VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA - … Generalidades Estructura Genomic… · VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA HEMOCENTRO BUENOS AIRES 18 de Agosto 2010 Lic. Inés Zapiola

VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA

HEMOCENTRO BUENOS AIRES

18 de Agosto 2010

Lic. Inés Zapiola

Unidad de Virología

Hospital “Francisco Javier Muñiz”

�GENERALIDADES: Estructura del virus, estructura del genoma, ciclo de replicación, subtipos.

HIVHIV

replicación, subtipos.

�DIAGNOSTICO SEROLOGICO: Marcadores tempranos.

�GENERALIDADES: Estructura del virus, estructura del genoma, ciclo de replicación, subtipos.

HIVHIV

replicación, subtipos.

�DIAGNOSTICO SEROLOGICO: Marcadores tempranos.

HIV - GeneralidadesHIV - Generalidades

� Familia: Retroviridae

� Subfamilia– Lentivirinae: Los lentivirus típicamente muestran un

curso crónico de la enfermedad, un periodo largo de latencia clínica, replicación viral persistente y latencia clínica, replicación viral persistente y compromiso del sistema nervios central (SIV, FIV, HIV)

� HIV-1 y HIV-2� Genoma: Dos cadenas idénticas de RNA de

polaridad + � Envuelto: posee una bicapa lipidica como

envoltura.

HIV - GeneralidadesHIV - Generalidades

�La partícula viral tiene un diámetro de 100 nm y esta envuelta por una membrana lipoproteica.

�Cada partícula contiene 72 complejos glicoproteicos integrados a la membrana

�Cada complejo esta formado por un trímero de la proteína gp120 externa y una proteína de transmembrana gp41.

� La proteína de matiz p17 estaanclada en la superficieinterna de la membranalipoproteica.

� El antígeno p24 es la proteínaque forma el core y quecontiene al genoma de HIV.

HIV – Estructura del virionHIV – Estructura del virion

contiene al genoma de HIV.

� El genoma consta de doscadenas identicas de RNAque tienen la polaridad delmensajero (polaridad +)

� El RNA de HIV es parte de uncomplejo acido nucleico-porteina: incluye a la proteinap7, la transcriptasa reversap66 la integrasa p32 y laproteasa p11.

� Genoma de HIV: dos cadenas idénticas de RNA de polaridad positiva.

� Flanqueado por dos secuencias terminales llamadas “Long terminal repeats” o LTR: no codificantes.

HIV GenomaHIV Genoma

� Genes: � gag (group antigen): codifica para las proteínas del core, matriz y

nucleoproteína� pol (polymerase): codifica para las enzimas TR, IN y PR � env (envoltura): codifica para la proteinas gp120 y gp41

5´LTR-gag-pol-env-LTR3´

� El genoma de HIV contiene además 6 genes accesorios: vif, vpu, vpr, tat, rev y nef.

� Las proteínas Nef, Tat y Rev se producen en las primeras etapas del ciclo de replicación

HIV GenomaHIV Genoma

HIV Genes, proteinas y funcionesHIV Genes, proteinas y funciones

HIV-1 Ciclo de ReplicaciónHIV-1 Ciclo de Replicación

1. Unión del virus a receptores celulares.

2. Fusión de la membrana del virus con la superficie de la célula.

3. Ingreso del core a la célula infectada.

4. Transcripción reversa 4. Transcripción reversa 5. Integración del DNA viral en el DNA

celular 6. Síntesis del RNA viral, del mRNA y

síntesis de proteínas virales. 7. Ensamblaje del RNA viral +

proteínas para formar la partícula viral inmadura

8. Liberación y procesamiento de las proteínas para formar una partícula madura e infectiva.

� CD4 es el receptor primario y necesario para la unión del HIV a la célula.

