Vida Lang - dk.um.si

UNIVERZA V MARIBORU

FAKULTETA ZA NARAVOSLOVJE IN MATEMATIKO

Katedra za izobraževalno kemijo

MAGISTRSKO DELO

Vida Lang

Maribor, 2017

UNIVERZA V MARIBORU


Oddelek za biologijo, Katedra za izobraževalno kemijo

Vida Lang

Pridobivanje transglutaminaze

iz bakterije Streptomyces platensis

Extraction of Transglutaminase

from the Bacterium Streptomyces platensis

MAGISTRSKO DELO

Mentorica:

red. prof. dr. Maja Leitgeb

Somentorica:

asist. Maja Čolnik, univ. dipl. inž. kem. tehnol.

Maribor, september 2017

I

UNIVERZA V MARIBORU


IZJAVA O AVTORSTVU IN ISTOVETNOSTI TISKANE IN ELEKTRONSKE

OBLIKE MAGISTRSKEGA DELA

Ime in priimek študentke: Vida Lang

Študijski program: Izobraževalna biologija in Izobraževalna kemija

Naslov zaključnega dela: Pridobivanje transglutaminaze iz bakterije Streptomyces

platensis

Mentorica: red. prof. dr. Maja Leitgeb

Somentorica: asist. Maja Čolnik, univ. dipl. inž. kem. tehnol.

Podpisana študentka Vida Lang

izjavljam, da je zaključno delo rezultat mojega samostojnega dela, ki sem ga izdelala

ob pomoči mentorice in somentorice;

izjavljam, da sem pridobila vsa potrebna soglasja za uporabo podatkov in avtorskih

del v magistrskem delu in jih v magistrskem delu jasno in ustrezno označila;

na Univerzo v Mariboru neodplačno, neizključno, prostorsko in časovno neomejeno

prenašam pravico shranitve avtorskega dela v elektronski obliki, pravico

reproduciranja ter pravico ponuditi zaključno delo javnosti na svetovnem spletu preko

DKUM; sem seznanjena, da bodo dela deponirana/objavljena v DKUM dostopna

široki javnosti pod pogoji licence Creative Commons BY-NC-ND, kar vključuje tudi

avtomatizirano indeksiranje preko spleta in obdelavo besedil za potrebe tekstovnega

in podatkovnega rudarjenja in ekstrakcije znanja iz vsebin; uporabnikom se dovoli

reproduciranje brez predelave avtorskega dela, distribuiranje, dajanje v najem in

priobčitev javnosti samega izvirnega avtorskega dela, in sicer pod pogojem, da

navedejo avtorja in da ne gre za komercialno uporabo;

dovoljujem objavo svojih osebnih podatkov, ki so navedeni v magistrskem delu in tej

izjavi, skupaj z objavo zaključnega dela;

izjavljam, da je tiskana oblika zaključnega dela istovetna elektronski obliki

zaključnega dela, ki sem jo oddala za objavo v DKUM.

Uveljavljam permisivnejšo obliko licence Creative Commons: _________________

(navedite obliko)

Datum in kraj: _______________ Podpis študentke:

____________________________

II

Zahvala

Zahvaljujem se mentorici red. prof. dr. Maji Leitgeb za

strokovno svetovanje in vodenje pri izdelavi magistrskega dela.

Zahvaljujem se somentorici asistentki Maji Čolnik, univ. dipl.

inž. kem. tehnol., za prijaznost in pomoč pri izvedbi

laboratorijskega dela ter vzpodbudne in koristne nasvete pri

pisanju magistrske naloge.

Prav tako se zahvaljujem ostalim sodelavcem laboratorija za

separacijske procese in produktno tehniko FKKT UM.

Hvala Lei za jezikovni pregled naloge in Tomažu za prevod

povzetka.

Posebna zahvala pa je namenjena mojim najbližjim, družini in

prijateljem, ki me ves čas podpirajo in mi stojijo ob strani.

Vsem iskrena hvala!

III

Lang, V.: Pridobivanje transglutaminaze iz bakterije Streptomyces platensis.

Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za

biologija, Katedra za izobraževalno kemijo, 2017.

Povzetek

Streptomyces platensis je bakterija iz rodu Streptomyces. V rod Streptomyces spadajo

nitaste bakterije, ki jih najdemo v prsti. Bakterije Streptomyces uspevajo pri pH 6,5 – 8,0

in v temperaturnem območju med 25 °C in 35 °C. Za S. platensis je značilna proizvodnja

zunajceličnih encimov, ki se uporabljajo za industrijske namene. Namen magistrske

naloge je bil ugotoviti kako sprememba pH v celični suspenziji S. platensis vpliva na

maso celic S. platensis, aktivnost encima transglutaminaza in koncentracijo skupnih

proteinov v bakterijski suspenziji S. platensis. Celično suspenzijo S. platensis smo

inkubirali v inkubacijskem stresalniku 8 dni pri temperaturi 28 °C in ob rahlem stalnem

stresanju. Naredili smo 3 izvedbe, pri katerih smo v procesu inkubiranja celične

suspenzije S. platensis spreminjali pogoje pH. Pri vseh 3 izvedbah inkubiranja celične

suspenzije S. platensis v odvisnosti od inkubacijskega časa smo ugotovili, da medtem ko

se je pH celične suspenzije zniževal, so koncentracija proteinov, aktivnost

transglutaminaze in prirast suhe mase celic naraščale. Po treh različnih izvedbah se je

izkazalo, da je za gojenje celične suspenzije S. platensis najugodnejši začetni pH 6,7 in

inkubiranje pri temperaturi 28 °C ob rahlem stresanju ter brez dodatnega spreminjanja

pH. Spreminjanje oziroma uravnavanje pH na začetku procesa ali med celotnim procesom

inkubiranja celične suspenzije S. platensis ni ugodno za uspešno gojenje bakterije S.

platensis, saj se celoten proces pospeši in bakterije hitreje propadejo.

Ključne besede: S. platensis, aktivnost transglutaminaze, koncentracija proteinov, pH,

masa celic.

IV

Lang, V.: Extraction of Transglutaminase from the Bacterium Streptomyces

platensis. University of Maribor, Faculty of Natural Sciences and Mathematics,

Department of Educational Chemistry, 2017.

Abstract

Streptomyces platensis is bacteria from the genus of Streptomyces. Part of the genus

Streptomyces are thread-like bacteria, which are found in the soil. Bacteria Streptomyces

thrive at pH 6,5 – 8,0 and in the temperature range between 25 and 35 °C. S. platensis are

known for the production of extracellular enzymes, which are being used for industrial

purposes. The purpose of this master thesis was to find out how changes of pH in the

cellular suspension of S. platensis affect the mass of cells of S. platensis, how they affect

the activity of transglutaminase enzyme and how they affect the concentration of total

proteins in bacterial suspension. We have incubated cellular suspension of S. platensis in

an incubator shaker for 8 days at a temperature of 28 °C and constant mild shaking. We

have performed three trials, during which we have been changing pH conditions in the

process of incubation of cellular suspension of S. platensis. At all three trials of incubation

of the cellular suspension of S. platensis we have discovered in respect to the incubating

time that while the pH of the cellular suspension was dropping, the concentration of

proteins, the activity of transglutaminase and the growth of the dry mass of cells were

rising. After three different trials it has turned out, that for the growth of the cellular

suspension of S. platensis it is ideal to have a starting value of pH to be 6,7 and for

incubating to occur at 28 °C with constant mild shaking and without additional altering

of the pH value. Changing the value of pH either at the start or during the process of

incubation of the cellular suspension of S. platensis is not beneficial for the successful

growth of the bacteria S. platensis as the entire process is being accelerated and bacteria

decay faster.

Key Words: S. platensis, activity of transglutaminase, concentration of proteins, pH,

cellular mass.

V

Kazalo vsebine

Povzetek .......................................................................................................................... III

Abstract ........................................................................................................................... IV

Kazalo vsebine .................................................................................................................. V

Kazalo slik ..................................................................................................................... VII

Kazalo tabel .................................................................................................................. VIII

Kazalo grafov ................................................................................................................. IX

1 Uvod ............................................................................................................................... 1

2 Teoretični del .................................................................................................................. 2

2.1 Streptomyces ........................................................................................................... 2

2.1.1 Streptomyces platensis ...................................................................................... 3

2.2 Proteini ................................................................................................................... 5

2.3 Encimi ..................................................................................................................... 7

2.3.1 Aktivnost encimov in njeni dejavniki ............................................................... 8

2.3.2 Transglutaminaza............................................................................................ 10

3 Metode in materiali ....................................................................................................... 12

3.1 Opredelitev namena .............................................................................................. 12

3.2 Omejitve raziskave ............................................................................................... 13

3.3 Raziskovalni vzorec .............................................................................................. 14

3.4 Laboratorijske metode .......................................................................................... 14

3.4.1 Priprava hranilnega medija za gojenje bakterije S. platensis ......................... 17

3.4.2 Aseptično nacepljanje bakterijske kulture S. platensis ................................... 19

3.4.3 Merjenje pH bakterijski suspenziji S. platensis .............................................. 21

3.4.4 Bradfordov test za določevanje koncentracije skupnih proteinov .................. 22

3.4.5 Encimski test za določevanje aktivnosti transglutaminaze............................. 25

3.4.6 Nučiranje celične suspenzije S. platensis, sušenje in tehtanje mokre in suhe

mase celic S. platensis ............................................................................................. 31

VI

3.5 Materiali ............................................................................................................... 33

3.5.1 Kemikalije ...................................................................................................... 33

3.5.2 Laboratorijska oprema .................................................................................... 34

4 Rezultati in diskusija .................................................................................................... 36

4.1 Spreminjanje pH celični suspenziji S. platensis ................................................... 37

4.2 Preostala koncentracija proteinov v celični suspenziji S. platensis ...................... 47

4.3 Preostala aktivnost encima transglutaminaza v celični suspenziji S. platensis .... 48

4.4 Prirast suhe mase celic S. platensis ...................................................................... 50

4.5 Opazovanje bakterije S. platensis skozi optični mikroskop ................................. 52

5 Zaključek ...................................................................................................................... 54

6 Literatura ...................................................................................................................... 56

6.1 Viri slikovnega materiala...................................................................................... 58

Priloge .............................................................................................................................. 59

Priloga A ..................................................................................................................... 59

Priloga B ..................................................................................................................... 61

Priloga C ..................................................................................................................... 63

VII

Kazalo slik

Slika 1: Geosmin .............................................................................................................. 3

Slika 2: S. platensis skozi optični mikroskop. ................................................................. 4

Slika 3: Nastanek peptidne vezi z vezavo dveh aminokislin. .......................................... 5

Slika 4: Primarna, sekundarna, terciarna in kvartarna struktura proteinov (primer

hemoglobina). ................................................................................................................... 6

Slika 5: Model ključ – ključavnica. ................................................................................. 7

Slika 6: Laminarna komora ............................................................................................ 13

Slika 7: S. platensis na trdnem gojišču. ......................................................................... 14

Slika 8: S. platensis v tekočem gojišču. ......................................................................... 14

Slika 9: Shema eksperimentalnega dela v laboratoriju. ................................................. 16

Slika 10: Hranilni medij v erlenmajericah. .................................................................... 17

Slika 11: Laboratorijski avtoklav. .................................................................................. 18

Slika 12: Aseptično delo v laminarni komori. ............................................................... 19

Slika 13: Inkubacijski stresalnik. ................................................................................... 19

Slika 14: S. platensis v hranilnem mediju. ..................................................................... 20

Slika 15: 100 mL celic S. platensis v merilnem valju. .................................................. 20

Slika 16: 100 mL S. platensis v 900 mL hranilnega medija. ......................................... 20

Slika 17: Odvzeta vzorca celične suspenzije S. platensis. ............................................. 20

Slika 18: Shema razdelitve laboratorijskega dela v 3 sklope. ........................................ 21

Slika 19: Priprava Bradfordovega reagenta. .................................................................. 22

Slika 20: Umeritvena krivulja za določevanje koncentracije proteinov po Bradfordu. . 23

Slika 21: Priprava reakcijske mešanice.......................................................................... 27

Slika 22: CBZ-glutaminilglicin (Zedira). ...................................................................... 27

Slika 23: 1 – vorteks Assistent; 2 – Centrifuga 5804 R; 3 – spektrofotometer Cary 50

Probe UV-Visible Spectrophotometer. ........................................................................... 29

Slika 24: Tehtanje urnega stekla in filtrirnega papirja. .................................................. 32

Slika 25: Nučiranje vzorca. ............................................................................................ 32

Slika 26: Mokra masa celic S. platensis na filtrirnem papirju. ...................................... 32

Slika 27: Odnučirani vzorci S. platensis. ....................................................................... 32

Slika 28: Sušenje odnučiranih vzorcev S. platensis v sušilniku, 60 minut pri T = 70 °C.

........................................................................................................................................ 32

Slika 29: Gojišče se je začelo peniti. ............................................................................. 43

VIII

Slika 30: Tekoče gojišče z bakterijami S. platensis 1. dan inkubiranja. ........................ 46

Slika 31: Tekoče gojišče z bakterijami S. platensis 8. dan inkubiranja. ........................ 46

Slika 32: Celice S. platensis skozi optični mikroskop pred inkubiranjem. .................... 52

Slika 33: Celice S. platensis skozi optični mikroskop8. dan inkubiranja. ..................... 52

Slika 34: Prečni premeri bakterijskih celic S. platensis pred inkubiranjem. ................. 53

Slika 35: Celice S. platensis pred inkubiranjem. ........................................................... 53

Slika 36: Celice S. platensis osmi dan inkubiranja. ....................................................... 53

Kazalo tabel

Tabela 1: Sestava tekočega hranilnega medija za rast bakterije S. platensis. ............... 17

Tabela 2: Priprava reagentov za test aktivnosti transglutaminaze................................. 25

Tabela 3: Postopek priprave sveže reakcijske mešanice. .............................................. 26

Tabela 4: Postopek priprave vzorcev S. platensis za aktivnostni test transglutaminaze.

