Virusi

1892. Ivanovski, filtrabilni uzročnik mozaične bolesti duvana 1898. Bejerink, potvrdio eksperimente Ivanovskog 1898. Lefler i Froš, filtrabilni uzročnik slinavke i šapa 1909. Landštajner i Poper, filtrabilni uzročnik dečije paralize Nazvani terminom „virusi“ – živi otrov 1915. Tvort i 1917. Derel, otkriće bakteriofaga – virusa koji napadaju

bakterije

Otkriće virusa (kraj XIX veka)Postoje ’agensi’ koji dovode do različitih oboljenja, a koji prolaze kroz bakteriološke filtre (filtrabilni su) manjih su dimenzija od ćelije bakterija

Dugo priroda ovih agenasa nije bila poznata, ali se znalo da postoje, da su manjih dimenzija od bakterija i da dovode do različitih oboljenja. Vizuelizovani sa otkrićem elektronskog mikroskopa.

Opšte osobine virusa

Van ćelije su metabolički inertni (neaktivni)

Obligatni intracelularni paraziti (obavezno parazitiraju u ćeliji) - u ćeliji koriste metabolički aparat (enzime, ribozome) i energiju domaćina za sopstvenu reprodukciju

Ubrajaju se u žive organizme jer poseduju genetičku informaciju za sopstvenu reprodukciju

1 čestica virusa u jednom ciklusu razmnožavanja može dati preko hiljadu novih virusnih čestica

Najmanji i najjednostavniji mikroorganizmi

Nemaju ćelijsku građu – acelularni su

Virusna čestica – virion Virion je na granici veličine

makromolekula (20-300 nm)

Građa viriona Nukleinska kiselina (DNK ili

RNK) Kapsid, proteinske prirode,

izgrađen iz strukturnih jedinica – kapsomera

Nukleinska kiselina i kapsid grade nukleokapsid

Kod nekih virusa postoji dodatni omotač poreklom od citoplazmatične membrane prethodnog domaćina i specifičnih virusnih proteina uronjenih u membranu

U nukleokapsid mogu biti upakovani enzimi neophodni za inicijalne faze infekcije; sintetišu se i pakuju u ćeliji prethodnom domaćinu (nikada nemaju kompletan enzimski sistem potreban za umnožavanje virusa, uvek koriste i domaćinove enzime i strukture)

Podela virusa

Prema domaćinu na kome parazitiraju: Virusi Bacteria (bakteriofagi) Virusi Archaea Virusi Eukarya (animalni, biljni i virusi gljiva)

Prema morfologiji virusne čestice...

Prema arhitekturi genoma (tipu nukleinske kiseline)...

Prema strategijama reprodukcije koje koriste tokom infekcije...

Nukleinske kiseline virusa DNK ili RNK jednolančana ili dvolančana, cirkularna ili linearna, neki RNK

genomi su segmentirani

Proteinski omotač – kapsid Izgrađen od kapsomera Kubna, spiralna ili kompleksna simetrija

◦Kompleksna tipična za bakteriofage◦Spiralna tipična za biljne viruse◦Animalni virusi imaju veliku varijabilnost

u obliku kapsida (ikosaedarna ili spiralna simetrija, nikada nije kompleksna)

Kubna simetrija

Adenovirus(dsDNK)

Ikosaedarnasimetrijapapova virus (dsDNK)polio virus(+ssRNK)

Spiralna simetrija - TMV virus

Kompleksna simetrijaBakteriofag T4 Bakteriofag λ

Bakteriofag Mu

Virusi sa omotačem Najčešće animalni virusi,

kubne ili spiralne simetrije Na površini se uočavaju

’šiljci’, izgrađeni iz virusnih glikoproteinaKod influenca virusa to su:◦ hemaglutinin, koji se vezuje

za ćelijske receptore (prepoznavanje domaćina)

◦ neuraminidaza, enzim koji olakšava oslobađanje iz ćelije (napuštanje domaćina)

Influenca virus

Klasifikacija virusa• Prema domaćinu:

virusi Bacteria, Archaea i Eukarya (animalni, biljni, gljiva)

• Prema nukleinskim kiselinama:

• Prema načinu replikacije

Klasifikacija u taksonomske kategorije najpre je počela da se koristi kod animalnih virusa, najčešće do nivoa familija; familija dobija ime sa nastavkom viridae, rod ima nastavak virus, a vrsta dobija naziv prema bolesti koju izaziva.

