Viscoelastic properties of beta fibrin

8/13/2019 Viscoelastic properties of beta fibrin

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CLOTS OF A-FIBRINV i s c o e l a s t i c P r o p e r t i e s , T e m p e r a t u r e D e p e n d e n c e o f E l a s t i c i t y , a n d I n t e r a c t i o nw i t h F i b r i n o g e n - b i n d i n g T e t r a p e p t i d e s

A K I R A S H I M I Z U AND J O H N D . F E R R YD e p a r t m e n t of C h e m i s t r y , U n i v e r s i t y of W i s c o n s i n , M a d i s o n , W i s c o n s i n 5 3 7 0 6ABSTRACT C l o t s o f h u m a n , 8 - f i b r i n , i n w h i c h o n l y ( o r p r e d o m i n a n t l y ) t h e B f i b r i n o p e p t i d e i s r e l e a s e d , were f o r m e d a t1 4 0 C b y c o p p e r h e a d venom p r o c o a g u l a n t enzyme CV E or v e n z y m e ) , a t pH 8 . 5 , i o n i c s t r e n g t h 0 . 4 5 . T h e s h e a r m o d u l u so f e l a s t i c i t y i n c r e a s e d s l o w l y a n d a f t e r s e v e r a l d a y s a t t a i n e d a c o n s t a n t v a l u e , w h i c h wa s l o w er t h an t h o s e o f a - f i b r i n ora , 3 - f i b r i n u n d e r t h e same c o n d i t i o n s . B e f o r e s t u d y i n g t h e t e m p e r a t u r e d e p e n d e n c e o f e l a s t i c i t y , t h e CV E was t h e ni n h i b i t e d b y i n t r o d u c i n g p h e n y l m e t h y l s u l f o n y l c h l o r i d e ( P M S F ) b y d i f f u s i o n . W i t h i n c r e a s i n g t e m p e r a t u r e , t h em o d u l u s d e c r e a s e d p r o g r e s s i v e l y f r o m 5 0 C t o n e a r l y zero a t 3 5 0 a n d was e s s e n t i a l l y r e v e r s i b l e w i t h t e m p e r a t u r e c h a n g e ;recovery o f e l a s t i c i t y a f t e r c h a n g e f r o m 3 4 . 5 0 t o 1 4 0 r e q u i r e d - 2 d b u t wa s c o n s i d e r a b l y f a s t e r t h a n t h e i n i t i a l b u i l d u p o fe l a s t i c i t y b y CV E a t 1 4 0 . C r e ep a nd creep recovery m e a s u r e m e n t s on u n l i g a t e d c l o t s s h o w e d creep r a t e s a n di r r e c o v e r a b l e d e f o r m a t i o n t h a t were s i m i l a r i n m a g n i t u d e t o t h o s e o f a - f i b r i n c l o t s f o r m e d w i t h b a tr o x o b i n a n d muchl a r g e r t h a n t h o s e o f a ( 3 - f i b r i n c l o t s f o r m e d w i t h t h r o m b i n , u n d e r t h e same c o n d i t i o n s . D u r i n g creep a n d creep r e c o v e r y ,t h e d i f f e r e n t i a l m o d u l u s or c o m p l i a n c e r e m a i n e d c o n s t a n t , s h o w i n g t h a t t h e r e wa s no p e r m a n e n t s t r u c t u r a l d a m a g e ,a n d i f n e t w o r k s t r a n d s are s e v e r e d i n s l o w f l o w , t h e y must r e j o i n i n new c o n f i g u r a t i o n s . I n t r o d u c t i o n ( b y d i f f u s i o n ) o ft h e t e t r a p e p t i d e s G l y - H i s - A r g - P r o GHRP) a n d G l y - P r o - A r g - P r o ( G P R P ) , w h i c h r e s e m b l e t h e B a n d A b i n d i n g s i t e son t h e E d o m a i n o f f i b r i n r e s p e c t i v e l y , r e d u c e d t h e s h e a r m o d u l u s a n d i n c r e a s e d t h e creep r a t e o f ( 3 - f i b r i n c l o t s t o ane x t e n t s i m i l a r t o t h e e f f e c t o f G PRP on a f B - f i b r i n , m u c h m ore t h a n t h a t o f GHRP on a , - f i b r i n , b u t much l e s s t h a n t h a to f G PRP on a - f i b r i n . A l i g a t e d , - f i b r i n c l o t f o r m e d w i th F a c to r X I I I a ( i n w h i c h t h e a c t i v a t i n g t h r o m b i n h a d b e e nn e u t r a l i z e d b y h i r u d i n ) s h o w e d e s s e n t i a l l y p e r f e c t e l a s t i c b e h a v i o r , w i t h no creep a n d w i t h c o m p l e t e recovery a f t e rr e m o v a l o f s t r e s s , a n d wa s i n e r t t o GHRP.

INTRODUCTIONT h r o m b i n c o n v e r t s f i b r i n o g e n t o f i b r i n monomer b y c l e a v -i n g t w o m o l e s e a c h o f t h e f i b r i n o p e p t i d e s A a n d B ( 1 ) ,u n c o v e r i n g n o n co v a l en t b i n d i n g s i t e s w h i c h c an i n t e r a c tr e s p e c t i v e l y w i t h s i t e s d e s i g n a t e d ( 2 ) a a n d b on o t h e rf i b r i n monomer m o l e c u l e s . T h e Aa j u n c t i o n s are s u f f i c i e n tf o r s e l f - a s s e m b l y o f f i b r i n monomers i n t h e s t a g g e r e do v e r l a p p i n g p a t t e r n t o f o r m t h e p r o t o f i b r i l , w h i c h i s t h ef i r s t s t a g e i n t h e c o n s t r u c t i o n o f a f i b r i n c l o t . T h e Bf i b r i n o p e p t i d e s are r e l e a s e d more s l o w l y t h a n t h e A . Th eBb j u n c t i o n s w h i c h are t h e n e s t a b l i s h e d h a v e b e e n t h o u g h tt o b e i n v o l v e d i n t h e l a t e r a l a g g r e g a t i o n o f p r o t o f i b r i l s( 3 , 4 ) , a l t h o u g h s u c h a g g r e g a t i o n can t a k e p l a c e w i t h o u tt h e m . H o w e v e r , i t i s e v i d e n t f r o m r e c e n t w o r k t h a t t h e Bbj u n c t i o n s a l s o s t a b i l i z e t h e b i n d i n g o f f i b r i n monomerst o g e t h e r w i t h i n t h e p r o t o f i b r i l s t h e m s e l v e s ( 5 - 6 a ) .T h e r o l e s o f t h e Aa a n d Bb j u n c t i o n s c an b e i n v e s t i g a t e db y s t u d y i n g t h e a c t i o n o n f i b r i n o g e n o f c e r t a i n s n a k evenom enzymes t h a t remove t h e A or B f i b r i n o p e p t i d e ss e l e c t i v e l y ( 7 ) . A n c r o d ( f r o m A g k i s t r o d o n r h o d o s t o m a )a n d b a t r o x o b i n ( f r o m B o t h r o p s a t r o x or B o t h r o p s m o o j e -B I O P H Y S . J . a B i o p h y s i c a l S o c i e t y 0 0 0 6 - 3 4 9 5 / 8 8 / 0 3 / 3 1 1 / 0 8V o l u m e 5 3 M a r c h 8 8 3 1 1 - 3 1 8

n i ) c l e a v e A o n l y ; CV E o r v e n z y m e ( f r o m A g k i s t r o d o nc o n t o r t r i x c o n t o r t r i x ) c l e a v e s B o n l y , o r a t l e a s t h i g h l yp r e f e r e n t i a l l y , u n d e r c e r t a i n c o n d i t i o n s ( 8 ) . F i b r i n m o n -o m e r l a c k i n g b o t h f i b r i n o p e p t i d e s i s o f t e n d e s i g n a t e d a s( a ' Y ) 2 o r a - f i b r i n ; l a c k i n g A , a s ( a B f 3 Y ) 2 o r a - f i b r i n ;l a c k i n g B , a s ( A c a 3 ' y ) 2 o r f - f i b r i n .a - F i b r i n m o n o m e r p o l y m e r i z e s t o f o r m o l i g o m e r s a n dc l o t s t h a t r e s e m b l e t h o s e f r o m a - f i b r i n ( 6 ) e x c e p t t h a t t h ec l o t s h a v e v e r y d i f f e r e n t m e c h a n i c a l p r o p e r t i e s ( 6 a , 9 ) .A l s o , , 8 - f i b r i n p o l y m e r i z e s t o f o r m o l i g o m e r s a n d c l o t s b u to n l y a t l o w e r t e m p e r a t u r e s ; b o t h d i s s o c i a t e i n t o s m a l l e ro l i g o m e r s a t t e m p e r a t u r e s a p p r o a c h i n g 3 7 0 C a n d i n t om o n o m e r s w h e n d i l u t e d t o 0 . 2 mg/mL a t 3 7 0 C ( 1 0 , 1 1 ) .E l e c t r o n m i c r o s c o p y o f t h e t h r e e t y p e s o f c l o t s s h o w ss t r i k i n g s i m i l a r i t i e s ( 6 , 1 2 ) a n d i t i s e v i d e n t t h a t a l l t h r e et y p e s o f p r o t o f i b r i l s a r e b a s e d o n t h e s t a g g e r e d o v e r l a p p i n gp a t t e r n i n w h i c h A a n d B s i t e s o n t h e c e n t r a l f i b r i n n o d u l ei n t e r a c t r e s p e c t i v e l y w i t h a a n d b s i t e s o n t h e t e r m i n a ln o d u l e s o f t w o o t h e r f i b r i n m o n o m e r s .T h e a s s o c i a t i o n a n d g e l a t i o n o f , B - f i b r i n , t h e i r r e v e r s i b i l -i t y w i t h t e m p e r a t u r e c h a n g e , a n d l i g a t i o n ( c r o s s - l i n k i n g )b y F a c t o r X I I Ia h a v e b e e n s t u d i e d i n s e v e r a l i n v e s t i g a t i o n s

