Vantagens das colunas SEC Agilent AdvanceBio para análises biofarmacêuticasComparação de colunas de diferentes fornecedores para melhorar a qualidade dos dados

Descrição técnica

IntroduçãoA cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) é uma técnica padrão para a determinação das médias de massa molar e é frequentemente usada para descrever a separação de biomoléculas baseadas em medida. Na SEC, a eficiência da separação vem somente da fase estacionária, ,enquanto a fase móvel não deveria ter efeito algum. Portanto, a seleção de coluna para uma dada biomolécula é essencial para a aplicação com êxito da SEC. Há diferentes tipos de colunas SEC disponíveis comercialmente que vêm em várias dimensões, porosidades e tamanhos de partículas. As colunas SEC Agilent AdvanceBio contam com uma tecnologia inovadora para a análise de SEC. As colunas foram projetadas e fabricadas pela Agilent para dar eficiência máxima sem risco de degradação de cisalhamento da amostra ou entupimento entre as partículas. O método único de fabricação que controla o volume, a estrutura e o tamanho dos poros e, em seguida, a a aplicação de um revestimento polimérico hidrófilo asseguram que os picos de proteína são sejam fortes e bem resolvidos.

Essa nota técnica compara as colunas SEC de diferentes fornecedores usando uma fase móvel comumente usada para uma separação com padrões de proteína, anticorpos monoclonais e um conjugado anticorpo-droga (ADC). Queríamos identificar as diferenças no desempenho da coluna que poderia impactar a qualidade dos dados que estavam sendo gerados. Demonstramos a vantagem exclusiva das colunas SEC AdvanceBio para separação de alta resolução de biomoléculas para aplicações biofarmacêuticas.

2

Materiais e métodosColunas7,8 × 300 mm

• SEC Agilent AdvanceBio 300Å, 2,7 µm

• Outro fornecedor A 200Å, 3,5 µm

• Outro fornecedor B 450Å, 3,5 µm

• Outro fornecedor C 250Å, 5 µm

• Outro fornecedor D 250Å, 4 µm

• Outro fornecedor E 300Å, 3 µm

4,6 × 300 mm

• SEC Agilent AdvanceBio 300Å, 2,7 µm

• Outro fornecedor F 450Å, 2,5 µm

• Outro fornecedor G 200Å, 1,7 µm

Resultados e discussãoComparação da robustez de colunas SEC de 7,8 × 300 mm para métodos de SEC-DADPadrões de separação de proteínasA Figura 1 compara a resolução de um padrão de referência de seis proteínas em colunas com diferentes tamanhos de poros e mostra claramente o efeito do tamanho do poro na resolução. As proteínas maiores, tiroglobulina e seu monômero, têm boa resolução com poros de 450Å e 300Å. No entanto, conforme o tamanho do poro diminui, as maiores proteínas são excluídas e a resolução é ruim. Enquanto as maiores proteínas apresentavam melhor resolução na coluna B de 450Å e na coluna E de 300Å, ambas as colunas ofereceram larguras de pico mais amplas, o que torna a quantificação de baixos níveis de agregação mais difícil e menos precisa. A coluna SEC AdvanceBio melhorou a resolução de biomoléculas de peso alto, médio e baixo, o que é essencial para a separação de muitas de las (Figura 1). A SEC AdvanceBio também forneceu aumento da sensibilidade, simetria de pico estreita e baixo volume de eluição.

Tabela 1. Condições cromatográficas

Parâmetro 7,8 × 300 mm 4,6 × 300 mmTaxa de fluxo 0,8 mL/min 0,4 mL/minFase móvel 150 mM de tampão de fosfato, pH 7,0 150 mM de tampão de fosfato, pH 7,0Instrumento LC quaternário Agilent 1260 Infinity

Bio-inertLC binário Agilent 1290 Infinity com DAD G1315D e cela de fluxo Bio-inert (1.200 bar)

Volume de injeção 5 µL 5 µLTCC Ambiente AmbienteDetecção UV, 220 nm UV, 220 nmAmostras • Marcadores de peso molecular de proteína (agregado de tireoglobulina,

tireoglobulina, IgG, albumina de soro bovino, mioglobina) e marcador de permeação total de uracil

• Anticorpos monoclonais terapêuticos (rituximabe e trastuzumabe)• Conjugado de medicamentos de anticorpos terapêuticos

Figura 1. Comparação dos perfis de SEC de padrões de proteínas em colunas SEC 7,8 × 300 mm. As resoluções entre os picos 1 e 2, 3 e 4 e 5 e 6 foram calculadas.

