Upload
lamcong
View
219
Download
3
Embed Size (px)
Citation preview
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM KHOA MÔI TRƯỜNG & CÔNG NGHỆ SINH HỌC
------
BÀI GIẢNG
THỰC HÀNH
VI SINH VI SINH VI SINH VI SINH ỨNG DNG DNG DNG DỤNGNGNGNG
TS. Nguyễn Hòai Hương
Dùng cho sinh viên ngành Công nghệ Sinh học Năm xuất bản: 2009
2
MỤC LỤC
Trang
Giới thiệu môn học 4
Bài 1 Vi khu�n amôn hóa 5
I Lý thuyết 5
II Thực hành 5
1. Môi trường - hóa chất 5
2. Tiến hành thí nghiệm 6
3. Quan sát và ghi nhận kết quả 7
III Bài nộp 8
Bài 2 Vi khu�n nitrate hóa 9
I Lý thuyết 9
II Thực hành 9
1. Môi trường - hóa chất 10
2. Tiến hành thí nghiệm 10
3. Quan sát và ghi nhận kết quả 10
III Bài nộp 11
Bài 3 Vi khu�n phản nitrate hóa 12
I Lý thuyết 12
II Thực hành 12
1. Môi trường - hóa chất 12
2. Tiến hành thí nghiệm 13
3. Quan sát và ghi nhận kết quả 13
III Bài nộp 14
Bài 4 Vi khu�n cố định nitơ 15
I Lý thuyết 15
II Thực hành 16
1. Môi trường - hóa chất 16
2. Tiến hành thí nghiệm 17
3. Quan sát và ghi nhận kết quả 17
III Bài nộp 18
Bài 5 Vi khu�n phân hủy cellulose 19
3
I Lý thuyết 19
II Thực hành 20
1. Môi trường - hóa chất 20
2. Tiến hành thí nghiệm 20
3. Quan sát và ghi nhận kết quả 20
III Bài nộp
Tài liệu tham khảo
Phụ lục
21
22
23
4
GIỚI THIỆU MÔN HỌC Môn thực hành vi sinh ứng dụng nhằm giúp sinh viên làm quen với các phương
pháp phân lập, khảo sát các vi sinh vật được ứng dụng trong xử lý môi trường, công
nghệ lên men. Các vi sinh ứng dụng thường được phân lập từ môi trường tự nhiên,
chúng có khả năng sử dụng các cơ chất khác nhau, chuyển hóa vật chất trong tự nhiên.
Nguồn phân lập chúng có thể từ đất, nước, động vật, thực vật hay thực phNm. Phân
lập, xác định chức năng, định danh chúng là bước đầu đưa chúng vào ứng dụng.
Trong khuôn khổ bài thực hành môn vi sinh ứng dụng sinh viên phân lập vi
sinh vật chủ yếu từ môi trường đất. Đất là một trong những cơ chất thuận lợi nhất đối
với sự phát triển của các loại vi sinh vật khác nhau. Số lượng vi sinh trong 1 g đất có
tới hàng trăm triệu, thậm chí hàng tỉ tế bào. Hoạt động sống của vi sinh vật đất có liên
quan đến nhiều quá trình xảy ra trong đất, trước hết là các vòng tuần hoàn của vật chất
trong tự nhiên như chu trình carbon, chu trình nitơ, phospho và lưu huỳnh.
Các bước chung của bài thực hành là
1. Phát hiện các nhóm vi sinh vật trong mẫu đất bao gồm đại diện của một số
nhóm phân loại
2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh trưởng và hình thái tế bào học tế bào của các
đại diện thuộc vi sinh vật phân lập được.
NỘI DUNG THỰC HÀNH
BÀI 1: VI KHUẨN AMÔN HÓA
BÀI 2: VI KHUẨN NITRATE HÓA
BÀI 3: VI KHUẨN PHẢN NITRATE HÓA
BÀI 4: VI KHUẨN CỐ ĐNNH NITƠ
BÀI 5: VI SINH VẬT PHÂN GIẢI CELLULOSE
5
BÀI 1: VI KHUẨN AMÔN HÓA
I. Lý thuyết
Quá trình amôn hóa là quá trình phân giải protein và các hợp chất hữu cơ khác có
chứa nitơ tạo thành amoniac. Các vi sinh vật có khả năng amôn hóa bao gồm nhiều
loài sinh bào tử hoặc không sinh bào tử, có khả năng sử dụng nhiều nguồn vật chất
khác nhau. Ngoài ra còn nhiều loại xạ khuNn và nấm khuNn ty. Tuy vậy, những vi sinh
vật chỉ sử dụng riêng một loại protein thì không nhiều.