$ 2 . 0 0 3 1 1


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b y S h a i n o f f , F u r l a n , M o s e s s o n , a n d o t h e r s ( 5 , 8 , 1 0 - 1 4 ) .H o w e v e r , t h e r e h a v e b e e n n o q u a n t i t a t i v e m e a s u r e m e n t s o fm e c h a n i c a l p r o p e r t i e s o f f - f i b r i n c l o t s . T h e p r e s e n t p a p e rr e p o r t s m e a s u r e m e n t s o f t h e s h e a r m o d u l u s o f e l a s t i c i t ya n d i t s d e p e n d e n c e o n t e m p e r a t u r e , v i s c o e l a s t i c c r e e p , a n dc r e e p r e c o v e r y , a n d t h e e f f e c t s o n m e c h a n i c a l p r o p e r t i e s o ft h e i n t r o d u c t i o n , b y d i f f u s i o n i n t o a c l o t , o f t h e t e t r a p e p t i d eG l y - H i s - A r g - P r o GHRP) w h i c h r e s e m b l e s t h e N - t e r m i -n a l s e q u e n c e o f t h e B s i t e a n d b i n d s t o t h e b s i t e ( 1 5 , 1 6 ) ,a s w e l l a s G l y - P r o - A r g - P r o ( G P R P ) , w h i c h r e s e m b l e s t h e a s i t e a n d b i n d s t o i t b u t a l s o b i n d s t o t h e b s i t e ( 1 6 ) .P r e v i o u s s t u d i e s ( 6 a , 9 , 1 7 - 2 0 ) o f t h e v i s c o e l a s t i c p r o p -e r t i e s o f a f - f i b r i n a n d a - f i b r i n c l o t s m a y b e b r i e f l y s u m -m a r i z e d a s f o l l o w s . T h e s e s t a t e m e n t s r e f e r t o f i n e c l o t sf o r m e d a t pH 8 . 5 , i o n i c s t r e n g t h 0 . 4 5 , w h e r e t h e r e i sm i n i m a l l a t e r a l a g g r e g a t i o n o f p r o t o f i b r i l s ( f i n e c l o tc o n d i t i o n s ) , a n d t o s m a l l s h e a r d e f o r m a t i o n s . U n l i g a t e da f 3 - f i b r i n c l o t s s u b j e c t e d t o c o n s t a n t s t r e s s s h o w a n i n i t i a le l a s t i c d e f o r m a t i o n ( i n i t i a l i n o u r e x p e r i m e n t s m e a n s 2 5s a f t e r i m p o s i t i o n o f s t r e s s ) f o l l o w e d b y c r e e p ( g r a d u a li n c r e a s i n g d e f o r m a t i o n ) . A f t e r r e m o v a l o f s t r e s s , t h e c r e e pr e c o v e r y i s i n c o m p l e t e a n d t h e i r r e c o v e r a b l e d e f o r m a t i o n i sp r o p o r t i o n a l t o t h e s t r e s s d u r a t i o n . I n t r o d u c t i o n o f t h et e t r a p e p t i d e G P R P , w h i c h b i n d s t o t h e a s i t e a n di n h i b i t s ( 1 5 ) p o l y m e r i z a t i o n o f a c q - f i b r i n m o n o m e r s ,d i m i n i s h e s t h e s h e a r m o d u l u s ( r a t i o o f s t r e s s t o s t r a i n a t 2 5s ) , a n d i n c r e a s e s e n o r m o u s l y t h e c r e e p r a t e a n d i r r e c o v e r a -b l e d e f o r m a t i o n . T h e c r e e p d e f o r m a t i o n b e c o m e s a l i n e a rf u n c t i o n o f t i m e s o t h e c l o t c o n t a i n i n g G PRP a p p e a r s t of l o w l i k e a h i g h l y v i s c o u s v i s c o e l a s t i c l i q u i d . B y c o n t r a s t ,c l o t s l i g a t e d b y F a c t o r X I I I a s h o w n o c r e e p , o n l y a n i n i t i a le l a s t i c d e f o r m a t i o n w h i c h i s c o m p l e t e l y r e c o v e r e d a f t e rr e m o v a l o f s t r e s s , a n d a r e u n a f f e c t e d b y t h e i n t r o d u c t i o n o fG P R P .U n l i g a t e d a - f i b r i n c l o t s h a v e s o m e w h a t l o w e r s h e a rm o d u l i a n d l a r g e r c r e e p r a t e s a n d i r r e c o v e r a b l e d e f o r m a -t i o n s t h a n a f 3 - f i b r i n c l o t s . T h e y a r e a l s o f a r m o r e s u s c e p t i -b l e t o t h e a c t i o n o f GPRP i n l o w e r i n g t h e s h e a r m o d u l u sa n d f u r t h e r i n c r e a s i n g c r e e p r a t e s a n d i r r e c o v e r a b l e d e f o r -m a t i o n s . T h e s e o b s e r v a t i o n s , a s w e l l a s s t u d i e s o f t h ei n t e r a c t i o n o f G PRP w i t h o l i g o m e r s ( 6 a , 2 0 ) s u p p o r t t h ev i e w ( 5 , 6 ) t h a t B b c o n t a c t s s t a b i l i z e t h e b o n d i n g o fi n d i v i d u a l a 3 - f i b r i n m o n o m e r s w i t h i n p r o t o f i b r i l s . I t i s o fp a r t i c u l a r i n t e r e s t , t h e r e f o r e , t o s t u d y c l o t s i n w h i c h t h e r ea r e o n l y B b c o n t a c t s , a n d t h e i r i n t e r a c t i o n w i t h GHR Pw h i c h b i n d s t o t h e b s i t e s , a s w e l l a s G PRP w h i c h a l s ob i n d s t o t h e b s i t e s .

MATERIALS AND METHODSL y o p h i l i z e d h u m a n f i b r i n o g e n , I m c o L o t F 1 7 6 , w a s g e n e r o u s l y g i v e n u sb y D r s . B . B l o m b a c k a n d R . P r o c y k , New Y o r k B l o o d C e n t e r . I t w a sd i s s o l v e d i n T r i s - H C I / N a C l b u f f e r , pH 8 . 5 , i o n i c s t r e n g t h 0 . 4 5 , o f w h i c h0 . 4 0 w a s c o n t r i b u t e d b y N a C l . A f t e r d i a l y s i s a g a i n s t t h i s b u f f e r a t 4 0 Cf o r 2 d w i t h s e v e r a l c h a n g e s , a l i q u o t s w e r e f r o z e n w i t h l i q u i d n i t r o g e n a n ds t o r e d a t 1 0 C . A f t e r e a c h w a s t h a w e d , f i b r i n o g e n c o n c e n t r a t i o n w a s

m e a s u r e d s p e c t r o p h o t o m e t r i c a l l y a t 2 8 2 n m , w i t h c o r r e c t i o n f o r s c a t t e r -i n g b y s u b t r a c t i o n o f a b s o r b a n c e a t 3 2 0 n m .B o v i n e t h ro m b i n w a s o b t a i n e d f r o m P a r k e - D a v i s a n d C o . , D e t r o i t , M I .CV E e n z y m e f r o m A . c o n t o r t r i x c o r t o r t r i x , p u r i f i e d b y c h r o m a t o f o c u s -i n g , w a s g e n e r o u s l y p r o v i d e d b y D r . J o h n R . S h a i n o f f , C l e v e l a n d C l i n i cF o u n d a t i o n . T r a s y l o l ( p l a s m i n i n h i b i t o r ) w a s o b t a i n e d f r o m FBA p h a r -m a c e u t i c a l s , New Y o r k ; p h e n y l m e t h y l s u l f o n y l f l u o r i d e ( P M S F ) a n dh i r u d i n f r o m S i g m a C h e m i c a l C o . , S t . L o u i s , MO; a n d t o s y l l y s i n ec h l o r o m e t h y l k e t o n e ( T L C K ) f r o m A l d r i c h C h e m i c a l C o . , M i l w a u k e e ,W I . M a t e r i a l s f o r g e l e l e c t r o p h o r e s i s ( a c r y l a m i d e a n d c r o s s - l i n k i n gc o m o n o m e r , a m m o n i u m p e r s u l f a t e , a nd C o o m as s i e B r i l l i a n t B l u e d y e )

w e r e o b t a i n e d f r o m B i o r a d L a b o r a t o r i e s , R i c h m o n d , C A . F a c t o r X I I I( f i b r i n s t a b i l i z i n g f a c t o r ) w a s g e n e r o u s l y f u r n i s h e d b y P r o f e s s o r L .L o r a n d , N o r t h w e s t e r n U n i v e r s i t y .B e c a u s e t h e f i b r i n c l o t s w e r e k e p t f o r l o n g p e r i o d s ( u p t o t w o w e e k s )d u r i n g m e c h a n i c a l m e a s u r e m e n t s , i n h i b i t o r s w e r e a d d e d t o t h e f i b r i n o g e ns o l u t i o n s , b e f o r e c l o t t i n g , t o i n a c t i v a t e p o s s i b l e t h o u g h u n l i k e l y t r a c e s o ff o r e i g n e n z y m e s : T r a s y l o l ( 2 U/mL) f o r p l a s m i n , h i r u d i n ( 5 U/mL) f o rt h r o m b i n , a n d TLCK ( 0 . 1 m M) f o r a f i b r i n o l y t i c e n z y m e o r i g i n a l l yp r e s e n t i n t h e s n a k e v e n o m ( 1 0 , 1 2 ) . U n l e s s l i g a t i o n w a s d e s i r e d , t h es o l u t i o n s c o n t a i n e d 1 . 5 mM EDTA. When a l i g a t e d c l o t w a s r e q u i r e d , t h eEDTA w a s r e p l a c e d b y 3 . 2 mM c a l c i u m c h l o r i d e p l u s F a c t o r X I I I a a sn o t e d . T h e l a t t e r w a s p r e p a r e d b y a c t i v a t i n g F a c t o r X I I I ( a t 1 5 0 m g / L )w i t h t h r o m b i n ( 0 . 6 U/mL) a n d c a l c i u m c h l o r i d e ( 0 . 0 1 6 M) f o r 9 0 m i n .a n d t h e n i n a c t i v a t i n g t h e t h r o m b i n b y h i r u d i n ( 4 5 U / m L ) . T h e p r o c e -d u r e s f o r d i s c g e l e l e c t r o p h o r e s i s h a v e b e e n p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( 2 0 -2 2 ) .T h e a p p a r a t u s f o r m e a s u r e m e n t s o f e l a s t i c m o d ul u s a n d c r e e p h a s b e e np r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( 1 8 , 2 0 , 2 3 ) . T h e s o l u t i o n t o b e c l o t t e d , c o n t a i n i n ga p p r o x i m a t e l y 8 . 5 m g / mL f i b r i n o g e n , w a s c o o l e d t o 1 4 0 C , CVE w a sa d d e d a n d i t w a s i n t r o d u c e d b e t w e e n t h e p a r a l l e l c i r c u l a r p l a t e s o f t h ea p p a r a t u s , w h i c h h a d b e e n p r e c o o l e d t o 1 4 0 C , t o a v o i d r e l e a s e o f Af i b r i n o p e p t i d e s a t h i g h e r t e m p e r a t u r e s ( 8 - 1 0 ) . S e p a r a t e a l i q u o t s w e r e

m o n i t o r e d f o r c l o t t i n g t i m e a n d k e p t f o r g e l e l e c t r o p h o r e s i s m e a s u r e -m e n t s . A f t e r c l o t t i n g , t h e s h e a r m o d u l u s G 2 s w a s m e a s u r e d i n t e r m i t t e n t l yb y i m p o s i n g a t o r q u e e f o r 2 5 s , m e a s u r i n g t h e a n g u l a r d i s p l a c e m e n t a ,a n d r e t u r n i n g t h e t o r q u e i m m e d i a t e l y t o z e r o . H e r e , G 2 5 i s c a l c u l a t e d b yt h e r e l a t i o n , ( 2 3 )

