F o r m a m i d e / p h o s p h a t e b u f f e r w a s s p r e a d o v e r t h e e n t i r eDN A p r e c i p i t a t e b y g e n t l e t a p p i n g ; t h e t u b e w a s t h e n o v e r l a i dw i t h a b o u t 2 0 0 t i l o f m i n e r a l o i l . T h e t u b e s w e r e c o v e r e d w i t hn o . 4 r e d c a p s ( F e d e r a l S c i e n t i f i c , B e t h e s d a , M D ) .T h e t u b e s w e r e p l a c e d a t 9 0 - 1 0 0 ' C f o r 1 0 m i n , t h e n i n c u -b a t e d a t h y b r i d i z a t i o n t e m p e r a t u r e f o r t h e d e s i r e d l e n g t h o ft i m e . RNA-DNA h y b r i d i z a t i o n p r o c e e d e d w i t h o u t DN Ar e a n n e a l i n g i n f o r m a m i d e / p h o s p h a t e b u f f e r a t 4 4 0 C ( 1 6 , 1 7 ) .T h e h y b r i d i z a t i o n r e a c t i o n w a s t e r m i n a t e d b y d i r e c t a d d i t i o nt o t h e t u b e o f 1 m l o f 0 . 4 5 M N a C l / 0 . 0 4 5 M N a c i t r a t e c o n -t a i n i n g 2 0 , g o f R N a s e A ( S i g m a ) p e r m l a n d 5 0 u n i t s o f R N a s eT I ( C a l b i o c h e m ) p e r m l . T h e s o l u t i o n s w e r e m i x e d , t h e n i n -c u b a t e d f o r 2 h r a t 3 7 0 C . T h e s a m p l e s w e r e c h i l l e d a n d b r o u g h tt o 1 0 % w i t h t r i c h l o r o a c e t i c a c i d . T h e p r e c i p i t a t e w a s c o l l e c t e do n t y p e G F / C g l a s s f i b e r f i l t e r s ( W h a t m a n ) . B a c k g r o u n d l e v e l sw e r e u n d e r 0 . 5 % o f t h e i n p u t r a d i o a c t i v i t y . T h e m i n e r a l o i ll a r g e l y p a s s e d t h r o u g h t h e f i l t e r . 1 2 5 I w a s m e a s u r e d i n a g a m m ac o u n t e r . T o d e t e r m i n e t h e r a d i o a c t i v i t y o f t h e i n t e r n a l m a r k e r s ,w e s h o o k t h e f i l t e r s o v e r n i g h t w i t h 1 m l o f H20/NCS t i s s u es o l u b i l i z e r ( A m e r s h a m ) ( 0 . 1 5 : 1 , v o l / v o l ) t h e n c o u n t e d t h e m i n1 0 m l o f t o l u e n e - b a s e d s c i n t i l l a n t c o n t a i n i n g 0 . 1 m l o f g l a c i a la c e t i c a c i d .M e t h o d s I I : P r e p a r a t i v e E l e c t r o p h o r e s i s a n d R e m o v a l o fDN A F r o m A g a r o s e . A 5 - i n c h ( 1 2 . 7 - c m ) d i a m e t e r g e l s y s t e md e s i g n e d b y D a v i d S t r a y e r w a s u s e d ( u n p u b l i s h e d d a t a ) . P r e -p a r a t i v e g e l s o f 0 . 4 - 0 . 6 % a g a r o s e g a v e h i g h r e s o l u t i o n o ff r a g m e n t s f r o m 0 . 5 3 - 1 0 6 t o 3 3 - 1 0 6 d a l t o n s , s t a r t i n g f r o m 1 2 m go f DN A d i g e s t e d w i t h r e s t r i c t i o n e n z y m e s h a v i n g s i x b a s e -p a i r - r e c o g n i t i o n s i t e s . S l i c e s f r o m p r e p a r a t i v e g e l s w e r e w e i g h e da n d d i s s o l v e d i n 2 m l o f s a t u r a t e d N a l p e r g o f a g a r o s e , u s u a l l yi n s c r e w - c a p , p o l y p r o p y l e n e , c e n t r i f u g e t u b e s ( n o . 2 0 8 9 , F a l -c o n ) . R a d i o a c t i v e DN A w a s a d d e d t o m o n i t o r r e c o v e r y . A t l e a s t1 m g o f g l a s s p o w d e r w a s a d d e d p e r M i g o f DN A e x p e c t e d t o b ei n t h e a g a r o s e s l i c e . T h e t u b e w a s r e v o l v e d s l o w l y e n d - o v e r - e n da t 2 5 C u n t i l a l l t h e DN A w a s b o u n d t o t h e g l a s s . T h e r a t e o fb i n d i n g o f DN A t o g l a s s w a s p r o p o r t i o n a l t o t h e c o n c e n t r a t i o no f g l a s s s u r f a c e ; F i g . l B c a n b e u s e d t o c a l c u l a t e b i n d i n gr a t e s .G l a s s p o w d e r w a s c o l l e c t e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t t h e l o w e s tp e r m i s s i b l e g - f o r c e . D N A - g l a s s c l u m p s s e d i m e n t e d q u a n t i t a -t i v e l y a t l e s s t h a n 5 0 0 0 X g f o r 5 m i n . D N A - g l a s s w a s t h e nw a s h e d w i t h a b o u t 1 0 0 v o l o f 7 0 % ( w t / v o l ) N a I . T o d o t h i sw i t h o u t d e g r a d a t i o n o f h i g h m o l e c u l a r w e i g h t D N A , we s u s -p e n d e d t h e p a r t i c l e s g e n t l y a s l a r g e a g g r e g a t e s a n d r e v o l v e dt h e m f o r 3 0 m i n a t 2 5 0 C , a l l o w i n g r e s i d u a l a g a r o s e t o d i f f u s ei n t o t h e N a T . D N A - g l a s s w a s a g a i n c o l l e c t e d b y c e n t r i f u g a t i o n .P a r t i c l e s w e r e w a s h e d g e n t l y w i t h t h e l a r g e s t c o n v e n i e n t v o l -ume o f a m i x t u r e o f 5 0 % b u f f e r ( 2 0 mM T r i s . H C I , pH 7 . 2 / 0 . 2M N a C l / 2 mM E D T A ) a n d 5 0 % e t h a n o l t o r e m o v e N a l .T h e D N A - g l a s s w a s s u s p e n d e d i n a b o u t 1 0 v o l o f 2 0 mMT r i s - H C l , pH 7 . 2 / 0 . 2 M N a C l / 2 mM EDTA. DN A w a s e l u t e da t 3 7 0 C f o r 3 0 m i n w i t h o c c a s i o n a l g e n t l e m i x i n g . G l a s s w a sr e m o v e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 1 0 , 0 0 0 X g f o r 2 0 m i n . DN A w a sp r e c i p i t a t e d f r o m e t h a n o l a n d d i s s o l v e d i n S mM N a O A c / 2 mME D T A / 4 0 mM T r i s a c e t a t e , pH 7 . 8 .