Các vi sinh vật này có khả năng tiết men phân giải protein vào môi trường, thủy
phân thành các amino acid. Khi đó, chúng sử dụng các amino acid này trong quá trình
dị hóa và đổng hóa. Các sản phNm đặc trưng của quá trình phân giải protein là NH3 và
H2S.
Quá trình phân giải protein có thể xảy ra trong các điều kiện hiếu khí và kỵ khí.
Trong điều kiện hiếu khí, các hợp chất hữu cơ có chứa nitơ được phân giải bởi các
loài trong giống Bacillus và Pseudomonas, các đại diện trong họ Enterobacteriaceae,
các xạ khuNn và nấm khuNn ty. Trong đó, vai trò quan trọng và chủ yếu nhất là giống
Bacillus. Trong điều kiện kỵ khí thì các loài trong giống Clostridium tham gia quá
trình chuyển hóa này. Còn trong điều kiện thông khí hạn chế, quá trình amôn hóa
được thực hiện bới các loài vi khuNn và trực khuNn kỵ khí tùy nghi.
II. Thực hành
Việc phát hiện và xác định số lượng các vi sinh vật amôn hóa được thực hiện bằng
cách cấy các mẫu phân tích vào môi trường lỏng và rắn canh thịt-peptone.
Việc cấy lên môi trường thạch được tiến hành bằng dịch huyền phù đã thanh trùng
Pasteur nhằm tiêu diệt các tế bào sinh dưỡng và chỉ còn giữ lại bào tử của các đại diện
thuộc giống Bacillus – giống đặc trưng nhất cho quá trình amôn hóa.
Ngoài ra, việc cấy lên môi trường thạch cho phép nhận định được các đặc tính
khác nhau của khuNn lạc các vi khuNn khác nhau này.
1. Môi trường - hóa chất
- Môi trường canh thịt- peptone:
Cao thịt 5g
Peptone 10g
Nước 1000ml
6
- Môi trường thạch: Trộn vào môi trường lỏng 2% thạch.
- Dung dịch pha loãng mẫu: dung dịch nước muối sinh lý tiệt trùng.
Giấy lọc loại thấm acetate chì
- Giấy quỳ đỏ
- Các loại thuốc nhuộm quan sát vi sinh vật: thuốc nhuộm Gram và thuốc nhuộm
bào tử
- Thuốc thử Nessler:
Hòa tan 50 g KI trong 35 ml nước cất không đạm. Thêm dung dịch
HgCl2 bão hòa cho đến khi xuất hiện kết tủa. Thêm 400 ml KOH 50%
pha lõang đến 1 l, để lắng, sử dụng dịch trong.
2. Tiến hành thí nghiệm
Chu�n bị môi trường:
- Môi trường canh thịt-peptone được phân vào khoảng 1/3 chiều cao ống nghiệm,
khử trùng ở 1 atm, 15 phút.
- Các dải giấy quỳ và giấy lọc thấm acetat chì được cho vào đĩa petri, hấp khử
trùng ở 0,5 atm.
- Môi trường thạch canh thịt-peptone: sau khi hấp khử trùng được phân vào các
đĩa petri, giữ ở 30OC
Chu�n bị mẫu:
- Mẫu đất được pha với nước để thu dịch huyền phù
Ủ vi sinh vật trên môi trường lỏng:
- Cấy từ các dịch pha loãng nồng độ 102, 103, 104, 105, 106
- Lấy 1ml dịch pha loãng cấy vào ống nghiệm có chứa môi trường canh thịt-
peptone đã khử trùng ở trên
- Dùng kẹp lấy các dải giấy quỳ và giấy lọc thấm acetate chì gài vào giữa nút bông
và ống nghiệm
- Ủ ở nhiệt độ 30OC trong 3 ngày đêm.
- Mẫu đối chứng là môi trường không cấy dịch huyền phù.
Ủ vi sinh vật trên môi trường thạch:
- Cấy từ các dịch pha loãng nồng độ 102, 103, 104, 105, 106
- Lấy 0,1 ml dịch pha loãng cho vào các đĩa petri có chứa môi trường đã khử
trùng ở trên
- Dùng que trang trải đều lên bề mặt thạch
7
- Ủ ở nhiệt độ 30oC trong 3 ngày đêm.
- Mẫu đối chứng là môi trường không cấy dịch huyền phù.