G 2 5 = 2 e V h / l r a 4 a ( 1 )w h e r e h i s t h e d i s t a n c e b e t w e e n t h e p l a t e s ( a b o u t 0 . 1 2 c m ) a n d a i s t h ep l a t e r a d i u s ( 2 . 5 c m ) . T h e s h e a r s t r a i n s i n t h e d i s c - s h a p e d c l o t w e r ea l w a y s v e r y s m a l l ( m a x i m u m , a t t h e d i s c p e r i p h e r y , a b o u t 1 a t t h eb e g i n n i n g o f a c r e e p e x p e r i m e n t a n d 6 a t t h e e n d ) . A f t e r G 2 5 h a di n c r e a s e d t o a c o n s t a n t v a l u e , r e q u i r i n g s e v e r a l d a y s , a c r e e p e x p e r i m e n tw a s d o n e a t c o n s t a n t t o r q u e ; t h e a n g u l a r d i s p l a c e m e n t a ( t ) w a s f o l l o w e da s a f u n c t i o n o f t i m e . T h e c r e e p c o m p l i a n c e J ( t ) i s

J ( t ) = v a ' a ( t ) 1 2 e h ( 2 )T h e i n i t i a l v a l u e , J 1 , i s s i m p l y t h e r e c i p r o c a l o f G 2 5 . T h e f i n a l v a l u e a t t i m et , i s d e n o t e d b y J ' . A t t l , a d i f f e r e n t i a l c o m p l i a n c e J , w a s d e t e r m i n e df r o m a n i n c r e m e n t a l a n g u l a r d i s p l a c e m e n t 2 5 s a f t e r a p p l i c a t i o n o f a ni n c r e m e n t a l t o r q u e ( a b o u t h a l f t h e o r i g i n a l t o r q u e ) . T h e n t h e t o r q u e w a sr e m o v e d , a n d c r e e p r e c o v e r y b e g a n . A f t e r 2 5 s t h e c o m p l i a n c e h a dd e c r e a s e d t o J , . I t g r a d u a l l y d e c r e a s e d f u r t h e r t o a f i n a l v a l u e J , , am e a s u r e o f p e r m a n e n t d e f o r m a t i o n . F i n a l l y , a f t e r c r e e p r e c o v e r y , a ni n c r e m e n t a l t o r q u e w a s a p p l i e d a g a i n a n d t h e r e s u l t a n t a n g u l a r d i s p l a c e -m e n t w a s m e a s u r e d t o o b t a i n t h e d i f f e r e n t i a l c o m p l i a n c e J . f i n a l . T h e s ev a r i o u s c o m p l i a n c e s m o n i t o r p o s s i b l e c h a n g e s i n c l o t s t r u c t u r e ( 9 , 1 9 ) .When m e a s u r e m e n t s w e r e t o b e m a d e a t d i f f e r e n t t e m p e r a t u r e s , t h eCV E i n t h e c l o t w a s i n a c t i v a t e d a t 1 4 0 C b y d i f f u s i n g i n f r o m t h e c l o tp e r i p h e r y PMSF o v e r a p e r i o d o f 4 0 h t o a n o m i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 5mM t o p r e v e n t r e l e a s e o f A f i b r i n o p e p t i d e a t h i g h e r t e m p e r a t u r e s ( 8 , 1 0 ) .T h e a r r a n g e m e n t f o r t h i s d i f f u s i o n p r o c e d u r e h a s b e e n d e s c r i b e d p r e v i -o u s l y ( 1 9 , 2 0 ) .

B I O P H Y S I C A L J O U R N A L VOLUME 5 3 1 9 8 81 2


3/8

RESULTSD e p e n d e n c e o f S h e a r M o d u l u s onT i m e a n d T e m p e r a t u r e

T h e b u i l d u p o f s h e a r m o d u l u s w it h t i me a t 1 4 0 C a f t e rc l o t t i n g o f a s o l u t i o n c o n t a i n i n g 0 . 3 8 TAME u n i t s ( 8 ) o fCV E per m L i s s h o w n i n F i g . 1 . F o r c o m p a r i s o n w i t h c l o t so f af3 a n d a - f i b r i n u n d e r t h e same c o n d i t i o n s , f o r m e d w i t ht h r o m b i n a n d b a t r o x o b i n r e s p e c t i v e l y ( 6 a ) , G 2 5 ( t ) / G 2 5 i sp l o t t e d a g a i n s t t / t c , w h e r e G f 2 5 i s t h e f i n a l m o d u l u s v a l u ea n d t , i s t h e c l o t t i n g t i m e . V a l u e s o f t c , G f 2 5 , a n d f i b r i n o g e nc o n c e n t r a t i o n [ F ] are g i v e n i n t h e l e g e n d .T h e c l o t t i n g t i m e f o r f - f i b r i n u n d e r f i n e c l o t c o n d i -t i o n s i s m u c h l o n g e r t h a n a t pH 7 . 3 , i o n i c s t r e n g t h 0 . 1 5( 8 , 1 0 ) . T h e b u i l d u p o f r i g i d i t y r e l a t i v e t o t h e c l o t t i n g t i m ei s a l s o s t r i k i n g l y s l o w c o m p a r e d w i t h t h e b e h a v i o r o fa - f i b r i n a n d a f l - f i b r i n ; h a l f t h e f i n a l e l a s t i c m o d u l u s i sa t t a i n e d a t t =7 t c , c o m p a r e d w i t h - 2 t c f o r t h e o t h e r s . T h ei n s e t s h o w s r e s u l t s o f g e l e l e c t r o p h o r e s i s u n d e r r e d u c i n gc o n d i t i o n s on a l i q u o t s q u e n c h e d b y SDS a t t i m e s i n d i c a t e db y a t o e on t h e g r a p h f o r f A f i b r i n a n d c o m p a r e d w i t h af u l l y d e v e l o p e d t h r o m b i n c l o t ( T h ) a n d f i b r i n o g e n ( 0 ) .T h e d i s p l a c e m e n t o f t h e c h a i n i n d i c a t e s t h a t t h e r e l e a s eo f t h e B p e p t i d e i s c o m p l e t e a t b , - 6 t i m e s t c . T h u s t h er e l e a s e o f B i s n o t t h e r a t e - d e t e r m i n i n g s t e p i n t h e s l o wb u i l d u p . ( R e l e a s e o f A p e p t i d e i s t h e r a t e - d e t e r m i n i n g s t e pi n p o l y m e r i z a t i o n o f a / 3 - f i b r i n u n d e r s i m i l a r c o n d i t i o n s( 2 4 ) . ) A t l a t e r t i m e s , t h e a h a i n appears t o h a v e u n d e r -gone s o m e a t t a c k i n s p i t e o f t h e enz y me i n h i b i t o r s p r e s e n t .S i m i l a r b e h a v i o r wa s o b s e r v e d b y M o s e s s o n a n d c o l l a b o r a -t o r s ( 1 3 ) .

F o r a s i m i l a r e x p e r i m e n t w i t h CVE, t h e m o d u l u s G 2 5 i sp l o t t e d d i r e c t l y a g a i n s t r e a l t i m e i n F i g . 2 . T h e course o fb u i l d u p agrees q u i t e w e l l w i t h t h a t i n F i g . 1 , a l t h o u g h t h ef i n a l m o d u l u s i s s o m e w h a t h i g h e r ( 6 7 0 d y n / c m 2 ) . C r e e p

t c t / t cF I G U R E 1 S h e a r m o d u l u s r e l a t i v e t o i t s f i n a l v a l u e p l o t t e d a g a i n s t t / t 1 . CVE0.38 U/mL [F ] 8.54 mg/mL t 9 h, G ' 5 490 dyn/cm2( e x p . 9 3 ) ; a b a t r o x o b i n 0 . 1 U/mL, [ F ] =8 . 5 1 mg/mL, t c =9 0 m i n ,G f s = 1 , 3 0 0 d y n / c m 2 ( E x p . 8 4 ) ; a , B , thrombin 0.19 U/ mL , [ F ] = 8.57mg/mL, t r = 3 2 m i n , G f 5 1 , 8 6 0 d y n / c m 2 ( E x p . 9 0 ) . I n s e t : r e d u c e d g e le l e c t r o p h o r e s i s on a l i q u o t s o f - f i b r i n t a k e n a t t i m e s i n d i c a t e d b y a t o e ong r a p h ; Th i s f o r f u l l y d e v e l o p e d t h r o m b i n c l o t , 0s f i b r i n o g e n .

E

C~ D

6 0 0 1

4 0 0 1

20 0

V Tt c 2 3 4T i m e , s x 1 0 - 5 5 6 7F I G U R E 2 S h e a r m o d ul u s p l o t t e d d i r e c t l y a g a i n s t t i m e f o r c l o t o ff i b r i n , [ F ] = 8 . 6 0 mg/mL, CV E 0 . 3 8 U/mL, t , 8 . 5 h ( e x p . 8 7 ) . T i m e so f creep e x p e r i m e n t a n d o f i n t r o d u c t i o n o f PMSF are s h o w n . B l a c kc i r c l e s : b u i l d u p o f G 2 5 a f t e r t e m p e r a t u r e c h a n g e f r o m 3 4 . 5 0 t o 1 4 . 0 C ( c f . ,F i g . 3 ) . T h e a b s c i s s a u n i t ( 1 0 5 s ) i s - 1 d .a n d creep recovery m e a s u r e m e n t s were m a d e a t 1 4 . 2 0 a f t e r- 5 d , a n d on t h e s i x t h d a y PMSF wa s d i f f u s e d i n t oi n a c t i v a t e t h e enzyme. T h e n m e a s u r e m e n t s were m a d e a t a

s e r i e s o f d i f f e r e n t t e m p e r a t u r e s i n t h e o r d e r 1 4 . 2 0 , 5 . 0 0 ,1 2 . 2 0 , 2 5 . 0 0 , 3 0 . 0 0 , 1 4 . 2 0 , 3 4 . 5 , a n d 1 4 . 0 0 . A f t e r e a c ht e m p e r a t u r e c h a n g e , G 2 5 wa s f o l l o w e d as a f u n c t i o n o f t i m ea n d r e a c h e d a p l a t e a u l e v e l w i t h i n 3 t o 5 h e x c e p t w h e n t h et e m p e r a t u r e wa s l o w e r e d f r o m 3 0 0 or h i g h e r . D u r i n g t h i ssequence o f t e m p e r a t u r e c h a n g e s , t h e age o f t h e c l o ti n c r e a s e d f r o m 7 t o 1 2 d . U n f o r t u n a t e l y , t h e t e m p e r a t u r ei t s e l f i s s l o w t o come t o e q u i l i b r i u m i n t h i s a p p a r a t u s a n dno c o n c l u s i o n s c an b e d r a w n a b o u t t h e k i n e t i c s o f c h a n g e si n t h e f i b r i n n e t w o r k f o r t i m e s s h o r t e r t h a n - 2 h . H o w e v e r ,t h e b u i l d u p o f G 2 5 a f t e r t h e f i n a l c h a n g e f r o m 3 4 . 5 0 t o1 4 . 0 0 r e q u i r e d a t l e a s t 2 d a n d i s p l o t t e d w i t h b l a c k c i r c l e s