RES U LTSB i n d i n g o f DN A t o G l a s s . B o t h DN A a n d a g a r o s e a r e s o l u b l ei n h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f N a T ; a n d i n N a I , g l a s s b i n d s DNA. T h et w o m a j o r c l a s s e s o f g l a s s t e s t e d , s o d a l i m e a n d b o r o s i l i c a t e ,b o u n d DN A w i t h c o m p a r a b l e e f f e c t i v e n e s s ( F i g . 1 A ) . S m a l la m o u n t s o f DN A c a n b e b o u n d t o c o n t i n u o u s g l a s s s u r f a c e s ; t h ei n t e r i o r s u r f a c e o f a 1 0 X 7 5 mm t u b e h o l d s a b o u t 1 M i g o f D N A ;t h a t o f a s c i n t i l l a t i o n v i a l , a b o u t 1 0 M u g . G l a s s f i b e r f i l t e r s b i n d

0 . 0 1 0 . 0 31 0 0 - A

-

c: 30. 0z

a

. 0C

za

j u g DNA b o u nd /mg g l a s s0 . 1 0 . 3 1 2 3 5 1 0 2 0

1 2 3 4T i m e , h r

c2 0 0 0

1500E0 .1 0 0 0

5 0 0

1 0 2 0 3 0 40S l i c e n o .

F I G . 1 . B i n d i n g o f DNA t o g l a s s . ( A ) C a p a c i t y o f g l a s s . DN Awas m i x e d w i t h 1 0 m g o f g l a s s p a r t i c l e s i n 0 . 2 5 m l o f 5 mM N a O A c / 2mM E D T A / 4 0 mM T r i s a c e t a t e , pH 7 . 8 . S a t u r a t e d N a l ( 0 . 6 m l ) w i t ho r w i t h o u t 1 0 m g o f a g a r o s e was a d d e d a n d DN A was a l l o w e d t o b i n dt o t h e g l a s s f o r 1 5 m i n a t 2 5 0 C w i t h m i x i n g . G l a s s was s e p a r a t e d f r o mt h e s o l u t i o n b y c e n t r i f u g a t i o n . A , L a r g e f l i n t g l a s s p a r t i c l e s ; 0 a n d* , l a r g e b o r o s i l i c a t e g l a s s p a r t i c l e s ; 3 a n d * , medium f l i n t g l a s sp a r t i c l e s ; 0 , v , a n d * , f l i n t g l a s s p o w d e r ; + a n d v , s i l i c a p o w d e r . 0 ,* , * , a n d v , P l u s a g a r o s e ; r e m a i n d e r , n o a g a r o s e . S i z e s o f g l a s s a r ed e f i n e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . ( B ) K i n e t i c s o f b i n d i n g . S a t u r a t e dN a I ( 3 2 m l ) w a s u s e d t o d i s s o l v e 1 6 g o f 0 . 6 % a g a r o s e i n a 5 0 - m l F a l c o np o l y p r o p y l e n e c e n t r i f u g e t u b e . E . c o l i [ 1 4 C ] D N A ( 1 0 t i g ) a n d s i l i c ap o w d e r ( 5 0 m g ) w e r e a d d e d a n d t h e t u b e was r e v o l v e d e n d - o v e r - e n da t a b o u t 6 r p m . A t i n t e r v a l s , 1 m l was r e m o v e d a n d t h e p e r c e n t o f t h e1 4 C b o u n d was d e t e r m i n e d . ( C ) S i z e o f r e c o v e r e d DNA. [ 3 H ] D N Af r o m b a c t e r i o p h a g e X was r u n i n t o a 0 . 3 % a g a r o s e s l a b . T h e DNA wasl o c a t e d a f t e r s t a i n i n g w i t h e t h i d i u m b r o m i d e , t h e n r e m o v e d f r o ma g a r o s e b y b i n d i n g t o f l i n t g l a s s p o w d e r . T h e DNA was p r e c i p i t a t e df r o m e t h a n o l , t h e n r e r u n o n a 0 . 3 % a g a r o s e g e l . T h i s g e l was s l i c e d a n dt h e r a d i o a c t i v i t y o f e a c h s l i c e was m e a s u r e d i n a s c i n t i l l a t i o n c o u n t e r .A r r o w m a r k s t h e p o s i t i o n o f m a r k e r b a c t e r i o p h a g e X DNA.DNA i n N a l , b u t q u a n t i t a t i v e r e c o v e r y i n s m a l l v o l u m e s i sd i f f i c u l t .A l t h o u g h t h e b i n d i n g o f DNA t o t u b e s o r v i a l s i s a n un c om-m o n l y e a s y w a y o f s e p a r a t i n g DNA f r o m a g a r o s e , t h e c a p a c i t yi s t o o s m a l l f o r m o s t p r e p a r a t i v e e x p e r i m e n t s . Th e amount o fDNA b o u n d p e r w e i g h t o f g l a s s w a s i n c r e a s e d d r a m a t i c a l l y b yu s i n g g l a s s p o w d e r ( F i g . 1 A ) . M o r e o v e r , t h e k i n e t i c s o f b i n d i n go f DNA t o g l a s s w a s i m p r o v e d w i t h t h e p o w d e r ( F i g . 1 B ) . P o -r o u s g l a s s b e a d s b i n d e x t r a o r d i n a r y a m o u n t s o f D N A , b u t t h eb i n d i n g i s s l o w a n d n o t q u a n t i t a t i v e a n d DNA d e g r a d a t i o nr e s u l t s d u r i n g e l u t i o n o f t h e DNA f r o m t h e p o r e s . S i l i c i c a c i da l s o h a s a v e r y h i g h c a p a c i t y f o r D N A , b u t i s d i f f i c u l t t o h a n d l em e c h a n i c a l l y a n d p r e s e n t s s i m i l a r r e c o v e r y p r o b l e m s .T h e g l a s s - b i n d i n g t e c h n i q u e i s u n i q u e l y s u i t e d f o r t h e r a p i dr e m o v a l o f h i g h m o l e c u l a r w e i g h t DNA f r o m a g a r o s e . DNA