3. Quan sát và ghi nhận kết quả
Môi trường lỏng:
Quan sát:
- Sự đục môi trường
- Sự tạo bông, kết cạn
- Nổi váng trên bề mặt.
Phản ứng sinh hóa:
- Thử với thúôc thử Nessler: nhỏ một giọt thuốc thử Nessler lên đĩa sứ trắng,
thêm một que cấy đầy đất vườn ủ trong peptone broth. Quan sát màu kết tủa:
Màu vàng nhạt – ít ammoniac
Vàng sậm – nhiều ammoniac
Nâu – rất nhiều ammoniac
- Dùng giấy quỳ thử sự sinh NH3 (làm giấy quỳ hóa xanh).
- Quan sát màu giấy lọc thấm acetate chì: sự sinh H2S làm giấy lọc thấm acetate
chì hóa đen.
- So sánh đối chứng và thí nghiệm và ghi kết quả vào bảng sau:
Độ pha
loãng
Đục môi
trường
Tạo bông Tạo cặn Sinh NH3 Sinh H2S
- Chọn một độ pha loãng có tỷ lệ vi sinh vật cao nhất làm tiêu bản và soi kính
hiển vi.
Môi trường thạch:
Ghi nhận:
- Số lượng khuNn lạc trên 1 đĩa ở mỗi độ pha loãng
- Quan sát hình thái khuNn lạc, mô tả, ghi nhận vào bảng sau:
Độ pha loãng Số khu�n lạc Hình thái
khu�n lạc
Xuất hiện bào tử
8
- Làm tiêu bản và soi kính hiển vi
- So sánh hình thái quan sát được giữa tiêu bản từ môi trường lỏng và môi
trường thạch
- Chụp hình khuNn lạc, tế bào.
III. Bài nộp
- Nộp kết quả ghi chép trong thí nghiệm và hình chụp khuNn lạc, tế bào.
- Nêu ứng dụng vi khuNn amôn hóa.
9
BÀI 2: VI KHUẨN NITRATE HÓA
I. Lý thuyết
Nitrate hóa là quá trình oxi hóa NH3 thành HNO3, cung cấp năng lượng cho vi
sinh vật hoạt động. Quá trình oxi hóa này xảy ra cùng với quá trình đồng hóa CO2.
Hầu hết các vi sinh vật tự dưỡng hóa năng vô cơ thuộc loại hiếu khí bắt buộc đều có
khả năng thực hiện quá trình này.
Nitrate hóa qua 2 giai đoạn:
Đầu tiên là giai đoạn oxi hóa NH3 thành nitrite bởi một số đại diện thuộc nhóm vi
khuNn nitrite hóa: Nitrosomonas, Nitrosocystis, Nitrosococcus, Nitrosolobus, ...Tất cả
chúng đều giống nhau về mặt sinh lý, sinh hóa, chỉ khác nhau về mặt hình thái học và
cấu trúc tế bào.
Các đại diện của giống Nitrosomonas không sinh nội bào tử, tế bào nhỏ bé hình
bầu dục. Trên môi trường lỏng, Nitrosomonas trải qua một số pha, phát triển tùy thuộc
một số điều kiện. Hai pha chủ yếu là pha di động- tế bào có 1 hay chùm tiên mao và
pha tập đoàn khuNn keo-các tế bào không di động.
Giai đoạn 2 của quá trình nitrate hóa oxi hóa nitrite thành nitrate bởi một số vi
khuNn: Nitrobacter winogradski, N. agilis, Nitrospina gracilis, Nitrococcus mobilis.
Tế bào đặc trưng của Nitrobacter trong dịch nuôi thường có dạng hình que
tròn, hình hạt đậu, hoặc hình trứng, có thể di động hoặc không di động. Khi điều kiện
không thuận lợi chúng có thể hình thành những tập đoàn khuNn keo. Nitrospina
gracilis là những trực khuNn thẳng, mảnh dẻ, thỉnh thoảng có dạng hình cầu, không di
động, và có đặc trưng là hình thành những tập đoàn khuNn keo. Nitrococcus mobilis
thì có dạng hình tròn, có tiên mao.
Vi khuNn nitrate hóa không sử dụng các chất hữu cơ và chuyển hóa một cách chặt
chẽ đối với việc oxi hóa cơ chất-NH3 và nitrite.
II. Thực hành
Việc phát hiện vi khuNn nitrate hóa được thực hiện bằng cách cấy dịch huyền phù
cần phân tích lên môi trường chọn lọc vô cơ Winogradski. Nguồn C duy nhất trong
môi trường này là CO2 có trong không khí và trong thành phần của CaCO3. Nguyên
liệu năng lượng và nguồn N cho các vi khuNn gây ra giai đoạn đầu của quá trình
nitrate hóa là NH3 và muối amôn, còn đối với vi khuNn gây ra giai đoạn hai là nitrite.