........................................................................................................................................ 29

Tabela 5: pH v celični suspenziji S. platensis (1. izvedba). .......................................... 38

Tabela 6: pH v bakterijski suspenziji S. platensis (2. izvedba). .................................... 40

Tabela 7: pH v bakterijski suspenziji S. platensis (3. izvedba). .................................... 42

Tabela 8: pH v bakterijski suspenziji S. platensis (primerjava vseh 3 izvedb). ............ 44

Tabela 9: Prečni premer bakterij S. platensis izmerjen s programom Image Focus V2.6.

........................................................................................................................................ 53

Tabela 10: Koncentracija proteinov v bakterijski suspenziji S. platensis [mg/mL]. ..... 59

Tabela 11: Aktivnost transglutaminaze [enot/mL] v bakterijski suspenziji S. platensis.

........................................................................................................................................ 61

Tabela 12: Prirast suhe masae celic S. platensis [mg/10 mL vzorca]. .......................... 63

IX

Kazalo grafov

Graf 1: Spreminjanje pH pri gojenju bakterijske suspenzije S. platensis v 1. izvedbi v

odvisnosti od časa inkubiranja. ....................................................................................... 38

Graf 2: Spreminjanje pH pri gojenju bakterijske kulture v odvisnosti od časa inkubacije

celične suspenzije S. platensis – 2. izvedba.................................................................... 40

Graf 3: Spreminjanje pH pri gojenju bakterijske kulture v odvisnosti od časa

inkubiranja – 3. izvedba.................................................................................................. 42

Graf 4: Primerjava vseh 3 izvedb – spreminjanje pH pri gojenju bakterijske kulture S.

platensis v odvisnosti od časa inkubiranja. .................................................................... 44

Graf 5: Preostala koncentracija proteinov [%] v celični suspenziji S. platensis v

odvisnosti od časa inkubiranja pri temperaturi 28 °C in ob stalnem rahlem stresanju. .. 47

Graf 6: Preostala aktivnost transglutaminaze [%] v bakterijski suspenziji S. platensis v


Graf 7: Prirast suhe mase celic S. platensis [%] v odvisnosti od časa inkubiranja pri

temperaturi 28 °C in ob stalnem rahlem stresanju. ......................................................... 51

Graf 8: Koncentracija proteinov v bakterijski suspenziji S. platensis [mg/mL] v


Graf 9: Aktivnost transglutaminaze [enot/mL] v bakterijski suspenziji S. platensis v


Graf 10: Suha m celic S. platensis [mg/10 mL vzorca] v odvisnosti od časa inkubiranja

pri temperaturi 28 °C in ob stalnem rahlem stresanju. ................................................... 64

Lang, V.: Pridobivanje transglutaminaze iz bakterije Streptomyces platensis. Magistrsko delo, Univerza v Mariboru,

Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, Katedra za izobraževalno kemijo, 2017.

1

1 Uvod

Encime najdemo v vseh živih organizmih in so biološko pomembna skupina proteinov,

ki pospešujejo presnovne procese. Encime zaradi njihove visoke katalitične sposobnosti

in specifičnosti pogosto vključujemo v biotehnološke procese. Uporabljamo jih v

živilski, farmacevtski, kozmetični, tekstilni in papirni industriji. Pomembno vlogo imajo

pri razvoju biotehnologije, genetike in inženirstva proteinov. Večino takih encimov

pridobivamo iz gliv in bakterij.

S. platensis najdemo v zemeljski prsti in imajo širok spekter tolerance na pH. Za S.

platensis je značilna proizvodnja encimov in drugih sekundarnih metabolitov. S.

platensis zunajcelično izloča tudi encim transglutaminazo. Transglutaminaza katalizira

tvorbo prečnih vezi med fibrilarnimi proteini in tvori netopne polimerne strukture, kot

so krvni strdki, lasje, koža itd. Različne študije so pokazale, da ima transglutaminaza

velik potencial za tkivno inženirstvo in proizvodnjo biotehnoloških orodij.

Transglutaminaza je postala zanimiva za raziskovalce, saj je zaradi katalitične aktivnosti

v različnih raziskavah pokazala industrijski potencial. Ugotovili so, da transglutaminaza

prikazuje visoko aktivnost v širokem razponu pH in temperature.

V sklopu magistrskega dela smo izvedli raziskavo, kako sprememba pH vpliva na

celično suspenzijo S. platensis in posledično na aktivnost encima transglutaminaza,

koncentracijo proteinov v celični suspenziji in prirast suhe mase celic v celični

suspenziji S. platensis. Bakterije S. platensis smo testirali v treh izvedbah. Za vsako

izvedbo smo pripravili svežo celično suspenzijo S. platensis, ki smo ji zagotovili

ustrezne pogoje za gojenje (inkubiranje pri 28 °C ob rahlem stresanju) in mediju za

namene raziskave ustrezno spreminjali pH. V procesu gojenja smo z vsakodnevnim

vzorčenjem spremljali dogajanje v bakterijski suspenziji S. platensis. Z aktivnostnim

testom smo določili aktivnost encima transglutaminaza. Z metodo po Bradfordu smo

določili preostalo koncentracijo proteinov in z nučiranjem celične suspenzije, sušenjem

ter tehtanjem mokre in suhe mase celic določili prirast suhe mase celic S. platensis.



2

2 Teoretični del

2.1 Streptomyces

Streptomyces je rod aerobnih, negibljivih, grampozitivnih, nitastih bakterij iz prsti, od

katerih nekatere vrste proizvajajo antibiotike, nekatere pa so lahko patogene (Slovenski

medicinski slovar, 2012).

Streptomyces je največji rod aktinobakterij. Opisali so že več kot 550 vrst Streptomyces

bakterij (Kämpfer, 2006). Kot druge aktinobakterije so tudi te grampozitivne in imajo

genom z visoko vsebnostjo gvanin – citozin baznih parov (GC: 72,1 %). Spadajo v

grampozitivne bakterije, zato je za njih značilno izločanje v ekstracelularni

(zunajcelični) medij. Najdemo jih v prsti in v odmrlih rastlinskih in živalskih ostankih.

Iz bakterijskih metabolitov tega roda proizvajajo več kot dve tretjini klinično uporabnih

antibiotikov naravnega izvora (Madigan in sod., 2005).

Bakterija Streptomyces ima temperaturni optimum v območju med 25 °C in 35 °C,

nekatere vrste pa lahko uspevajo v psihrofilnem in termofilnem območju. Bakterije

Streptomyces uspevajo pri pH 6,5 – 8,0 (Holt in sod., 1994).

Streptomyces v naravi najpogosteje najdemo kot prostoživeče saprofite na rastlinskem

materialu. Rastline bakterije oskrbujejo s potrebnimi hranili in tako omogočajo njihov

obstoj, koreninske izločke pa bakterije uporabljajo kot substrat. Za tako uravnavanje

procesov simbioze je potrebno kompleksno gensko ozadje (Kieser in sod., 2000).

Streptomyces poseljujejo predvsem nevtralna, rahlo alkalna tla, ki dobro prepuščajo

vodo. V tleh predstavljajo do 90 % vseh aktinobakterij in imajo pomembno vlogo pri

začetnih stopnjah razkrajanja organskega materiala (Schrempf, 2006).

Bakterije S. platensis oddajajo neprijeten vonj po zemlji, ki je posledica nastanka

hlapnega metabolita, imenovanega geosmin (Tallhouarne, 2008).

Geosmin je organska spojina, ki jo proizvajajo aktinobakterije, in je odgovoren za

zemeljski vonj, ki se pojavi v zraku. Geosmin se sprosti, ko mikroorganizmi odmrejo.



3

Najbolj ga zaznamo, ko po nekaj časa suhega vremena začne deževati (Gerritsen, 2003).

Geosmin (slika 1) je biciklični alkohol s formulo C12H22O in je derivat dekalina. Po

IUPAC-ovi nomenklaturi spojino imenujemo 4,8a-dimethyl-decahydronaphthalen-4a-

ol.

Slika 1: Geosmin

(Vir: simplyfantasticbooks.com/tag/rain/, 2017)

2.1.1 Streptomyces platensis

S. platensis so gram pozitivne bakterije iz rodu Streptomyces. Najdemo jih v zemeljski

prsti v različnih regijah po vsem svetu. Kot vse vrste iz rodu Streptomyces imajo tudi S.

platensis določene strukture podobne glivam. Posebnost teh bakterij je njihova linearna

razporeditev kromosomov, med katerimi poteka izmenjava informacij. To prispeva k

njihovi izjemni prilagodljivosti na nove habitate. Bakterije S. platensis imajo širok

spekter tolerance na pH (od 5 do 11,5) kar jim omogoča preživetje na najbolj

onesnaženih območjih (Hines, 2010).

Talhouarne (2008) poroča, da so najboljši habitati za S. platensis pH nevtralna tla (pH

7). Znano je tudi, da te prokariontske bakterije živijo v kolonijah in da so aerobni

sporofiti. To pomeni, da so odvisni od odmrlih rastlinskih in živalskih ostankov in da za

učinkovitost potrebujejo kisik. Za S. platensis (slika 2) je značilna proizvodnja encimov

in drugih sekundarnih metabolitov. Izločajo zunajcelične encime, ki se uporabljajo za

industrijske namene. Encimi, ki jih bakterija S. platensis proizvaja so različni in delujejo

kot biokatalizatorji kemijskih reakcij ter sodelujejo pri metaboličnih procesih.

Pomembno vlogo imajo pri razvoju biotehnologije, genetike, inženirstva proteinov itd.



4

Slika 2: S. platensis skozi optični mikroskop.

S. platensis je znana po tem, da poleg številnih metabolitov, proizvaja tudi

platensimicin, ki deluje antibiotično proti mnogim nevarnim bakterijam. Ta sekundarni

metabolit je antibiotik, ki zavira biosintezo maščobnih kislin (Tallhourne, 2008; Akst,

2014), ki so pomembne v celičnih membranah grampozitivnih bakterij, same pa imajo

mehanizem za lastno zaščito, odpornost proti antibiotikom, ki bi lahko motili sintezo

lastnih maščobnih kislin (Akst, 2014).

Sekundarni metaboliti so organske spojine, ki jih proizvajajo številni mikroorganizmi,

za njihovo rast pa niso nujno potrebni. Na splošno velja, da biosinteza sekundarnih

metabolitov poteka med posebno fazo rasti ali pod posebnimi pogoji, ki niso povezani

s hitrostjo njihove rasti. Maksimalno proizvodnjo sekundarnih metabolitov so opazili,

kadar v gojišču začne primanjkovati hranil (Döhren in Gräfe, 1997).

Sekundarni metaboliti se formirajo proti koncu faze rasti, to je v stacionarni fazi, ko se

število celic ne povečuje. Večina sekundarnih metabolitov je zanimiva za industrijo.

Najbolj znani in najbolj raziskani sekundarni metaboliti so antibiotiki, mikotoksini in

pigmenti. Stacionarni fazi sledi faza odmiranja, kjer se število celic v populaciji

progresivno zmanjšuje (Leitgeb, 2014).



5

2.2 Proteini

Proteini so polimeri aminokislin in so med seboj povezani s peptidno vezjo (amidna

vez). Proteine najdemo v vseh živih organizmih. Sodelujejo pri ohranjanju celične

strukture in biološke funkcije, hkrati pa so najpomembnejše molekule, ki omogočajo

ustrezno prilagajanje celic spremenjenim razmeram v okolju. Nastanejo s kondenzacijo,

pri čemer se karboksilna skupina ene aminokisline poveže z amino skupino druge

aminokisline. Pri tem izstopi voda in nastane dipeptid. Z dodajanjem novih aminokislin

dobimo protein. V naravi se pojavlja 20 različnih aminokislin. Proteini nastanejo v

celicah v procesu translacije, ko se mRNK na ribosomih prevede v proteine (Bavec,

Zorko in Stojan, 2008; Potočnik, 2013; Boyer, 2005).

Slika 3: Nastanek peptidne vezi z vezavo dveh aminokislin.

(Vir: ocelici.weebly.com/beljakovine.htmL, 2017)

Zgradbo proteinov preučujemo na štirih strukturnih ravneh (slika 4):

primarna struktura: določa aminokislinsko zaporedje proteina;

sekundarna struktura: nastane, ko se med posameznimi deli proteina vzpostavijo

vodikove vezi, primera sekundarne strukture sta α-vijačnica in ß-prepognjena

lista;

http://ocelici.weebly.com/beljakovine.html



6

terciarna struktura: prostorska ureditev elementov sekundarne strukture, ki jo

vzdržujejo predvsem interakcije med stranskimi verigami aminokislin, opiše

položaj vseh atomov v proteinu;

kvartarna struktura: prostorska ureditev beljakovinskih podenot. Imajo jo samo

nekatere beljakovine (na primer hemoglobin je sestavljen iz štirih podenot)

(Bavec, Zorko in Stojan, 2008; Boyer, 2005).

Slika 4: Primarna, sekundarna, terciarna in kvartarna struktura proteinov (primer hemoglobina).

(Vir: Wikipedia, 2017)



7

2.3 Encimi

Encimi ali fermenti so biološko najpomembnejša skupina proteinov. So katalizatorji, ki

pospešujejo presnovne procese v celici, zato jih imenujemo biokatalizatorji. Encimi so

nujno potrebni za celični metabolizem, saj večina življenjsko pomembnih reakcij brez

katalizatorjev poteka prepočasi (Boyer, 2005).

Bavec, Zorko in Stojan, 2008, so ugotovili, da encimi:

1. izredno specifično pospešujejo kemijske reakcije,

2. so izredno specifični za substrate, ki jih pretvarjajo,

3. delujejo v vodnih raztopinah, pod milimi pogoji, pri sobni temperaturi in v

okolici nevtralnega pH ter

4. imajo sposobnost regulacije.

Reakcije, ki jih encimi katalizirajo, so organizirane v metabolične poti, v katerih se

izgrajujejo ali razgrajujejo hranilne snovi, del sproščene energije pa se pretvarja in

skladišči v obliki organizmu potrebnih makromolekul (Bavec, Zorko in Stojan, 2008).