I

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 6 ( 1 9 7 9 )

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P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 6 ( 1 9 7 9 ) 6 1 7f r o m b a c t e r i o p h a g e X i s a b o u t 4 8 , 0 0 0 b a s e p a i r s l o n g a n d canb e r e c o v e r e d u n d e g r a d e d ( F i g . I C ) . O n t h e o t h e r h a n d , DN Af r a g m e n t s u n d e r 1 0 0 b a s e p a i r s l o n g w e r e a l s o r e c o v e r e d i n h i g hy i e l d ( n o t s h o w n ) . DNA r e c o v e r e d f r o m agarose b y t h e g l a s s -b i n d i n g t e c h n i q u e was a s u i t a b l e s u b s t r a t e f o r r e s t r i c t i o n en -zymes ( s e e l a t e r ) . I t was a l s o i n f e c t i o u s ( P . M a r k h a m , D .W h e e l e r , a n d D . S t r a y e r , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) .M o n i t o r i n g DNA S e q u e n c e s i n A g a r o s e G e l S l i c e s . DNAc an b e s e l e c t i v e l y p r e c i p i t a t e d f r o m N a I w i t h a c e t o n e o r e t h a n o lc o n c e n t r a t i o n s ( 3 3 % ) t h a t d o n o t p r e c i p i t a t e a g a r o s e . A s l i t t l eas 0 . 4 v o l o f a c e t o n e c a u s e d DN A t o p r e c i p i t a t e , w h i l e a b o u t1 v o l was necessary t o p r e c i p i t a t e agarose ( F i g . 2 A ) . E s s e n t i a l l yno N a T was p r e c i p i t a t e d , b u t t r a c e s o f agarose c o p r e c i p i t a t e dw i t h DNA. T h e r a p i d i t y o f DNA i s o l a t i o n a n d t h e c o n c e n -t r a t i n g n a t u r e o f t h e p r e c i p i t a t i o n process ar e e s p e c i a l l y u s e f u li n h y b r i d i z a t i o n e x p e r i m e n t s .T h o u g h s m a l l amounts o f DNA i n N a I c an b e p r e c i p i t a t e df r o m a c e t o n e a n d r e c o v e r e d b y c e n t r i f u g a t i o n , i t q u i c k l y b e -came a p p a r e n t t h a t t h e most c o n v e n i e n t f o r m o f t h e m e t h o d

w o u l d r e q u i r e t h e a d d i t i o n o f c a r r i e r DNA t o t h e t e s t DNA.C a r r i e r DNA p r o v i d e d a v i s i b l e p r e c i p i t a t e t o f o l l o w , m i n i -m i z e d t h e b i n d i n g o f t h e t e s t DN A t o t h e w a l l s o f t h e c e n t r i f u g et u b e s , a n d a l l o w e d c o m p l e t e s e d i m e n t a t i o n i n a 1 5 - t o 3 0 - m i n ,l o w - s p e e d c e n t r i f u g a t i o n . F i g . 2 B s h o w s t h a t DNA o f w i d e l yv a r i a n t m o l e c u l a r w e i g h t s ar e q u a n t i t a t i v e l y p r e c i p i t a t e d w i t ht h i s p r o c e d u r e . T h e DNA p r e c i p i t a t e i n c l u d e s N a l , w h i c hl o w e r s t h e tm ( m i d p o i n t o f t h e r m a l t r a n s i t i o n ) o f DN A a n dc o u l d b e e x p e c t e d t o i n t e r f e r e w i t h m o l e c u l a r h y b r i d i z a t i o n .N a I was r e m o v e d b y s e v e r a l w a s h e s w i t h 7 5 % a c e t o n e .T h e m o l e c u l a r h y b r i d i z a t i o n s y s t e m was c o n s t r u c t e d s i m p l yb y a d d i n g a f e w m i c r o l i t e r s o f a l a b e l e d p r o b e i n a p p r o p r i a t eb u f f e r a n d o v e r l a y i n g t h e l i q u i d w i t h m i n e r a l o i l . T h e r a t e o fh y b r i d i z a t i o n o f R N A t o DNA r e c o v e r e d f r o m agarose wase q u i v a l e n t t o h y b r i d i z a t i o n u n d e r s t a n d a r d c o n d i t i o n s ( F i g . 2 C ) .T h e r a t e o f h y b r i d i z a t i o n was n o t a p p r e c i a b l y a f f e c t e d b y i n -c r e a s e d c h a i n l e n g t h s over 1 0 0 0 n u c l e o t i d e s . F i n a l l y , i n h i g h

DNA, Mr X 1 0 - 60 . 1 5 0 . 3 0 . 4 5 1 . 1 1 0 . 0B

2 0

608 aI o

IO

0)

.5 _C.

