Varijacije u broju

kopija u genomu

čoveka

Koje su razlike između individua ?

Koje su razlike između vrsta ?

Projekat “Genom čoveka” –

Genomika – Komparativna

genomika

Komparativna genomika

• 3. mart 2016. godine

• Kompletno sekvencirano 8.017 genoma

• U toku sekvenciranje preko 35.000 genoma

• http://www.genomesonline.org/

Projekat “Genom čoveka “

(Human Genome Project) Preliminarna procena - Homo sapiens 99.9% identični

The Encyclopedia of DNA

Elements (ENCODE)

• Cilj projekta – registrovati sve funkcionalne elemente

genoma čoveka:

• Segmenti genoma koji kodiraju za definisani produkt (RNK

i/ili protein)

• Elementi genoma koji pokazuju “reproducible biochemical

signature" (sekvence za vezivanje proteina ili sekvence

odgovorne za specifične strukture hromatina)

The Encyclopedia of DNA

Elements (ENCODE)

• 399,124 regiona koji po svojim karakteristikama

odgovaraju pojačivačima i 70,292 regiona koji po svojim

karakterisitkama odgovaraju promotorima

• Procena da se dve trećine genoma čoveka prepisuje

Genom čoveka

• 3.164,7 miliona nukleotida

• 3 miliona SNP-ova - 2001

• 38 miliona SPN-ova - 2012

• 1-2 % kodira proteine

• 100.000 - 30.000 gena 1991-2001

• Oko 20.000 protein kodirajućih

gena – 2012.

• 1000 gena za RNK – 2001

• 8,801 malih RNK i

9,640 lncRNK – 2012

• 1.947 pseudogena – 2001

• 11,224 pseudogena – 2012

Razlike u genomima ljudi

• Prvi eksperimentalni dokazi o postojanju značajnih

razlika u genomima zdravih individua dobijeni su

zahvaljujući razvoju novih tehnika

• Komparativna genomska hibridizacija

bazirana na genskom čipu (aCGH)

• Iafrate et al, 2004

• Sebat et al., 2004

Komparativna genomska

hibridizacija

• Metoda se bazira na kvantitativnom dvobojnom FISH-u

• Simultana hibridizacija dve različito obeležene genomske probe sa normalnim metafaznim hromozomima.

• Genomske probe – kontrolna DNK i DNK tumorskog tkiva

Genski čip

• Na osnovu količine probe koja hibridizuje za svaku tačku

(“spot”) na array-u dobija se informacija o specifičnom

sastavu nk u ispitivanom uzorku.

Representational Oligonucleotide

Microarray Analysis

• Konstruisana 2003. godine

• Michael H. Wigler i Rob Lucito

• Cold Spring Harbor Laboratory

Komparativna genomska hibridizacija

bazirana na genskom čipu (aCGH)

aCGH

• Metodološke kritike

- Šta je referentni genom

- Kako je “istačkan” genski čip

- Analiza dobijenih rezultata

- Tehnika se definiše kao “prljava”

Provera rezultata

• FISH

• qPCR

• MLPA

Metoda multipleks

amplifikacije

ligiranih proba

• Sekvenciranje

Multipleks amplifikacija ligiranih

proba - MLPA • Jedan oligonukleotid svake

MLPA probe na 3’ kraju sadrži

sekvencu komplementarnu

specifičnoj ciljnoj sekvenci,

dok na 5’ kraju sadrži

sekvencu koja je zajednička

za sve MLPA probe i identična

je fluorescentno obeleženom

PCR prajmeru.

Multipleks amplifikacija ligiranih

proba - MLPA • Drugi oligonukleotid svake MLPA

probe na 5’ kraju poseduje sekvencu

komplementarnu specifičnoj ciljnoj

sekvenci, na 3’ kraju sadrži sekvencu

zajedničku za sve MLPA probe dužine

koja je komplementarna

neobeleženom prajmeru.