Encimi so glede na reakcijo, ki jo katalizirajo, in glede na izbiro reaktantov,

visokospecifični. Področje encima, ki veže substrat, se imenuje aktivno mesto in

zavzema samo 1 % celotnega volumna encima. Aktivna mesta so razpoke ali špranje.

Da se substrat prilega v aktivno mesto, mora imeti prilagojeno obliko (model ključ –

ključavnica, slika 5) ali pa se oblika aktivnega mesta encima pri vezavi s substratom

modificira. Običajno encim katalizira eno kemijsko reakcijo ali vrsto podobnih reakcij.

Pri kataliziranih reakcijah izredno redko potekajo stranske reakcije s stranskimi

produkti. Encimi znižajo aktivacijsko energijo v reakciji, zato lahko med seboj reagira

več delcev, s čimer se poveča hitrost reakcij (Boyer, 2005; Kolednik, 2014).

Slika 5: Model ključ – ključavnica.

(Vir: eucbeniki.sio.si/kemija9)



8

2.3.1 Aktivnost encimov in njeni dejavniki

Encimi optimalno delujejo v svojih nativnih oblikah. Njihova katalitična aktivnost je

odvisna od konformacije. Encimi se lahko denaturirajo, ali se disociirajo na podenote

ter s tem izgubijo svojo katalitično sposobnost. Velja torej, da so za aktivnost encimov

potrebne vse štiri ravni strukture, ki izvirajo iz njihove proteinske narave. Na strukture

encimov odločilno vplivajo razmere v okolju (Bavec, Zorko in Stojan, 2008).

Dejavniki, ki vplivajo na aktivnost encimov, so:

- količina substrata,

- temperatura,

- kislost okolja (pH) in

- inhibitorji.

Količina substrata

Z naraščajočo količino substrata raste aktivnost encimov, ki doseže maksimum pri

tolikšni koncentraciji substrata, pri kateri so zasedeni vsi aktivni centri encima. Če se

potem koncentracija substrata še veča, aktivnost encima ne narašča več. V normalnih

razmerah do take koncentracije substrata ne pride. Po navadi je nekaj molekul encima

zaradi pomanjkanja substrata v neaktivnem stanju (Boyer, 2005).

Temperatura

Vsak encim ima temperaturni optium, maksimum in minimum. Aktivnost encimov

narašča z naraščanjem temperature, vendar le do temperaturnega optimuma encima. Ker

je del encima beljakovina, ta zaradi delovanja toplote denaturira, kar pomeni, da se

spremeni razporeditev aminokislin v aktivnih centrih. Zaradi tega encim izgubi svojo

katalitično sposobnost in aktivnost se zmanjša. Če se denaturacija nadaljuje, potem

encimske beljakovine postanejo netopne in koagulirajo (tvorijo strdke). Takrat je proces

ireverzibilen in encim za stalno izgubi svoje lastnosti (Boyer, 2005).

pH

Večina encimov ima tudi optimalen pH, pri katerem je njihova aktivnost najvišja.

Vrednosti pH, ki so večje ali manjše od optimuma, znižajo aktivnost encimov. Če se

spremeni vrednost medija (prostora), v katerem reakcija poteka, so poškodovane mnoge



9

aminokisline in tridimenzionalna zgradba je spremenjena. Z drugimi besedami

povedano, beljakovine koagulirajo (Boyer, 2005).

Vpliv pH na encimsko aktivnost je dvojen:

1. Reverzibilen vpliv na disiciabilne skupine v aktivnem centru.

2. Ireverzibilno delovanje po principu denaturacije beljakovin. Vzrok za tovrstno

denaturacijo je splošna protonacija ali deprotonacija disociabilnih skupin, posebej tistih

v notranjosti molekule. Med njimi pride do elektronskega odboja ali pa se nanje veže

voda. Oboje povzroči razpletanje globularne beljakovine (Bavec, Zorko in Stojan,

2008).

Inhibitorji

V celicah in tkivih so prisotne tudi druge kemične snovi, kot so zdravila, toksini (strupi)

in druge biokemijske spojine. Mnoge od teh snovi encime inhibirajo, jim onemogočijo

normalno delovanje (Boyer, 2005; Kapun-Dolinar, 2001).

Če so encimi izpostavljeni določenim spremembam, kot so nihanja temperature ali pH,

se lahko proteinske strukture spremenijo oziroma denaturirajo in izgubijo svojo

katalitično sposobnost (Grobelnik, 2016).

Encime delimo glede na vrsto kemijske reakcije, ki jo katalizirajo:

1. oksidoreduktaze katalizirajo prenos elektronov z ene molekule (reducent) na drugo

(oksidant),

2. transferaze katalizirajo prenos funkcionalne skupine z ene molekule (donor) na

drugo (akceptor),

3. hidrolaze katalizirajo reakcijo hidrolize,

4. liaze katalizirajo prekinitve različnih kemijskih vezi z drugimi ali s hidrolizo ali

oksidacijo, pogosto tvorijo novo dvojno vez ali novo ciklično strukturo,

5. izomeraze katalizirajo strukturno prerazporeditev izomerov in

6. ligaze katalizirajo spajanje dveh velikih molekul, ki tvorita novo kemijsko vez

(Miletić, 2009).



10

2.3.2 Transglutaminaza

Transglutaminaza je encim, ki katalizira tvorbo prečnih vezi med fibrilarnimi proteini

(Slovenski medicinski slovar, 2012). Transglutaminaza imenujemo družino strukturnih

in funkcionalnih proteinov, sestavljenih iz osmih izoencimov. Po kemijski strukturi so

izoencimi različne molekule, ki katalizirajo isto kemijsko reakcijo (Eckert in sod.,

2014).

Koda encima (enzyme.expasy.org) za transglutaminazo je EC 2.3.2.13, kar pomeni

naslednje:

EC 2: encim je transferaza (pri katalitski reakciji pride do prenosa funkcionalne

skupine z ene molekule na drugo);

EC 2.3: encim je aciltrasferaza;

EC 2.3.2: encim je aminoaciltransferaza;

EC 2.3.2.13: encim je transglutaminaza.

Transglutaminaza je encim, ki katalizira formacijo izopeptidne vezi med prosto amino

skupino in acilno skupino. Ta reakcija tvori koprodukt amonijak. Reakcije so odvisne

do številnih faktorjev, vključno s pH in temperaturo. Transglutaminaze tvorijo obsežne

premrežene, na splošno netopne polimerne strukture. Te snovi so za organizme

izrednega pomena, saj tvorijo bariere in stabilne strukture (npr. krvni strdki, lasje in

koža). Pomanjkanje faktorja XIII (transglutaminaza), je redka genetska napaka, ki

povzroča motnjo strjevanja krvi. Takim bolnikom je treba dodajati encim

transglutaminazo, da lahko potek strjevanja krvi steče normalno (Wiki.fkkt.uni-lj.si,

2014).

Eckert in sod. (2014) poročajo, da so raziskovalci prvo transglutaminazo identificirali

leta 1959 iz jeter morskih prašičkov. Postopki čiščenja in ločevanja so bili zapleteni in

dragi, kar pa je tudi vplivalo na ceno končnega proizvoda. Zaradi vseh teh razlogov, so

raziskovalci začeli iskati nove vire transglutaminaze. Leta 1989 so prvič ugotovili, da je

transglutaminazo možno pridobiti iz bakterije Streptomyces sp. Transglutaminazo so

identificirali v živalskih in rastlinskih tkivih ter mikroorganizmih (Iancu in sod. 2009).



11

Do leta 2011 so s poskusi odkrili, da se transglutaminaza izloča iz Streptomyces lividans,

Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum in metilotropskih kvasovk (Liu in sod.,

2011).

Transglutaminaza se iz bakterij rodu Streptomyces izloča kot proencim (tudi cimogen)

- protransglutaminaza. To je neaktivna oblika encima, ki se aktivira šele ob biokemijski

spremembi, ki razkrije njegovo aktivno mesto. Z uporabo signalnega peptida

transglutaminaze (pelB signalni peptid) so pretvorili neaktivno obliko encima v aktivno

(Liu in sod., 2011).

Transglutaminaza je postala zanimiva za raziskovalce, saj je zaradi katalitične aktivnosti

v različnih raziskavah pokazala industrijski potencial. Ugotovili so, da prikazuje visoko

aktivnost v širokem razponu pH in temperature (Shi, Y-G. in sod., 2011).

Liu in sod., 2011, poročajo, da je bila transglutaminaza iz Streptomyces uporabljena v

živilski industriji za izboljšanje funkcionalnih lastnosti živil. Raziskovalci iz Univerze

v Bologni (Scarnato in sod., 2017) so ugotovili, da je transglutaminaza pomemben

encim za prehrambeno industrijo, saj katalizira tvorbo beljakovinskih navzkrižnih

povezav. Naredili so raziskavo, s katero so dokazali, da je encim transglutaminaza v

kombinaciji s pekovskim kvasom primerna kombinacija za izboljšanje lastnosti

kruhovega testa. Rezultati raziskav so pokazali, da je transglutaminaza zmožna

proizvajati izopeptidne vezi, ki vodijo do nastanka proteinskih agregatov, ki izboljšajo

strukturo pekovskih izdelkov, povečajo fermentacijsko stabilnost in izboljšajo reološke

lastnosti, aromo ter rok uporabnosti. Študije so pokazale, da ima transglutaminaza tudi

velik potencial za tkivno inženirstvo, tekstilstvo in usnjarstvo, proizvodnjo

biotehnoloških orodij in drugih aplikacij (Liu in sod., 2011).



12

3 Metode in materiali

3.1 Opredelitev namena

Cilj magistrskega dela so bili:

ugotoviti, kolikšna je koncentracija proteinov v bakterijski suspenziji S.

platensis,

raziskati, kolikšna je aktivnost encima transglutaminaza v bakterijski

suspenziji S. platensis,

najti pogoje, kjer je aktivnost encima transglutaminaza najvišja, ter

ugotoviti, kako sprememba pH vpliva na rast celic S. platensis, aktivnost

encima transglutaminaza in koncentracijo skupnih proteinov v bakterijski

suspenziji S. platensis.

Predvidevali smo, da bo najvišja aktivnost transglutaminaze v celični suspenziji S.

platensis pri milih pogojih: T = 28 °C; pH = 7.



13

3.2 Omejitve raziskave

Omejeni smo bili na delo v laboratoriju za biokatalizo, ki je del Laboratorija za

separacijske procese in produktno tehniko, na Fakulteti za kemijo in kemijsko

tehnologijo, Univerze v Mariboru. V tem laboratoriju so laminarna komora za delo pri

aseptičnih pogojih (slika 6), inkubator in stresalnik za inkubacijo bakterijske kulture S.

platensis.

Slika 6: Laminarna komora

Namen magistrske naloge je bil ugotoviti kako sprememba pH vpliva na celično

suspenzijo S. platensis in posledično določiti koncentracijo proteinov, aktivnost

transglutaminaze in prirast suhe mase celic bakterijske kulture S. platensis. Bakterijo S.

platensis smo gojili v hranilnem mediju pri temperaturi 28 °C do 8 dni in ob stalnem

stresanju v inkubacijskem stresalniku. Za uspešno rast smo bakteriji S. platensis

zagotovili primerna hranila in primerne pogoje – ustrezen pH okolja in ustrezno

temperaturo. Mediju za gojenje bakterij S. platensis smo za namene raziskovalnega dela

magistrske naloge ustrezno spreminjali pH in z vsakodnevnim vzorčenjem (ob 8. in ob

12. uri) in testiranjem ugotavljali dogajanje v celični suspenziji S. platensis. Pri 1.

izvedbi eksperimenta je bil začetni pH celične suspenzije S. platensis 6,7 in ga več nismo

spreminjali. Spremljali smo, kako se pH v celični suspenziji S. platensis v odvisnosti od

časa inkubiranja spreminja v procesu gojenja. Pri 2. izvedbi smo celični suspenziji S.

platensis izmerili začetni pH, ki je bil 6,7. V procesu gojenja in inkubiranja celične

suspenzije S. platensis smo po vsakem odvzetem vzorcu pH uravnali na začetno

vrednost (pH 6,7). Pri 3. izvedbi smo celični suspenziji S. platensis prav tako izmerili

začetni pH in ga uravnali na 7,2 ter ga v nadaljnjem procesu inkubiranja več nismo

spreminjali.



14

3.3 Raziskovalni vzorec

Za raziskavo v magistrski nalogi smo uporabili bakterijo iz rodu Streptomyces, vrsto S.

platensis (sliki 7 in 8).

Slika 7: S. platensis na trdnem gojišču.

Slika 8: S. platensis v tekočem gojišču.

3.4 Laboratorijske metode

Uporabili smo naslednje laboratorijske metode dela:

priprava hranilnega medija za gojenje bakterij S. platensis,

aseptično nacepljanje in gojenje bakterijske kulture S. platensis,

merjenje pH bakterijski suspenziji S. platensis,

določevanje preostale koncentracije proteinov v bakterijski suspenziji S.

platensis z Bradfordovo metodo,

spektrofotometrično določevanje aktivnosti encima transglutaminaza v celični

suspenziji S. platensis,

nučiranje, sušenje in tehtanje mokre in suhe mase celic bakterije S. platensis.



15

Laboratorijsko delo je potekalo po shemi, ki je prikazana na sliki 9.

1 - Bakterije S. platensis smo aseptično prenesli iz trdega gojišča v manjše (250 mL)

erlenmajerice s tekočim hranilnim gojiščem ter jih gojili 3 dni pri 28 °C in ob rahlem

stresanju v inkubatorskem stresalniku.

2 - Iz manjših erlenmajeric smo aseptično zbrali 100 mL celic iz celične suspenzije S.

platensis in jih prenesli v 100 mL merilni valj.

3 - 100 mL celic in celične suspenzije S. platensis smo aseptično prenesli v 1000 mL

erlenmajerico s pripravljenim hranilnim medijem (900 mL hranilnega medija in 100 mL

celic S. platensis).

4 - Tako pripravljeno celično suspenzijo S. platensis smo 8 dni inkubirali pri temperaturi

28 °C in ob rahlem stresanju v inkubatorskem stresalniku.