2

z

InCDU7 5 lko0

. 0 3. > 5 0 Do. 0Z 2 5 C im r O0s0 , 3 10 30 1 0 0 30 0C o t ( D N A )F I G . 2 . P r e c i p i t a t i o n o f DNA f r o m a c e t o n e . ( A ) E f f e c t o f N a Ic o n c e n t r a t i o n . C a l f t h y m u s DNA ( 0 . 2 5 m g / m l ) ( 0 ) o r a g a r o s e ( 1 . 2 - 6m g / m l ) ( o ) w a s d i s s o l v e d i n v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f N a L . Thes m a l l e s t a m o u n t o f a c e t o n e r e q u i r e d t o f o r m a s t a b l e , v i s i b l e p r e c i p -i t a t e w a s d e t e r m i n e d . S i m i l a r c u r v e s w e r e o b t a i n e d f o r e t h a n o l . ( B )E f f e c t o f DN A c h a i n l e n g t h . [ 3 H ] D N A f r o m s i m i a n v i r u s 4 0 d i g e s t e dw i t h Hae I I I o r [ 1 4 C J D N A f r o m E . c o l i w a s e l e c t r o p h o r e s e d t h r o u g h1% a g a r o s e . S l i c e s c o n t a i n i n g s p e c i f i c DNA f r a g m e n t s w e r e c u t f r o mt h e g e l a n d d i s s o l v e d i n N a l i n t h e p r e se n c e o f 5 0 , g o f c a r r i e r DNA;t h e n DNA w a s p r e c i p i t a t e d f r o m a c e t o n e . DNA p r e c i p i t a t e s w e r ed i s s o l v e d i n 1 0 % a c e t i c a c i d a n d r e d u c e d w i t h a d r o p o f 2 - m e r c a p t o -e t h a n o l . R a d i o a c t i v i t y w a s m e a s u r e d i n A q u a s o l . ( C ) K i n et i c s o f h y -b r i d i z a t i o n o f a c e t o n e - p r e c i p i t a t e d DNA. Human DNA ( 5 0 , 4 g ) w a sa d d e d t o t u b e s c o n t a i n i n g 2 5 0 u l o f 1% a g a r o s e ( o r w a t e r ) d i s s o l v e di n 5 5 0 M l o f s a t u r a t e d N a l . T h e DNA w a s p r e c i p i t a t e d f r o m a c e t o n ea n d t h e p r e c i p i t a t e w a s w a s h e d w i t h 7 5 % a c e t o n e . The DNA w a sd i s s o l v e d i n 1 0 , 1 o f f o r m a m i d e / p h o s p h a t e b u f f e r c o n t a i n i n g 1 2 5 1 -l a b e l e d r R N A , c o v e r e d w i t h m i n e r a l o i l , i n c u b a t e d a t 1 0 0 ' C f o r 1 0m i n , t h e n h y b r i d i z e d a t 4 4 0 C f o r v a r i o u s t i m e s . R N a s e - r e s i s t a n t h y -b r i d w a s m e a s u r e d . 0 , S o n i c a t e d DNA, n o a g a r o s e ; 0 , s o n i c a t e d DNA,0 . 6 % a g a r o s e ; 0 , s o n i c a t e d DNA, 1 . 5 % a g a r o s e ; * , u n s h e a r e d DNA,1 . 5 % a g a r o s e . C h a i n l e n g t h : s o n i c a t e d DNA, 4 0 0 - 6 0 0 n u c l e o t i d e s ;u n s h e a r e d DNA, 1 0 , 0 0 0 - 1 5 , 0 0 0 n u c l e o t i d e s . C o t , i n i t i a l c o n c e n t r a t i o no f DN A i n m o l o f n u c l e o t i d e s p e r l i t e r m u l t i p l i e d b y t i m e i n s e c .P e r c e n t h y b r i d i z a t i o n w a s c o r r e c t e d f o r t h a t f r a c t i o n o f t h e R N A t h a td i d n o t h y b r i d i z e a t h i g h C o t v a l u e s ( t 4 0 % ) .

1E' 4 00030 0 0

ut

I-

0 1 0 0 0

60 0

4 0 0 0

2 0 0

EC.

2400 U

16 0 00' O

80 0 X

EI

1 0 0 080 06 0 040 02 00

8 16 24 32 40 48S l i c e no .F I G . 3 . A n a l y s i s o f f r a g m e n t s o f DNA c o m p l e m e n t a r y t o r R N A

( r D N A ) p r o du c e d b y r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e s . DNA f r o m humanN C 3 7 c e l l s i n f e c t e d w i t h s i m ia n sarcoma v i r u s was d i g e s t e d w i t hH i n d I I I a n d 1 0 mgwas f r a c t i o n a t e d on a g i a n t agarose c y l i n d e r ( u n -p u b l i s h e d d a t a ) . The g e l was s e c t i o n e d i n t o 5 - m m s l i c e s , a n d rD N Asequences w e r e l o c a t e d b y o u r p r o c e d u r e on 0 . 2 % a l i q u o t s o f e a c h s l i c e .S l i c e s c o n t a i n i n g r D N A w e r e d i s s o l v e d i n N a l a n d t h e DNA was r e -c o v e r e d b y b i n d i n g t o g l a s s . [ 3 H ] D N A f r o m b a c t e r i o p h a g e X was a d d e da n d new f r a g m e n t s , p r o d u c e d b y r e s t r i c t i o n enzym es on t h e i n i t i a lr D N A H i n d I I I f r a g m e n t , w e r e r e s o l v e d b y a n a l y t i c a l e l e c t r o p h o r e s i st h r o u g h s l a b s o f 1% agarose. G e l s were s l i c e d a n d r D N A seque nceswere l o c a t e d . ( A ) N o s e c o n d a r y d i g e s t ; ( B ) r e d i g e s t e d w i t h H i n d I I I ;( C ) r e d i g e s t e d w i t h E c o R I ; ( D ) r e d i g e s t e d w i t h BamHI. 0, H y b r i d -i z a t i o n t o 1 2 5 I - l a b e l e d rRNA; 0, [3H]DNA m a r k e r .