� CCR5 es un correceptor utilizado por virus HIV-1 monocitotropicos (M-tropicos)

HIV - Ciclo de replicación - receptoresHIV - Ciclo de replicación - receptores

HIV-1 monocitotropicos (M-tropicos)

� El receptor de quimioquinas CXCR4 se describió como correceptor utilizado por aislamientos con tropismo por células T (T-tropicos)

� Células blanco: Linfocitos T CD4+, Monocitos, Macrófagos, Cél de Langherans, Cél dendríticas

� Aislamientos T-tropicos infectan principalmente células T CD4+ activadas de sangre periférica y

HIV - Ciclo de replicación - receptoresHIV - Ciclo de replicación - receptores

células T CD4+ activadas de sangre periférica y utiliza CXCR4 para la entrada.

� Aislamientos M-tropicos son capaces de infectar células T CD4+, monocitos y macrófagos y dependen del uso de CCR5 y del CD4 para la entrada a la célula.

Transcripción inversa o retrotranscripción.

http://www.youtube.com/watch?v=1xkmmZnc-kM

� Extraordinaria variabilidad genética

– Alta tasa de replicación: 1010

viriones/día– Alta tasa de error: 1 mutación por

genoma copiado– Alta tasa de Recombinación

HIV Diversidad GeneticaHIV Diversidad Genetica

– Alta tasa de Recombinación

� Basados en estudios filogenéticos existen 3 grupos en HIV-1: – M (major) – O (outlier) (2% en Camerún)– N (new) (No M, no O, 2006 10

casos)

– P (1 caso pendiente de confirmación)

�> 90% de las infecciones por HIV esta causada por virus pertenecientes al grupo M

HIV – Grupo MHIV – Grupo M

• 9 Subtipos – 2 sub-subtipos

• Formas recombinantes circulantes (CRF)• Fromas recombinantes Unicas (URF)

A

B

C

D

“E”FG

HIV

Type 2

Group M

A2A1

F2F1CRF A/E

G

H

“I”

J

K

Type 1

Group M

Group O

Group N

A, G, H, K

A

E

B

D

F

gag

pol

vif

tat vpu

rev

tat nef

envLTR vpr LTR

rev

gag

pol

vif

tat vpu

rev

tat nef

envLTR vpr LTR

rev

gag

pol

vif

rev

envLTR vpr LTR

rev

C

gag

pol

vif

tat vpu

rev

tat nef

envLTR vpr LTR

rev

gag

pol

vif

tat vpu

rev

tat nef

envLTR vpr LTR

rev

gag

pol

vif

rev

envLTR vpr LTR

rev

CRF01_AE

CRF10_CD

CRF08_BC

CRF07_BC

CRF03_AB

CRF02_AG

Legend

HIV-1 Grupo M – CRFsHIV-1 Grupo M – CRFs

U

G

H

K

J

pol

tat vpu

rev

tat nef

rev

R

gag

pol

vif

tat vpu

rev

tat nef

envLTR vpr LT

rev

gag

pol

vif

tat vpu

rev

tat nef

envLTR vpr LTR

rev

gag

pol

vif

tat vpu

rev

tat nef

envLTR vpr LTR

rev

CRF01_AE

pol

tat vpu

rev

tat nef

rev

gag

pol

vif

tat vpu

rev

tat nef

envLTR vpr LTR

rev

CRF12_BF

CRF11_cpx

CRF10_CD

CRF06_cpx

CRF05_DF

CRF04_cpx

CRF03_AB

gag

pol

vif

tat vpu

rev

tat nef

envLTR vpr LTR

revCRF13_cpx

gag

pol

vif

tat vpu

rev

tat nef

envLTR vpr LTR

rev

gag

pol

vif

tat vpu

rev

tat nef

envLTR vpr LT R

revCRF14_BG

HIV – Distribución de subtiposHIV – Distribución de subtipos

HIV – America del SurHIV – America del Sur

Subtipos circulantes en Argentina: B, F, B/F, C y A.

El alto nivel de diversidad genética de HIV tiene implicancias importantes para el screening, el diagnóstico y el

HIV – Diversidad y ensayosHIV – Diversidad y ensayos

para el screening, el diagnóstico y el monitoreo de pacientes.