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23

4

5

61

SEC Agilent AdvanceBio, 2,7 µm, 300Å, 7,8 × 300 mm

Outro fornecedor A, 3,5 µm, 200Å, 7,8 × 300 mm

Outro fornecedor B, 3,5 µm, 450Å, 7,8 × 300 mm

Outro fornecedor C, 5 µm, 250Å, 7,8 × 300 mm

Outro fornecedor D, 4 µm, 250Å, 7,8 × 300 mm

Outro fornecedor E, 3 µm, 300Å, 7,8 × 300 mm

Rs = 1,44

Rs = 0,52

Rs = 2,0

Rs = 0,81

Rs = 0,97

Rs = 1,7Rs = 2,27

Rs = 4,90

Rs = 2,81

Rs = 1,77

Rs = 2,12

Rs = 1,86

Rs = 1,88

Rs = 3,70

Rs = 2,86

Rs = 3,49

Rs = 3,4

Rs = 5,59

DI de pico1. Agregados de tireoglobulina2. Tireoglobulina (662 kDa)3. IgG (150 kDa)4. BSA (66 kDa)5. Mioglobina (17 kDa)6. Uracil (112 Da)

3

Para avaliar o efeito do tamanho do poro na separação de uma gama de marcadores de proteína, as curvas de calibração para cada coluna foram representadas graficamente (Figura 2). As moléculas maiores do que o tamanho do poro são excluídas e partículas menores penetram nos poros para definir o limite da faixa de exclusão e permeação de uma coluna. Uma coluna SEC ideal é aquela que separa biomoléculas na parte mais linear da curva de calibração. Quando avaliamos as colunas para a separação da mesma variedade de proteínas, a SEC AdvanceBio forneceu uma inclinação linear e superficial para a maior parte da curva de resolução. Esse desempenho resultou na separação melhorada de marcadores de proteínas dentro da faixa de peso molecular 662 kDa a 112 Da, a faixa da maioria das bioterapias com base em proteína.

Comparação de volumes de poroA capacidade de pico e resolução na SEC são determinadas primariamente pelo volume dos poros. Um volume maior dos poros fornece melhor resolução em uma faixa mais ampla de peso molecular. A Tabela 2 mostra os volumes de poro calculados a partir do ponto de permeação total (uracil) e do limite de exclusão (agregado de tireoglobulina) para as colunas. A SEC AdvanceBio forneceu um volume maior do poro (7,11 mL) em comparação com as outras colunas, e assim forneceu melhor resolução e maior capacidade de pico.

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

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5.5

6.0

6.5

4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Log

Mw

Volume de eluição (mL)

Volume de eluição (mL)

Curvas de calibração comparação da SEC Agilent AdvanceBio com as colunas A e B

Coluna SEC Agilent AdvanceBio, 300ÅOutro fornecedor A, 200ÅOutro fornecedor B, 450Å

R2 = 0,9868R2 = 0,9538R2 = 0,8175

1,5

2,0

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3,0

3,5

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5,5

6,0

6,5

4 6 8 10 12 14

Log

Mw

Curvas de calibração comparação da SEC Agilent AdvanceBio com as colunas C, D e E

Coluna SEC Agilent AdvanceBio, 300Å

Outro fornecedor C, 250ÅOutro fornecedor D, 250Å

Outro fornecedor E, 300Å

R2 = 0,9868

R2 = 0,9201R2 = 0,8862

R2 = 0,9123

Figura 2. Curvas de calibração para padrões de proteína em várias colunas SEC de 7,8 × 300 mm.