2 4N a l , M

0 . 0 5 0 . 1 0 . 2 0 . 4 1 dAci~ 0A0

. t . . 1 . 6o w, 0.8kX E

0.4T o

I I) I I I t

. T ~ ~ ~ -I -

1 1

B i o c h e m i s t r y : V o g e l s t e i n a n d G i l l e s p i e

00

3A--, I ' . -y _

I- - O - .

8/8/2019 VOGELSTEIN Purification of DNA From Agarose

4/5

6 1 8 B i o c h e m i s t r y : V o g e l s t e i n a n d G i l l e s p i eT a b l e 1 . S a m p l e c a l c u l a t i o n s f r o m r e s u l t s o f F i g . 3 D : BamHI map o f h u m a n 2 8 S rD N A

DN A f r a g m e n t R N A cpm R e l a t i v e cpm S e q u e n c e l e n g t h , b pl e n g t h , b p h y b r i d i z e d c p m l b p h y b r i d i z e d C o d o g e n i c DN A N o n c o d o g e n i c DN A6 9 3 0 2 6 7 3 0 . 3 8 1 . 4 5 2 4 6 5 4 4 6 53 5 4 0 1 0 3 7 0 . 2 9 0 . 5 8 9 8 6 2 5 5 41 7 0 0 * 1 8 3 5 1 . 0 4 1 . 0 0 1 7 0 0 04 0 4 0 0 0 0 0 4 0 4 01 6 , 2 1 0 - 5 1 5 1 1 1 , 0 5 9

R a d i o a c t i v i t y u n d e r e a c h p e a k w a s s u m m e d , t h e n d i v i d e d b y t h e n u m b e r o f b a s e p a i r s ( b p ) o f DN A i n t h e r e l e v a n t f r a g m e n t .T h e p e a k w i t h t h e h i g h e s t c p m / b p ( 1 7 0 0 b p ) w a s s e t t o a r e l a t i v e c p m h y b r i d i z e d v a l u e o f 1 . 0 0 a n d o t h e r p e a ks w e r e n o r m a l i z e dt o i t . T h e DN A f r a g m e n t l e n g t h t i m e s t h i s v a l u e y i e l d e d t h e c o d o g e n i c s e q u e n c e l e n g t h . T h e n o n c o d o g e n i c s e q u e n c e l e n g t hw a s o b t a i n e d b y s u b t r a c t i o n . T h e c o d o g e n i c s e q u e n c e l e n g t h o f t h e t h r e e BamHI f r a g m e n t s i s 5 1 5 1 b p ; t h u s t h e s pa c e r i s1 1 , 0 5 9 b p ( 1 6 , 2 1 0 m i n u s 5 1 5 1 ) . T h e n o n c o d o g e n i c s e q u e n c e l e n g t h s o f t h e t h r e e BamHI f r a g m e n t s i s 7 0 1 9 b p ; t h u s t h e r em u s t b e 4 0 4 0 b p o f p u r e s p a c e r f r a g me nt s n ot d e t e c t e d .* D e t e r m i n e d s e p a r a t e l y o n g e l s o f 3% a g a r o s e .

c o n c e n t r a t i o n s o f f o r m a m i d e , DN A r e a n n e a l i n g d o e s n o tc o m p e t e w i t h RNA-DNA h y b r i d i z a t i o n ( 1 6 , 1 7 ) . W i t h a p p r o -p r i a t e i o n i c m o d i f i c a t i o n s t h e t e c h n i q u e w a s r e a d i l y a d a p t e dt o DNA-DNA h y b r i d i z a t i o n s , a s s a y e d w i t h n u c l e a s e s o r h y -d r o x y a p a t i t e ( u n p u b l i s h e d d a t a ) .C o u p l e d P r e p a r a t i v e a n d A n a l y t i c a l T e c h n i q u e s . T h e t w om e t h o d s d e s c r i b e d a b o v e c a n b e c o m b i n e d t o a d v a n t a g e f o rr e s t r i c t i o n e n z y m e m a p p i n g o f DN A f r a g m e n t s a n d f o r g e n ep u r i f i c a t i o n . F i g . 3 p r e s e n t s a s e c o n d a r y a n a l y s i s o f a DN Af r a g m e n t p r o d u c e d b y t r e a t i n g h u m a n DN A w i t h H i n d I I I a n dc o n t a i n i n g s e q u e n c e s c o m p l e m e n t a r y t o 2 8 S r R N A . T h i s 1 1 .1 0 6 - d a l t o n f r a g m e n t w a s l o c a t e d i n a p r e p a r a t i v e a g a r o s e g e l( D . S t r a y e r , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) , b y a c e t o n e p r e c i p i t a t i o n ,a n d f r e e d o f a g a r o s e b y t h e g l a s s - b i n d i n g t e c h n i q u e . I t w a sm i x e d w i t h [ 3 H ] D N A f r o m b a c t e r i o p h a g e X . T h e n a l i q u o t sw e r e t r e a t e d w i t h n o e n z y m e , w i t h H i n d I I I , w i t h E c o R I , o rw i t h B a m H I . E a c h s a m p l e w a s r u n o u t o n a s l a b g e l , a n d s l i c e sw e r e a n a l y z e d f o r s e q u e n c e s c o m p l e m e n t a r y t o 2 8 S r R N A . T h e1 6 , 2 1 0 - b a s e - p a i r o r i g i n a l f r a g m e n t ( F i g . 3 A ) i s a l i m i t d i g e s t i o np r o d u c t o f H i n d I I I ( F i g . S B ) . S u b s e q u e n t d i g e s t i o n b y E c o R Il e a v e s a f r a g m e n t o f a b o u t 7 0 0 0 b a s e p a i r s , c l o s e t o t h e 7 3 0 0b a s e p a i r s e x p e c t e d f r o m A r n h e i m a n d S o u t h e r n ' s r e s u l t s ( 1 8 ) .BamHI l e a v e s t h r e e f r a g m e n t s c o n t a i n i n g s e q u e n c e s c o m p l e -m e n t a r y t o 2 8 S r R N A ( F i g . 3 D ) . T h e r a t i o o f h y b r i d i z a t i o ns i g n a l t o DN A f r a g m e n t m o l e c u l a r w e i g h t ( c p m / b a s e p a i r )a l l o w s t h e c l a s s i f i c a t i o n o f t h e s m a l l e s t f r a g m e n t a s i n t e r n a l a n dt h e l a r g e r t w o a s t e r m i n a l ( T a b l e 1 ) . T h e r e m u s t a l s o e x i s t o n eo r m o r e f r a g m e n t s c o n t a i n i n g o n l y s p a c e r s e q u e n c e s ( T a b l e1 ) .