�GENERALIDADES: Estructura del virus, estructura del genoma, ciclo de replicación, genotipos.

HIVHIV

replicación, genotipos.

�DIAGNOSTICO SEROLOGICO: Marcadores tempranos

HIV-1HIV-1

Infección aguda Infección reciente

� Primoinfección: periodo comprendido entre la infección inicial y la seroconversión completa.

� La presencia de síntomas (síndrome retroviral agudo) ha sido reportada entre 10-90% (definición de caso,

HIV-1 Infección Aguda - GeneralidadesHIV-1 Infección Aguda - Generalidades

sido reportada entre 10-90% (definición de caso, metodología de estudio). PIH es una entidad poco reconocida.

� Período de ventana: aquel durante el cual los Ac. específicos no son evidentes a través de los ensayos virológicos.

� Alta replicacion viral precede a la producción de anticuerpos.

� Pico de viremia en sangre y fluidos genitales

� Alta transmisión de la infección debido a que los pacientes:

HIV-1 Infección Aguda - GeneralidadesHIV-1 Infección Aguda - Generalidades

� Alta transmisión de la infección debido a que los pacientes:

• Desconocen su status serológico para HIV • Son altamente infecciosos

� Oportunidad para trabajar en prevención

� El diagnóstico continúa siendo un desafio ya que hay que modificar el algoritmo estandar utilizado.

HIV-1 Perfil serológicoHIV-1 Perfil serológico

�Detección de anticuerpos�Detección de antígenos�Detección de virus (cultivo)

HIV-1 Diagnostico de infecciónHIV-1 Diagnostico de infección

�Detección de virus (cultivo)�Detección de genoma viral

� LEY NACIONAL DE SANGRE Nº 22.990 Y DECRETO REGLAMENTARIO Nº 375/89– Son obligatorias las siguientes pruebas para enfermedades

transmisibles: sifilis, brucelosis, Chagas, anticuerpos anti-HIV-1/2, anticuerpos anti-HCV y antÍgeno HBs para HBV.

HIV – Banco de sangreHIV – Banco de sangre

1/2, anticuerpos anti-HCV y antÍgeno HBs para HBV.

� NORMAS DE MEDICINA TRANSFUSIONAL (5ta ed., 1997) de la ASOCIACION ARGENTINA DE HEMOTERAPIA E INMUNOHEMATOLOGIA (AAHH)– Deben realizarse las determinaciones para anticuerpos anti-

HBc, anticuerpos anti-HTLV-I/II y antÍgeno p24 para HIV.

�Detección de anticuerpos�Detección de antígenos�Detección de virus (cultivo)

HIV-1 Diagnóstico de infecciónHIV-1 Diagnóstico de infección

�Detección de virus (cultivo)�Detección de genoma viral

� Técnicas de tamizaje

�ELISA�Aglutinación de Partículas

HIV-1 Detección de anticuerposHIV-1 Detección de anticuerpos

� Técnicas suplementarias o confirmatorias (Para confirmar diagnostico)

�Western Blot�Line Immune Assay� IFI

HIV-1 ENZIMOINMUNOENSAYOSHIV-1 ENZIMOINMUNOENSAYOS

Conjugado: Ag o Ac marcado con

una enzima

Sustrato

ENZIMOINMUNOENSAYOS: diseñoENZIMOINMUNOENSAYOS: diseño

Soporte solido

Fuente antigénica

Anticuerpos anti HIV en la muestra

del paciente

una enzima

� Primera generación: lisado viral, conjugado anti IgG.� 6-12 semanas� Anti HIV-1 IgG

1986

HIV-1 Detección de Ac - ELISAsHIV-1 Detección de Ac - ELISAs

� Segunda generación: Proteínas recombinantes y péptidos sintéticos, conjugado anti IgG marcado.� 6-12 semanas� Anti HIV-1/2 IgG

�Tercera generación: Proteínas recombinantes y péptidos sintéticos, elisa sandwich de antígeno.