Replikacija virusa i klasifikacija po Baltimoru

‘+’ lanac RNK služi kao iRNK‘-‘ lanac RNK je matrica za sintezu iRNK (komplementaran je iRNK)‘+’ lanac DNK je istog smisla kao i iRNK, tj. služi kao matrica za sintezu ’-’ lanca (dvolančana replikativna forma), a onda ’-’ lanac DNK služi kao matrica za sintezu iRNK

Uloga u početnim fazama infekcije DNK polimeraza ili RNK polimeraza Reverzna transkriptaza (retrovirusi) Lizozim (bakteriofagi)

Sintetišu se u prethodnom domaćinu i pakuju u kapsid

Enzimi u virionu

Metode studiranja virusa Elektronska mikroskopija (moć razdvajanja 0,4-1 nm) –

determinacija morfologije virusnih čestica (veličina 20-300 nm)

Imunološke metode – reakcije antigen-antitelo korisne za identifikaciju virusa u ćelijama i tkivima i za određivanje srodnosti i klasifikaciju virusa

Izolacija nukleinskih kiselina i proteina – biohemijske metode izučavanja

Izučavanje interakcije virusa i ćelije domaćina – gajenje virusa na bakterijama domaćinima

Određivanje broja virusa

Životni ciklus virusa(litički ciklus – reproduktivni ciklus)

Adsorpcija Penetracija Replikacija◦ sinteza nukleinske kiseline◦ sinteza proteina kapida

Sazrevanje (maturacija) Oslobađanje iz ćelije

Adsorpcija i penetracija virusa Adsorpcija na specifične

receptore Kod bakteriofaga ulazi

nukleinska kiselina Animalni i biljni virusi ulaze sa

kapsidom (translokacijom, endocitozom, fuzijom membrane sa dodatnim omotačem virusa, posredstvom insekata) i nukleinska kiselina se oslobađa u ćeliji

Sazrevanje i oslobađanje iz ćelije Pakovanje nukleinske

kiseline u kapsid Sklapanje kapsida “self

assembly” proces, ponekad učestvuju šaperoni

Oslobađanje lizom ćelije Prolaskom kroz

citoplazmatičnu membranu bez lize

Pupljenjem (virusi sa omotačem)

“Kriva rasta” virusa (jednog ciklusa razvića virusa u ćeliji)

Nakon ulaska virusa u ćeliju ona je lizirana nakon različitih vremenskih perioda. Ispitivano je da li ima infektivnih čestica koje mogu dovesti do pojave plaka na bakterijskom tepihu

Posle adrsorpcije neko vreme nema zrelih (infektivnih) virusnih čestica – period eklipse.

Period eklipse traje do pojave prvih zrelih virusa u ćeliji

Eklipsa i sazrevanje čine latentni period

Latentni period traje do oslobađanja prvih virusa iz ćelije

Životni ciklus bakteriofaga

Bakteriofagi

T2, T4 λ (lambda) φX174 M13, fd MS2 φ6

Virulentni virusi

Sa domaćinom isključivo ulaze u litički ciklus

Rezultat razmnožavanja po pravilu je liza ćelije i oslobađanje velikog broja fagnih partikula

Na bakterijskom tepihu daju svetle plake

Umereni virusi Sa domaćinom ulaze u litički ili lizogeni

ciklus Rezultat litičkog ciklusa je liza ćelije i

oslobađanje velikog br. fagnih partikula Rezultat lizogenog ciklusa je lizogena

bakterija u kojoj je virus u stanju profaga; lizogena bakterija se umnožava i svaka ćerka ćelija u sebi nosi profag (1 kopiju virusne DNK)

Profag je integrisan u hromozom domaćina (λ fag) ili je ekstrahromozomalna DNK (P1 fag)

Na bakterijskom tepihu daju mutne plake Lizogena indukcija – prelazak iz lizogenog u

litički ciklus Lizogena konverzija – domaćin stiče nova

svojstva kodirana genima profaga (pr. Corynebacterium diphteriae)

T4 bakteriofag

Genom dvolančana linearna DNK sa terminalnim ponavljanjem (geni na krajevima DNK su prisutni u dve kopije, po jedna se nalazi na svakom kraju), kodira 250 proteina, kapsid je kompleksan, izgrađen iz 25 proteina

Kompleksne simetrije: glava izduženi ikosaedar, kontraktilan repić sa dugim kukicama

Virulentni virus: sa domaćinom stupa u litički ciklus, lizira ćeliju i oslobađa se oko 100 virusnih čestica

Životni ciklus T4 bakteriofaga Rani proteini (preko 20): nukleaze (isecaju DNK domaćina), DNK polimeraza,

enzim za sintezu 5-hidroksimetilcitozina, enzim za kovalentnu modifikaciju RNK polimeraze domaćina tako da transkribuje virusne gene (rane gene prepoznaje σ70 faktor domaćina)