5 - Vsak dan smo ob 8. in ob 12. uri vzeli 2 paralelna vzorca, 10 mL homogene

suspenzije S. platensis.

6 - Homogenim vzorcem celične suspenzije S. platensis smo:

a - izmerili pH.

b - opravili Bradfordov test za določanje preostale koncentracije proteinov v

bakterijski suspenziji S. platensis.

c - z encimskim testom za določanje aktivnosti transglutaminaze smo določili

preostalo aktivnost encima transglutaminaza v bakterijski suspenziji S. platensis.

d - z nučiranjem, sušenjem in tehtanjem mokre ter suhe mase celic S. platensis

smo določili prirast suhe mase celic S . platensis.

Lang, V.: Pridobivanje transglutaminaze iz bakterije Streptomyces platensis. Magistrsko delo, Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko, Oddelek za biologijo, Katedra za

izobraževalno kemijo, 2017.

16

Slika 9: Shema eksperimentalnega dela v laboratoriju.



17

3.4.1 Priprava hranilnega medija za gojenje bakterije S.

platensis

Bakterije najlažje proučujemo, če jih znamo gojiti v laboratorijskih razmerah. Za gojitev

bakterij potrebujemo primerna gojišča, zagotoviti jim moramo hranila in vir energije,

ustrezen pH okolja ter inkubacijo pri ustrezni temperaturi (Habulin in Primožič, 2008).

Gojišča za gojenje bakterij so vodne raztopine, ki jih določena bakterija potrebuje za

rast. Za rast bakterij S. platensis smo pripravili 2000 mL gojišča s sestavinami, ki so

navedena v tabeli 1.

Tabela 1: Sestava tekočega hranilnega medija za rast bakterije S. platensis.

sestavina količina

glukoza 8,0 g

kvasni ekstrakt 8,0 g

sladni ekstrakt 20,0 g

destilirana voda 2000,0 mL

8,0 g glukoze, 8,0 g kvasnega ekstrakta in 20,0 g sladnega ekstrakta smo zmešali v 2000

mL čašo in do oznake dopolnili z destilirano vodo. Raztopino smo s pomočjo

magnetnega mešala mešali dokler se niso vse komponente raztopile. Pripravljeni

raztopini smo ob stalnem mešanju umerili pH na 7,2 z 1M NaOH. Pripravljen medij

smo razdelili v manjše erlenmajerice (slika 10).

Slika 10: Hranilni medij v erlenmajericah.



18

Erlenmajerice s hranilnim medijem smo zamašili z bombažnim zamaškom, prekrili z

aluminijasto folijo in jih sterilizirali v sterilizatorju (slika 11). Po sterilizaciji se je pH

medija znižal na 6,7.

S postopkom sterilizacije smo z vodno paro pod tlakom 2,06 bar in pri temperaturi 121

°C (15 minut) uničili vse žive celice in spore (Habulin in Primožič, 2008). Sterilni

hranilni medij je bil tako pripravljen za nacepljanje in gojenje čiste bakterijske kulture

S. platensis.

Slika 11: Laboratorijski avtoklav.



19

3.4.2 Aseptično nacepljanje bakterijske kulture S. platensis

Nacepljanje čiste bakterijske kulture S. platensis in odvzemi vzorcev bakterijske

suspenzije S. platensis so bili opravljeni aseptično. S tem smo onemogočili dostop

nezaželenim mikroorganizmom, ki bi kontaminirali naše kulture in zaradi katerih bi bili

rezultati poskusov napačni. Prav tako smo pazili, da mikroorganizmov nismo razširjali,

saj bi s tem utegnili inficirati sebe ali druge (Habulin in Primožič, 2008).

Za aseptično delo je nujno, da so steklovina, predmeti in pripomočki za delo ter gojišča

za gojenje mikroorganizmov sterilni. Le pri aseptični tehniki bodo rezultati preiskav

pravilni. (Habulin in Primožič, 2008), zato je nacepljanje in vzorčenje bakterijske

kulture S. platensis potekalo ob plamenu plinskega gorilnika (slika 12). Cepilno zanko

in steklovino smo med delom ožigali in delovno površino redno čistili z razkužilom.

Slika 12: Aseptično delo v laminarni

komori.

Slika 13: Inkubacijski stresalnik.

Bakterijsko kulturo S. platensis smo s cepilno zanko prenesli iz trdnega v tekoče gojišče

(v 50 mL erlenmajerice) in jo ob stalnem mešanju gojili v inkubacijskem stresalniku pri

temperaturi 28 °C (slika 13). Ko so se bakterije S. platensis primerno razmnožile

(približno po treh dneh) smo jih aseptično nacepili v tekoča gojišča večjih erlenmajeric

(250 mL) in jih ponovno gojili 3 dni v inkubacijskem stresalniku in pri ustreznih

pogojih.

Iz tako pripravljenih celičnih suspenzij S. platensis (slika 14) smo v sterilni merilni valj

aseptično prenesli 100 mL celic S. platensis (slika 15). Počakali smo, da so se celice S.

platensis posedle na dno merilnega valja in odlili tekoči medij. V merilnem valju smo



20

odmerili 100 mL čistih bakterijskih celic S. platensis, ki smo jih aseptično prenesli v

erlenmajerico z 900 mL hranilnega tekočega medija (slika 16) in jih ob stalnem stresanju

na stresalniku inkubirali 8 dni pri temperaturi 28 °C in različnem pH. Vsak dan smo ob

8. in ob 12. uri aseptično s pipeto in sterilnimi nastavki za pipeto vzeli vzorce celične

suspenzije S. platensis (2 paralelki po 10 mL) (slika 17) ter jih testirali po opisanih

metodah. Pri jemanju vzorca smo vsebino erlemnajerice mešali, da smo dobili homogeni

vzorec. Proces inkubiranja in testiranja celične suspenzije S. platensis je v eni izvedbi

trajal 8 dni. Celotni postopek smo ponovili v treh izvedbah, pri katerih smo celični

suspenziji S. platensis ustrezno spreminjali pogoje pH in posledično določili

koncentracijo proteinov, aktivnost encima transglutaminaza in maso suhih celic S.

platensis.

Slika 14: S. platensis v hranilnem mediju.

Slika 15: 100 mL celic S. platensis v merilnem valju.

Slika 16: 100 mL S. platensis v 900

mL hranilnega medija.

Slika 17: Odvzeta vzorca celične suspenzije S. platensis.



21

3.4.3 Merjenje pH bakterijski suspenziji S. platensis

pH vrednost medija je pri bakterijah in encimih zelo pomemben dejavnik. Če se

spremeni pH vrednost, je verjetnost, da proteini koagulirajo. Večina encimov ima

optimalno delovanje pri nevtralnem območju pH. pH bakterijske suspenzije smo merili

s pH metrom. Na podlagi meritev smo ugotovili, v kakšnem pH okolju bakterije S.

platensis najbolje uspevajo. Iz literature je namreč razvidno, da lahko pH medija vpliva

na aktivnost encima na več stvari:

na hitrost reakcije,

na afiniteto encima in substrata in

na obstojnost samega encima – visok ali prenizek pH lahko ireverzibilno

denaturira encim, zaradi česar se koncentracija aktivnega encima zmanjša

(Anderluh in sod., 2009).

Bakterije S. platensis smo testirali v 3 izvedbah. Za vsako izvedbo smo si na novo

pripravili hranilni medij in svežo celično suspenzijo S. platensis. Bakterijam S. platensis

smo zagotovili ustrezne pogoje za gojenje in mediju spreminjali pH, kot je opisano na

shemi (slika 18).

Slika 18: Shema razdelitve laboratorijskega dela v 3 sklope.



22

3.4.4 Bradfordov test za določevanje koncentracije skupnih

proteinov

Koncentracijo skupnih proteinov v celični suspenziji S. platensis smo določili s

kolorimetrično Bradfordovo metodo.

Bradfordov test za določanje proteinov v bakterijski suspenziji S. platensis je

kvantitativna metoda. Postopek določevanja vključuje vezavo Coomassie Brilliant

modre na proteine. Vezava barvila proteinu povzroči premik v najvišjo absorpcijo

barvila, zato absorpcijo merimo pri valovni dolžini 595 nm. Test je hitro ponovljiv in z

dobro barvno stabilnostjo do 1 ure (Bradford, 1976).

Priprava Bradfordovega reagenta za določevanje koncentracije skupnih proteinov

v celični suspenziji S. platensis

Bradfordov reagent (Slika 19) smo pripravili tako, da smo raztopili 100 mg Coomassie

Brilliant modre v 50 mL 95 % etanola in v 100 mL 85 % (v/v) fosforne kisline (H3PO4)

ter razredčili z Milli-Q vodo do oznake 1 L.

Slika 19: Priprava Bradfordovega reagenta.



23

Priprava umeritvene krivulje

Za pripravo umeritvene krivulje (slika 20) smo uporabili goveji serumski albumin

(BSA) v koncentracijskem območju od 0 mg/mL do 1 mg/mL. Nato smo si pripravili

znane koncentracije BSA tako, da smo zatehtali 10 mg albumina in dodali 1 mL Mili-Q

vode. Pripravljeno raztopino s koncentracijo 10 mg/mL smo razredčili po naslednjem

postopku:

1000 µL Mili-Q voda (Blank) 0,0 mg/mL

20 µL BSA (10 mg/mL) + 980 µL Mili-Q vode 0,2 mg/mL





Slika 20: Umeritvena krivulja za določevanje koncentracije proteinov po Bradfordu.



24

Enačba (1) umeritvene krivulje:

(1) A595nm = K × Cs

kjer je:

A595nm je srednja vrednost izmerjenih absorbanc vzorca S. platensis pri λ = 595

nm,

Cs je dejanska koncentracija proteinov v izmerjenem vzorcu (mg/mL) in

K je izračunan naklon umeritvene krivulje za Bradfordov reagent (0,5489).

Za izračun Cs smo enačbo preuredili:

(2) 𝑪𝒔 = 𝑨𝟓𝟗𝟓𝒏𝒎𝑲

Z enačbo (2) smo izračunali koncentracije proteinov v vzorcih bakterijske suspenzije S.

platensis.

Priprava vzorcev bakterijske suspenzije S. platensis za merjenje koncentracije po

Bradfordu

V mikrocentrifugirke smo odpipetirali 1 mL Bradfordovega reagenta in dodali 20 µL

predhodno pripravljenega vzorca. Vzorce smo zvorteksirali na Vortex Assistent ter

inkubirali na sobni temperaturi 15 minut.

Tako pripravljenim vzorcem smo izmerili absorbanco pri valovni dolžini λ = 595 nm na

spektrofotometru Cary 50 Probe UV-Visible Spectrophotometer. Kot slepi vzorec smo

v mikrcentrifugirko odpipetirali 1 mL Bradfordovega reagenta in namesto vzorca dodali

20 µL hranilnega medija.



25

3.4.5 Encimski test za določevanje aktivnosti transglutaminaze

Preučevanje biokemijskih lastnosti encimov je vezano na predhodno osamitev ali

izolacijo izbranega encima iz celic in od ostale množice proteinov ter drugih snovi.

Osamitev določenega encima omogoči in olajša njegovo analizo, saj se na ta način

zmanjša število najrazličnejših vplivov na delovanje encima ter merske metodoe Vendar

pa se s tem na drugi strani poveča možnost, da lastnosti, ki jih ugotovimo in vitro, niso

povsem identične z delovanjem encima in vivo.

Osnova za encimske teste je sledenje encimske reakcije v času, to je merjenje

spreminjajoče se koncentracije substrata ali produkta v časovnih presledkih. Pri

encimskih testih moramo vedno upoštevati temperaturo, pri kateri je aktivnost encima

največja, pH reakcijskega medija pa naj bo enak encimskemu pH-optimumu, tj.

vrednost pH, pri katerem je aktivnost encima največja (Anderluh in sod., 2009).

Priprava reagentov za encimski test

Za določevanje aktivnosti transglutaminaze v bakterijski suspenziji S. platensis smo

pripravili reagente, ki so prikazani v tabeli 2.

Tabela 2: Priprava reagentov za test aktivnosti transglutaminaze.

Reagent

Priprava

reagent A (Tris pufer)

1000 mM, pH = 6,0 pri 37 °C

V 50 mL bučko smo zatehtali tris pufer (Trizma base) ter jo do

oznake 50 mL napolnili z destilirano vodo. pH smo uravnali na pH

6,0 pri temperaturi 37 °C.

reagent B CBZ-Glutamilglicin (CBZ-Gln-Gly) (slika 22).

reagent C

200 mM hidroksilamin z 20 mM

glutationa

Vsak dan sproti smo pripravili sveži reagent C. V 25 mL čašo smo

zatehtali 0,1389 g hidroksilamina in 0,0615 g glutationa. Dodali

smo 10 mL destilirane vode in dobro premešali, da je raztopina

postala homogena.

reagent D

1000 mM kalcijevega diklorida (CaCl2)

Zatehtali smo 1,109 g CaCl2 in dodali 10 mL destilirane vode.

Raztopino smo dobro premešali, da se je sol popolnoma raztopila.

reagent E

10 mM L-glutaminska kislina

γ- monohidroksimat raztopina

Zatehtali smo 0,0162 g glutaminske kisline γ- monohidroksimata

in dodali 10 mL destilirane vode. Ta reagent nam je pri encimskem

testu aktivnosti za transglutaminazo služil kot standard.



26

Reagent F

12 % (v/v) trikloroocetna kislina; TCA

Zatehtali smo 12 g TCA in dopolnili z destilirano vodo do oznake

100 mL.

Reagent G

5 % (wv) železov (III) klorid

heksahidrat; FeCl3×6H2O

Stehtali smo 5 g FeCl3×6H2O in dodali reagent H do oznake 100

mL. Dobili smo raztopino živo rumene barve.

Reagent H

100 mM klorovodikove kisline, HCl

0,828 mL klorovodikove kisline smo odpipetirali v 100 mL bučko

in dopolnili z destilirano vodo do oznake.

Reagent I Vzorec oziroma raztopina encima transglutaminaza.

Priprava reakcijske mešanice

Vsak dan sproti smo pripravili svežo reakcijsko mešanico (tabela 3). Zmešali smo 120

mg reagenta B, 2,00 mL reagenta A in 5,00 mL sveže pripravljenega reagenta C.