126 2 0 0 0

8 *9 5

*2 0 4 * 3 1 6 0 0CY

6 0 0 1 2 0 02 ~ ~ ~ ~ 0 6

400 8 0 04\

2 0 0 4 0 0

0~~~~~~~~~~~~0 1 0 2 0 3 0 4 0T e m p e r a t u r e , ' C .F I G U R E 3 S h e a r m o d u l u s p l o t t e d a g a i n s t t e m p e r a t u r e f o r c l o t o f , B -f i b r i n , E x p . 8 7 ( c f . l e g e n d o f F i g . 2 ) . N u m e r a l s d e n o t e sequence o fm e a s u r e m e n t s . S o l i d c i r c l e s : s i m i l a r measurements f o r a c l o t o f a 3 f i b r i n ,[ F ] 8 . 5 7 mg/mL, t h r o m b i n 4 . 2 U/mL, t = 2 7 m i n . ( E x p . 8 3 ) . D a s h e dl i n e i s average o f measurements 7 t o 1 2 i n c i u s i v e . N o t e t h e d i f f e r e n c e i no r d i n a t e s c a l e .

S H I M I Z U AND F E R R Y M e c h a n i c a l P r o p e r t i e s o f , 8 - F i b r i n C l o t s

~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~REEP P M S F

B o o . I

0 1 i f a

I - I

3 1 3


4/8

i n F i g . 2 . T h e f a c t t h a t G 2 5 , s t a r t i n g f r o m 1 5 d y n / c m 2 a t3 4 . 5 0 , a t t a i n s a v a l u e a t 1 4 . 0 0 ( 5 3 0 ) n e a r l y a s h i g h a s t h ei n i t i a l v a l u e w h e n t h e c l o t w a s f i r s t f o r m e d a t 1 4 . 2 0 ( 6 7 0 )g i v e s s o m e r e a s s u r a n c e t h a t t h e r e h a s b e e n n o d e l e t e r i o u se f f e c t o f d e g r a d a t i o n o f t h e p r o t e i n d e s p i t e t h e e x t r e m ed u r a t i o n o f t h e e x p e r i m e n t . T h e b u i l d u p o f r i g i d i t y a f t e rl o w e r i n g t h e t e m p e r a t u r e , a l t h o u g h s l o w , i s m u c h f a s t e rt h a n t h a t f o l l o w i n g t h e o r i g i n a l c l o t t i n g , d e s p i t e t h e c o n c l u -s i o n t h a t i n t h e l a t t e r t h e r e l e a s e o f B p e p t i d e i s n o t t h er a t e - d e t e r m i n i n g s t e p . A s i m i l a r c o n c l u s i o n w a s r e a c h e d b yM o s e s s o n a n d c o l l a b o r a t o r s ( 1 2 ) b y f o l l o w i n g o p a c i t ym e a s u r e m e n t s .T h e p l a t e a u v a l u e s o f G 2 5 a r e p l o t t e d a g a i n s t t e m p e r a -t u r e i n F i g . 3 , w i t h n u m e r a l s d e n o t i n g t h e s e q u e n c e o fm e a s u r e m e n t s . T h e p o i n t s b e l o w 1 4 0 a r e s o m e w h a t e r r a t i cb u t t h e s h a r p d r o p i n t h e r a n g e 2 0 0 - 3 0 0 a g r e e s w i t h e a r l i e rq u a l i t a t i v e o b s e r v a t i o n s ( 8 , 1 0 ) a t l o w e r pH a n d i o n i cs t r e n g t h . T h e s e q u e n c e 5 - 6 - 7 - 8 s h o w s r a t h e r g o o d r e v e r s i -b i l i t y b e t w e e n t e m p e r a t u r e s w h e r e t h e c l o t i s n e a r l y l i q u e -f i e d a n d w h er e t h e m o d u l u s i s n e a r i t s maximum v a l u e .T h e f a c t t h a t , a f t e r t h e CV E h a d a c t e d f o r 6 d , t h e c l o tc o u l d b e e s s e n t i a l l y l i q u e f i e d a t 3 0 0 i s e v i d e n c e t h a t t h er e s u l t s a r e n o t a f f e c t e d b y a n y s l o w r e l e a s e o f f i b r i n o p e p -t i d e A . ( I n a q u a l i t a t i v e t e s t , a CV E c l o t w a s l i q u e f i e d a t3 7 0 a n d t h e s o l u t i o n w a s d i v i d e d i n t o t w o a l i q u o t s ; t o o n e ,b a t r o x o b i n w a s a d d e d t o a c o n c e n t r a t i o n o f 1 . 2 5 U / m L ;b o t h w e r e i n c u b a t e d a t a m b i e n t t e m p e r a t u r e , a t w h i c ht h e y g e l l e d , f o r 2 d . U p o n w a r m i n g t o 3 7 0 , t h e g e l w i t hb a t r o x o b i n , w h i c h r e l e a s e s t h e A p e p t i d e s , r e m a i n e d s o l i d ,a n d t h e o t h e r l i q u e f i e d . ) F a c i l i t i e s w e r e n o t a v a i l a b l e t od e t e r m i n e t h e A r e l e a s e d i r e c t l y .F i g . 3 i n c l u d e s , f o r c o m p a r i s o n , d a t a f o r t h e t e m p e r a t u r ed e p e n d e n c e o f G f o r a c l o t o f u n l i g a t e d a f l - f i b r i n f o r m e dw i t h t h r o m b i n a t t h e s a m e p H , i o n i c s t r e n g t h , a n d f i b r i n o -g e n c o n c e n t r a t i o n ( b u t a m u c h s h o r t e r c l o t t i n g t i m e , 2 7m i n ) . T h e t e m p e r a t u r e r a n g e h e r e w a s f r o m 5 . 2 t o 3 0 . 3 0 C .

T h e m e a s u r e m e n t s i n s e q u e n c e 1 - 6 w e r e m a d e w i t h i n ap e r i o d o f c l o t a g e f r o m 4 3 t o 7 6 h ; t h o s e i n s e q u e n c e 7 - 1 2w i t h i n a p e r i o d f r o m 1 1 5 t o 1 4 2 h . T h e s c a t t e r w i t h i n e a c hg r o u p a p p e a r s t o b e r a n d o m , a n d t h e a v e r a g e f o r t h es e c o n d g r o u p i s d r a w n a s a h o r i z o n t a l d a s h e d l i n e . F r o mt h e s e m e a s u r e m e n t s , t h e r e s e e m s t o b e n o s i g n i f i c a n td e p e n d e n c e o f m o d u l u s o n t e mp e ra t ur e i n a t h r o m b i n c l o t .( I n a v e r y e a r l y s t u d y ( 2 5 ) o f b o v i n e f i b r i n o f l o w e r p u r i t ya t pH 7 b y a n e n t i r e l y d i f f e r e n t e x p e r i m e n t a l m e t h o d , am o d e r a t e r e v e r s i b l e d e c r e a s e i n G w i t h i n c r e a s i n g t e m p e r -a t u r e w a s r e p o r t e d . W e h a v e n o e x p l a n a t i o n f o r t h i sd i f f e r e n c e . )

I n t e r a c t i o n w i t h G HR P a n d G P R P : S h e a rM o d u l u s a n d C r e e p

T o d e t e r m i n e t h e e f f e c t o f GHR P o n c l o t m e c h a n i c a lp r o p e r t i e s , t h e t e t r a p e p t i d e w a s d i f f u s e d i n f r o m a na p p r o x i m a t e l y e q u a l v o l u m e o f e x t e r n a l s o l u t i o n w i t h t w i c et h e d e s i r e d t e t r a p e p t i d e c o n c e n t r a t i o n i n t h e s a m e b u f f e r ,a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( 1 8 , 1 9 ) , a t 1 4 0 C . T h e d e c r e a s e i nG 2 5 w a s f o l l o w e d w i t h t i m e a s i n e a r l i e r e x p e r i m e n t s w h e r eG PRP w a s i n t r o d u c e d i n t o c l o t s o f a - f i b r i n a n d a f l - f i b r i n( 6 a , 1 9 , 2 0 ) . T h e c o n c e n t r a t i o n i s e x p e c t e d t o b e n e a r l ye q u a l i z e d a f t e r 1 d ( 2 0 ) , t h o u g h a s m a l l f u r t h e r d r o p i n G 2 5i s o b s e r v e d a f t e r 2 d . I n t h e f i r s t d i f f u s i o n , t h e n o m i n a lGHR P c o n c e n t r a t i o n w a s 0 . 5 mM ( a s s u m i n g c o m p l e t ee q u a l i z a t i o n ) ; i n t h e s e c o n d , a f t e r r e p l a c i n g t h e e x t e r n a ls o l u t i o n w i t h a m o r e c o n c e n t r a t e d c h a r g e , i t w a s 2 . 3 mM( E x p . 9 3 ) . A s i m i l a r s e q u e n c e w a s p e r f o r m e d w i t h t h eo t h e r t e t r a p e p t i d e , G P R P , i n w h i c h t h e n o m i n a l c o n c e n -t r a t i o n a f t e r t h e f i r s t d i f f u s i o n w a s 0 . 1 mM a n d a f t e r t h es e c o n d 1 . 0 mM ( E x p . 1 0 2 ) . T h e r a t i o G 2 5 / G 2 5 ( 0 ) , w h e r eG 2 5 ( 0 ) i s t h e m o d u l u s b e f o r e i n t r o d u c t i o n o f GHRP, a f t e r 1a n d 2 d i s g i v e n w i t h o t h e r i n f o r m a t i o n i n T a b l e I .I n F i g . 4 , G 2 5 / G 2 5 ( 0 ) ( a f t e r 2 d ) i s p l o t t e d a g a i n s t

TABLE IS HE AR M ODUL I AND CREEP COMPLIANCES ( U N I T S DYN/CM2 AND CM2/DYN R E S P E C T I V E L Y ) , AT 1 4 0 CG I G ( O ) G I G O j l X1 4 t l , j a X 0 4 J,- J . J , ( f i n a l )E x p t . F i b r i n [ F ] P e p t i d e [ P ] G 2 5 ( 0 ) G / G ( 0 ) G / G ( 0 ) d x 1 0 4 Xo 4 1 41 0 x i 0 4

mg / mL mM8 7 , B 8 . 6 - 6 7 0 1 6 . 4 1 . 2 1 6 . 2 1 5 . 7 1 6 . 19 3 f 8 8 . 5 4 9 0 - 2 1 . 3 1 . 2 2 1 . 6 2 0 . 6 2 0 . 7GHRP 0 . 5 0 . 6 0 0 . 5 1 4 0 1 . 2 4 0 4 0 4 0 . 4GHRP 2 . 3 0 . 2 1 0 . 1 6 1 2 6 0 . 3 1 1 7 1 1 7 1 2 6