� 4-6 semanas

HIV-1 Detección de Ac - ELISAsHIV-1 Detección de Ac - ELISAs

� 4-6 semanas� Anti HIV-1 (M y O), HIV-2 IgG, IgM, IgA.

�Cuarta generación: idem 3ra Generación + anti p24

� 2-4 semanas� Anti HIV-1 (M y O), HIV-2, HIV-O IgG, IgM e IgA y Agp24

2000

HRHR

PP

HRHR

PP

HRHR

PP

HRHR

PP

HRHR

PPHRHR

PP

HRHR

PP

HIV-1 ELISAs: 3ra y 4ta generaciónHIV-1 ELISAs: 3ra y 4ta generación

IgG IgIg

MMHRHR

PP

Ag p24

3ra generación

4ta generacion

ELISAs 1ra y 2da generaciónELISAs 3ra generaciónELISAs 4ta generación

•MANUALES: Microplaca

•AUTOMATIZADOS: Meia, ELFA, CMIA

HIV-1 ELISAs 4ta generaciónHIV-1 ELISAs 4ta generación

Ensayos combinados para la detección de Ag y Ac de HIV

� Fase sólida: Proteínas virales recombinantes y péptidos para HIV-1 (grupo M y O) y HIV-2 y anticuerpos anti p24 HIV-1.


� Diseño: ELISA sandwich

� Conjugado: Antígenos y Anticuerpos marcados.

� Detectan: Antígeno p24 y Anticuerpos de tipo IgG, IgM e IgA.

� Enzygnost HIV integral Dade Behring� Genscreen Ag/Ab HIV Ultra Bio Rad� Genscreen Plus HIV Bio Rad� Vidas HIV Duo Biomerieux


� Vidas HIV Duo Biomerieux� Vidas HIV Duo Ultra Quick Biomerieux� Vidas HIV Duo Ultra Biomerieux� Vironostika HIV Uniform II Ag-Ac Biomerieux� Murex HIV Ag-Ab Abbott� Axsym HIV Ag-Ab Abbott� ARCHITECT HIV Combo Abbott� HIV Combi Modular E170 Roche� Cobas Core HIV Combi EIA Roche

� 99 muestras Ac. HIV-1/2/Agp24 NEGATIVAS� 21 muestras Ac. HIV-1/2 POSITIVAS � 41 muestras de pacientes en

SEROCONVERSIÓN

Evaluación del ensayo de 4ta generación: Murex HIV AG/AB Combination (Abbott)Evaluación del ensayo de 4ta generación: Murex HIV AG/AB Combination (Abbott)

SEROCONVERSIÓN– 7 muestras Ac. HIV-1/2 Negativas/ Agp24 Positivas

– 2 muestras Ac. HIV-1/2 Borderline/Agp24 Positivas– 32 muestras Ac. HIV-1/2 Positivas

– 4 WB negativos (4 Agp24 positivas)– 28 WB indeterminados (3 Agp24 neg/22Agp24 pos y 3 agp24 no

realizados)

� Especificidad: Se evaluó especificidad sobre 99

muestras negativas para Ac.HIV-1/2 y Agp24

Ac. HIV-1/2Axsym

Ag p24 Coulter

MUREX HIV Ag-Ab

N TOTAL 99 99 99

Evaluación del ensayo de 4ta generación: Murex HIV AG/AB Combination (Abbott)Evaluación del ensayo de 4ta generación: Murex HIV AG/AB Combination (Abbott)

N TOTAL 99 99 99

INICIAL/ REACTIVOS: 0 0 2

REPETIDAMENTE REACTIVAS: ---- ----- 2

FALSOS POSITIVOS: ---- ----- 2

RP (RANGO): ---- ---- 3,87-1,66

ESPECIFICIDAD % 98,02

Elisa 3ra G. WBMUREX HIV

Ag-Ab

•Sensibilidad sobre muestras francamente reactivas

Evaluacion del ensayo de 4ta generacion: Murex HIV AG/AB Combination (Abbott)Evaluacion del ensayo de 4ta generacion: Murex HIV AG/AB Combination (Abbott)