• Između ova dva kraja nalazi se insert

ili “stuffer” sekvenca različite dužine.

Multipleks amplifikacija ligiranih

proba - MLPA • Ligacijom oligonukleotida MLPA probe formiraju se

uspešno ligirane probe koje imaju identične sekvence na

5’ i 3’ krajevima.

• Zahvaljujući ovoj njihovoj osobini omogućena je

istovremena amplifikacija i do 50 različitih MLPA proba

korišćenjem samo jednog para prajmera.

Multipleks amplifikacija ligiranih

proba - MLPA • Kao rezultat procesa amplifikacije ligiranih MLPA proba,

nastaju PCR produkti jedinstvene dužine, odnosno

kombinacija jedinstvenih, PCR-om umnoženih

fragmenata čiji je opseg dužina od nekoliko desetina do

nekoliko stotina nt.

Multipleks amplifikacija ligiranih

proba - MLPA • Umnoženi fragmenti se analiziraju fragment analizom,

metodom za razdvajanje fragmenata molekula DNK na

osnovu njihovih dužina sa senzitivnošću od 1bp.

CNV analizirane MLPA

metodom

Metodologija istraživanja CNV

• aCGH

• Nove tehnike sekvenciranja

• Danas najmanje 12 platformi za

detekciju CNV

Godina Naučnici Otkrića

2003. Wigler i Lucito Otkriće tehnike ROMA (genski čip reprezentativnih oligonukleotida)

2004. Iafrate i saradnici 255 duplikacija i delecija između genoma 55 nesrodnih individua

2004. Sebat i saradnici 221 razlika između genoma 20 nesrodnih individua

2005. Tuzin i saradnici 241 razlika i 56 inverzija između genoma datog od strane internacionalnog

konzorcijuma „Genom čoveka“ (HGP) i genoma anonimnog muškarca

2005. Conrad i saradnici Upoređivanjem dva genoma identifikovali 586 delecionih varijanti veličine od 300bp do

1,2Mb, pri čemu su 92 gena bilo kompletno deletirana dok su 109 gena bila delimično

deletirana

2006. Hinds i saradnici Identifikovali 215 potencijalnih delecionih varijanti veličine od 70bp do 10kb kod 24

nesrodnih individua

2006. Redon i saradnici Identifikovali 1,447 CNVs koje zauzimaju veličinu od 360Mb (12% genoma) i sadrže

hiljade gena (3000), lokuse povezane sa bolestima čoveka, funkcionalne elemente i

segmetne duplikacije tokom analize genoma 270 individua iz 4 evropske populacije

2007. Lipson i saradnici Optimizacija metode aCGH i unapređenje matematičkog algoritma za analizu dobijenih

rezultata

Varijacije u broju kopija

• Redon R i sard., 2006.

• Identifikovali 1,447 CNVs koje zauzimaju veličinu od 360 Mb

(12% genoma) i sadrže hiljade gena (3000), lokuse povezane

sa bolestima čoveka, funkcionalne elemente i segmetne

duplikacije tokom analize genoma 270 individua iz 4 evropske

populacije

Varijacije u broju kopija (eng. Copy number variations, CNVs)

• Termin CNV objedinjuje i pojmove:

• LSV – large–scale CNV (Iafrate et al.,2004)

• CNP – copy number polymorphism (Sebat et

al, 2004)

• ISV – intermediate – sized variants (Tuzun et

al., 2005)

Polimorfizmi DNK lokusa

• Razlike u sekvenci DNK koje postoje u određenom DNK

lokusu između individua jedne vrste označene su kao

polimorfizmi DNK

• Postoje dva tipa DNK polimorfizama:

1. Polimorfizmi nukleotidne sekvence, koji su vezani za

- varijabilnost tipa bazne zamene (tačkasti polimorfizmi)

- za inserciju ili deleciju određenog niza nukleotida

(inserciono-delecioni prolimorfizmi)

2. Polimorfizmi dužina sekvence, koji su vezani za različiti

broj ponovaka u mini- i mikrosatelitskim lokusima

Varijacije u broju kopija - CNVs

• Termin polimorfizam zamenjen

terminom varijanta jer se

polimorfizam definiše kao genetička

varijanta koja se u populaciji javlja

frekvencom ≥ 1%.