DISCUSSIONM o s t t e c h n i q u e s a v a i l a b l e f o r s e p a r a t i n g DN A f r o m a g a r o s eh a v e l i m i t a t i o n s ( 1 3 ) . E l u t i o n f r o m t h e g e l e l e c t r o p h o r e t i c a l l y ,b y p a s s i v e d i f f u s i o n , o r b y " f r e e z e - s q u e e z e " ( 3 - 8 , 1 2 ) f a i l s t oq u a n t i t a t i v e l y r e c o v e r h i g h m o l e c u l a r w e i g h t DN A a n d y i e l d sm a t e r i a l c o n t a m i n a t e d w i t h a g a r o s e ( 6 ) . S o m e m e t h o d s h a v eb e e n d e v i s e d t h a t u s e a g a r o s e d i s s o l u t i o n i n c h a i o t r o p i c s a l t ss u c h a s s o d i u m p e r c h l o r a t e ( 9 ) o r p o t a s s i u m i o d i d e ( 1 0 ) . M o s tc o m m o n l y , DN A i s t h e n b o u n d t o h y d r o x y a p a t i t e ( 1 1 ) . Weh a v e b e e n u n a b l e t o p r e p a r e u n d e g r a d e d h i g h m o l e c u l a rw e i g h t DN A w i t h t h i s m e t h o d a n d h a v e e x p e r i e n c e d d i f f i c u l t i e sd i g e s t i n g r e c o v e r e d DN A w i t h s o m e r e s t r i c t i o n e n z y m e s .F u r t h e r m o r e , r e c o v e r y o f t h e DN A i n p h o s p h a t e b u f f e r p r e -s e n t s a n n o y i n g p r o b l e m s . O c c a s i o n a l l y , c e n t r i f u g a t i o n t oe q u i l i b r i u m i s u s e d a s a s e c o n d s t e p ( 1 0 ) . T h i s m e t h o d i s q u i t es a t i s f a c t o r y f o r r e c o v e r i n g u n d e g r a d e d h i g h m o l e c u l a r w e i g h tD N A , b u t i s l a b o r i o u s a n d i s u n s u i t a b l e f o r r e c o v e r y o f l o wm o l e c u l a r w e i g h t DNA.B i n d i n g DN A t o g l a s s , a f t e r d i s s o l v i n g t h e a g a r o s e i n N a I , i sa s a t i s f a c t o r y m e a n s o f r e m o v i n g DN A f r o m a g a r o s e . I t i s r a p i d ,