N TOTAL evaluados 21 21 21

N POSITIVOS 21 21 21

SENSIBILIDAD % 100

Elisa 3ra GMUREX HIV

Ag-Ab

N TOTAL 41 41

Sensibilidad sobre muestras de pacientes en seroconversión

Evaluacion del ensayo de 4ta generacion: Murex HIV AG/AB Combination (Abbott)Evaluacion del ensayo de 4ta generacion: Murex HIV AG/AB Combination (Abbott)

INICIAL/ REACTIVOS: 32 41

RP (RANGO): 1,86-OF 3,15-OF

FALSOS NEGATIVOS: 7 0

BORDERLINE 2 0

SENSIBILIDAD EN SCV (analitica): 86% 100%

1. 219 muestras de suero frescas negativas para HIV previamente estudiadas por un ELISA de 4ta Generación (HIV-1/2 Combination Murex o Genscreen Plus Bio Rad)

2. 54 muestras de suero frescas positivas para HIV previamente estudiadas por un ELISA de 4ta generación (HIV-1/2 Combination Murex o Genscreen Plus Bio Rad) y confirmadas

Evaluacion del ensayo de 4ta generacion: Vironostika HIV Uni-Form II AG/AB (bioMerieux)Evaluacion del ensayo de 4ta generacion: Vironostika HIV Uni-Form II AG/AB (bioMerieux)

Combination Murex o Genscreen Plus Bio Rad) y confirmadas por Western Blot (New Lav blot Bio Rad)

3. 35 muestras de suero congeladas pertenecientes a pacientes en seroconversión:

• 10 WB negativo (9Ag p24 positivo, 1 NR)• 22 WB indeterminado (13 Ag p24 positivo, 7 Ag p24

negativo y 2 NR)• 3 WB NR

Especificidad: Se evaluó la especificidad sobre 219 muestras negativas

HIV 1/2Ag/Ab

Vironostika Uniform II ag/ab


N TOTAL 219 219

INICIAL/ REACTIVOS: 0 1 (Rp: 1.4)

REPETIDAMENTE REACTIVAS: ---- 0

FALSOS POSITIVOS: ---- 0

ESPECIFICIDAD % 100 100

� Sensibilidad: La Sensibilidad se evaluó sobre muestras francamente reactivas para anticuerpos

Vironostika Uniform II


ELISA 4taG WBVironostika Uniform II

ag/ab

N TOTAL 54 54 54

N POSITIVOS 54 54 54

SENSIBILIDAD % 100

Vironostika Uniform II ag/ab

•Sensibilidad en seroconvertidores


ag/ab

N TOTAL 35

INICIAL/ REACTIVOS: 35

RP (RANGO): 1.53->18

FALSOS NEGATIVOS: 0

SENSIBILIDAD EN SCV: 100%

Ensayo Sensibilidad Especificidad

Vidas Duo 100% 99.5%

Vidas Duo Ultra 100% 99.5%

Enzygnost HIV integral 100% 99.8%

ELISAs Comerciales de 4ta GeneraciónELISAs Comerciales de 4ta Generación

Enzygnost HIV integral 100% 99.8%

Vironostika Uniform II Ag/Ab

96.7% 99.9%

Murex HIV combination 100% 99.78%

Genscreen Plus 100% 100 %

Pte Mta # Dia ELISA 4ta . RP W B Ag p24 (RP) ELISA 3RA RP1 1 0 POS 18,87 IND NEG POS >18

1 0 POS 26,9 IND POS 4.06 POS 12,72 12 POS 18,46 IND POS 2.84 POS 11,33 22 POS 12,1 POS POS 2.28 POS 17,21 0 POS 23,05 IND POS 9.22 POS >182 5 POS 22,49 IND POS 3.84 POS >183 17 POS 24,48 IND POS 6.06 POS >184 23 POS 19,25 IND POS 16.77 POS >181 0 POS 22,95 IND NEG POS >18