Reagente smo premešali, segreli na 37 °C in dodali 0,05 mL reagenta D. Reakcijsko

mešanico smo ponovno premešali. Reakcijski mešanici smo ob segrevanju in mešanju

s pomočjo magnetnega mešala umerili pH na 6 z 0,1 M NaOH pri 37 °C. Pripravljeno

raztopino smo razredčili z 2,95 mL destilirane vode in vsebino dobro premešali. Dobili

smo 10 mL sveže pripravljene reakcijske mešanice.

Tabela 3: Postopek priprave sveže reakcijske mešanice.

Reagent Količina

B 120 mg

A 2,00 mL

sveže pripravljen C 5,00 mL

Vsebino smo dobro premešali in segreli na 37 °C ter ob mešanju dodali:

D 0,05 mL

Vsebino smo premešali in vzdrževali temperaturo pri 37 °C in pH umerili na 6,0.




27

Slika 21: Priprava reakcijske mešanice.

Določevanje aktivnosti encima transglutaminaza

Določevanje aktivnosti encima transglutaminaza so potekale s pomočjo analitske

metode, ki temelji na merjenju peptidno vezanega CBZ-Gln-Gly

(glutaminilhidroksimata), ki ga tvori CBZ-glutaminilglicin v prisotnosti hidroksilamina

in encima transglutaminaza (Cui in sod., 2007). CBZ-Gln-Gly (CBZ-glutaminilglicin)

je bel prašek (slika 22), ki se skupaj s hidroksilaminom uporablja kot substrat za encim

transglutaminaza. Transglutaminaza katalizira kovalentno navzkrižno povezovanje

Gln-Gly, ki vsebujejo peptide.

Reakcija poteka po naslednji reakcijski shemi:

transglutaminaza

CBZ-Gln-Gly + hidroksilamin CBZ-Gln-Gly-hidroksimat

Slika 22: CBZ-glutaminilglicin (Zedira).

(Vir: zedira.com)



28

Priprava vzorcev za aktivnostni test transglutaminaze v celični suspenziji S.

platensis

Testne vzorce S. platensis smo pripravljali tako, da smo v 1,5 mL mikrocentrifugirko

zmešali 0,20 mL reakcijske mešanice in jo segreli na 37 °C. Dodali smo 0,03 mL celične

suspenzije S. platensis. Vsebino mikrocentrifugirke smo premešali na vorteksu in 10

minut inkubirali pri temperaturi 37 °C. Nato smo dodali 0,50 mL 12 % trikloroocetne

kisline (TCA) in vsebino premešali na vorteksu. Dodali smo še 0,50 mL 5 % železovega

(III) klorida heksahidrata in ponovno premešali na vorteksu.

Slepe testne vzorce (blank), ki so nam bili v pomoč za izračun aktivnosti encima

transglutaminaza v celični suspenziji S. platensis, smo prav tako pripravili v 1,5 mL

mikrocentrifugirki. Zmešali smo 0,20 mL reakcijske mešanice, 0,50 mL 12 %

trikloroocetne kisline (TCA) in 0,03 mL hranilnega medija. Vsebino smo premešali na

vorteksu in dodali 0,50 mL 5 % železovega (III) klorida heksahidrata ter ponovno

premešali na vorteksu.

Tako pripravljene vzorce smo centrifugirali 5 minut pri 11000 rpm/min s Centrifugo

5804 R (slika 23 – 2). Centrifugiranje je separacijska metoda, katere princip temelji na

različno hitrem usedanju delcev v polju centrifugalne sile. Sila teže oziroma zemeljski

gravitacijski pospešek je premajhen, da bi delce sedimentirali v krajšem času. Proces

usedanja pospešimo z delovanjem večjih pospeškov, to pa dosežemo s centrifugiranjem

(Anderluh in sod., 2009). Po centrifugiranju se na spodnji strani mikrocentrifugirk

nabere usedlina, zato smo si pripravili nove mikrocentrifugirke in s Pasteurjevo pipeto

vzeli supernatant. Prisotnost plavajočih delcev v raztopini moti merjenje absorbance.

Tako pripravljenim vzorcem smo na spektrofotometru Cary 50 Probe UV-Visible

Spectrophotometer (Slika 23 – 3) izmerili absorbance pri valovni dolžini 525 nm.

Testirali smo tudi vzorce, ki smo jih analizirali kot test standard in test slepi standard,

kot je navedeno v tabeli 4. Standarde smo potrebovali za izračune encimske aktivnosti

transglutaminaze v vzorcih celične suspenzije S. platensis.



29

Slika 23: 1 – vorteks Assistent; 2 – Centrifuga 5804 R; 3 – spektrofotometer Cary 50 Probe UV-Visible

Spectrophotometer.

Tabela 4: Postopek priprave vzorcev S. platensis za aktivnostni test transglutaminaze.

test

(vzorec S.

platensis)

slepi test

(blank)

test

(standard)

test

(standard

blank)

reakcijska mešanica 0,20 mL

Segreli smo na 37 °C.

reagent I

(celična suspenzija S.

platensis)

0,03 mL

Premešali smo na vorteksu in inkubirali 10 min pri temperaturi 37 °C.


reakcijska mešanica 0,20 mL

reagent E (standard) 0,10 mL

reagent F (TCA) 0,50 mL 0,50 mL 0,50 mL 0,50 mL

reagent I

(čisti hranilni medij)

0,03 mL

Premešali smo na vorteksu in dodali:

reagent G (FeCl3) 0,50 mL 0,50 mL 0,50 mL 0,50 mL

Premešali smo na vorteksu Assistent (slika 23 – 1).



30

Izračun encimske aktivnosti transglutaminaze v celični suspenziji S.

platensis

Za izračun aktivnosti encima transglutaminaza smo uporabili spodnji enačbi.

(3) EmM = (A525nm Std. – A525nm Std. B) × VStd.

Kjer je:

EmM razlika absorbanc standard in standard vzorca,

A525nm Std. izmerjena absorbanca standard vzorca pri valovni dolžini 525 nm,

A525nm Std. B izmerjena absorbanca standard blank vzorca pri valovni dolžini 525 nm

in

VStd. volumen standarda [1,1 mL].

Enačbo (3) smo uporabili za izračun razlike absorbanc standarda in standard blank

vzorca.

Sledil je izračun aktivnosti po enačbi (4):

(4) 𝒙 = (𝑨𝟓𝟐𝟓 𝒏𝒎 𝒕𝒆𝒔𝒕 − 𝑨𝟓𝟐𝟓 𝒏𝒎𝒕𝒆𝒔𝒕 𝒃𝒍𝒂𝒏𝒌)

𝑬𝒎𝑴 × 𝒕 × 𝑽𝒎𝒊𝒙

Kjer je:

x aktivnost encima transglutaminaza v celični suspenziji S.

platensis [unit/mL encima],

A525nm test izmerjena absorbanca test vzorca S. platensis pri valovni dolžini

525 nm,

A525nm test blank izmerjena absorbanca slepega vzorca pri valovni dolžini 525 nm,

EmM razlika absorbanc standard in standard vzorca,

t čas reakcije [10 minut] in

Vmix volumen mešanice [1,23 mL].



31

3.4.6 Nučiranje celične suspenzije S. platensis, sušenje in

tehtanje mokre in suhe mase celic S. platensis

Za določitev mase celic S. platensis iz celične suspenzije S. platensis smo uporabili

metodi odsesavanja (nučiranja) in sušenja. Za nučiranje smo pripravili ustrezno

aparaturo, ki je sestavljena iz presesalne buče in nuče, ki sta priklopljeni na vodno

črpalko. Bakterijsko suspenzijo S. platensis smo s pomočjo Pasteurjeve pipete počasi

prelivali v nučo, v kateri je bil stehtan filtrirni papir. Filtrat, ki je bil v presesalni buči

smo sterilizirali in zavrgli. Filtrirni papir z maso bakterijskih celic S. platensis (slika 25)

smo s pinceto vzeli iz nuče in dali na urno steklo (slika 26). Tako pripravljene

odnučirane vzorce S. platensis smo dali v sušilnik, kjer smo jih s pomočjo toplega zraka

sušili 60 minut pri temperaturi 70 °C (slika 27). Po eni uri so bili vzorci suhi. S tehtanjem

filtrirnih papirjev smo določili suho maso bakterijskih celic S. platensis. Maso suhih

celic S. platensis smo izračunali po enačbi 5 in jo spremljali skozi celotni proces (8 dni).

(5) m(suhih celic S. platensis) = m2 – m1

Kjer je:

m(suhih celic) masa suhih celic S. platensis [mg/10mL vzorca],

m2 masa suhega filtrirnega papirja s suho maso celic S. platensis

[mg] in

m1 masa suhega filtrirnega papirja pred nučiranjem [mg].



32

Določevanje suhe mase celic S.

platensis iz celične suspenzije S.

platensis je potekalo po zaporedju kot

prikazujejo slike 24 – 28.

Slika 24: Tehtanje urnega stekla in filtrirnega

papirja.

Slika 25: Nučiranje vzorca.

Slika 26: Mokra masa celic S. platensis na

filtrirnem papirju.

Slika 27: Odnučirani vzorci S. platensis.

Slika 28: Sušenje odnučiranih vzorcev S. platensis v sušilniku, 60 minut pri T = 70 °C.



33

3.5 Materiali

3.5.1 Kemikalije

Kemikalije za pripravo tekočega medija –za gojenje S. platensis:

glukoza (Sigma),

kvasni ekstrakt (Sigma),

sladni ekstrakt (Sigma) in

destilirana voda.

Reagenti uporabljeni pri testu za merjenje aktivnosti transglutaminaze:

CBZ-glutaminilglicin (Zedira),

glutation reduciran (Sigma-Aldrich),

99 % hidroksilamin hidroklorid (Sigma-Aldrich),

kalcijev diklorid, CaCl2, taljen, zrnast (Kemika),

L-Glutaminska kislina γ-monohidroksimat (Sigma-Aldrich),

natrijev hidroksid, NaOH (Merck),

triklorova kislina, TCA, CCl3COOH (Sigma-Aldrich),

Tris pufer, (HOCH2)3CNH2 (Sigma-Aldrich) in

železov (II) klorid heksahidrat, FeCl3×6H2O (Merck).

Reagenti uporabljeni za Bradfordov test za določevanje koncentracije proteinov:

85 % (v/v) fosforna kislina, H3PO4 (Kemika),

95 % etanol, CH3CH2OH (Kefo),

Barvilo Coomassie Brilliant modro (Merck) in

Milli-Q voda.



34

3.5.2 Laboratorijska oprema

UV-Vis spektrofotometer, Varian, Cary 50 Probe,

avtomatični avtoklav za sterilizacijo, Zirbus,

avtomatska pipeta Transferpette,

vortex, Assistent,

magnetno mešalo in grelna plošča Rotamix 550 MMH, Tehtnica Slovenija,

tehtnica (0,0001), Kern 770, INTERTECH,

pH/temperatura meter, Hanna instruments 991001,

centrifuga Centrifuge 5804 R, eppendorf,

inkubator in stresalnik Inkubator 1000 in Unimax 1010, Heidoplh,

optični mikroskop, Novex Holland opremljen s kamero Euromex Holland,

alufolija,

bombažni zamaški za erlenmajerice,

hladilnik,

1,5 mL plastične mikrocentrifugirke,

25 mL steklene posode s pokrovom,

50 mL steklene čaše,

100 mL steklene čaše,

100 mL merilne bučke,

100 mL merilni valj,

200 mL merilne bučke,

2000 mL steklena čaša,

1000 mL merilni valj,

5 mL pipeta,

1000 µL pipeta,

100 µL pipeta,

nastavki za pipete,

urna stekla,

filtrirni papir,

škarje,

stojalo za mikrocentrifugirke,

žlička,



35

steklena palčka,

zaščitne rokavice,

Pasteurjeve pipete,

presesalna buča,

nuča in

pinceta.



36

4 Rezultati in diskusija

V skladu z opisanimi laboratorijskimi metodami smo podali rezultate z diskusijo.

Preučili smo, kako sprememba pH okolja v celični suspenziji S. platensis vpliva na rast

celic, aktivnost encima transglutaminaza in koncentracijo proteinov. Celice S. platensis

smo gojili v hranilnem mediju za gojenje bakterije S. platensis, ki smo ga pripravili po

postopkih, opisanih v podpoglavju 3.4.1. Nacepljanje bakterij S. platensis in jemanje

vzorcev celične suspenzije S. platensis je potekalo v aseptičnih pogojih.

Naredili smo 3 izvedbe eksperimentalnega dela. Pri vsaki izvedbi smo celično

suspenzijo gojili in inkubirali 8 dni pri ustreznih pogojih. Na podlagi spremembe pH v

celični suspenziji S. platensis smo z Bradfordovim testom ugotovili, kolikšna je

koncentracija proteinov v celični suspenziji S. platensis. Z encimskim testom za

določevanje aktivnosti transglutaminaze smo določili, kolikšna je aktivnost

transglutaminaze v celični suspenziji S. platensis. Z nučiranjem celične suspenzije S.

platensis, sušenjem in tehtanjem mokre in suhe mase celic S. platensis smo določili pri

katerih pogojih je bil prirast mase celic S. platensis najvišji.

Pri 1. izvedbi, celični suspenziji S. platensis v procesu inkubiranja pH nismo

spreminjali. Začetni pH je bil 6,7. Pri 2. izvedbi inkubiranja celične suspenzije S.

platensis smo po vsakem odvzetem vzorcu pH celične suspenzije umerili nazaj na

začetno vrednost, to je 6,7. Pri 3. izvedbi smo začetni pH celične suspenzije S. platensis

umerili na 7,2 in ga v nadaljnjem procesu inkubiranja nismo več spreminjali. Proces

inkubiranja in gojenja celične suspenzije S. platensis posamezne izvedbe je trajal 8 dni.