Tabela 2. Comparação do volume total do poro da coluna

Coluna Volume do poro (mL)7,8 × 300 mmSEC Agilent AdvanceBio 300Å, 2,7 µm 7,11Outro fornecedor A 200Å, 3,5 µm 6,25Outro fornecedor B 450Å, 3,5 µm 4,57Outro fornecedor C 250Å, 5 µm 6,51Outro fornecedor D 250Å, 4 µm 6,70Outro fornecedor E 300Å, 3 µm 5,624,6 × 300 mmSEC Agilent AdvanceBio 300Å, 2,7 µm 2,36Outro fornecedor F 450Å, 2,5 µm 2,06Outro fornecedor G 200Å, 1,7 µm 2,20

4

e a coluna D mostraram os maiores fatores de resolução de 2,37 e 2,41, respectivamente, para o monômero de trastuzumabe e seu agregado. A coluna E, que afirma separar proteínas maiores ou dímeros de anticorpos e agregados maiores, não resolveu o agregado e não foi possível integrar o monômero e o agregado para determinar sua resolução.

Separação de anticorpos  monoclonais terapêuticosA Figura 3 mostra a melhoria na qualidade dos dados para a separação de trastuzumabe terapêutico na coluna SEC AdvanceBio de 2,7 µm. O cromatograma exibe os valores de resolução de várias colunas para a separação do monômero e dos agregados. A SEC AdvanceBio

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1,000

SEC Agilent AdvanceBio, 2,7 µm, 300Å, 7,8 × 300 mm

Rs = 2,37

Rs = 1,89

Rs = 1,70

Rs = 2,1

Rs = 2,41

Outro fornecedor A, 3,5 µm, 200Å, 7,8 × 300 mm

Outro fornecedor B, 3,5 µm, 450Å, 7,8 × 300 mm

Outro fornecedor C, 5 µm, 250Å, 7,8 × 300 mm

Outro fornecedor D, 4 µm, 250Å, 7,8 × 300 mm

Outro fornecedor E, 3 µm, 300Å, 7,8 × 300 mm

Figura 3. Análise de monômero de trastuzumabe e agregados usando colunas SEC de 7,8 × 300 mm.

5

Também foram feitas comparações entre as colunas para a separação de rituximabe de anticorpos monoclonais terapêuticos comerciais, para mostrar o desempenho das colunas em situações reais. A área destacada na Figura 4 revela a capacidade da SEC AdvanceBio

Figura 4. Comparação de perfis de rituximabe em várias colunas SEC de 7,8 × 300 mm.

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min5 10 15

min5 10 15

SEC Agilent AdvanceBio, 2,7 µm, 300Å, 7,8 × 300 mm

Outro fornecedor A, 3,5 µm, 200Å, 7,8 × 300 mm

Outro fornecedor B, 3,5 µm, 450Å, 7,8 × 300 mm

Outro fornecedor C, 5 µm, 250Å, 7,8 × 300 mm

Outro fornecedor D, 4 µm, 250Å, 7,8 × 300 mm

Outro fornecedor E, 3 µm, 300Å, 7,8 × 300 mm

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Zoom

de resolver agregados e fragmentos em comparação com as colunas de A a E. O tamanho e o volume ideais do poro da SEC AdvanceBio oferece a maior resolução necessária para a separação dos monoclonais terapêuticos, seus agregados e os produtos de degradação.

6

AdvanceBio com uma fase móvel, tampão de fosfato de 150 mM. Esse método também deu a maior resolução de monômero e agregados (Rs = 1,75), indicando nenhuma interação não específica do medicamento hidrofóbico com a fase estacionária (Figura 5). Além disso, a SEC AdvanceBio conseguiu separar e resolver agregados de ADC melhor do que as outras colunas, indicando sua adequação para a análise de ADC e agregados. Os picos mais largos produzidos por colunas de outros fornecedores não apenas impactou a sensibilidade e limitou a detecção de baixos níveis de agregados, mas também tornou difícil a integração de pico.

superar esse efeito, mas a viscosidade da fase móvel, e, consequentemente, a pressão, pode comprometer a taxa de fluxo ou a vida útil da coluna. A integridade da amostra pode ser comprometida pois os componentes orgânicos podem afetar a agregação da amostra.