c o n v e n i e n t , a n d n e a r l y q u a n t i t a t i v e , a n d y i e l d s DN A o f h i g hp u r i t y . T h e b i n d i n g o f DN A t o g l a s s i s c o m p l e t e ( o v e r 9 9 % ) , a n de l u t i o n o f t h e DN A i s a b o u t 9 0 % e f f i c i e n t w i t h 1 0 A l o f b u f f e rp e r m g o f g l a s s - D N A c o m p l e x . W i t h s m a l l v o l u m e s ( 1 - 1 0 m l ) ,b i n d i n g i s c o m p l e t e i n m i n u t e s ; w i t h l a r g e r v o l u m e s ( e . g . , 1 0 0m l ) , a n o v e r n i g h t b i n d i n g i s u s u a l l y r e q u i r e d . T h e c a p a c i t y o fg l a s s p o w d e r e x c e e d s 1 mg o f DN A b o u n d p e r g o f g l a s s . T h u s ,DN A c a n b e r e c o v e r e d a t c o n c e n t r a t i o n s o f 1 0 0 , g / m l , i n d e -p e n d e n t o f t h e c o n c e n t r a t i o n o f DN A i n t h e g e l . DN A i s r e -c o v e r e d i n a n y c o n v e n i e n t b u f f e r .T h e g l a s s - b i n d i n g m e t h o d i s p a r t i c u l a r l y s u i t a b l e f o r r e c o v -e r i n g DN A f r o m a g a r o s e f o r f u r t h e r a n a l y s i s o r p u r i f i c a t i o n .I n s p i t e o f i t s c o n v e n i e n c e f o r p r e p a r a t i v e p u r p o s e s , h o w e v e r ,i t i s n o t s u f f i c i e n t l y c o n v e n i e n t f o r m o n i t o r i n g DN A s e q u e n c e si n s l i c e d a g a r o s e g e l s i n a n a l y t i c a l e x p e r i m e n t s . F o r a n a l y t i c a lp u r p o s e s t w o t e c h n i q u e s a r e n o w a v a i l a b l e , t h e S o u t h e r nt r a n s f e r s y s t e m ( 1 9 ) a n d p r e c i p i t a t i o n f r o m a c e t o n e ( o u rt e c h n i q u e ) . S o u t h e r n t r a n s f e r s a r e q u a l i t a t i v e a n d c o m p a r a t i v e ,w h e r e a s o u r t e c h n i q u e i s q u a n t i t a t i v e . Q u a n t i t a t i o n i s a t t a i n e db e c a u s e h y b r i d i z a t i o n i s c a r r i e d o u t i n l i q u i d w i t h a n e x c e s s o fu n l a b e l e d DN A f r a g m e n t u n d e r c o n d i t i o n s w h e r e DN A f r a g -m e n t r e a n n e a l i n g i s e l i m i n a t e d , b y u s i n g R N A p r o b e s ( 1 6 , 1 7 ) ,o r w h e r e i t i s n o t a s e r i o u s t h e o r e t i c a l p r o b l e m ( e . g . , b y u s i n gDN A p r o b e s ) .Q u a n t i t a t i o n p e r m i t s t h e e l u c i d a t i o n o f s e v e r a l p a r a m e t e r s .A t h i g h C o t , t h e p r o p o r t i o n o f t h e l a b e l e d p r o b e c o m p l e m e n t a r yt o e a c h f r a g m e n t i s o b t a i n e d , w h i l e a t l o w e r C o t t h e r e l a t i v ea b u n d a n c e o f e a c h f r a g m e n t i s m e a s u r e d . T h e 1 6 , 2 1 0 - b a s e - p a i rf r a g m e n t o f t h e h u m a n rDNA c i s t r o n l e f t b y H i n d I I I c o n t a i n sa l l o f t h e s e q u e n c e s c o d o g e n i c f o r 2 8 S r R N A a n d BamHI c u t st h e c o d o g e n i c r e g i o n t w i c e , l e a v i n g t h r e e f r a g m e n t s c o m p l e -m e n t a r y t o t h e R N A ( F i g . 3 D ) . T h e r a t i o o f r a d i o a c t i v i t y h y -b r i d i z e d t o DN A f r a g m e n t l e n g t h ( c p m / b a s e p a i r ) s h o w s t h a tt h e s m a l l e s t f r a g m e n t i s i n t e r n a l . T h e t w o l a r g e r f r a g m e n t sh y b r i d i z e l e s s R N A p e r u n i t DN A l e n g t h , s o t h e y c o n t a i nn o n c o d o g e n i c r e g i o n s i n a d d i t i o n t o p o r t i o n s t h a t a r e c o m p l e -m e n t a r y t o t h e R N A . T h e s p a c e r o n e a c h s i d e o f t h e 2 8 S c i s t r o nw a s p r e c i s e l y e v a l u a t e d w i t h r e s p e c t t o t h e p o s i t i o n s o f BamHIs i t e s b y s i m p l y s u b t r a c t i n g t h e c o d o g e n i c 2 8 S b a s e p a i r s f r o m

t h e t o t a l f r a g m e n t l e n g t h ( T a b l e 1 ) . T h u s , t h e 3 5 4 0 - b a s e - p a i rf r a g m e n t e x t e n d s a b o u t 2 5 0 0 b a s e p a i r s i n t o t h e s h o r t s p a c e rb e t w e e n t h e 2 8 S a n d 1 8 S c i s t r o n s a n d t h e 6 9 3 0 - b a s e - p a i rf r a g m e n t e x t e n d s 4 4 6 5 b a s e p a i r s i n t o t h e l a r g e s p a c e r o n t h eo t h e r s i d e o f t h e 2 8 S g e n e . O f t h e 1 6 , 2 1 0 - b a s e - p a i r H i n d I I If r a g m e n t , a b o u t 1 2 , 0 0 0 b a s e p a i r s a r e a c c o u n t e d f o r b y BamHIf r a g m e n t s c a r r y i n g 2 8 S s e q u e n c e s . T h u s , a b o u t 4 0 0 0 b a s e p a i r so f p u r e s p a c e r f r a g m e n t ( s ) a r e a l s o p r o d u c e d . T h e s e a r e n o td e t e c t e d b y t h e 2 8 S rRN A p r o b e .H y b r i d i z a t i o n w i t h e x c e s s DN A o b v i o u s l y c i r c u m v e n t s t h ed e t e c t i o n o f f r a g m e n t s c o m p l e m e n t a r y t o i m p u r i t i e s i n t h e

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 6 ( 1 9 7 9 )

8/8/2019 VOGELSTEIN Purification of DNA From Agarose

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P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 6 ( 1 9 7 9 ) 6 1 9p r o b e . T h e t e c h n i q u e i s c o m p a t i b l e w i t h a n a l y s e s o f t h e p r o p -e r t i e s o f t h e h y b r i d f o r m e d b e t w e e n e a c h DN A f r a g m e n t a n dt h e r a d i o a c t i v e p r o b e , e s p e c i a l l y i t s t h e r m a l s t a b i l i t y . I n p r i n -c i p l e , p e r f e c t l y c o m p l e m e n t a r y s e q u e n c e s c a n b e d i s t i n g u i s h e df r o m r e l a t e d s e q u e n c e s . F i n a l l y , t h e c a p a c i t y f o r i n c l u d i n gi n t e r n a l m a r k e r s p r o v i d e s a m o n i t o r f o r t h e e x t e n t o f n u c l e a s ed i g e s t i o n , y i e l d s p r e c i s e m o l e c u l a r w e i g h t e s t i m a t e s , a n d a l l o w sa r o u g h e s t i m a t e o f s e q u e n c e p u r i t y i n a h y b r i d i z a t i o n p e a k( f r o m b a n d - w i d t h p a r a m e t e r s ) .