Srednji proteini: novi σ faktori koji omogućavaju RNK polimerazi da prepozna kasne gene

Kasni proteini: proteini kapsida i lizozim

Replikacija i pakovanje nukleinske kiseline Replikacija genoma u linearnoj

formi Formiranje konkatemera

rekombinacijom (džinovski molekuli DNK)

Pakovanje u glavu dok se ne napuni – headhful mehanizam (staje više od veličine genoma)

Terminalno ponavljanje (pojedini geni su duplirani i nalaze se na oba kraja genoma) i cirkularna permutacija (koji će geni biti ponovljeni zavisi od mesta zasecanja, na različitim fragmentima to su različiti geni)

λ fag Umereni virus, sa domaćinom može ući u lizogeni ili litički

ciklus Kompleksan kapsid: glava i nekontraktilni rep bez kukica Genom linearna dvolančana DNK sa jednolančanim

komlementarnim krajevima (12 nukleotida, cos mesta = ‘cohesive sites’), u ćeliji se cirkularizuje

Životni ciklus λ fagaLitički ciklus:

• Faza replikacije virusa• Faza maturacije virusa• Liza ćelije i oslobađanje novih viriona

Lizogeni ciklus:• Virusna DNK je profag integrisan u hromozom domaćina• Ćelija je lizogena, imuna na ponovnu infekciju istim tipom virusa• Ekspresija virusnog represora CI sprečava ekspresiju drugih gena i ulazak u litički ciklus

Lizogena indukcija – prelazak iz lizogenog u litički ciklus

Regulacija ulaska u litički/lizogeni ciklus U početku se sintetišu rani proteini uključeni i u

litički i u lizogeni ciklus

Ključna uloga dva represora Cro – represor, kada ga ima dovoljno fag ulazi u

litički ciklus CI – represor λ faga, ključan za održavanje

virusa u lizogenom ciklusu

Litički ciklus λ bakteriofaga

Replikacija DNK virusa

Najpre θ replikacija, kasnije rolling circle

pakovanje isecanjem cos mesta

Lizogeni ciklus λ bakteriofaga Za lizogeni ciklus neophodni proteini Int (integraza, omogućava

ugradnju profaga u hromozom domaćina), CII i CIII, CI. Potrebno da se sintetiše λ represor (CI) i zaustavi transkripciju

svih gena osim sopstvenog

CI represor λ fagaStabilno vezan za operatorska mesta virusnih gena

↓1. Onemogućena je sinteza proteina neophodnih za litički ciklus

- virus ulazi u lizogeni ciklus.2. Ukoliko dođe do ponovne infekcije istorodnim tipom faga,

represor se odmah vezuje za operatorska mesta njegovih gena i sprečava njihovu ekspresiju, a to znači imunost na ponovnu infekciju istim tipom faga.

Kada se CI represor sintetiše i veže za operatorska mesta, zaustavlja se ekspresija ranih gena

Pomoću Int proteina (mesto specifična nukleaza/integraza) genom λ se integriše u hromozom, mehanizam integracije – rekombinacija specifična za mesto

Zašto ulazak u litički/lizogeni ciklus zavisi odenergetskog stanja u ćeliji? Protein CII je rani protein, neophodan je za sintezu represora

CI i ulazak u lizogeni ciklus. Njegova stabilnost zavisi od količine ćelijskih proteza koje

omogućavaju njegovu razgradnju.

Energetsko stanje u ćeliji dobro,

intenzivan metabolizam↓

Ima dovoljno proteaza, nema CII,

nema ni CI represora↓

Litički ciklus

Energetsko stanje u ćeliji loše,metabolizam usporen

↓Nema dovoljno proteaza, CII je

stabilan,CI represor se sintetiše

↓Lizogeni ciklus

Lizogena indukcija

Izvlačenje profaga iz hromozoma domaćina i prelazak u litički ciklus, omogućen je razgradnjom λ represora.

Za izvlačenje profaga neophodan je produkt xis gena – ekscizionaza)

Spontan proces se retko dešava, ali je moguće indukovati ga agensima koji oštećuju DNK (UV, X, γ zračenje, hemijski mutageni).

U slučaju oštećenja DNK dolazi do indukcije specifičnog ’SOS’ odgovora u ćeliji, što vodi razgradnji CI represora λ faga.

Skidanje CI represora ima za posledicu otključavanje litičkih gena faga, tj. prelazak u litički ciklus.