10
Điều kiện cần thiết đối với sự phát triển của vi khuNn nitrate hóa là việc thông khí
đầy đủ vào môi trường nuôi cấy.
1. Môi trường - hóa chất
- Môi trường Winogradski phân lập Nitrosomonas spp.
(NH4)2SO4 2 g/l
K2HPO4 1 g/l
MgSO4.7 H2O 0,5 g/l
FeSO4 . 7H2O 0,4 g/l
NaCl 2 g/l
Chia vào các bình thủy tinh 50ml, cho vào mỗi bình một ít CaCO3. Hấp khử
trùng ở 1 atm
- Môi trường phân lập Nitrobacter spp.
NaNO2 1,0 g
MgSO4. 7H2O 0,5 g
FeSO4. 7H2O 0,03 g
NaCl 0,3 g
Na2CO3 1,0 g
K2HPO4 1,0
Nước 1 L
Chỉnh pH về 7,3.
- Dung dịch pha loãng mẫu
- Tinh thể diphenylamin
- H2SO4 đậm đặc
2. Tiến hành thí nghiệm
- ChuNn bị môi trường: Môi trường đã hấp khử trùng được phân vào các ống nghiệm
- Xác định vi sinh vật trên môi trường lỏng:
Pha loãng mẫu 102 - 105
Mỗi độ pha loãng lấy 1ml mẫu cấy vào ống nghiệm có chứa môi trường đả khử
trùng ở trên
Ủ ở 30OC trong 2-3 tuần
- Làm 1 ống nghiệm đối chứng
3. Quan sát và ghi nhận kết quả:
11
- Ở mỗi độ pha loãng, ghi nhận sự thay đổi môi trường trong ống nghiệm
- Những ống nghiệm nào ghi nhận có vi khuNn phát triển, cần tiến hành thử nghiệm
định tính.
Phản ứng định tính nitrate: Lấy vài tinh thể diphenylamin hòa tan trong 1 giọt
H2SO4 đậm đặc. Sau đó thêm 1 giọt dịch cần kiểm tra. Tiến hành trên bản sứ trắng sẽ
thấy xuất hiện màu xanh thNm. Ghi nhận kết quả vào bảng:
Ống
nghiệm
số
Độ pha loãng
102 103 104 105 106
NO2- NO3- NO2- NO3- NO2- NO3- NO2- NO3- NO2- NO3-
Chọn ống nghiệm có kết quả dương tính làm tiêu bản quan sát dưới kính hiển
vi. Cần lưu ý chọn được cả những hạt CaCO3, vì xung quanh hạt này, tỷ lệ vi khuNn là
cao nhất. Miêu tả, so sánh hình thái các tế bào vi khuNn quan sát được.
III. Bài nộp
- Nộp kết quả ghi chép trong thí nghiệm và hình chụp khuNn lạc, tế bào.
- Nêu ứng dụng vi khuNn nitrate hóa.
12
BÀI 3. VI KHUẨN PHẢN NITRATE HÓA I. Lý thuyết
Phản nitrate hóa là quá trình vi sinh vật thực hiện việc khử nitrate thành nitơ phân
tử, đồng thời oxi hóa các chất hữu cơ như đường, rượu, axit hữu cơ thành CO2 và H2O
với chất nhận điện tử cuối cùng là NO3-. Năng lượng sinh ra khi oxi hóa cơ chất được
vi sinh vật sử dụng trong quá trình hoạt động sống của mình.
Quá trình phản nitrate hóa có thể xảy ra trong điều kiện hiếu khí lẫn kỵ khí, nhưng
đặc biệt mạnh trong điều kiện kỵ khí.
Các vi sinh vật thực hiện quá trình này phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Phần
lớn chúng thuộc loại dị dưỡng hóa năng hữu cơ, kỵ khí tùy nghi gồm một số giống
Pseudomonas, Achromobacter, Micrococcus …
II. Thực hành
Việc phát hiện vi khuNn phản nitrate hóa được thực hiện bằng phương pháp cấy
mẫu lên môi trường chứa hợp chất C ở dạng oxi hóa, có nitrate và các hợp chất khác
cần cho quá trình sinh tổng hợp của tế bào. Các vi khuNn này sử dụng nitrate làm chất
nhận electron nhưng không dùng làm nguồn N trong quá trình đồng óa, vì không thể
khử NO3- thành NH4
+. Vì vậy, trong môi trường nuôi cấy vi khuNn phản nitrate hóa,
người ta cho thêm peptone, asparagine hoặc muối amôn và hạn chế lưu khí trong quá
trình nuôi cấy.