T h e l e n g t h o f t i m e r e q u i r e d f o r a p a r t i c u l a r h y b r i d i z a t i o nc a n b e c a l c u l a t e d w i t h i n a c c e p t a b l y n a r r o w l i m i t s , g i v e n t h ea m o u n t o f DN A r u n o u t o n a n a g a r o s e g e l , t h e f r a c t i o n o f e a c hs l i c e u s e d , t h e a p p r o x i m a t e w i d t h o f t h e b a n d s , a n d t h e c o p yn u m b e r o f t h e s e q u e n c e o f i n t e r e s t . C o n s e q u e n t l y , s i n g l e - c o p ys e q u e n c e s h a v e b e e n a m e n a b l e t o a n a l y s i s w i t h b o t h RN A a n dDN A p r o b e s ( u n p u b l i s h e d d a t a ) .S o u t h e r n t r a n s f e r s a n d o u r t e c h n i q u e h a v e c o m p l e m e n t a r ya t t r i b u t e s . S o u t h e r n t r a n s f e r s a r e t h e u l t i m a t e i n c o m p a r a t i v ec o n v e n i e n c e a n d p r o v i d e a s a t i s f y i n g v i s u a l d i s p l a y o f t h e r e -s u l t s . T h e y a r e p a r t i c u l a r l y s u i t a b l e f o r s u r v e y s t o i n d i c a t e t h es i t u a t i o n s t h a t m i g h t b e p r o f i t a b l y s t u d i e d i n q u a n t i t a t i v e d e t a i lb y o u r t e c h n i q u e . C l e a r l y , t h e c o m b i n a t i o n o f t h e s e t w o t e c h -n i q u e s w i t h p r e p a r a t i v e r e m o v a l o f DN A f r o m a g a r o s e a n dp r e p a r a t i v e g e l e l e c t r o p h o r e s i s p r o v i d e s a r e a s o n a b l e s t a r t i n gp o i n t f o r d i s m a n t l i n g c o m p l e x g e n o m e s .We t h a n k D . S t r a y e r , W . P r e n s k y , S . G i l l e s p i e , B . N e l k i n , L . K r u e g e r ,a n d D . W h e e l e r f o r h e l p f u l d i s c u s s i o n s a n d f o r r e v i e w i n g t h e m a n u -s c r i p t . We t h a n k J . M a z e t t a a n d S . G i l l e s p i e f o r e x p e r t t e c h n i c a l a s s i s -t a n c e .

1 . A a i j , C . & B o r s t , P . ( 1 9 7 2 ) B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 2 6 9 , 1 9 2 -2 0 0 .2 . S h a r p , P . A . , S u g d e n , B . & S a m b r o o k , J . ( 1 9 7 3 ) B i o c h e m i s t r y 1 2 ,3 0 5 5 - 3 0 6 3 .3 . A l l e t , B . , J e p p e s e n , P . G . N . , K a t a g i r i , K . J . & D e l i u s , H . ( 1 9 7 3 )N a t u r e ( L o n d o n ) 2 4 1 , 1 2 0 - 1 2 2 .4 . P o p e s c u , M . , L a z a r u s , L . H . & G o l d b l u m , N . ( 1 9 7 1 ) A n a l . B i o -c h e m . 4 0 , 2 4 7 - 2 5 3 .5 . J a c o b s o n , A . & L o d i s h , H . ( 1 9 7 3 ) A n a l . B i o c h e m . 5 4 , 5 1 3 - 5 1 7 .6 . L e e , A . S . & S i n s h e i m e r , R . L . ( 1 9 7 4 ) A n a l . B i o c h e m . 6 0 , 6 4 0 -6 4 4 .7 . C a t t o l i c o , R . A . & J o n e s , R . F . ( 1 9 7 5 ) A n a l . B i o c h e m . 6 6 , 3 5 -4 6 .8 . S u b r a m a n i a n , K . N . , P a n , J . , Z a i w , S . & W e i s s m a n , S . M . ( 1 9 7 4 )N u c l e i c A c i ds R e s . 1 , 7 2 7 - 7 5 2 .9 . F u k e , M . & T h o m a s , C . A . ( 1 9 7 0 ) J . M o l . B i o l . 5 2 , 3 9 5 - 3 9 7 .1 0 . B l i n , N . , G a b a i n , A . V . & B u j a r d , H . ( 1 9 7 5 ) FEBS L e t t . 5 3 ,8 4 - 8 6 .1 1 . S o u t h e r n , E . M . ( 1 9 7 5 ) J . M o l . B i o l . 9 4 , 5 1 - 7 0 .1 2 . T h u r i n g , A . W . J . , S a n d e r s , J . P . M . & B o r s t , P . ( 1 9 7 5 ) A n a l .B i o c h e m . 6 6 , 2 1 3 - 2 2 0 .1 3 . R o b e r t s , R . J . ( 1 9 7 6 ) C R C R e v . B i o c h e m . 4 , 1 2 3 - 1 6 4 .1 4 . G i l l e s p i e , D . , G i l l e s p i e , S . & W o n g - S t a a l , F . ( 1 9 7 5 ) M e t h o d sC a n c e r R e s . 1 1 , 2 0 5 - 2 4 3 .1 5 . P r e n s k y , W . , S t e f f e n s o n , D . & H u g h e s , W . ( 1 9 7 3 ) P r o c . N a t l .A c a d . S c i . USA 7 0 , 1 8 6 0 - 1 8 6 4 .1 6 . V o g e l s t e i n , B . & G i l l e s p i e , D . ( 1 9 7 7 ) B i o c h e m . B i o p h y s . R e s .C o m m u n . 7 5 , 1 1 2 7 - 1 1 3 2 .1 7 . C a s e y , J . & D a v i d s o n , N . ( 1 9 7 7 ) N u c l e i c A c i d s R e s . 4 , 1 5 3 9 -1 5 5 2 .1 8 . A r n h e i m , N . & S o u t h e r n , E . M . ( 1 9 7 7 ) C e l l 1 1 , 3 6 3 - 3 7 0 .1 9 . S o u t h e r n , E . M . ( 1 9 7 5 ) J . M o l . B i o l . 9 8 , 5 0 3 - 5 1 8 .

B i o c h e m i s t r y : V o g e l s t e i n a n d G i l l e s p i e