1 0 2 1 3 8 . 5 - 4 6 0 - 2 2 . 7 1 . 3 2 1 . 5 2 2 . 6 2 2 . 3G P R P 0 . 1 0 . 9 1 0 . 8 6 2 5 . 2 1 . 3 2 5 . 5 2 4 . 8 2 5 . 6G P R P 1 . 0 0 . 2 0 0 . 1 2 1 8 8 0 . 4 1 8 79 8 8 . 5 1 4 2 0 7 . 1 1 . 2 6 . 9 7 . 0 7 . 0GHRP 6 . 0 0 . 9 9 0 . 9 7 7 . 2 5 1 . 2 7 . 0 7 . 3 7 . 38 4 t a 8 . 5 1 3 0 0 - 7 . 8 1 . 2 7 . 3 7 . 1 7 . 99 0 4 : a / 3 8 . 6 1 8 9 0 5 . 2 9 . 5 5 . 1 5 . 4 5 . 49 6 t a , 3 8 . 5 1 8 6 0 5 . 4 1 . 2 5 . 1 5 . 5 5 . 4

* L i g a t e d b y F a c t o r X I I I a a n d c a l c i u m .t M e a s u r e m e n t s a t 2 2 1 C .B I O P H Y S I C A L J O U R N A L VOLUME 5 3 1 9 8 81 4


5/8

F I G U R E 4 S h e a r m o d u l u s r a t i o a f t e r d i f f u s i o n f o r 2 d p l o t t e d a g a i n s tn o m i n a l c o n c e n t r a t i o n o f t e t r a p e p t i d e : GHR P a n d GPRP ( c r o s s e dc i r c l e s ) f o r , B - f i b r i n , GPRP f o r a - f i b r i n a n d a c , - f i b r i n ( 7 ) . P o i n t w i t h p i pu p i s f o r f i b r i n c o n c e n t r a t i o n 1 5 . 0 m g / m L .

t e t r a p e p t i d e c o n c e n t r a t i o n f o r b o t h t e t r a p e p t i d e s a n d c o m-p a r e d w i t h s i m i l a r d a t a f o r i n t r o d u c t i o n o f G PRP i n t oa - f i b r i n a n d a f - f i b r i n c l o t s p r e p a r e d f r o m I m c o f i b r i n o -g e n . I t i s e v i d e n t t h a t / - f i b r i n i s m u c h l e s s s u s c e p t i b l e t od i s s o c i a t i o n b y GHR P t h a n a - f i b r i n i s t o G P R P . T h ee f f e c t o f GHRP o n t h e m o d u l u s o f A - f i b r i n i s q u i t e s i m i l a ri n m a g n i t u d e t o t h a t o f G PRP o n a f 3 - f i b r i n . H o w e v e r ,G PRP l o w e r s t h e m o d u l u s o f A - f i b r i n e v e n m o r e t h a nGHR P d o e s . ( A s i n g l e e x p e r i m e n t f r o m R e f e r e n c e 1 9 , n o ts h o w n , g a v e t h e e f f e c t o f GHR P o n a d - f i b r i n a s G/G [ 0 ] =0 . 7 9 a t 5 . 6 m M, t r i v i a l i n c o m p a r i s o n w i t h t h e o t h e r s ; a n da n o t h e r s h o w e d a s y n e r g i s t i c e f f e c t o f G PRP a n d GHR Pc o m b i n e d . )

C r e e p a n d c r e e p r e c o v e r y d a t a f o r a A l - f i b r i n c l o t b e f o r ei n t r o d u c t i o n o f GHR P a n d a t t w o l e v e l s o f GHR P c o n c e n -t r a t i o n a r e s h o w n i n F i g . 5 . N u m e r i c a l d a t a f o r J I , t , , J ,J J , , a n d J , ( f i n a l ) a r e i n c l u d e d i n T a b l e I , f o r t h e s e a sw e l l a s t w o o t h e r c l o t s w i t h o u t GHRP, i n r e a s o n a b l ea g r e e m e n t , a n d c l o t s c o n t a i n i n g GPRP a t t w o d i f f e r e n tl e v e l s , a l s o r e p r e s e n t a t i v e d a t a f o r a - f i b r i n a n d a / 3 - f i b r i nc l o t s f r o m I m c o f i b r i n o g e n f r o m p r e v i o u s m e a s u r e m e n t s( 6 a ) .

t ,t i m e , s z I 0 -F I G U R E 5 C r e e p a n d c r e e p r e c o v e r y o f , B - f i b r i n c l o t b e f o r e ( 0 ) a n d a f t e ri n t r o d u c t i o n o f GHR P t o n o m i n a l c o n c e n t r a t i o n s o f 0 . 5 a n d 2 . 3 mM ( e x p .9 3 ) . A d d i t i o n a l d a t a i n T a b l e I .

I t i s e v i d e n t f r o m F i g . 5 t h a t GHR P i n c r e a s e s b o t h t h ec r e e p r a t e a n d t h e i r r e c o v e r a b l e d e f o r m a t i o n o f A - f i b r i n ,j u s t a s G PRP d o e s f o r a - f i b r i n a n d a f 3 - f i b r i n ( 6 a , 2 0 ) .S i m i l a r i n c r e a s e s w e r e o b s e r v e d f o r A - f i b r i n c l o t s c o n t a i n -i n g G P R P , b u t t h e l a t t e r w a s s o m e w h a t m o r e e f f e c t i v e a sw i l l b e s e e n f r o m c o m p a r i s o n o f v i s c o s i t i e s . E v e n w i t h o u tG P R P , t h e c r e e p a n d c r e e p r e c o v e r y o f d 3 f i b r i n , l i k e t h o s eo f a - f i b r i n , r e s e m b l e t h e b e h a v i o r o f a v i s c o e l a s t i c l i q u i d ,a n d t h e r e c i p r o c a l s l o p e o f t h e l i n e a r p o r t i o n o f t h e c r e e pc u r v e r e p r e s e n t s a s t e a d y - f l o w v i s c o s i t y . A d e t a i l e d c o m -p a r i s o n o f t h e p r o p e r t i e s o f t h e t h r e e t y p e s o f f i b r i n w i l lf o l l o w . I n T a b l e I , t h e c o l u m n s J A J ' - J . , a n d J , ( f i n a l )a r e o f p a r t i c u l a r i n t e r e s t . T h e s e r e p r e s e n t a d i f f e r e n t i a lc o m p l i a n c e m e a s u r e d 2 5 s a f t e r a s t e p c h a n g e i n s t r e s s ( t h er e m o v a l o f t h e o r i g i n a l t o r q u e a t t i m e t 1 i s e q u i v a l e n t t o an e g a t i v e s t r e s s c h a n g e a n d J ' - J . i s t h e c o r r e s p o n d i n gc h a n g e i n c o m p l i a n c e ) . A l l t h e s e q u a n t i t i e s a r e e s s e n t i a l l ye q u a l a n d i n a g r e e m e n t w i t h t h e i n i t i a l c o m p l i a n c e J , . T h i ss h o w s , a s h a s b e e n f o u n d t o b e t h e c a s e f o r a f i - a n da - f i b r i n s b o t h w i t h a n d w i t h o u t G P R P , t h a t e v e n t h o u g hs u b s t a n t i a l f l o w o c c u r s t h e n e t w o r k s t r u c t u r e h a s n o t b e e nd a m a g e d , a n d i f n e t w o r k s t r a n d s h a v e b e e n s e v e r e d t h e ym u s t f o r m a g a i n i n n e w c o n f i g u r a t i o n s .I n T a b l e I I , v a l u e s o f v i s c o s i t y 7 a n d s t e a d y - s t a t ec o m p l i a n c e J ' ( a m e a s u r e o f r e c o v e r a b l e e l a s t i c d e f o r m a -t i o n , g i v e n b y t h e i n t e r c e p t o f t h e l i n e a r s e g m e n t o f t h ec r e e p c u r v e o n t h e o r d i n a t e a x i s ) a r e l i s t e d , a s w e l l a s t h el o g a r i t h m o f t h e p r o d u c t 7 J , w h i c h r e p r e s e n t s a w e i g h t -a v e r a g e v i s c o e l a s t i c r e l a x a t i o n t i m e ( 2 0 ) . C o m p a r i s o n w i t ha - a n d a f 3 - f i b r i n s i n T a b l e s I a n d I I s h o w s t h a t b o t h a a n d 3t y p e s h a v e s o m e w h a t l o w e r m o d u l i a n d e n o r m o u s l y l o w e rv i s c o s i t i e s ( o r d e r s o f m a g n i t u d e ) t h a n t h e n o r m a l f i b r i nf o r m e d w i t h t h r o m b i n . T h e m o d u l i a n d v i s c o s i t i e s o f a - a n d - f i b r i n a r e o f s i m i l a r m a g n i t u d e s , t h o u g h a - f i b r i n h a s as o m e w h a t h i g h e r m o d u l u s a n d s o m e w h a t l o w e r v i s c o s i t y .T h e a v e r a g e r e l a x a t i o n t i m e i s s o m e w h a t h i g h e r f o r , B -f i b r i n .T h e v i s c o s i t y i s p l o t t e d l o g a r i t h m i c a l l y a g a i n s t c o n c e n -

TABLE I IEFFECTIVE VISCOSITIES AND STEADY STATECOMPLIANCES, AT 1 4 0 C

E x p t . F i b r i n P e p t i d e [ P ] q x 1 0 - 7 J x 1 0 4 l o g J oP c m 2 / d y n e u n i t s s

8 7 ,- 0 . 3 7 2 4 3 . 9 59 3 , B - 0 . 2 5 3 3 3 . 9 1G HR P 0 . 5 0 . 0 9 6 9 3 . 7 9

G HR P 2 . 3 0 . 0 1 2 2 1 6 3 . 4 11 0 2 / 3 0 . 2 4 3 5 3 . 9 2G PRP 0 . 1 0 . 1 7 4 5 3 . 8 9G P R P 1 . 0 0 . 0 1 5 3 2 5 3 . 6 88 4 * a 0 . 1 9 2 5 3 . 6 89 0 * a , 3 ( 3 9 ) t 7 . 4 * 5 . 4 6 *

* M e a s u r e m e n t s a t 2 2 1 C .t A l o w e r l i m i t b e c a u s e i t i s d o u b t f u l w h e t h e r s t e a d y s t a t e f l o w i sa c h i e v e d .