2

3

4

HIV-1 ELISAs: 3ra vs 4ta generaciónHIV-1 ELISAs: 3ra vs 4ta generación

1 0 POS 22,95 IND NEG POS >182 90 NR NR POS NR POS >181 0 POS 18,4 NEG POS 14.5 NEG 2 3 POS 10,38 NEG POS 13.8 NEG 3 10 POS 22,09 NEG POS 11,7 POS 2,071 0 POS 6,19 NEG POS 13.09 NEG 2 8 POS OF NEG POS 6.88 POS 13,11 0 POS 25,7 IND POS 23.4 POS >182 9 POS 5,6 POS POS 4.38 NR1 0 POS 4,3 NEG POS 11,6 NEG 2 7 POS 23,6 IND POS 2,47 POS >183 20 POS 20,31 POS NEG POS 13,81 0 POS 20,78 IND POS NEG 2 8 POS 15 IND POS 16.34 NEG 3 22 POS 11,3 IND POS 10.85 NEG

6

7

8

9

4

5

NR: no realizado; RP: relación de positividad; IND: Indeterminado

� 1ros ensayos: límite de detección de Ag >60 pg Agp24/ml (French Society of Blood Transfusion).

� Estos ensayos inadecuados para reemplazar


� Estos ensayos inadecuados para reemplazar ensayos de Ag 24 con limite de detección de <20 pg Ag24/ml

� La especificidad de los ensyos de los primeros ensayos de 4ta G era mas baja que los de 3ra G

Especificidad de ensayos de tamizaje

Journal of Virological Methods 143 (2007) 86–94Could the new HIV combined p24 antigen and antibody assays replace p24 antigen specific assays?Thoai Duong Ly et al.

Evaluación de ensayos combinados

Limite de detección de los diferentes ensayos utilizando diferentes standards

Journal of Virological Methods 143 (2007) 86–94Could the new HIV combined p24 antigen and antibody assays replace p24 antigen specific assays?Thoai Duong Ly a, et al.

Journal of Virological Methods 143 (2007) 86–94Could the new HIV combined p24 antigen and antibody assays replace p24 antigen specific assays?Thoai Duong Ly a,∗, et al.

� Mejora significativa en la performance de los ensayos en relación a los fabricados antes de 2001

� Mejora en al especificidad: 99,8% vs 99,4% antes 2000

� Sensibilidad similar para detección de ac. Anti HIV de


� Sensibilidad similar para detección de ac. Anti HIV de diferentes subtipos

� No hay ensayo combinado capaz de detectar Ag p24 de todos los subtipos con una sensibilidad optima.

� La mejora en la sensibilidad para detectar infecciones recientes se basa en una mejor sensibilidad para detectar Ag p24 (<20 pg/ml SFTS Ag panel)

Evaluation and standards Laboratory, Centre for Infections, London

Evaluación de la sensibilidad en seroconversion utilizando 18 paneles

http://www.hpa-midas.org.uk/reports/documents/NBSR07003-Architect-HIV.pdf

Evaluation and standards Laboratory, Centre for Infections, London

HIV ELISAs - Detección en seroconversion

http://www.hpa-midas.org.uk/reports/documents/NBSR07003-Architect-HIV.pdf

� Embarazadas

� Politansfundidos

� Desordenes auto inmunes

HIV ELISAs: Falsos PositivosHIV ELISAs: Falsos Positivos

� Error del operador�Contaminación cruzada

� Error de los instrumentos

� Incubador: Temperatura

� Lavador

� Seroconversión

� Error del operador• Agregar la muestra o el reactivo en un pocillo equivocado• Dilución incorrecta de un reactivo o en un diluyente

HIV ELISAs: Falsos NegativosHIV ELISAs: Falsos Negativos

• Dilución incorrecta de un reactivo o en un diluyente incorrecto

� Error de los instrumentos

� Incubador: Temperatura

� Lector: longitud de onda equivocada

Ensayo para la detección de anticuerpos anti HIV-1/2 en suero o plasma que se basa en la capacidad que tienen los anticuerpos de aglutinar las partículas de gelatina recubiertas con un anfígeno específico.