1. Môi trường- hóa chất
- Môi trường Giltay:
Dung dịch A:
Asparagine (C4HgN2O3. H2O) 1g
KNO3 1g
Nước máy: 0,25 l
Dung dịch B:
Citric acid hoặc 5g
Citrate kali 8,5 g
KH2PO4 1g
MgSO4.7H2O 1g
13
CaCl2.6H2O: 0,2g
FeCl2. 4H2O vết
Nước máy: 0,25l
Nếu sử dụng acid citric cần bổ sung KOH 10% với phenolphthalein làm
chất chỉ thị. Hòa 0,25l dung dịch A và 0,25l dung dịch B, sau đó thêm nước
máy đến 1L dung dịch môi trường Giltay hoàn tất.
2. Tiến hành thí nghiệm
- ChuNn bị môi trường: môi trường Giltay với thành phần như trên được phân vào
6 ống nghiệm, hấp khử trùng 0,5 atm.
- Pha loãng mẫu 103- 107
- Lấy 1ml mẫu cấy sâu vào đáy ống nghiệm có chứa môi trường đã khử trùng ở
trên. Ống đối chứng không cấy mẫu.
- Ủ ở 30OC trong 7 ngày đêm.
3. Quan sát và ghi nhận kết quả
Dấu hiệu chủ yếu nhất cho sự phát triển của vi khuNn nitrate hóa là sự sinh khí, làm
đục và giảm pH của môi trường.
- Quan sát các ống nghiệm ở các độ pha loãng khác nhau và ghi nhận vào bảng.
- Kiểm tra việc khử nitrate trong môi trường bằng phản ứng sinh hóa với
diphenylamine
Độ pha loãng Đục môi
trường
Sinh khí pH môi
trường
NO3-
103
104
105
106
107
- Chọn 1 ống nghiệm cho kết quả tốt nhất làm tiêu bản, quan sát kính hiển vi và
ghi nhận hình thái học của các vi khuNn phản nitrate hóa phân lập được.
- Kiểm tra việc khử nitrate trong môi trường bằng phản ứng sinh hóa với
diphenylamine: Lấy vài tinh thể diphenylamine hòa tan vào một giọt H2SO4 đặc,
sau đó thêm vào một giọt dịch nghiên cứu. Nếu có mặt nitrate sẽ xuất hiện màu
xanh thẫm.
14
III. Bài nộp
- Nộp kết quả ghi chép trong thí nghiệm và hình chụp khuNn lạc, tế bào.
- Nêu ứng dụng vi khuNn phản nitrate hóa.
15
BÀI 4. VI SINH VẬT CỐ ĐNNH NITƠ
I. Lý thuyết
Cố định N là khả năng đồng hóa N phân tử của một số vi sinh vật và dùng làm
nguồn kiến tạo tế bào. Các vi sinh vật cố định N sống tự do, có nhiều trong đất, hay
sống cộng sinh trong nốt sần cây họ đậu, hai họ quan trọng nhất là Azotobacteraceae
và Rhizobiaceae. Trong bài thí nghiệm này chúng ta sẽ phân lập các vi khuNn cố định
đạm tự do thuộc họ Azotobacteraceae.
Trong họ Azotobacteraceae có hai giống vi khuNn cố định đạm tự do trong điều
kiện hiếu khí là Azotobacter và Azomonas. Tất cả các loài thuộc giống Azotobacter và
Azomonas đều sống dị dưỡng, dùng nhiều nguồn carbon khác nhau, monosacharide,
disacharide, polysacharide (dextrin, tinh bột), nhiều rượu và acid hữu cơ, các hợp chất
có vòng thơm…Nguồn nitơ có thể là nitơ phân tử, cũng có thể là muối amôn, nitrate,
nitrite, amino acid. Tùy thuộc nồng độ các hợp chất có nitơ này trong môi trường mà
quá trình cố định nitơ phân tử sẽ bị ức chế nhiều hay ít. Đồng thời chúng có nhu cầu
lớn đối với P và Ca, cũng như để cố định nitơ mạnh mẽ chúng cần Mo và B.