A análise de ADC usando as colunas de A a E com fase móvel aquosa levou a formatos de pico inadequados devido à interação não específica da carga hidrofóbica com a fase estacionária, como mostrado na Figura 5. No entanto, os picos foram simétricos quando o ADC foi analisado usando uma SEC

Separação de conjugado anticorpo-drogaA análise por SEC de conjugado anticorpo-droga (ADCs) exige colunas com interação secundária reduzida de cargas hidrofóbicas com a fase estacionária da coluna. Os métodos mais publicados para análise da SEC de ADC realizados usando fases aquosas geraram um formato de pico inadequado e resolução incompleta do agregado do conjugado monomérico. Esse efeito foi causado devido à interação não específica da carga hidrofóbica com a fase estacionária. A adição de modificadores orgânicos demonstrou

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Rs = 1,75

Rs = 1,11

Rs = 1,40

Rs = 1,28

Zoom

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0200400600 SEC Agilent

AdvanceBio, 2,7 µm, 300Å, 7,8 × 300 mm

min5 10 15

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0200400600 Outro fornecedor A,

3,5 µm, 200Å, 7,8 × 300 mm

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0200400600 Outro fornecedor B,

3,5 µm, 450Å, 7,8 × 300 mm

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mAU

0200400600 Outro fornecedor C,

5 µm, 250Å, 7,8 × 300 mm

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0200400600 Outro fornecedor D,

4 µm, 250Å, 7,8 × 300 mm

min5 10 15

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0200400600 Outro fornecedor E,

3 µm, 300Å, 7,8 × 300 mm

Figura 5. Comparação de perfis de ADC terapêutico em várias colunas SEC de 7,8 × 300 mm.

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Comparação de colunas SEC de 4,6 × 300 mm para métodos sensíveisPadrões de separação de proteínasA Figura 6 compara a resolução de um padrão de referência de cinco proteínas na coluna SEC AdvanceBio 4,6 × 300 mm, 2,7 µm e as colunas F e G. A proteína maior, agregado de tireoglobulina) (pico 1), estava bem resolvida, com sensibilidade aprimorada e picos simétricos em comparação com outras colunas. No geral, a SEC AdvanceBio oferece melhor resolução para marcadores de peso molecular alto, médio e baixo do que a coluna F e é comparável à coluna G de 1,7 µm.

A curva de calibração da SEC AdvanceBio tem menos inclinação, com a curva mostrando um excelente valor de coeficiente para um peso molecular mais preciso (Figura 7). A SEC AdvanceBio também fornece um volume maior de poro (2,36 mL) em comparação com as colunas F (2,06 mL) e G (2,20 mL), e assim fornece melhor resolução e maior capacidade de pico. Além disso, a coluna F exige um tempo de corrida cromatográfica maior para resolver o mesmo intervalo de marcadores. A faixa de permeação da coluna (5,48 mL) também excede o volume da coluna (4,9 mL), sugerindo alguma interação não específica durante a eluição.

min2 4 6 8 10 12 14

mAU

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1,0001,2501,5001,750

min2 4 6 8 10 12 14

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380 bar

176 bar

174 bar

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SEC Agilent AdvanceBio, 2,7 µm, 300Å, 4,6 × 300 mm

Outro fornecedor F, 2,5 µm, 450Å, 4,6 × 300 mm

Outro fornecedor G, 1,7 µm, 200Å, 4,6 × 300 mm

Rs = 2,11

Rs = 2,52

Rs = 3,61

Rs = 2,20

Rs = 1,89

Rs = 1,44

Rs = 2,90

Rs = 4,10

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DI de pico1. Agregados de tireoglobulina2. Tireoglobulina (662 kDa)3. IgG (150 kDa)4. BSA (66 kDa)5. Mioglobina (17 kDa)6. Uracilo (112 kDa)

Figura 6. Comparação de perfis de padrões de proteína em várias colunas SEC de 4,6 × 300 mm. As resoluções entre os picos 1 e 2, 3 e 4 e 5 e 6 foram calculadas.

Figura 7. Curvas de calibração para padrões de proteína em várias colunas SEC de 4.6 × 300 mm.