HIV Aglutinación de PartículasHIV Aglutinación de Partículas

Marcas disponibles Marcas disponibles comercialmente:

�Serodia HIV 1/2 Particle Agglutination Test Method. (Siemens)

�SFD HIV-1/2 PA Assay (Bio Rad)

HIV Aglutinación de PartículasHIV Aglutinación de Partículas

Negativo PositivoNo concluyente

� Detectan anticuerpos de tipo IgG e IgM

� Son de facil realizacion (no se necesita infraestructura compleja)

HIV-1 ELISAs: detección de Antígeno p24HIV-1 ELISAs: detección de Antígeno p24

� Elisa en microplaca

� Sensibilidad en pacientes adultos asintomático : 32%

� Sensibilidad aumentada cuando se disocia previamente los imnunocomplejos.


imnunocomplejos.

� Esta disociación puede ser ácida, alcalina o por calor.

�Resultados positivos deben ser confirmados en un ensayo de neutralización.

� Sensibilidad aumentada (80%) durante el periodo de seroconversión

� Algunas marcas disponibles comercialmente

�Vironostika HIV-1 Antigen (bioMerieux) 5,9-32 pg/ml�Murex HIV Antigen mAb (Abbott) 10 pg/ml


�Genetic Systems HIV-1 Ag EIA (Sanofi-Pasteur)

�Coulter HIV p24 Ag 15,7 pg/ml*�HIV p24 Core (DuPont) 14,2 pg/ml*�Innotest HIV Ag mAb (Innogenetics) 9,3 pg/ml*

*Ly a,, et al. Journal of Virological Methods 143 (2007) 86–94

� Para el tamizaje de sangre la sensibilidad y la especificidad de los ensayos deben ser las mas altas posibles

HIV-1 ELISAs: Selección de ensayosHIV-1 ELISAs: Selección de ensayos

� www.who.int/diagnostics_laboratory/evaluations� www.who.int/diagnostics_laboratory/publications/evalu

ations/en/index.html � www.who.int/bloodproducts/ref_materials/en/).

I. Separación de las proteínas virales (provenientes de un lisado) mediante una electroforésis en gel de poliacrilamida (SDS/PAGE)

II. Transferencia (blotting) de las proteínas separadas a un papel de nitrocelulosa

HIV-1 Western Blot – principio del métodoHIV-1 Western Blot – principio del método

papel de nitrocelulosa

III. Testeo de una muestra sobre el papel mediante una técnica similar a un ELISA

� Altamente específica

� Conjugado anti IgG

� Antigenos provenientes de un lisado viral (nativos)

Proteinas de HIV provenientes de un lisado viral son separadas por tamaño por

Las proteinas son transferidas a la superficie de una membrana (blotting)

WESTERN BLOTprincipio del método

por electroforesis

La membrana se corta en tiras

(blotting)

Las tiras son incubadas con el suero del paciente, luego conjugado y sustrato.

Commercial Methods in Clinical Microbiology, ASM Press

Gen Producto DescripciónENV gp160 precursor

gp120 gp externagp41 gp transmembrana

GAG p55 precursor

HIV-1 Proteínas ViralesHIV-1 Proteínas Virales

GAG p55 precursorp40 precursorp24 corep17 matriz

POL p66 RTp51 RTp32 endonucleasa

Organización CriterioASTPHLD/CDC Al menos dos de:

- p24-gp41-gp160/120

HIV-1 WB: Criterios de positividadHIV-1 WB: Criterios de positividad

Cruz Roja Americana Al menos tres bandas Una correspondiente a cada uno de los genes: GAG + POL + ENV

Consorcio para la Al menos dos bandas: p24 o p32 +Estandarización de gp41 o gp160/120Serología de retrovirus