Phần lớn các loài Azotobacter chỉ phát triển được ở pH lớn hơn 6, vì vậy hầu như
không gặp chúng ở đất chua. Azotobacter cần độ Nm cao hơn so với nhiều vi khuNn
khác nên cũng ít gặp chúng ở các vùng đất khô hạn.
Giống Azotobacter theo Khóa phân lạoi Bergey gồm 6 lòai chính: A. chroococcum,
A. vilelandii, A. beijerinckii, A. nigricans, A. armenicanus và A. paspali; trong khi đó
giống Azomonas gồm 3 lòai chính: A. agilis, A. insignis và A. macrocytpgenes. Có thể
phân biệt các lòai này qua khả năng sinh kén, khả năng di động, khả năng tổng hợp
sắc tố, khả năng phát hùynh quang (Bảng 1).
Bảng 1. Phân biệt các lòai thuộc giống Azotobacter và Azomonas dựa vào đặc
điểm hình thái
Giống Lòai Kén Di
động
Sắc tố tan trong nước
Nâu
đen
Nâu
đen –
đỏ tím
Đỏ
tím
Lục Vàng
– lục
hùynh
quang
Lam-
trắng
hùynh
quang
A z A. + + - - - - - -
16
chroococcum
A. vilelandii + + - - +/- +/- + -
A. beijerinckii + - - - - - - -
A. nigricans + - +/- + +/- - - -
A. armenicanus + + - + + - - -
A. paspali + + - - + - + -
Azo
mo
na
s
A. agilis - + - - - - + +
A. insignis - + +/- - +/- - +/- -
A.
macrocytpgene
s
- + - - - - +/- +/-
Qua bảng 1 ta nhận thấy tất cả các Azotobacter đều sinh kén, ngược lại với các
Azomonas. Cả ba lòai thuộc giống Azomonas đều có hình thái khuNn lạc và tế bào rất
giống A. chroococcum. Hầu hết chúng tổng hợp sắc tố phát hùynh quang (phát hiện
khi chiếu tia cực tím λ = 364 nm trong buồng tối).
II. Thực hành
Việc phát hiện Azotobacter và Azomonas được thực hiện trên môi trường chọn lọc
Thompson-Skerman không chứa nitơ hợp chất, trong điều kiện hiếu khí và độ Nm cao.
1. Môi trường- hóa chất
- Môi trường Thompson-Skerman (N2-free glucose) tăng sinh
K2HPO4: 1g
MgSO4: 0,2g
FeSO4: 0,2g
CaCl2: 0,1g
Na2MoO4: 0,001g
Glucose: 10g
Nước máy: 1000ml
- Môi trường Thompson-Skerman (N2-free glucose) phân lập
K2HPO4: 1g
MgSO4: 0,2g
17
CaCl2: 0,1g
Na2MoO4: 0,001g
Glucose: 10g
Nước máy: 1000ml
Agar: 3% thể tích môi trường
- ChuNn bị môi trường Thompson-Skerman với thành phần như trên, hấp khử
trùng ở 121oC trong 15 phút 1 atm.
- Buồng tối có đèn cực tím.
2. Tiến hành thí nghiệm
- Giai đoạn tăng sinh: Cân 1g đất cho vào erlen có 50 ml môi trường Thompson-
Skerman tăng sinh đã hấp khử trùng với thành phần như trên. Ủ 4-7 ngày 30OC.
- Giai đọan sau tăng sinh: kiểm tra xem có vi khuNn mong múôn không: soi kính
X 100 hay soi dầu quan sát tìm tế bào hình oval hay que đứng riêng lẻ hay cặp đôi.
- Giai đoạn phân lập: Cấy truyền từ môi trường tăng sinh vào môi trường
Thompson-Skerman phân lập đã phân vào đĩa petri và hấp khử trùng. Ủ 3-5 ngày,
30oC.
3. Quan sát và ghi nhận kết quả
- Quan sát và ghi nhận hình thái vi khuNn đặc trưng sau giai đoạn tăng sinh.
Hình dạng tế
bào Bào tử
Kích
thước
Sự sắp xếp
tế bào
Hình vẽ tế
bào
Lọai 1
Lọai 2
…
- Ghi nhận các loại khuNn lạc khác nhau xuất hiện sau giai đoạn phân lập. Mô tả
các khuNn lạc đó:
Khu�n
lạc
Hình
dạng Bề mặt
Độ
trong
Màu
sắc
Huỳnh
quang
Khuếch
tán màu
vào môi
trường
Số lượng
khu�n lạc
loại này
18
- Chọn các khuNn lạc đặc trưng nhất làm tiêu bản giọt ép đề quan sát bao nhầy. Soi
kính hiển vi vật kính 40X đề kiểm tra hình thái vi khuNn: kích thước lớn, thường
đứng thành đôi và có bao nhầy.