Samo 37 CNVRs (5%) prisutan u sve tri

izolovane populacije sa frekvencom >1%

2012. godina

Novo pitanje

• Genom čoveka ili genomi ljudi

ETIČKA, PRAVNA I SOCIJALNA PITANJA

Ethical, legal and social issues (ELSI)

Varijacije u broju kopija - CNVs

• Varijacije u broju kopija su segmenti molekula DNK veličine od 50bp do 1Mb ili veći koji se u jednom genomu pojavljuje u različitom broju kopija u odnosu na referentni genom.

• Po svojoj prirodi, CNV mogu biti

• duplikacije,

• delecije,

• insercije,ili

• kompleksniji genetički rearanžmani koji obuhvataju veći broj hromozoma (kompleksne CNV).

• CNV su kvantitativne strukturne varijante genoma.

• Pored kvantitativnih, razlikuju se i pozicione strukturne varijante (translokacije) i orijentacione strukturne varijante (inverzije).

• CNV treba razlikovati od mikro-delecija, mikro-duplikacija i inverzija hromozoma koje su vidljive tehnikom bojenja traka i koje se, kao takve, ubrajaju u hromozomske aberacije.

• CNV po tipu duplikacija treba razlikovati od mikrosatelita i minisatelita kao i triplikate od trinukleotidnih ponovaka.

Duplikacije

• Tandemske duplikacije podrazumevaju duplikacije

određenog segmenta molekula DNK koji se u svim

analiziranim genomima dupliciraju na isti način.

• Multialelske duplikacije podrazumevaju duplikacije čiji

se broj dupliciranih segmenata molekula DNK razlikuje

između analiziranih genoma.

Delecije i kompleksne CNV

• Delecije

• Kompleksna CNV podrazumeva segment molekula

DNK koji u jednom genomu može biti dupliciran a u

drugom deletiran

Triplikati

• Po svojoj strukturi razlikuju se dva tipa triplikata.

• Triplikati tipa I su segmenti molekula DNK koji predstavljaju tandemski ponovljene triplikate.

• Triplikati tipa II su triplikati koji su međusobno invertni i razdvojeni segmentima molekula DNK koji su duplicirani.

• 179,450 CNVs u genomu čoveka (avg 2012)

• Do sada identifikovano najmanje 100 gena meta

komoletnih delecija

Varijacije u broju kopija češće

pogađaju tri kategorije gena:

1) Signalni putevi imunskog sistema i međućelijske komunikacije

2) Interakcija sa spoljašnom sredinom (imunski odgovor i čulo

mirisa)

3) Retrovirusi i protein kodirajući geni povezani sa mehanizmima

transpozicije.

Efekat CNV na ekspresiju genoma

CNV u drugim vrstama

• Primati, psi, miševi, konji, krave,

kokoške, kukuruz, Arabidopsis

thaliana, Vinska mušica, Pivski

kvasac, C. Elegans....

• Perry i sar., 2006. godine

• 331 CNVs kod 20 šimpanza od

toga 74 CNVs detektovane u istim

regionima kao i kod čoveka

Distribucija CNV kod

šimpnze i čoveka u prilog

hipotezi o dupliciranju

gena kao mehanizmu

povećanja genoma tokom

evolucije

Molekularni mehanizmi nastanka CNV

• Nealelska homologna rekombinacije

• Prostim spajanjem krajeva kao mehanizam reparacije

dvolančanih prekida

• Reparacija prekida u molekulu DNK mehanizmom FoSTeS

• Tokom transpozicije L1 elemenata

Nealelska homologna

rekombinacija

• Duplikacije i delecije mogu biti posledica kako

interhromozomskog, tako i intrahromozomskog

krosingovera.