1,52,02,53,03,54,04,55,05,56,06,5

1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0

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Volume de eluição (mL)

Curvas de calibração comparação da SEC Agilent AdvanceBio com as colunas F e G

R2 = 0,9868R2 = 0,816R2 = 0,9716

SEC Agilent AdvanceBioOutro fornecedor F, 450ÅOutro fornecedor G, 200Å

8

Separação de anticorpo  monoclonal terapêutico A Figura 8 mostra a separação de mAb de trastuzumabe nas colunas de 4,6 × 300 mm. O cromatograma exibe os valores de resolução na separação do monômero e dos agregados. A SEC AdvanceBio mostra a resolução do pico de monômero como comparável à coluna F de 2,5 µm, 450Å, assim como à coluna G de 1,7 µm, 200Å. Além disso, a SEC AdvanceBio e a coluna F puderam identificar trastuzumabe degradado, destacado em azul, que a coluna G não pôde separar.

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min4 6 8 10

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02468380 bar

176 bar

174 bar

SEC Agilent AdvanceBio, 2,7 µm, 300Å, 4,6 × 300 mm

Outro fornecedor F, 2,5 µm, 450Å, 4,6 × 300 mm

Outro fornecedor G, 1,7 µm, 200Å, 4,6 × 300 mm

Rs = 1,70

Rs = 1,71

Rs = 1,91

Figura 8. Análise de monômero de trastuzumabe e agregados usando colunas SEC de 4.6 × 300 mm de diferentes fornecedores.

9

e fragmentos para separações robustas e confiáveis. Para atingir melhor sensibilidade, o método foi transferido para uma coluna de 4,6 × 300 mm e comparado a colunas de 2,5 µm, 450Å e 1,7 µm, 200Å, que também resultaram em resolução superior. Além disso, as capacidades de pico e resolução podem ser significativamente melhoradas acoplando duas colunas em série. Isso é possível somente com as colunas SEC AdvanceBio que podem ser executadas em pressões mais baixas. Por fim, as colunas SEC AdvanceBio fornecem melhores formatos de pico e a certeza de resolver monômeros ADC e seus agregados usando a fase móvel aquosa, sem comprometer a vida útil da coluna e a integridade da amostra.

aos 380 bar da coluna G de coluna de sub-2 µm A última exige sistemas de LC que são capazes de tolerar altas pressões

ConclusõesO potencial da cromatografia de exclusão de tamanhos para caracterização de biomoléculas é muito alto. Essa Descrição técnica demonstra vários benefícios das colunas SEC Agilent AdvanceBio para análises biofarmacêuticas em comparação às colunas SEC de outros fornecedores. Primeiro, usamos as colunas de 7,8 × 300 mm para separar uma gama de proteínas, monômeros mAb, agregados e fragmentos. O tamanho e o volume ideais de poro da SEC AdvanceBio oferece excelente separação e capacidade de pico para agregados de monômeros

Separação de conjugado de medicamentos de anticorpos A Figura 9 ilustra a separação da SEC de ADC em várias colunas 4,6 × 300 mm. É evidente que a SEC AdvanceBio mostrou o maior fator de resolução (Rs = 1,47) para monômero de ADC e seu agregado, comparado às colunas F e G. As colunas F e G deram formatos de pico incorretos devido à interação de cargas hidrofóbicas com a fase estacionária da coluna. A Coluna SEC AdvanceBio também forneceu melhor formato de pico para o monômero ADC e melhorou a resolução de seus agregados. Além disso, para melhor separação de marcadores de proteínas, mABs/ADCs e seus agregados, a SEC AdvanceBio opera a aproximadamente 176 bar, em oposição

Figura 9. Comparação de separação de ADC em várias colunas SEC de 4,6 × 300 mm.

SEC Agilent AdvanceBio, 2,7 µm, 300Å, 4,6 × 300 mm

Outro fornecedor F, 2,5 µm, 450Å, 4,6 × 300 mm

Outro fornecedor G, 1,7 µm, 200Å, 4,6 × 300 mm

Rs = 1,47

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Rs = 1,07

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www.agilent.com/chem

Estas informações estão sujeitas a alterações sem aviso prévio.

© Agilent Technologies, Inc., 2015 Publicado nos Estados Unidos, 1º de dezembro de 2015 5991-6474PTBR