- Ghi nhận các đặc điểm này vào bảng:
Hình dạng tế
bào Bào tử
Kích
thước
Sự sắp xếp
tế bào
Hình vẽ tế
bào
Lọai 1
Lọai 2
…
III. Bài nộp
- Nộp kết quả ghi chép trong thí nghiệm và hình chụp khuNn lạc, tế bào.
- Nêu ứng dụng vi khuNn cố định nitơ.
19
BÀI 5:VI SINH VẬT PHÂN GIẢI CELLULOSE I. Lý thuyết
Cellulose là thành phần cấu tạo cơ bản của thành tế bào thực vật. Việc tổng hợp
cellulose có quy mô phức tạp hơn hẳn việc tổng hợp những hợp chất khác. Do đó, vi
sinh vật phân giải cellulose có vai trò đặc biệt quan trọng trong chu trình tuần hoàn
Carbon.
Sự phân giải tiến hành trong điều kiện hiếu khí lẫn kỵ khí, môi trường kiểm hoặc
acid, độ Nm thấp hoặc cao và ở các nhiệt độ khác nhau. Tất cả vi sinh vật tham gia vô
cơ hóa cellulose đều thuộc loại dị dưỡng hóa năng hữu cơ, có enzyme cellulase xúc
tác việc phân giải cellulose thành cellobiose và glucose. Vi sinh vật dùng các hợp chất
sinh ra này làm nguồn carbon và nguồn năng lượng.
Trong điều kiện hiếu khí, các vi sinh vật tham gia vào quá trình này gồm niêm
khuNn, một số đại diện của các vi khuNn không sinh bào tử và sinh bào tử, xạ khuNn,
nấm...Trong đó, quan trọng nhất là niêm khuNn (Myxobacteria).
Niêm khuNn có tế bào hình que nhỏ bé (03-0,4 x 0,7-10µm) hơi uốn cong, thường
có đầu nhọn, thành tế bào mỏng và nhuộm màu kém hơn so với các vi khuNn khác.
Trên cơ chất đặc niêm khuNn có chuyển động trượt, do sự tiết chất nhầy không đồng
đều trên bề mặt tế bào. Vài loài niêm khuNn có tiên mao, có chu kỳ phát triển phức
tạp. Đầu tiên, các tế bào hình que từ từ dầy lên, biến thành những tế bào dạng nghỉ,
hình cầu hoặc bầu dục, kích thước khác nhau.
Niêm khuNn phân giải cellulose chủ yếu gồm các giống Cytophaga,
Sporocytophaga, Sorangium sống trong đất ít acid, trung tính và ít kiềm. Các loài
thuộc giống Cytophaga có tế bào đầu nhọn, không sinh vi kén. Các loài trong giống
Sporocytophaga có hình thái tương tự như Cytophaga nhưng khác ở chỗ có khả năng
sinh vi kén. Các loài thuộc giống Sorangium là những trực khuNn đầu nhọn, có khả
năng hình thành kén.
Trên bề mặt vật liệu có cellulose, niêm khuNn phát triển trong dạng thể nhầy,
không có hình dạng xác định, lan rộng, không màu hoặc có màu vàng, da cam, đỏ
tương ứng với chỗ cellulose bị phân giải nhiều hay ít.
Ngoài niêm khuNn, trong đất còn có các loài phân giải cellulose thuộc giống
Cellvibrio, tế bào uống cong, di động nhờ 1 tiên mao, không sinh nội bào tử, khuNn
20
lạc không màu hoặc có màu vàng lục. Chúng chỉ dùng cellulose khi cạn kiệt các
nguồn cacbon khác và khả năng phân giải không mạnh mẽ bằng niêm khuNn.
Trong đất chua, vai trò phân giải do các nấm thuộc giống Chaelomium,
Trichoderma, Fusarium, Aspergillus...
II. Thực hành
Hầu hết tất cả những loài phân giải cellulose thuộc nhóm hiếu khí và ưa Nm.
Việc phát hiện và xác định sô lượng các vi sinh vật phân giải cellulose trong điều
kiện hiếu khí được tiến hành bằng cách cấy dịch huyền phù nghiên cứu lên các đĩa
chứa môi trường chọn lọc Hutchinson có nguồn carbon duy nhất là cellulose. Nuôi
cấy trong điều kiện hiếu khí.