S H I M I Z U AND F E R R Y M e c h a n i c a l P r o p e r t i e s o f , 8 - F i b r i n C l o t s 3 1 5


6/8

t r a t i o n f o r b o t h t e t r a p e p t i d e s i n F i g . 6 , w i t h c o m p a r i s o n s( 6 a , 2 0 ) f o r a - f i b r i n a n d a f l - f i b r i n w i t h G P R P . A l t h o u g ht h e r e d u c t i o n o f v i s c o s i t y o f A - f i b r i n b y GHRP i s s u b s t a n -t i a l , i t i s r e l a t i v e l y l e s s t h a n t h e e f f e c t o f G PRP o na f - f i b r i n a n d f a r l e s s t h a n t h e s p e c t a c u l a r r e d u c t i o n b yG PRP i n a - f i b r i n . T h e v i s c o s i t y o f A - f i b r i n , l i k e t h em o d u l u s , i s l o w e r e d m o r e b y GPRP t h a n b y GHR P a t ac o m p a r a b l e c o n c e n t r a t i o n . I t may b e n o t e d t h a t a l l t h ev i s c o s i t i e s a r e e x c e e d i n g l y h i g h c o m p a r e d w i t h t h o s e o fo r d i n a r y l i q u i d s ; f o r e x a m p l e , t h a t o f g l y c e r o l i s 9 p o i s e a t2 5 . 0 C . T h e p r o d u c t o f q J i n T a b l e I I w i l l b e c o n s i d e r e d i nt h e D i s c u s s i o n s e c t i o n .

L i g a t e d : - F i b r i n C l o t sT h e a c t i o n o f CV E on f i b r i n o g e n i n t h e presence o f F a c t o rX I I I a a n d c a l c i u m p r o d u c e s a c l o t w i t h y--y l i g a t i o n ( 1 1 ) .T h e i n c r e a s e i n s h e a r m o d u l u s w i t h t h e progress o f t i m e i ns u c h a c l o t i s p l o t t e d i n F i g . 7 . T h e m o d u l u s b u i l d s up morer a p i d l y t h a n f o r t h e c o r r e s p o n d i n g u n l i g a t e d c l o t , repro-d u c e d f o r c o m p a r i s o n f r o m F i g . 2 , a n d r e a c h e s a c o n s i d e r a -b l y h i g h e r l i m i t i n g v a l u e . A f t e r 5 d , t h e y- y l i g a t i o n wa se s s e n t i a l l y c o m p l e t e . No aad i m e r s or p o l y m e r s wereo b s e r v e d , a l t h o u g h t h e a - c h a i n s were d e g r a d e d as i n t h eu n l i g a t e d c l o t s .

C r e e p a n d creep r e c o v e r y d a t a f o r t h i s c l o t b e f o r e a n da f t e r i n t r o d u c t i o n o f G HRP t o a very h i g h n o m i n a lc o n c e n t r a t i o n o f 6 mM are s h o w n i n F i g . 8 , a n d n u m e r i c a ld a t a are i n c l u d e d i n T a b l e I. T h e c o n t r a s t w i t h t h eu n l i g a t e d c l o t s ( F i g . 5 ) i s s t r i k i n g . T h e r e i s e s s e n t i a l l y noc r e e p , j u s t an i m m e d i a t e e l a s t i c d e f o r m a t i o n , a n d t h erecovery a f t e r r e m o v a l o f s t r e s s i s a l m o s t i n s t a n t a n e o u sa n d c o m p l e t e ; t h e b e h a v i o r i s a l m o s t t h a t o f a p e r f e c te l a s t i c s o l i d . T h u s i n t r o d u c t i o n o f GHRP a t a much h i g h e rc o n c e n t r a t i o n t h a n t h a t w h i c h d e c r e a s e s t h e m o d u l u s ( F i g .4 ) a n d g r e a t l y i n c r e a s e s creep r a t e a n d i r r e c o v e r a b l ed e f o r m a t i o n ( F i g . 5 ) o f u n l i g a t e d c l o t s h a s p r a c t i c a l l y noe f f e c t on t h e m o d u l u s . I n t h e presence o f t h e GHRP, t h e r e

35, B P e i ~,a,;OHP6 t. I j. .0

N o m i n a l T e t r a p i p t i d e C O c e n t r a t i o n , mMF I G U R E 6 L o g a r i t h m o f v i s c o s i t y f r o m s l o p e o f l i n e a r p o r t i o n o f c r e e pcurve p l o t t e d a g a i n s t n o m i n a l c o n c e n t r a t i o n o f t e t r a p e p t i d e : GHRP andG P R P ( c r o s s e d c i r c l e s ) f o r - f i b r i n , GPRP f o r a - f i b r i n a n d c a - f i b r i n .F i b r i n c o n c e n t r a t i o n s - 8 . 5 m g / m L e x c e p t f o r p o i n t s w i t h p i p s , 1 5 . 0mg/mL.

F I G U R E 7 S h e a r m o d u l u s p l o t t e d a g a i n s t t i m e f o r l i g a t e d c l o t o f, 8 - f i b r i n , E x p . 9 8 , [ F ] =8 . 4 5 mg/mL, CV E 0 . 3 8 U/mL, F a c t o r X I I I a 4 . 8m g / L , t , 6 h . D a s h e d curve i s f o r u n l i g a t e d c l o t , r e p r o d u c e d f r o m F i g .2 . T h e a b s c i s s a u n i t i s 1 d .i s s t i l l a l m o s t no creep or f l o w a n d n e a r l y p e r f e c t e l a s t i crecovery. A s e x p e c t e d , t h e v a r i o u s J v a l u e s i n T a b l e I agrees i n c e t h e s t r u c t u r e i s s t a b l e a n d n o t r e a r r a n g i n g as i t d o e si n u n l i g a t e d c l o t s . S i m i l a r b e h a v i o r h a s b ee n f o u n d f o rl i g a t e d f i n e c l o t s o f a f - f i b r i n a n d a - f i b r i n ( 6 a ) , w h i c h areu n a f f e c t e d b y t h e i n t r o d u c t i o n o f GPRP b y d i f f u s i o n .

DISCUSSIONA s p o i n t e d o u t i n p r e v i o u s c o m m u n i c a t i o n s ( 6 a , 2 0 ) , t h em o d u l u s G 2 5 i s a measure o f t h e a b i l i t y o f t h e f i b r i ns t r u c t u r e t o s to r e e l a s t i c e n e r g y , w h i l e t h e creep r a t e a n dv i s c o s i t y are measures o f t h e r a t e ( a n d i t s r e c i p r o c a l ,r e s p e c t i v e l y ) o f r e a r r a n g e m e n t s o f t h e s t r u c t u r e .T h e r e v e r s i b l e t e m p e r a t u r e d e p e n d e n c e of G i n d i c a t e st h a t t h e s t r u c t u r e o f u n l i g a t e d 3 - f i b r i n i s s u b j e c t t o d i s s o -c i a t i o n i n an a c c e s s i b l e t e m p e r a t u r e r a n g e , a n d e x p e r i -m e n t s w i t h o l i g o m e r s ( 5 , 1 2 ) i n d i c a t e t h a t t h e d i s s o c i a t i o ni s b e t w e e n monomer u n i t s w i t h i n t h e p r o t o f i b r i l s a n di n v o l v e s t h e B b a s s o c i a t i o n s . Two mono mers i n s t a g g e r e do v e r l a p p i n g c o n f i g u r a t i o n are j o i n e d b y t w o Bb j u n c t i o n s .

- Z9

C-c._

u

CL

8 _

6-

4 -

2-

0 0 0 . 5 1 . 0 T 1 . 5 2 . 0t iT i m e , S X l 1 Y 4F I G U R E 8 C r e e p a n d c r e e p recovery o f l i g a t e d 3 - f i b r i n c l o t b e f o r e a n da f t e r i n t r o d u c t i o n o f GHRP t o a n o m i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 6 . 0 mM ( e x p .9 8 ) . A d d i t i o n a l d a t a i n T a b l e I .