Vsak dan smo ob 8. in ob 12. uri odvzeli 2 paralelki vzorca homogene celične suspenzije

S. platensis in ju testirali po opisanih metodah. Celična suspenzija S. platensis po osmih

dneh inkubiranja in gojenja ni bila več primerna za testiranje, saj se je ta primanjkovanja

hranil v hranilnem mediju in zniževanja pH zakisala in so počasi celice S. platensis

odmrle. Celična suspenzija S. platensis je pri vseh 3 izvedbah dobila tudi vonj po

razpadanju, ki je bil pri 3. izvedbi inkubiranja najintenzivnejši.



37

4.1 Spreminjanje pH celični suspenziji S. platensis

Želeli smo ugotoviti kako spreminjanje pH vpliva na celično suspenzijo S. platensis.

1. izvedba

V tabeli 5 so zapisani rezultati merjenja pH bakterijske suspenzije S. platensis v 1.

izvedbi, ki je opisana v metodah 3.4.3 (slika 18). Pri 1. izvedbi je bil začetni pH celične

suspenzije 6,7. V procesu inkubiranja S. platensis, pH nismo več spreminjali. Vsak dan

smo po vzorčenju celični suspenziji S. platensis izmerili pH in spremljali dogajanje.

Iz grafa 1 je razvidno, da se je vrednost pH v celični suspenziji S. platensis med

procesom do vključno 5. dneva zniževala (od začetne vrednosti pH 6,7 do 5,86). 6. in 7.

dan meritve nismo opravili. 8. dan inkubiranja celične suspenzije S. platensis smo

odvzeli vzorec in ugotovili, da se je vrednost pH celične suspenzije S. platensis znižala

le še za 0,03, na vrednost pH 5,83. Pri celotni 1. izvedbi inkubiranja celične suspenzije

S. platensis, se je pH bakterijski suspenziji znižal za 0,87. Četrti dan se je začelo hranilno

gojišče peniti. Penjenje je bilo vsak dan bolj intenzivno. Proti koncu procesa je nastopila

tudi sprememba v vonju bakterijske suspenzije S. platensis.



38

Tabela 5: pH v celični suspenziji S. platensis (1. izvedba).

dan čas [h] pH (1. izvedba)

1. 0 6,7

4 6,6

2. 24 6,52

28 6,43

3. 48 6,29

52 6,15

4. 72 6,1

76 6,05

5. 96 5,91

100 5,86

8. 168 5,83

172 5,83

5

5,2

5,4

5,6

5,8

6

6,2

6,4

6,6

6,8

0 4 24 28 48 52 72 76 96 100 168 172

pH

v b

akte

rijs

ki s

usp

enzi

ji S.

pla

ten

sis

čas [h]

pH (1. izvedba)

Graf 1: Spreminjanje pH pri gojenju bakterijske suspenzije S. platensis v 1. izvedbi v odvisnosti od časa

inkubiranja.



39

2. izvedba

V tabeli 6 so zapisani rezultati merjenja pH bakterijske suspenzije S. platensis pri 2.

izvedbi, ki je opisana v metodah 3.4.3 (slika 18). Pri 2. izvedbi smo celični suspenziji S.

platensis izmerili začetni pH 6,7. V procesu gojenja smo po vsakem odvzetem vzorcu

celične suspenzije S. platensis, umerili pH nazaj na začetno vrednost (pH 6,7).

Graf 2 prikazuje rezultate spreminjanja vrednosti pH pri 2. izvedbi inkubiranja celične

suspenzije S. platensis v odvisnosti od časa. Pri tej izvedbi poskusa smo po vsakem

vzorčenju celične suspenzije S. platensis, spremembo pH celične suspenzije uravnali

nazaj na začetno vrednost pH, ki je bila 6,7. Iz grafa 2 je razvidno, da je pH celične

suspenzije S. platensis v odvisnosti od časa inkubiranja hitro zniževal. Največja razlika

je vidna 3. dan inkubiranja celične suspenzije S. platensis ( po 52 urah inkubiranja), kjer

se je v samo 4 urah pH celične suspenzije znižal iz 6,7 na 5,1. Pri tem smo ugotovili, da

se je v celični suspenziji S. platensis 3. dan inkubiranja pojavilo tudi intenzivnejše

penjenje gojišča in suspenzija S. platensis je začela dobivati značilen vonj. V nadaljnjem

inkubiranju celične suspenzije S. platensis nismo več zaznali tako strmega padca

vrednosti pH v celični suspenziji. Kot je razvidno z grafa 2 se pH v celični suspenziji 8.

dan izvajanja eksperimenta ni več spreminjal.



40

Tabela 6: pH v bakterijski suspenziji S. platensis (2. izvedba).


1. 0 6,7

4 6,3

2. 24 6,1

28 6,5

3. 48 5,5

52 5,1

4. 72 5,4

76 5,9

5. 96 5,6

100 6,2

8. 168 6,6

172 6,6

Graf 2: Spreminjanje pH pri gojenju bakterijske kulture v odvisnosti od časa inkubacije celične

suspenzije S. platensis – 2. izvedba.

4,5

4,7

4,9

5,1

5,3

5,5

5,7

5,9

6,1

6,3

6,5

6,7

6,9

0 4 24 28 48 52 72 76 96 100 168 172

pH

v b

akte

rijs

ki s

usp

enzi

jiS.

pla

ten

sis

čas [h]

pH (2. izvedba)

pH 6,7



41

3. izvedba

V tabeli 7 so zapisani rezultati merjenja pH v bakterijski suspenziji S. platensis pri 3.

izvedbi, ki je opisana v metodah 3.4.3 (slika 18). Pri 3. izvedbi eksperimentalnega dela

smo celični suspenziji S. platensis začetni pH umerili na 7,2. V procesu gojenja pH

nismo več spreminjali.

Rezultati 3. izvedbe inkubiranja celične suspenzije S. platensis v odvisnosti od časa

inkubacije so prikazani na grafu 3. Razberemo lahko, da se je pH bakterijske suspenzije

zelo hitro zniževal. Že po prvih 4 urah inkubiranja celične suspenzije S. platensis, se je

pH v celični suspenziji S. platenis znižal s 7,2 na 6,6. Na podlagi rezultatov lahko

predvidevamo, da sprememba pH na začetku inkubiranja ni ustrezala rasti celic S.

platensis, saj se je celična suspenzija hitro zakisala. Ugotovili smo, da gojišče s pH 7,2

ni primerno za rast in razmnoževanje bakterije S. platensis, saj se je hitreje kot v prvih

2 izvedbah pojavilo penjene gojišča. Značilen vonj po razpadanju se je pojavil že 2. dan

inkubacije celične suspenzije S. platensis.



42

Tabela 7: pH v bakterijski suspenziji S. platensis (3. izvedba).


1. 0 7,2

4 6,6

2. 24 6,5

28 6,5

3. 48 4,6

52 4,5

4. 72 4,2

76 4,2

5. 96 4,2

100 4,2

8. 168 4,2

172 4,2

Graf 3: Spreminjanje pH pri gojenju bakterijske kulture v odvisnosti od časa inkubiranja – 3. izvedba.

4

4,2

4,4

4,6

4,8

5

5,2

5,4

5,6

5,8

6

6,2

6,4

6,6

6,8

7

7,2

7,4

0 4 24 28 48 52 72 76 96 100 168 172

pH

v b

akte

rijs

ki s

usp

enzi

ji S.

pla

ten

sis

čas [h]

pH (3. izvedba)



43

Primerjava spreminjanja pH pri vseh 3 izvedbah inkubiranja celične suspenzije S.

platensis v odvisnosti od časa inkubiranja

V tabeli 8 in na grafu 4 vidimo, da se je pH pri inkubiranju celične suspenzije S. platensis

v odvisnosti od časa in ob stalnem stresanju pri temperaturi 28 °C zniževal pri vseh 3

izvedbah. pH se je lahko nižal zaradi sproščanja CO2 in drugih plinov, ki nastajajo pri

procesu gojenja in inkubiranja celične suspenzije S. platensis in razgradnji organskih

snovi. Bakterije S. platensis so iz hranilnega gojišča porabljale kisik in izločale ogljikov

dioksid, ki tvori ogljikovo kislino in vpliva na nižanje pH.

Da so v procesu gojenja nastajali plini, ki so povzročili nižanje pH celične suspenzije S.

platensis, dokazuje tudi naše opažanje, da se je pri vseh 3 izvedbah gojišče začelo peniti

(slika 28). Penjenje je pri prvih 2 izvedbah nastopilo takrat, ko smo celični suspenziji S.

platensis izmerili pH 6,2, v 3. izvedbi pa pri izmerjenem pH 6,5 (1. izvedba – 4. dan; 2.

izvedba – 3. dan; 3. izvedba – 2. dan). Še isti dan se je pri celični suspenziji S. platensis

pojavil tudi vonj po razpadanju, ki pa dokazuje, da se je začela razgradnja organskih

snovi. Nizek pH celične suspenzije S. platensis je najverjetneje povzročil tudi

denaturacijo proteinov.

Slika 29: Gojišče se je začelo peniti.



44

Tabela 8: pH v bakterijski suspenziji S. platensis (primerjava vseh 3 izvedb).

Graf 4: Primerjava vseh 3 izvedb – spreminjanje pH pri gojenju bakterijske kulture S. platensis v

odvisnosti od časa inkubiranja.

4

4,2

4,4

4,6

4,8

5

5,2

5,4

5,6

5,8

6

6,2

6,4

6,6

6,8

7

7,2

7,4

0 4 24 28 48 52 72 76 96 100 168 172

pH

v b

akte

rijs

ki s

usp

enzi

ji S.

pla

ten

sis

čas [h]

pH (1. izvedba)

pH (2. izvedba)

pH (3. izvedba)

pH 6,7

dan čas [h] pH (1. izvedba) pH (2. izvedba) pH (3. izvedba)

1. 0 6,7 6,7 7,2

4 6,6 6,3 6,6

2. 24 6,5 6,1 6,5

28 6,4 6,5 6,5

3. 48 6,3 5,5 4,6

52 6,2 5,1 4,5

4. 72 6,1 5,4 4,2

76 6,05 5,9 4,2

5. 96 5,9 5,6 4,2

100 5,86 6,2 4,2

8. 168 5,8 6,6 4,2

172 5,8 6,6 4,2



45

V procesu inkubiranja bakterije S. platensis se je pH v celični suspenziji znižal, kar

prikazuje tudi graf 4. Iz rezultatov je razvidno, da se je pH zniževal v vseh 3 izvedbah.

Pri 1. izvedbi eksperimenta je pH v celični suspenziji S. platensis v odvisnosti od časa

inkubiranja najpočasneje upadal. Pri drugi izvedbi smo po vsakem vzorčenju celične

suspenzije S. platensis, umerili pH na 6,7. Na grafu vidimo, da se je pH hitro zniževal.

Največja sprememba pH je bila 3. dan inkubiranja celične suspenzije S. platensis (po 48

urah), ko se je gojišče začelo peniti in dobivati vonj po razpadanju. Pri 3. izvedbi smo

začetni pH celične suspenzije ustalili na 7,2. Z grafa 4 lahko razberemo, da je pri tej

izvedbi pH dosegel najnižjo vrednost, to je 4,2. Menimo, da smo z začetno spremembo

pH na 7,2 pospešili celotni proces gojenja celične suspenzije S. platensis, saj se je

gojišče začelo peniti že 1. dan inkubiranja, vonj po razpadanju pa je začela dobivati 2.

dan.

V procesu inkubiranja celične suspenzije S. platensis smo opazili tudi spremembe v

barvi in strukturi bakterijskih celic. Spremembe so vidne na slikah 30 in 31. 1. dan so

bakterije S. platensis svetlo rumene barve, skupki so bistri in čisti, zadnji dan testiranja

pa so bakterije S. platensis rjave barve in so skupki razmazani.

Po določenem času je v bakterijski suspenziji S. platensis nastopila tudi sprememba

vonja. Bakterije so dobile vonj po razpadanju (podobno vonju gnilega krompirja), ki je

postajal iz dnevna v dan intenzivnejši. Tudi pri nučiranju smo opazili razliko. 3. dan

testiranja se je gojišče ob nučiranju začelo peniti. Intenzivneje se je gojišče penilo tudi

pri inkubiranju in stresanju. Predvidevamo, da je do tega prišlo zaradi nastanka plinov,

ki so se proizvajali pri procesu razgradnje bakterij.

Slika 30 prikazuje hranilno gojišče 1. dan, slika 31 pa gojišče 8. dan. Vidne so

spremembe v bistrosti gojišča. 1. dan inkubiranja celične suspenzije S. platensis (slika

30) je gojišče bistro in čisto, zadnji dan inkubiranja (slika 31) pa je gojišče motno in

zakisano.



46

Slika 30: Tekoče gojišče z bakterijami S.

platensis 1. dan inkubiranja.

Slika 31: Tekoče gojišče z bakterijami S.

platensis 8. dan inkubiranja.



47

4.2 Preostala koncentracija proteinov v celični

suspenziji S. platensis

Koncentracijo proteinov v celični suspenziji S. platensis smo določali s pomočjo

Bradfordove metode. Bakterijski suspenziji S. platensis smo izmerili absorbance pri

valovni dolžini 595 nm. S pomočjo umeritvene krivulje smo določili koncentracije

proteinov v celični suspenziji S. platensis. Rezultati, kolikšna je koncentracija proteinov

v celični suspenziji so v Prilogi A (tabela 10 in graf 8). V nadaljevanju (graf 6) pa smo

podajali izračunano preostalo koncentracijo proteinov [%] v celični suspenziji S.

platensis.

Graf 5: Preostala koncentracija proteinov [%] v celični suspenziji S. platensis v odvisnosti od časa

inkubiranja pri temperaturi 28 °C in ob stalnem rahlem stresanju.