1. Môi trường và hóa chất
- Môi trường Hutchinson (g)
KNO3 2,5
K2HPO4 1,0
MgSO4 0,3
CaCl2 0,1
NaCl 0,1
FeCl3 0,01
Agar 3%
Nước máy 1000ml
2. Tiến hành thí nghiệm
- ChuNn bị các đĩa petri có môi trường Hutchinson với thành phần như trên, hấp
khử trùng ở 1 atm.
- Giấy lọc cắt thành những khoanh tròn kích thước tương ứng đĩa petri. Hấp khử
trùng ở 1 atm.
- Mẫu đất pha với nước máy để lấy dịch huyền phù
- Cấy 0,1 ml dịch huyền phù từ độ pha loãng 102 đến 106, trang đều lên bề mặt
bằng que cấy trang.
- Dùng kẹp sắt đã khử trùng trên ngọn lửa gắp 1 khoanh giấy lọc vô trùng đặt áp
sát lên bề mặt. Mỗi độ pha loãng lập lại 3 lần, đậy nắp đĩa petri.
- Nuôi cấy 30OC trong 12-14 ngày đêm.
3. Quan sát và ghi nhận kết quả
21
- Quan sát và đếm số lượng khuNn lạc vi sinh vật mọc được trên khoanh giấy lọc
trong mỗi đĩa petri.
- Xác định xem khuNn lạc là của nhóm vi sinh vật nào (niêm khuNn, xạ khuNn hay
nấm khuNn ty) chiếm ưu thế trên giấy lọc. Để phân biệt các khuNn lạc nhỏ của xạ
khuNn và nấm, có thể quan sát trên kính hiển vi với vật kính 10X. Nhận xét sự
khác nhau giữa các loại vi sinh vật phát hiện được.
Khu�n
lạc
Hình
dạng
Kích
thước
Màu
sắc
Số khu�n lạc cùng loại
ghi nhận được (khu�n
lạc/đĩa)
Loại 1
Loại 2
- Mô tả khác khuNn lạc khác nhau của niêm khuNn, ghi nhận các dấu hiệu. Chọn
khuNn lạc đặc trưng nhất làm tiêu bản cùng với các sợi cellulose từ những chỗ giấy
lọc bị phân giải nhiều nhất. Lưu ý hình dạng tế bào sinh dưỡng và vi kén hoặc bào
tử nấm mốc.
III. Bài nộp
- Nộp kết quả ghi chép trong thí nghiệm và hình chụp khuNn lạc, tế bào.
- Vi sinh vật nuôi cấy được thuộc nhóm vi isnh vật nào?
- Qua quan sát hình thái, màu sắc bào tử và cuống sinh bào tử nấm mốc, hãy thử
phân lọai nấm mốc.
22
TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Ebgorov. Thực tập vi sinh vật học. NXB Đại học quốc gia Moscow.
2. Benson: Microbiological Applications Lab Manual, Eighth Edition. The McGraw−Hill Companies, 2001.
23
PHỤ LỤC
Bài 1. Vi khu�n phân giải amôn
Mẫu đất thanh trùng 80oC, 10 phút pha lõang
rồi trải đĩa
KhuNn lạc Bacillus megaterium
KhuNn lạc Bacillus substilis Bacillus substilis nhuộm bào tử
Bacillus cereus var. Mycoides
A) KhuNn lạc B) Tế bào kết chuỗi có bào tử
24
2. Bài 2. Vi khu�n nitrate hóa
Nitrosomonas europea (Kính hiển vi quang
học, tương phản pha X2500)
Nitrosomonas europea (Kính hiển vi điện tử
X39,600.
Nitrobacter winogradskyi (Kính hiển vi
quang học, tương phản pha X2500)
Nitrobacter winogradskyi (Kính hiển vi điện
tử X 213000)
Bài 3. Vi khu�n phản nitrate hóa
KhuNn lạc Paracoccus denitrificans Tế bào Paracoccus denitrificans
25
KhuNn lạc Pseudomonas aeruginosa Tế bào Pseudomonas aeruginosa
Bài 4. Vi khu�n cố định đạm
KhuNn lạc Azotobacter spp. Tề bào Azotobacter spp. hình que và kén hình cầu, oval
Bài 5. Vi sinh vât phân hủy cellulose
Vi khu�n thủy phân cellulose (niêm khu�n)
Cytophaga hutchinsonii,
26
KhuNn lạc Sorangium cellulosum Tế bào Sorangium cellulosum
Nấm phân hủy cellulose
Trichoderma harzianum
Trichoderma viride
Trichoderma flavofuscum