B I O P H Y S I C A L JOURNAL VOLUME 5 3 1 9 8 8

t c T i m e , s x I O - 5

3 1 6


7/8

V a r i o u s e x p e r i m e n t s w i t h o l i g o me r s o f a f - f i b r i n( 2 0 , 2 6 , 2 7 ) or a - f i b r i n ( 2 8 ) h a v e b e en i n t e r p r e t e d i n t e r m so f an e q u i l i b r i u m c o n s t a n t f o r d i s s o c i a t i o n o f t w o m o no-mers i n w h i c h p a i r s o f b o t h Aa a n d B b j u n c t i o n s , or p a i r s o fAa j u n c t i o n s a l o n e , m a i n t a i n t h e c o n t a c t . H o w e v e r , t h ed i s s o c i a t i o n e q u i l i b r i u m l i e s s o f a r on t h e l e f t ( u n l e s sd i s r u p t i v e r e a g e n t s s u c h as GPRP ( 2 0 ) or h e x a n e d i o l ( 2 7 )are p r e s e n t ) t h a t i t s d e p e n d e n c e on t e m p e r a t u r e p r o b a b l yc a n n o t b e d e t e c t e d . W i t h B b j u n c t i o n s a l o n e , t h e b i n d i n g o ft w o monomers t o g e t h e r i s e v i d e n t l y m u c h w e a k e r .U n f o r t u n a t e l y t h e l a c k o f a t h e o r y r e l a t i n g t h e m a g n i -t u d e o f G t o t h e d e g r e e o f d i s s o c i a t i o n o f t h e A - f i b r i ns t r u c t u r e p r e v e n t s t h e use o f F i g . 3 t o c a l c u l a t e an e q u i l i b -r i u m c o n s t a n t a n d an e n t h a l p y o f d i s s o c i a t i o n . H o w e v e r , i tmay b e n o t e d t h a t a s m a l l i n c r e a s e , w i t h i n c r e a s i n gt e m p e r a t u r e , o f t h e p r o p o r t i o n o f d i s s o c i a t e d Bb j u n c t i o np a i r s c an cause a l a r g e c h a n g e i n G , b e c a u s e a s i n g l e b r e a ki n a c l o t n e t w o r k s t r a n d c an remove t h e c o n t r i b u t i o n o f t h ee n t i r e s t r a n d t o t h e e l a s t i c m o d u l u s ( 2 0 ) . T h u s G may f a l lt o a very l o w v a l u e a t 3 4 . 5 0 w h e n o n l y a m o d e s t f r a c t i o n o fB b j u n c t i o n s are d i s s o c i a t e d . T h i s p r o b a b l y e x p l a i n s w h yt h e r a t e o f G b u i l d u p i n F i g . 2 i s so m u c h f a s t e r a f t e r at e m p e r a t u r e c h a n g e f r o m 3 4 . 5 t o 1 4 0 t h a n i n t h e o r i g i n a lp o l y m e r i z a t i o n a t 1 4 0 ; e x t e n s i v e o l i g o m e r i c c o m p l e x e s areu n d o u b t e d l y a l r e a d y p r e s e n t i n t h e f o r m e r c a s e .T h e p r o d u c t q J r e p r e s e n t s a w e i g h t - a v e r a g e v i s c o e l a s -t i c r e l a x a t i o n t i m e r e l a t e d t o w h a t e v e r s t r u c t u r a l r e a r -r a n g e m e n t s are o c c u r r i n g ( 6 a , 2 0 ) . I f t h e f l o w processu n d e r c o n s t a n t s t r e s s i s a t t r i b u t e d t o severance o f n e t w o r ks t r a n d s , q 7 J c an b e i d e n t i f i e d w i t h t h e average l i f e t i m e o fan i n t a c t s t r a n d ( 2 0 ) , i . e . , t h e average t i m e b e t w e e n b r e a k si n a s i n g l e s t r a n d , 1 . 3 h f o r a - f i b r i n a n d 2 . 4 h f o r d - f i b r i n .O n e may s p e c u l a t e a b o u t t h e r e l a t i o n o f t h i s t o t h e l i f e t i m eo f an a s s o c i a t i o n b e t w e e n two monomer u n i t s a n d h e n c et h e r a t e o f d i s s o c i a t i o n i n t h e f o r m u l a t i o n o f a d i s s o c i a t i o ne q u i l i b r i u m . I f t h e r a t e c o n s t a n t s f o r d i s s o c i a t i o n ares i m i l a r i n m a g n i t u d e f o r t h e s e t w o f i b r i n s , a n d t h e e q u i l i b -r i u m c o n s t a n t f o r d i s s o c i a t i o n i s m u c h l a r g e r f o r j - f i b r i n , i tf o l l o w s q u a l i t a t i v e l y t h a t t h e r a t e c o n s t a n t f o r a s s o c i a t i o ni s l o w e r f o r A - f i b r i n , i n q u a l i t a t i v e a g r e e m e n t w i t h t h ec o m p a r i s o n s i n F i g . 1 . O f c o u r s e , a / 3 - f i b r i n h a s a m u c hl o n g e r s t r a n d l i f e t i m e i n t h i s i n t e r p r e t a t i o n as w e l l asp r e s u m a b l y a m u c h s m a l l e r d i s s o c i a t i o n e q u i l i b r i u m con-s t a n t . T h i s s p e c u l a t i o n i g n o r e s many a s p e c t s , i n c l u d i n g t h en u m b e r o f d i s s o c i a b l e monomer c o n t a c t s i n a n e t w o r ks t r a n d a n d t h e n u m b e r o f p r o t o f i b r i l s i n a s t r a n d b u n d l e .H o w e v e r , one f e a t u r e i s u n a m b i g u o u s , n a m e l y , i f t h e r e i s as t e a d y s t a t e o f d i s s o c i a t i o n a n d r e a s s o c i a t i o n o f s t r a n d s i nnew c o n f i g u r a t i o n s d u r i n g f l o w u n d e r c o n s t a n t s t r e s s , t h ea c t u a l r a t e s o f d i s s o c i a t i o n a n d r e a s s o c i a t i o n must b e t h esame b e c a u s e o f t h e e q u a l i t y o f J 1 , J J ' . , a n d J , f i n a li n T a b l e I.W e now t u r n t o t h e e f f e c t s o f t h e t e t r a p e p t i d e s GHRPa n d GPRP. B i n d i n g e x p e r i m e n t s b y L a u d a n o a n d D o o l i t t l e( 1 8 , 2 9 ) w i t h r a d i o a c t i v e p e p t i d e s , i n c l u d i n g u se o f , B - f i b r i nf r o m t h e a c t i o n o f t h r o m b i n on lamprey f i b r i n o g e n , show

.4

& 3W - , . . ZN o m i n a l T e t r a p e p t i d e C o n c e n t r a t i o n , mM

F I G U R E 9 L o g a r i t h m o f w e i g h t - a v e r a g e r e l a x a t i o n t i m e p l o t t e d a g a i n s tn o m i n a l c o n c e n t r a t i o n o f t e t r a p e p t i d e . P o i nt s h al f f i l l e d , - f i b r i n w i t hGHRP; c r o s s e d , , B - f i b r i n w i t h GPRP; d a s h e d c u r v e , a - f i b r i n w i t h GPRP( f r o m R e f e r e n c e 7 ) .

t h a t GPRP i s b o u n d n o n c o v a l e n t l y t o t h e a s i t e s a n d l e s ss t r o n g l y t o t h e b s i t e s ; GHRP i s b o u n d o n l y t o t h e bs i t e s a n d s o m e w h a t l e s s s t r o n g l y t o t h e s e s i t e s t h a n GPRP.W e p o s t u l a t e as b e f o r e ( 6 a ) t h a t t h e a s s o c i a t i o n s b e t w e e nf i b r i n mono mers are s t a b i l i z e d b y b o t h Aa a n d Bb j u n c -t i o n s a n d t h a t t e t r a p e p t i d e s c o m p e t e w i t h t h e A a n d B s i t e si n a c c o r d a n c e w i t h t h e s e r e l a t i v e b i n d i n g s t r e n g t h s .I n a - f i b r i n , t h e s t r o n g b i n d i n g o f G P R P t o t h e a s i t e sd i s p l a c e s A s i t e s a n d t h e r e are no Bb j u n c t i o n s , so G a n d qare s h a r p l y d e c r e a s e d a t very l o w G P R P c o n c e n t r a t i o n s . I na f - f i b r i n , h i g h e r GPRP c o n c e n t r a t i o n s are n e e d e d f o r t h esame e f f e c t b e c a u s e t h e Bb j u n c t i o n s must a l s o b e d i s s o -c i a t e d a n d t h e b i n d i n g o f GPRP t o t h e b s i t e s i s w e a k e r .I n , 8 - f i b r i n , t h e B b j u n c t i o n s are d i s s o c i a t e d b y e i t h e rt e t r a p e p t i d e , b u t s o m e w h a t more e f f e c t i v e l y b y G P R Pb e c a u s e i t b i n d s m ore s t r o n g l y t h a n GHRP t o t h e b s i t e s .I n a f 3 - f i b r i n , G HRP h a s o n l y a s m a l l e f f e c t ( 1 9 , 2 0 ) a n d ac o m b i n a t i o n o f t h e two t e t r a p e p t i d e s i s more e f f e c t i v e t h a ne i t h e r ( 1 9 ) . T h u s , q u a l i t a t i v e l y , a l l t h e o b s e r v e d r e s u l t s c anb e e x p l a i n e d i n t e r m s o f e q u i l i b r i u m d i s p l a c e m e n t s .When t h e e f f e c t s o f t h e t e t r a p e p t i d e s on q J are e x a m -i n e d , t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n a - f i b r i n a n d , B - f i b r i n i se m p h a s i z e d , as seen i n F i g . 9 . W i t h t h e i n t e r p r e t a t i o n o ft h i s p r o d u c t as t h e average l i f e t i m e o f a n e t w o r k s t r a n d , i tappears t h a t G P R P g r e a t l y i n c r e a s e s t h e r a t e o f d i s s o c i a -t i o n o f monomer c o n t a c t s w i t h i n a - f i b r i n p r o t o f i b r i l s b u tb o t h t e t r a p e p t i d e s , i n t h e same c o n c e n t r a t i o n r a n g e , a f f e c tt h e r a t e o f d i s s o c i a t i o n i n , B - f i b r i n o n l y s l i g h t l y . T h e i ra c t i o n on , 8 - f i b r i n i s p r i n c i p a l l y t o d e c r e a s e t h e e q u i l i b r i u mn u m b e r o f s t r a n d s c o n t r i b u t i n g t o t h e e l a s t i c i t y , r a t h e rt h a n t h e k i n e t i c s o f t h e i r r e a r r a n g e m e n t .F i n a l l y , t h e e s s e n t i a l l y p e r f e c t e l a s t i c b e h a v i o r o f l i g a t e dc l o t s b o th w i t h a n d w i t h o u t G HRP s h o w s t h a t -y-yl i g a t i o n ( e v e n w i t h o u t a ai g a t i o n ) c o m p l e t e l y e l i m i n a t e st h e s t r u c t u r a l r e a r r a n g e m e n t s t h a t are r e s p o n s i b l e f o rcreep a n d f l o w i n u n l i g a t e d c l o t s , a n d r e i n f o r c e s t h eh y p o t h e s i s t h a t t h e l a t t e r are d u e t o severance o f n e t w o r ks t r a n d s .We are much i n d e b t e d t o P r o f . R u s s e l l F . D o o l i t t l e f o r t h e g i f t o f t h et e t r a p e p t i d e s , t o P r o f . J o h n R . S ha in o f f f o r t h e c o p p e r h e a d venomenzyme, t o P r o f . L a s z l o L o r a n d f o r F a c t o r X I I I , t o D r s . B . B l o m b a c k a n dR . P r o c y k f o r f i b r i n o g e n , t o P r o f . M. T . R e c o r d , J r . , f o r t h e use o f

S H I M I Z U AND FERRY M e c h a n i c a l P r o p e r t i e s o f , 8 - F i b r i n C l o t s

p \ a - F i b r i n

o c a - F i b r n na - 0

3 1 7


8/8

e q u i p m e n t , a n d t o P r o f s . J . S h a i n o f f a n d M . M o s e s s o n f o r v a l u a b l ec o m m e n t s .T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d i n p a r t b y g r a n t GM 2 1 6 5 2 f r o m t h e N a t i o n a lI n s t i t u t e s o f H e a l t h .R e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n 1 2 A u g u s t 1 9 8 7 a n d i n f i n a l f o r m 5 N o v e m b e r1 9 8 7 .

REFERENCES1 . D o o l i t t l e , R . F . 1 9 8 4 . F i b r i n o g e n a n d f i b r i n . A n n u . R e v . B i o c h e m .

5 3 : 1 9 5 - 2 2 9 .2 . O l e x a , S . A . , a n d A . Z . B u d z y n s k i . 1 9 8 0 . E v i d e n c e f o r f o u r d i f f e r e n tp o l y m e r i z a t i o n s i t e s i n v o l v e d i n h u m a n f i b r i n f o r m a t i o n . P r o c .N a t l . A c a d . S c i . U S A . 7 7 : 1 3 7 4 - 1 3 7 8 .3 . B l o m b a c k , G . , B . H e s s e l , D . H o g g , a n d L . T h e r k i l d s e n . 1 9 7 8 . At w o - s t e p f i b r i n o g e n - f i b r i n t r a n s i t i o n i n b l o o d c o a g u l a t i o n . N a t u r e( L o n d . ) . 2 7 5 : 5 0 1 - 5 0 5 .4 . B u d z y n s k i , A . Z . , S . A . O l e x a , a n d B . V . P a n d y a . 1 9 8 3 . F i b r i np o l y m e r i z a t i o n s i t e s i n f i b r i n o g e n a n d f i b r i n f r a g m e n t s . A n n . N . Y .A c a d . S c i . 4 0 8 : 3 0 1 - 3 1 4 .5 . S h a i n o f f , J . R . , a n d B . N . D a r d i k . 1 9 8 3 . F i b r i n o p e p t i d e B i n f i b r i na s s e m b l y a n d m e t a b o l i s m : p h y s i o l o g i c s i g n i f i c a n c e i n d e l a y e dr e l e a s e o f t h e p e p t i d e . A nn . N . Y. A c a d . S c i . 4 0 8 : 2 5 4 - 2 6 8 .6 . W e i s e l , J . W. 1 9 8 6 . F i b r i n a s s e m b l y . L a t e r a l a g g r e g a t i o n a n d t h er o l e o f t h e t w o p a i r s o f f i b r i n o p e p t i d e s . B i o p h y s . J . 5 0 : 1 0 7 9 - 1 0 9 3 .