Pri inkubiranju celične suspenzije S. platensis pri temperaturi 28 °C ob stalnem stresanju

in v odvisnosti od inkubacijskega časa je preostala koncentracija proteinov pri vseh 3

izvedbah raziskave do določenega dne naraščala, potem pa se je koncentracija proteinov

pričela zniževati. Na koncu procesa (to je po 8 dneh) se je koncentracija proteinov v

celični suspenziji S. platensis ustalila (graf 5). Z grafa 5 je razvidno, da se je

koncentracija proteinov v celični suspenziji S. platensis, ki smo jo inkubirali pri 1.

izvedbi, kjer pH nismo spreminjali, najbolj povečala. Najvišjo preostalo koncentracijo

proteinov (260 %) smo v celični suspenziji dosegli 3. dan inkubiranja. Celična

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240

260

280

0 4 24 28 48 52 72 76 96 100 168 172

pre

ost

ala

kon

cen

trac

ija p

rote

ino

v v

bak

teri

jski

su

spen

ziji

S. p

late

nsi

s[%

]

čas [h]

1. izvedba

2. izvedba

3. izvedba



48

suspenzija S. platensis se je 3. dan tudi najbolj zakisala, zato lahko sklepamo, da so

bakterije S. platensis za svojo rast in razvoj porabile vse hranilne snovi in začele

odmirati ter razpadati. Posledično smo lahko zaznali značilen vonj po razpadanju

bakterije S. platensis. Sklepamo, da so se pri inkubiranju celične suspenzije S. platensis

iz bakterijskih celic izločili vsi ekstracelularni proteini, zaradi česar se je povečala

koncentracija skupnih proteinov v suspenziji. Ker pa se je pH celične suspenzije pri

inkubiranju še nižal, sklepamo, da so se izločeni ekstracelularni proteini denaturirali,

zato se je preostala koncentracija skupnih proteinov v celični suspenziji S. platensis

znižala. Enako se je dogajalo pri inkubiranju celične suspenzije S. platensis pri 2. in 3.

izvedbi, vendar v pospešenem procesu. S spreminjanjem pH hranilnega medija smo

celotni proces pospešili za približno 1 dan. Tako smo pri 2. izvedbi dobili najvišjo

preostalo koncentracijo proteinov (130 %) 2. dan inkubiranja celične suspenzije S.

platensis. Pri 3. izvedbi je bila največja preostala koncentracija proteinov (70 %)

dosežena že 1. dan inkubiranja celične suspenzije S. plantensis.

Z grafa 5 je razvidno, da se je pri inkubiranju celične suspenzije S. platensis pri vseh 3

izvedbah preostala koncentracija skupnih proteinov v celični suspenziji na koncu

procesa znižala. Sklepamo lahko, da je prišlo do denaturacije proteinov.

4.3 Preostala aktivnost encima transglutaminaza v

celični suspenziji S. platensis

Aktivnost encima transglutaminaza v celični suspenziji S. platensis smo določili z

encimskim testom za določanje aktivnosti transglutaminaze, po postopku, ki je opisan

v laboratorijskih metodah v podpoglavju 3.4.5. Rezultati aktivnosti encima

transglutaminaza v celični suspenziji S. platensis so podani v Prilogi B (tabela 11 in graf

9). V nadaljevanju smo podali rezultate preostale aktivnosti encima transglutaminaza

[%] v celični suspenziji S. platensis.

Aktivnost transglutaminaze smo določevali pri vseh 3 izvedbah. Encim

transglutaminaza je sekundarni metabolit. Raziskovalci (Döhren in Gräfe, 1997) so

ugotovili, da se sekundarni metaboliti začnejo intenzivneje izločati, kadar v gojišču

začne primanjkovati hranil. Na podlagi tega lahko sklepamo, kdaj je pri naših izvedbah



49

hranilnemu mediju začelo primanjkovati hranil. Najvišjo preostalo aktivnost encima

transglutaminaza (1160 %) v celični suspenziji S. platensis smo dosegli pri 1. izvedbi

(kjer pH v hranilnem mediju nismo spreminjali), in sicer 4. dan inkubiranja celične

suspenzije S. platensis. Ugotovili smo, da je četrti dan hranilnemu mediju pričelo

primanjkovati hranil in rast bakterijske S. platensis je prešla v stacionarno fazo. Za

stacionarno fazo rasti je značilno, da se rast celic upočasni in tvorijo se sekundarni

metaboliti. Preostala aktivnost encima je ostala konstantna do konca procesa inkubiranja

celične suspenzije S. platensis. Z grafa 6 lahko razberemo, da je aktivnost

transglutaminaze pri 2. in 3. izvedbi inkubiranja celične suspenzije S. platensis veliko

nižja. V 2. izvedbi inkubiranja celične suspenzije (kjer smo pH hranilnemu mediju po

vsakem vzorčenju uravnali na začetno vrednost pH 6,7) je najvišja preostala aktivnost

transglutaminaze 370 %. Sklepamo lahko, da je 3. dan hranilnemu mediju začelo

primanjkovati hranil. Pri 3. izvedbi inkubiranja celične suspenzije S. platensis (kjer smo

na začetku inkubiranja hranilnemu mediju pH uravnali na 7,2) je bila najvišja preostala

aktivnost encima 120 % in je bila dosežena že 1. dan inkubiranja celične suspenzije S.

platensis. Z grafa 6 je razvidno, da aktivnost transglutaminaze pri posamezni izvedbi,

ko doseže svojo maksimalno aktivnost, ostane bolj ali manj konstantna. Le pri 2. izvedbi

inkubiranja celične suspenzije S. platensis se je preostala aktivnost transglutaminaze na

koncu procesa inkubiranja zmanjša za 70 %.

Graf 6: Preostala aktivnost transglutaminaze [%] v bakterijski suspenziji S. platensis v odvisnosti od

časa inkubiranja pri temperaturi 28 °C in ob stalnem rahlem stresanju.

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

1100

1200

0 4 24 28 48 52 72 76 96 100 168 172

pre

ost

ala

akti

vno

st t

ran

sglu

tam

inaz

e v

bak

teri

jski

su

spen

ziji

S. p

late

nsi

s [%

]

čas [h]

1. izvedba

2. izvedba

3. izvedba



50

4.4 Prirast suhe mase celic S. platensis

Maso celic S. platensis smo določili z metodo nučiranja bakterijske suspenzije, s

sušenjem in tehtanjem mokre in suhe mase celic, in sicer tako, kot je zapisano v

laboratorijskih metodah, podpoglavje 3.4.6. V Prilogi C so tabelarično (tabela 12) in

grafično (graf 10) prikazani rezultati prirast suhe mase celic S. platensis v odvisnosti od

časa inkubiranja bakterijske suspenzije S. platensis. V nadaljevanju so podani rezultati

prirasta suhe mase celic S. platensis v celični suspenziji.

Graf 7 prikazuje rezultate prirasta suhe mase celic S. platensis v bakterijski suspenziji

pri vseh 3 izvedbah eksperimenta. Največji prirast suhe mase celic v celični suspenziji

S. platensis je bil dosežen pri 1. izvedbi, in sicer na 7. dan inkubiranja celične suspenzije

in je znašal 480 %. Pri 2. izvedbi inkubiranja celične suspenzije S. platensis je bil

največji prirast suhe mase 210 % in je bil dosežen 4. dan inkubiranja celične suspenzije

S. platensis. Pri 3. izvedbi je bil prirast suhe mase celic S. platensis minimalen, to je 33

%, in je ostal do konca procesa inkubiranja celične suspenzije S. platensis konstanten.

Na grafu 7 vidimo, da smo pri 1. izvedbi največji prirast suhe mase celic S. platensis

dosegli na koncu procesa inkubiranja celične suspenzije, to je 8. dan. Pri 2. izvedbi smo

največji prirast suhe mase celic S. platensis dosegli 4. dan inkubiranja celične

suspenzije, pri 3. izvedbi pa smo največjo prirast suhe mase celic S. platensis dosegli 3.

dan inkubiranja. Pri 3. izvedbi inkubiranja celične suspenzije S. platensis je bil prirast

suhe mase celic S. platensis zelo nizek. Na podlagi tega lahko sklepamo, da bakterijska

suspenzija S. platensis pri 3. izvedbi ni imela primernih pogojev za rast celic S. platensis.

Predvidevamo lahko, da sprememba pH na začetku procesa ni bila primerna za gojenje

te bakterijske kulture.



51

Graf 7: Prirast suhe mase celic S. platensis [%] v odvisnosti od časa inkubiranja pri temperaturi 28 °C

in ob stalnem rahlem stresanju.

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

0 4 24 28 48 52 72 76 96 100 168 172

pri

rast

su

he

mas

e ce

lic S

. pla

ten

sis

[%]

čas [h]

1. izvedba

2. izvedba

3. izvedba



52

4.5 Opazovanje bakterije S. platensis skozi optični

mikroskop

Morfološke značilnosti mikroorganizmov lahko opazujemo z različnimi

mikroskopskimi tehnikami. Mikroskop uporabljamo tudi za kvantifikacijo populacij ali

za preverjanje možnih kontaminacij (Habulin, Primožič, 2008).

Skozi mikroskop smo opazovali celice iz celične suspenzije S. platensis pred

inkubiranjem in 8. dan inkubiranja.

Slika 32: Celice S. platensis skozi optični

mikroskop pred inkubiranjem.

Slika 33: Celice S. platensis skozi optični mikroskop 8.

dan inkubiranja.

Sliki 32 in 33 prikazujeta primerjavo celic S. platensis skozi optični mikroskop. Med

slikama opazimo razliko, saj so bile celice S. platensis pred inkubiranjem razvejane in

nitaste. Celice S. platensis so po 8 dneh inkubiranja razpadle in nimajo več prvotne

oblike. Sklepamo, da je prišlo do procesa razpadanja in razgradnje organskih snovi, kar

je dokazovala tudi sprememba v vonju celične suspenzije S. platensis.

S programom Image Focus V2.6 smo bakterijskim celicam S. platensis pred

inkubiranjem celične suspenzije S. platensis izmerili prečne premere. V tabeli 9 so

prikazani rezultati meritev. Ugotovili smo, da je povprečni prečni premer nitaste

bakterije S. platensis 1,42 µm. Na sliki 34 lahko vidimo kako se nitaste bakterije S.

platensis prepletajo med seboj. 8. dan inkubiranja celice S. platensis nimajo več prvotne

nitasto razvejane oblike, zato razpadlim celicam (slika 33) nismo mogli izmeriti

prečnega premera.



53

Tabela 9: Prečni premer bakterij S. platensis izmerjen s programom Image Focus V2.6.

oznaka prečni premer [µm]

L1 1,23

L2 1,57

L3 1,43

L4 1,43

L5 1,46

Slika 34: Prečni premeri bakterijskih celic S. platensis pred inkubiranjem.

Sliki 35 in 36 prikazujeta celice iz celične suspenzije S. platensis pri nučiranju. S slik

sta že na prvi pogled razvidni razliki v barvi in strukturi celic S. platensis. Pred

inkubiranjem so skupki celic S. platensis rumene barve. Po osmih dnevih inkubiranja

celične suspenzije so celice S. platensis razmazane in rjave barve.

Slika 35: Celice S. platensis pred inkubiranjem.

Slika 36: Celice S. platensis osmi dan inkubiranja.



54

5 Zaključek

Celično suspenzijo S. platensis smo pri 3 različnih izvedbah inkubirali 8 dni pri

temperaturi 28 °C, ob rahlem stalnem stresanju in pri različnem pH. Posamezna izvedba

je trajala 8 dni. Pri vsaki izvedbi smo sveže pripravljeni celični suspenziji S. platensis

ustrezno spremenili pH in z vsakodnevnim vzorčenjem, ob 8. in 12. uri spremljali

spremembe, ki so se dogajale s celično suspenzijo S. platensis. Skozi celoten proces smo

spremljali spreminjanje pH celične suspenzije S. platensis in z ustreznimi metodami

določili preostalo koncentracijo proteinov, preostalo aktivnost encima transglutaminaza

ter prirast suhe mase celic S. platensis.

pH v celični suspenziji se je zniževal pri vseh 3 izvedbah inkubiranja in prav tako se je

po določenem času zakisala tudi celična suspenzija S. platensis. Pri 1. izvedbi se je v

celotnem procesu inkubiranja celične suspenzije S. platensis pH znižal za 0,87. Pri 2.

izvedbi se je pH celične suspenzije pospešeno zniževal in se 3. dan v samo 4 urah znižal

za 1,6 (s 6,7 na 5,1). Prav tako se je pH zniževal tudi pri tretji izvedbi inkubiranja, kjer

se je že 1. dan celična suspenzija zakisala, pH pa se je znižal za 0,6. Ugotovili smo, da

se je zniževanje pH v procesu inkubiranja dogajalo zaradi sproščanja ogljikovega

dioksida in drugih plinov, ki nastajajo pri procesu gojenja celične suspenzije S. platensis

in razgradnji organskih snovi. Bakterije S. platensis iz gojišča porabljajo kisik in

izločajo ogljikov dioksid, ki se raztopi v vodi, kar pa povzroča nastanek ogljikove

kisline. Ogljikova kislina pa vpliva na nižanje pH okolja. Da so pri procesu nastajali

plini, dokazuje naše opažanje, da se je gojišče po določenem času začelo peniti in

dobivati vonj po razpadanju. Pri 1. prvi izvedbi sta se penjenje in vonj po razpadanju

pojavila 4. dan, pri 2. izvedbi 3. dan in pri 3. izvedbi 2. dan inkubiranja celične

suspenzije S. platensis.

Preostala koncentracija proteinov v celični suspenziji S. platensis je naraščala v

odvisnosti od časa inkubiranja pri vseh 3 izvedbah. Najvišjo preostalo koncentracijo

proteinov smo določili pri prvi izvedbi, saj je 3. dan inkubiranja celične suspenzije

preostala koncentracija proteinov znašala 260 %. Pri 2. izvedbi smo najvišjo preostalo

koncentracijo proteinov izmerili 2. dan inkubiranja in je znašala 130 %. Pri 3. izvedbi



55

pa je bila najvišja preostala koncentracija proteinov v primerjavi s prvima dvema

izvedbama najnižja in je znašala 70 %.