φX174 bakteriofag

cirkularna ’+’ ss-DNK, ~ 5400 nt geni koji se preklapaju

(‘overlapping genes’), fenomen da sa istog nukleotidnog zapisa započinje transkripcija različitih gena (sa različitih mesta i iz različitih okvira čitanja)

kodirano 11 proteina ikosaedarni kapsid, 60 kapsomera

(25 nm veličine)

Životni ciklus φX174 bakteriofaga

Replikacija zavisna od enzima domaćina

Replikativna ds forma, teta replikacija

Transkripcija minus lanca daje policistronske iRNK

Formiranje genoma - replikacija po tipu kotrljajućeg obruča

Pakovanje i oslobađanje lizom ćelije

Replikacija φX174 bakteriofaga

Filamentozni M13 bakteriofag

Cirkularna ’+’ ss-DNK Filamentozni fagi Adsorbuju se na seks pilus (F+

ćelije E. coli su domaćini) Pakovanje u kapsid pri izlasku

iz ćelije (pupljenjem, ne ubija ćeliju domaćina)

Nema lize ćelija – nema plaka, već prosvetljenja na tepihu bakterija

RNK bakteriofagi

Ikosaedarni kapsid (25 nm) ’+’ ss RNK genom od

3569 nt (RNK se koristi kao iRNK)

Geni koji se preklapaju kodiraju 4 proteina: RNK replikazu (deo), protein kapsida, maturacioni protein i protein za lizu ćelije domaćina

Adsorbuje se na seks pilus F+ ćelije E.coli

Bakteriofag MS2

φ6 bakteriofag Segmentirani dvolančani

RNK genom Parazitira na Pseudomonas

syringae

Dva ili više virusa inficiraju jednu ćeliju Tokom mešovite infekcije mutantnim virusima iste vrste moguća je:◦ rekombinacija (nasledni materijal se rekombinuje, promena na

nivou genotipa)◦ komplementacija (kombinuju se proteini dobijeni iz različitih

mutanata, promena na nivou fenotipa; komplementacija – dopuna)

T4 fag raste na E. coli C i K12 linijama. Mutanti u lokusu rII ne rastu na E.coli K12.U mešovitoj infekciji različitim mutantima u rII lokusu dolazi do pojave plaka na E.coli K12.

Fagi iz pojedinačne plake prilikom sledeće infekcije:ne rastu na E.coli K12 – komplementacijarastu na E.coli K12 - rekombinacija

Mešovita infekcija

Bakterije sintetišu enzime - restrikcione endonukleaze Seku dvolančanu DNK virusa (stranu DNK) na specifičnim

sekvencama (ssDNK i RNK virusi nisu osetljivi) Bakterijska DNK je modifikovana (najčešće metilacija ili

glikozilacija) i nije osetljiva na sopstvene restrikcione enzime (restrikciono-modifikacioni sistem)

Bakterije poseduju specifične restrikciono-modifikacione sisteme (npr. E.coli linije K i B imaju, E. coli C nema restrikciono-modifikacioni sistem)

Virusi se brane od restrikcionih endonukleaza modifikacijom sopstvene DNK koja je istog tipa kao modifikacija DNK domaćina.

Npr. T4 fag: modifikacija citozina u 5-hidroksimetil citozin

Odbrana od virusne infekcije

Virusi Archaea

Virusi Archaea DNK virusi (dsDNK, linearna ili cirkularna,

nekoliko ssDNK) Svi poznati virusi arhea parazitiraju na

ekstremofilima Veliki broj različitih morfotipova (kod Archaea

opisano 16, kod Bacteria 9) Postoje vrste koje mogu ući u lizogeni ciklus –

otkriven je provirus u genomu arhee iz filuma Thaumarchaeota

Neobično: ATV virus (parazitira u Acidianus sp., phylum Crenarchaeota) menja morfološki oblik tek pošto napusti ćeliju domaćina; ćeliju napušta kao vretenasta forma bez repića, ex vivo razvija dva duga repa, sa svake strane po jedan)

ATV virus

Virusi Archaea

DNK virusi hipertermofilnih Archaea roda Sulfolobus

virus PAV1 hipertermofilne Archaea roda Pyrococcus, ima kratak rep

Virusi metanogena i halofila imaju sličnu morfologiju kao T4 fag i linearnu dsDNK

Virusi hipertermofilnih Archaea (Sulfolobus, Pyrococcus) imaju neobičnu morfologiju i linearnu ili cirkularnu dsDNK

Značaj virusa u evoluciji živog sveta- smatra se da je DNK molekul virusnog porekla; - prvobitne ćelije - RNK genom;- infekcije predačkih linija Archaea, Eukarya i Bacteria DNK virusima uvele DNK u ćeliju- DNK je kao stabilniji molekul preuzeo ulogu nosioca naslednog materijala – značaj

reverzne transkriptaze