6 a . S h i m i z u , A . , G . F . S c h i n d l a u e r , a n d J . D . F e r r y . 1 9 8 8 . I n t e r a c t i o n o ft h e f i b r i n o g e n - b i n d i n g t e t r a p e p t i d e G l y - P r o - A r g - P r o w i t h f i n ec l o t s a n d o l i g o m e r s o f a - f i b r i n ; c o m p a r i s o n s w i t h a f l - f i b r i n . B i o -p o l y m e r s . I n p r e s s .7 . S t o c k e r , K . , H . F i s c h e r , a n d J . M e i e r . 1 9 8 2 . T h r o m b i n - l i k e s n a k ev e n o m p r o t e i n a s e s . T o x i c o n . 2 0 : 2 6 5 - 2 7 3 .8 . H e r z i g , R . H . , 0 . D . R a t n o f f , a n d J . R . S h a i n o f f . 1 9 7 0 . S t u d i e s o n ap r o c o a g u l a n t f r a c t i o n o f s o u t h e r n c o p p e r h e a d s n ak e v e n o m : t h ep r e f e r e n t i a l r e l e a s e o f f i b r i n o p e p t i d e B . J . L a b . C l i n . M e d . 7 6 : 4 5 1 -4 6 5 .9 . B a l e , M . D . , M. F . M u l l e r , a n d J . D . F e r r y . 1 9 8 5 . R h e o l o g i c a l s t u d i e so f c r e e p a n d c r e e p r e c o v e r y o f u n l i g a t e d f i b r i n c l o t s : c o m p a r i s o n o fc l o t s f o r m e d w i t h t h r o m b i n a n d a n c r o d . B i o p o l y m e r s . 2 4 : 4 6 1 -4 8 2 .1 0 . S h a i n o f f , J . R . , a n d B . N . D a r d i k . 1 9 7 9 . F i b r i n o p e p t i d e B a n da g g r e g a t i o n o f f i b r i n o g e n . S c i e n c e ( W a s h . D C ) . 2 0 4 : 2 0 0 - 2 0 4 .1 1 . D a r d i k , B . N . , a n d J . R . S h a i n o f f . 1 9 7 9 . C r o s s l i n k i n g o f m o n o m e r i cf i b r i n b y f a c t o r X I I I a . T h r o m b o s . H a e m o s t a s i s . 4 2 : 8 6 4 - 8 7 2 .1 2 . M o s e s s o n , M . W . , J . P . D i O r i o , M . F . M u l l e r , J . R . S h a i n o f f , K . R .S i e b e n l i s t , D . L . A m r a n i , G . A . H o m a n d b e r g , J . S o r i a , C . S o r i a ,a n d M. S a m a m a . 1 9 8 7 . S t u d i e s o f t h e u l t r a s t r u c t u r e o f f i b r i nl a c k i n g f i b r i n o p e p t i d e B ( d - f i b r i n ) . B l o o d . 6 9 : 1 0 7 3 - 1 0 8 1 .1 3 . F u r l a n , M . , T . S e e l i c h , a n d E . A . B e c k . 1 9 7 6 . C l o t t a b i l i t y a n dc r o s s l i n k i n g r e a c t i v i t y o f f i b r i n ( o g e n ) f o l l o w i n g d i f f e r e n t i a l r e l e a s e

o f f i b r i n o p e p t i d e s A a n d B . T h r o m b o s . H ae mo s t as i s . 3 6 : 5 8 2 -5 9 2 .1 4 . F u r l a n , M . , C . R u p p , E . A . B e c k , a n d L . S v e n d s e n . 1 9 8 2 . E f f e c t o fc a l c i u m a n d s y n t h e t i c p e p t i d e s o n f i b r i n p o l y m e r i z a t i o n . T h r o m -b o s . H a e m o s t a s i s . 4 7 : 1 1 8 - 1 2 1 .1 5 . L a u d a n o , A . P . , a n d R . F . D o o l i t t l e . 1 9 7 8 . S y n t h e t i c p e p t i d e d e r i v a -t i v e s t h a t b i n d t o f i b r i n o g e n a n d p r e v e n t t h e p o l y m e r i z a t i o n o ff i b r i n m o n o m e r s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A . 7 5 : 3 0 8 5 - 3 0 8 9 .1 6 . L a u d a n o , A . P . , a n d R . F . D o o l i t t l e . 1 9 8 0 . S t u d i e s o n s y n t h e t i cp e p t i d e s t h a t b i n d t o f i b r i n o g e n a n d p r e v e n t f i b r i n p o l y m e r i z a t i o n .S t r u c t u r a l r e q u i r e m e n t s , n u m b e r o f b i n d i n g s i t e s , a n d s p e c i e sd i f f e r e n c e s . B i o c h e m i s t r y . 1 9 : 1 0 1 3 - 1 0 1 9 .1 7 . N e l b , G . W . , C . G e r t h , J . D . F e r r y , a n d L . L o r a n d . 1 9 7 6 . R h e o l o g y o ff i b r i n c l o t s . I I I . S h e a r c r e e p a n d c r e e p r e c o v e r y o f f i n e l i g a t e d a n dc o a r s e u n l i g a t e d c l o t s . B i o p h y s . C h e m . 5 : 3 7 7 - 3 8 7 .1 8 . Ne l b , G . W . , G . W. K a m y k o w s k i , a n d J . D . F e r r y . 1 9 8 1 . R h e o l o g y o ff i b r i n c l o t s . V . S h e a r m o d u l u s , c r e e p , a n d c r e e p r e c o v e r y o f f i n eu n l i g a t e d c l o t s . B i o p h y s . C h e m . 1 3 : 1 5 - 2 3 .1 9 . B a l e , M . D . , M . F . M u l l e r , a n d J . D . F e r r y . 1 9 8 5 . E f f e c t s o ff i b r i n o g e n - b i n d i n g t e t r a p e p t i d e s o n m ec h an i ca l p r o p e r t i e s o f f i n ef i b r i n c l o t s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A . 8 2 : 1 4 1 0 - 1 4 1 3 .2 0 . S c h i n d l a u e r , G . , M . D . B a l e , a n d J . D . F e r r y . 1 9 8 6 . I n t e r a c t i o n o ff i b r i n o g e n - b i n d i n g t e t r a p e p t i d e s w i t h f i b r i n o l i g o m e r s a n d f i n ef i b r i n c l o t s . B i o p o l y m e r s . 2 5 : 1 3 1 5 - 1 3 3 6 .2 1 . N e l b , G . W . , G . W. K a m y k o w s k i , a n d J . D . F e r r y . 1 9 8 0 . K i n e t i c s o fl i g a t i o n o f f i b r i n o l i g o m e r s . J . B i o l . C h e m . 2 5 5 : 6 3 9 8 - 6 4 0 2 .

2 2 . M c K e e , P . , P . M a t l o c k , a n d R . L . H i l l . 1 9 7 0 . S u b u n i t s t r u c t u r e o fh u m a n f i b r i n o g e n , s o l u b l e f i b r i n , a n d c r o s s - l i n k e d i n s o l u b l e f i b r i n .P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A . 6 6 : 7 3 8 - 7 4 4 .2 3 . P l a z e k , D . J . , M . N . V r a n c k e n , a n d J . W. B e r g e . 1 9 5 8 . A t o r s i o np e n d u l u m f o r d y n a m i c a n d c r e e p m e a s u r e m e n t s o f s o f t v i s c o e l a s t i cm a t e r i a l s . T r a n s . S o c . R h e o l . 2 : 3 9 - 5 1 .2 4 . B a l e , M. D . , P . A . J a n m e y , a n d J . D . F e r r y . 1 9 8 2 . K i n e t i c s o ff o r m a t i o n o f f i b r i n o l i g o m e r s . I I . S i z e d i s t r i b u t i o n s o f l i g a t e do l i g o m e r s . B i o p o l y m e r s . 2 1 : 2 2 6 5 - 2 2 7 7 .2 5 . F e r r y , J . D . , M . M i l l e r , a n d S . S h u l m a n . 1 9 5 1 . T h e c o n v e r s i o n o ff i b r i n o g e n t o f i b r i n . V I I . R i g i d i t y a n d s t r e s s r e l a x a t i o n o f f i b r i nc l o t s ; e f f e c t o f c a l c i u m . A r c h B i o c h e m . B i o p h y s . 3 4 : 4 2 4 - 4 3 6 .2 6 . S c h e r a g a , H . A . , a n d M. L a s k o w s k i , J r . 1 9 5 7 . T h e f i b r i n o g e n - f i b r i nc o n v e r s i o n . A d v . P r o t e i n C h e m . 1 2 : 1 - 1 3 1 .2 7 . F e r r y , J . D . , S . S h u l m a n , K . G u t f r e u n d , a n d S . K a t z 1 9 5 2 . T h ec o n v e r s i o n o f f i b r i n o g e n t o f i b r i n . X I . L i g h t s c a t t e r i n g s t u d i e s o nc l o t t i n g s y s t e m s i n h i b i t e d b y h e x a m et h y l en e g l y c o l . J . A m e r .C h e m . S o c . 7 4 : 5 7 0 9 - 5 7 1 5 .2 8 . L e w i s , S . D . , P . P . S h i e l d s , a n d J . A . S h a f e r . 1 9 8 5 . C h a r a c t e r i z a t i o no f t h e k i n e t i c p a t h w a y f o r l i b e r a t i o n o f f i b r i n o p e p t i d e s d u r i n ga s s e m b l y o f f i b r i n . J . B i o l . C h e m . 2 6 0 : 1 0 1 9 2 - 1 0 1 9 9 .2 9 . L a u d a n o , A . P . , B . A . C o t t r e l l , a n d R . F . D o o l i t t l e . 1 9 8 3 . S y n t h e t i cp e p t i d e s m o d e l e d o n f i b r i n p o l y m e r i z a t i o n s i t e s . A n n . N . Y . A c a d .S c i . 4 0 8 : 3 1 5 - 3 2 9 .

3 1 8 B I O P H Y S I C A L JOURNAL VOLUME 5 3 1 9 8 8

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