Prav tako se je pri vseh 3 izvedbah inkubiranja celične suspenzije S. platensis v

odvisnosti od časa povečevala preostala aktivnost encima transglutaminaza. Iz literature

smo razbrali, da se encim transglutaminaza začne intenzivneje izločati, kadar v gojišču

začne primanjkovati hranil, to je v stacionarni fazi rasti. Pri 1. izvedbi inkubiranja

celične suspenzije S. platensis smo najvišjo preostalo aktivnost encima izmerili četrti

dan in je znašala 1160 %. Pri 2. izvedbi inkubiranja je bila najvišja vrednost preostale

aktivnosti transglutaminaze izmerjena 3. dan in je znašala 370 %, medtem ko smo

najvišjo preostalo aktivnost encima pri 3. izvedbi izmerili že 1. dan in je znašala 120 %.

V odvisnosti od časa inkubiranja celične suspenzije S. platensis se je pri vseh 3 izvedbah

povečeval tudi prirast suhe mase celic S. platensis. Največji prirast suhe mase celic S.

platensis smo ugotovili pri 1. izvedbi inkubiranja celične suspenzije S. platensis in je po

sedmih dneh inkubiranja znašal 480 %, medtem ko je bil prirast suhe mase celic S.

platensis v 2. izvedbi 210 %, pri 3. izvedbi pa le 33 %. V stacionarni fazi rasti nastopi

fenomen prikrite rasti, ko se nekatere celice sicer delijo, vendar jih enako število odmre.

Stacionarni fazi rasti sledi faza odmiranja, kjer se število živih celic v populaciji

progresivno zmanjšuje.

Iz pridobljenih eksperimentalnih rezultatov lahko potrdimo našo predvidevanje, da je za

gojenje celic in pridobivanje encimov ter proteinov iz bakterijske suspenzije S. platensis

najbolj ugodno inkubiranje pri milih pogojih, to je pri 1. izvedbi, pri temperaturi 28 °C,

ob rahlem stresanju in pri pH gojišča z začetno vrednostjo 6,7. Spreminjanje pH gojišča

ni bilo najbolj primerno za gojenje celic S. platensis, saj so celice začele hitreje propadati

in oddajati neprijeten vonj po razpadanju.



56

6 Literatura

1. Akst, J. (2014). How a Microbe Resists Its Own Antibiotics. The Scientist.

http://www.the-scientist.com/?articles.view/articleNo/39237/title/How-a-

Microbe-Resists-its-Own-Antibiotics/ (dostopno 24. 5. 2017).

2. Anderluh, G., Maček, P., Sepčič, K., Turk, T. (2009). Eksperimentalne metode

v biokemiji. Ljubljana, Scripta, Študentska založba.

3. Bavec, A., Zorko, M., Stojan, J. (2008). Navodila za laboratorijske vaje iz

biokemije s teoretičnim dodatkom. Ljubljana, Študentska založba.

4. Boyer, R. (2005). Temelji biokemije, Ljubljana: Študentska založba.

5. Bradford, M. M. (1976). A rapid and Sensitive Method fort he Quantitation of

Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye

Binding, Georgia, Analytical Biochemistry 72, 248 – 254.

6. Cui, L., Du, G., Zhag, D., Lin, H., Chen, J. (2005). Purification and

characterization of transglutaminase from a newly isolated Streptomyces

hygroscopicus. Food Chemistry. Volume 105, 612-618

7. Eckert, R. L., Kaartinen, M. T., Nurminkaya, M., Belkin, A. M., Colak, G.,

Johnson, G. V. W., Mehta, K. (2014). Transglutaminase Regulation of Cell

Function. Physiological Reviews Published.

http://physrev.physiology.org/content/94/2/383.full-text.pdf+htmL

(pridobljeno 29. 5. 2017)

8. Enzyme nomenclature database. Swiss Institute of Bioinformatics.

http://enzyme.expasy.org/ (pridobljeno 27. 6. 2017).

9. Euzéby, J. P. (2008). "Genus Streptomyces". List of Prokaryotic names with

Standing in Nomenclature. Retrieved 2008-09-28.

10. Gerritsen, B. V. (2003). The earth's perfume.

http://web.expasy.org/spotlight/back_issues/035/ (dostopno 18. 5. 2017).

11. Grobelnik, K. (2016). Aktivnost encimov iz Wallemie ichthyophage po

izpostavitvi v SC CO2. Magistrsko delo. Univerza v Mariboru. Fakulteta za

kemijo in kemijsko tehnologijo.

http://www.the-scientist.com/?articles.view/articleNo/39237/title/How-a-Microbe-Resists-its-Own-Antibiotics/

http://www.the-scientist.com/?articles.view/articleNo/39237/title/How-a-Microbe-Resists-its-Own-Antibiotics/

http://physrev.physiology.org/content/94/2/383.full-text.pdf+html

http://enzyme.expasy.org/

http://web.expasy.org/spotlight/back_issues/035/



57

12. Holt, J. G., Krieg, N. R., Sneath, P. H. A., Staley, J. T., Williams, S. T. (1994).

Bergey's manual of deterinative bacteriology. 9th ed. Baltimore, Williams &

Wilkins: 668-668.

13. Iancu, C., Butu, N., Bahrim, G. (2009). Preliminary studies regarding

Transglutaminase synthesis by polar filamentous Bacteria of the genus

Streptomyces sp., Innovative Romanian Food Biotechnology, University of

Galati.

14. Kapun-Dolinar, A. (2001). Mikrobiologija. Ljubljana: Zavod Republike

Slovenije za šolstvo.

15. Kämpfer, P. (2006). "The Family Streptomycetaceae, Part I: Taxonomy". The

Prokaryotes. Vol 3. Archea. Bacteria: Firmicutes, Actinomycetes. Dworkin M.

New York, Springer.

16. Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. A. (2000).

Practical Streptomyces genetics. Norwich, The John Innes Fundation: 2 -33.

17. Kolednik, L. (2014). Aktivnost encimov iz kvasovk Phaeotheca triangularis.

Diplomsko delo, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kemijo in kemijsko

tehnologijo.

18. Leitgeb, M. (2014). Zapiski s predavanj pri predmetu Pregled tehnologij.

Univerza v Mariboru, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo.

19. Liu, S., Zhang, D., Wang, M., Cui, W., Chen, K., Liu, Y., Du, G.,Chen, J.,

Zhou, Z., (2011). The pro-region of Streptomyces hygroscopicus

transglutaminase affects its secretion by Escherichia coli. Federation of

European Microbiological Societies. Microbiology Letters.

20. Madigan M, Martinko J, eds. (2005). Brock Biology of Microorganisms (11th

ed.). Prentice Hall.

21. Miletić, N. (2009). Improved biocatalysts on Candida antartica lipase B

immobilization, University of Groningen.

22. Nagy, V., Szakacs, G. (2008). Production of transglutaminase by Streptomyces

isolates in solid-state fermentation. Budapest University of Technology and

Economics. Letters in Applied Microbiology.

23. Potočnik, U., Perin, P. (2013). Biokemija in molekularna biologija, navodila za

laboratorijske vaje, Maribor.

https://books.google.com/books?id=swciHNNWZDEC&pg=PA538



58

24. Scarnato, L., Montanari, C., Serrazanatti D. I., Aloisi, I., Balestra F., Del Duca,

S., Lanciotti, R. (2017). New bread formulation with improved rheological

properties and longer shelf-life by the combined use of transglutaminase and

sourdough. Food Science and Technology. University of Bologna, Italy.

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0023643817301871

(pridobljeno 29. 5. 2017).

25. Schrempfe, H. (2006). The family Streptomycetaceae, Part II: Molecular

biology. The prokaryotes. Archea. Bacteria: Firmicutes, Actinomycetes.

Dworkin, M. New Yourk, Springer.

26. Sodelavci Medicinske fakultete v Ljubljani in drugi. (2012). Slovenski

medicinski slovar. Univerza v Ljubljani, Medicinska faluteta.

http://www.termania.net/slovarji/slovenski-medicinski

slovar/5540078/streptomyces (dostopno 18. 5. 2017).

27. Wiki FKKT UL. (2014), Transglutaminaza.

http://wiki.fkkt.uni-lj.si/index.php/Transglutaminaza (dostopno 18. 5. 2017).

28. Wikipedia the free encyclopedia. (2017). Streptomyces.

https://en.wikipedia.org/wiki/Streptomyces (dostopno 18.5.2017).

6.1 Viri slikovnega materiala

Slika 1: Geosmin, pridobljeno 17. 6. 2017,

https://simplyfantasticbooks.com/tag/rain/.

Slika 3: Nastanek peptidne vezi z vezavo dveh aminokislin, pridobljeno 18. 5.

2017, http://ocelici.weebly.com/beljakovine.htmL.

Slika 4: Primarna, sekundarna, terciarna in kvartarna struktura proteinov

(primer hemoglobina), pridobljeno 18. 5. 2017,

https://sl.wikipedia.org/wiki/Beljakovina#/media/File:225_Peptide_Bond-

01.jpg.

Slika 5: Model ključ – ključavnica, pridobljeno 18. 5. 2017,

https://eucbeniki.sio.si/kemija9/1108/index7.htmL.

Slika 22: CBZ-Glutamilglicin, pridobljeno 22. 6. 2017,

http://zedira.com/Assays-and-substrates/Glutamine-donor-peptides/Z-Gln-Gly-

OH_C001?oswsid=93de9e5c7c0cc25e1c0b64fba3e88c10.

Vir ostalih slik je lasten.

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0023643817301871

http://www.termania.net/slovarji/slovenski-medicinski%20slovar/5540078/streptomyces

http://www.termania.net/slovarji/slovenski-medicinski%20slovar/5540078/streptomyces

https://en.wikipedia.org/wiki/Streptomyces

https://simplyfantasticbooks.com/tag/rain/

http://ocelici.weebly.com/beljakovine.html

https://sl.wikipedia.org/wiki/Beljakovina#/media/File:225_Peptide_Bond-01.jpg

https://sl.wikipedia.org/wiki/Beljakovina#/media/File:225_Peptide_Bond-01.jpg

https://eucbeniki.sio.si/kemija9/1108/index7.html

http://zedira.com/Assays-and-substrates/Glutamine-donor-peptides/Z-Gln-Gly-OH_C001?oswsid=93de9e5c7c0cc25e1c0b64fba3e88c10

http://zedira.com/Assays-and-substrates/Glutamine-donor-peptides/Z-Gln-Gly-OH_C001?oswsid=93de9e5c7c0cc25e1c0b64fba3e88c10



59

Priloge

Priloga A

Tabela 10: Koncentracija proteinov v bakterijski suspenziji S. platensis [mg/mL].

Koncentracija proteinov v bakterijski suspenziji S. platensis [mg/mL]

dan čas [h]

1. izvedba

[mg/mL]

2. izvedba

[mg/mL]

3. izvedba

[mg/mL]

1. 0 0,02569 0,04044 0,04

4 0,02988 0,05447 0,0498

2. 24 0,03628 0,09182 0,0521

28 0,05793 0,09273 0,0678

3. 48 0,08129 0,08323 0,0197

52 0,08482 0,03881 0,0108

4. 72 0,09179 0,01448 0,00314

76 0,06352 0,00885 0,00314

5. 96 0,0286 0,00547 0,00314

100 0,023 0,00594 0,00314

8. 168 0,023 0,00568 0,00314

172 0,023 0,00569 0,00314



60

Graf 8: Koncentracija proteinov v bakterijski suspenziji S. platensis [mg/mL] v odvisnosti od časa


0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0,09

0,1

0 24 48 72 96 120 144 168 192

kon

cen

trac

ija p

rote

ino

v v

bak

teri

jski

su

spen

zicj

i S.

pla

ten

sis

[mg/

mL]

čas [h]

1. izvedba

2. izvedba

3. izvedba



61

Priloga B

Tabela 11: Aktivnost transglutaminaze [enot/mL] v bakterijski suspenziji S. platensis.

Aktivnost transglutaminaze [enot/mL] v bakterijski suspenziji S. platensis

dan čas [h]

1. izvedba

[enot/mL]

2. izvedba

[enot/mL]

3. izvedba

[enot/mL]

1. 0 0,000165 0,000417 0,000604

4 0,000203 0,000535 0,000688

2. 24 0,000839 0,000792 0,000747

28 0,00088 0,00101 0,000716

3. 48 0,00088 0,00103 0,00072

52 0,00135 0,00118 0,00072

4. 72 0,00147 0,00195 0,000725

76 0,0015 0,0019 0,000738

5. 96 0,00192 0,00155 0,000738

100 0,00205 0,00143 0,000738

8. 168 0,00205 0,00143 0,000738

172 0,00205 0,00143 0,000738



62

Graf 9: Aktivnost transglutaminaze [enot/mL] v bakterijski suspenziji S. platensis v odvisnosti od časa


0

0,0002

0,0004

0,0006

0,0008

0,001

0,0012

0,0014

0,0016

0,0018

0,002

0,0022

0 24 48 72 96 120 144 168 192

akti

vno

st t

ran

sglu

tam

inaz

e [e

no

t/m

L] v

bak

teri

jski

su

spen

ziji

S. p

late

nsi

s

čas [h]

1. del

2. del

3. del



63

Priloga C

Tabela 12: Prirast suhe masae celic S. platensis [mg/10 mL vzorca].

m celic S. platensis [mg/10 mL vzorca]

dan čas [h]

1. izvedba

[mg/10 mL vzorca]

2. izvedba

[mg/10 mL vzorca]

3. izvedba

[mg/10 mL vzorca]

1. 0 0,04 0,05 0,16

4 0,04 0,052 0,185

2. 24 0,07 0,089 0,189

28 0,086 0,091 0,2

3. 48 0,115 0,134 0,2

52 0,138 0,146 0,2

4. 72 0,148 0,156 0,2

76 0,165 0,147 0,2

5. 96 0,195 0,146 0,2

100 0,205 0,146 0,2

8. 168 0,233 0,146 0,2

172 0,233 0,146 0,2



64

Graf 10: Suha m celic S. platensis [mg/10 mL vzorca] v odvisnosti od časa inkubiranja pri temperaturi 28

°C in ob stalnem rahlem stresanju.

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0 24 48 72 96 120 144 168 192

Suh

a m

celic

Str

epto

myc

es p

late

nsi

s [m

g/1

0 m

L vz

orc

a]

čas [h]

1. del

2. del

3. del

Documents

Vida Lang - dk.um.si