OMS al menos dos bandas de envoltura

� POSITIVO: según criterio usado�

HIV-1 WB: Criterios de positividadHIV-1 WB: Criterios de positividad

� NEGATIVO: Ausencia total de bandas� INDETERMINADO: Cualquier combinación

intermedia.• Seroconversión• Falsos positivos

HIV-1 WB: Aparición de bandasHIV-1 WB: Aparición de bandas

� Es un ensayo de segunda generación para la detección de anticuerpos anti HIV-1/2

HIV-1 LIA (Line Immuno Assay)HIV-1 LIA (Line Immuno Assay)

– Proteínas recombinantes y péptidos sintéticos en bandas definidas sobre soporte plástico

– Altamente enriquecido en antígenos

� Incorpora antígenos de HIV-2� Método alternativo de confirmación

HIV-1 LIA (Line Immuno Assay)HIV-1 LIA (Line Immuno Assay)

Proteínas recombinantes y péptidos sintéticos de HIV-1, HIV-2 y HIV-1 gO sembradas en lineas discretas sobre una tira de nylon en soporte plastico.

Antígenos: sgp120, gp41 (específicos de HIV-1), p31, p24, p17 (que también reaccionan con HIV-2), gp36 y sgp105 (específicos de HIV-2). Péptidos para HIV-1 gO en la línea de sgp120

TESTS RAPIDOS DE HIV

�Distintos formatos �Conformación antigénica: proteínas

recombinantes y/o péptidos sintéticos.�Tipo de muestra�Tiempo de lectura: 10-15 min.�Sensibilidad: 95.5%-100%�Sensibilidad: 95.5%-100%�Especificidad: 94.46%-100%�Fácil realización y escaso equipamiento

para su realización.

Tipos de ensayo: formatos

� Aglutinación: Capillus™ HIV-1/HIV-2 (Trinity Biotech)

�Flujo lateral: Determine HIV-1/2 (Abbott Diagnostics)�Flujo lateral: Determine HIV-1/2 (Abbott Diagnostics)

� Flujo en membrana: Multispot HIV1/2 (BioRad Laboratories)

� Inmunodot (peine): Immunocomb II HIV 1&2 Combfirm (Orgenics)

Ensayos aprobados por FDA

TEST RAPIDOS: Tipo de muestra

• Suero

• Plasma

• Sangre entera:

•punción venosa

•punción en dedo

• Saliva

TESTS RAPIDOS: Usos

�Accidentes en trabajadores de la salud: testeo del paciente fuente

�Salas de partos en mujeres sin control previo para HIV

RESULTADOS

Población de alta prevalencia:� Sensibilidad: 100 %� Especificidad: 99.05%

VPP: 97.78%. VPN: 100%

Performance del test rápido Abbott DetermineTm HIV1/2

� VPP: 97.78%. VPN: 100%� Eficiencia: 99.33%Banco de sangre:� Especificidad: 100%

RESULTADOS

Panel de seroconversión:� Sensibilidad general: 79,07 %. (86,05% EIE

3 era G)

Performance del test rápido Abbott DetermineTm HIV1/2

3 G)� Sensibilidad en WB(-): 60%� Sensibilidad en WB (Ind): 93,94%Nivel de concordancia en las lecturas: 98,05%

La utilización de Determine no excluye el subsiguiente estudio mediante el algoritmo convencional.

Infección por HIVInfección por HIV

�Reducir riesgo de transmitir infección �

HIV-1 Detección temprana de infecciónHIV-1 Detección temprana de infección

�Iniciar de tratamiento�Asesoramiento

CONTEXTOCLINICO

CONTEXTOEPIDEMIOLOGICO

HIV-1 SeroconversiónHIV-1 Seroconversión

DIAGNOSTICODE

SEROCONVERSION

ALGORITMORACIONAL

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VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA - … Generalidades Estructura Genomic… · VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA HEMOCENTRO BUENOS AIRES 18 de Agosto 2010 Lic. Inés Zapiola