Nealelska homologna

rekombinacija

• Rezultat nealelske

homologne rekombinacije

koja se odvija u okviru

iste hromatide može biti

delecija određenog

segmenta molekula DNK.

Nealelska homologna

rekombinacija

• Kao posledica odvijanja

nealelske homologne

rekombinacije između

sestrinskih hromatida

formira se izohromozom

koji sadrži segment

molekula DNK koji je

invertovan.

Prosto spajanje

krajeva kao

mehanizam

reparacije

dvolančanih prekida

• Dvolančani prekidi u

molekulu DNK čoveka

najčešće se repariraju

nehomologim

spajanjem krajeva.

• Ovaj mehanizam može

biti uzrok delecije

određenog segmenta

molekula DNK.

Mehanizam FoSTeS

• Kompleksne CNV verovatno

nastaju kao posledica

reparacije jednolančanih

prekida u molekulu DNK

tokom procesa replikacije

mehanizmom koji je poznat po

svojoj skraćenici FoSTeS

(eng. fork stalling and template

switching).

• Mehanizam FoSTeS aktivira se zaustavljanjem replikacione viljuške na mestu jednolančanog prekida u molekulu DNK koji se replikuje.

• Razdvajanje zaostajućeg lanca od lanca koji je služio za njegovu sintezu.

• Zaostajući lanac, na osnovu mikrohomologije nastavlja replikaciju korišćenjem druge replikacione viljuške koja se nalazi u blizini.

• U zavisnosti da li se nova replikaciona viljuška nalazi uzvodno ili nizvodno od mesta jednolančanog prekida, nastavak replikacije dovodi do delecije ili duplikacije određenog segmenta molekula DNK.

• Duplicirani segmenti mogu biti direktno ponovljeni ili invertovani.

Tokom transpozicije L1 elemenata

• Tokom transpozicije

moguće je “nastanak”

CNV po tipu duplikacije

• Ove CNV nazivaju se i

retro CNV.

CNV i bolesti ljudi

• Dosadašnja istraživanja pokazala su snažnu asocijaciju

pojedinih CNV koje obuhvataju protein kodirajuće gene

sa razvojem psihijatrijskih bolesti (uključujući i autizam),

gojaznosti, psorijaze (autoimunska bolest kože), šećerne

bolesti, zapaljenskih bolesti creva, itd.

CNV i bolesti ljudi

• Poslednjih godina istražuje se moguća uloga CNV u

procesima neoplastične transformacije koji su

odogovorni za razvoj karicinoma debelog creva, pluća i

prostate.

Oboljenja broja kopija

(eng. copy-number disorder) • Za neke bolesti čoveka molekularno-biološkim

analizama pokazano je da su jedini do sada utvrđeni

genetički uzročnici razvoja bolesti CNV.

• Određene kongentalne bolesti srca ili bubrega su neke

od njih.

CNV i bolesti ljudi

• Protektivna uloga tokom infekcije HIV-om ili malarije

• Milanese M. i sarad., 2009

• Ispitivanje infekcije HIV

• Upoređivanje CNVs u 13 gena kod HIV+ i HIV- dece u

populaciji Brazila

• Gen DEFB104

• Pozitivna korelacija između

broja kopija ovog gena i

rezistentnosti na infekciju HIV

CNV i bolesti ljudi

• Personalna medicina

• Farmakogenomika

• Uloga CNV u individualnim odgovorima

na primenjenu terapiju u lečenju brojnih

bolesti čoveka

Budućnost

• Copy Number Variation Project

• Analiza genoma 269 nasumično izabranih individua

iz svih krajeva sveta

• Otkriće uloge CNV u fenomenima odgovornim za

ekspresiju

• Ključno pitanje – značaj CNV u evoluciji genoma