VALIDAZIONE DI UN METODO EFFICACE PER LO

STUDIO FARMACOCINETICO DELLA NICOTINA

Università degli studi di Catania

Scuola di Medicina e Chirurgia

Corso di laurea in Tecniche di Laboratorio Biomedico

Tesi di Laurea

Sonia SaittaSonia SaittaSonia SaittaSonia SaittaSonia SaittaSonia SaittaSonia SaittaSonia Saitta

RELATORE: Prof.ssa Margherita Ferrante RELATORE: Prof.ssa Margherita Ferrante RELATORE: Prof.ssa Margherita Ferrante RELATORE: Prof.ssa Margherita Ferrante

CORRELATORE: Dott.ssa Gea Oliveri ContiCORRELATORE: Dott.ssa Gea Oliveri ContiCORRELATORE: Dott.ssa Gea Oliveri ContiCORRELATORE: Dott.ssa Gea Oliveri Conti

La sigaretta rappresenta attualmente un vero e proprio fenomeno socio

economico e di costume a livello globale.

Glamour women

Lo studio della farmacocineticafarmacocineticadella nicotina è considerato uno

strumento conoscitivo fondamentale

per la delucidazione dei meccanismi

di assorbimento e di efficacia

correlati all’uso dei nuovi dispositivi

antifumo se comparati all’assunzione

di nicotina mediante il fumo di

sigaretta tradizionale.

CYP2A6 è il più importante P450 per la C-ossidazione della nicotina

La nicotina assunta ha un'emivita di circa 2h

metaboliti: nicotina-N-ossido, nornicotina e

cotininacotinina

Circa il 70-80% della dose viene

C-ossidata dal citocromo P-450 nel fegato

E’ stato avviato un progetto pilota per la valutazione della farmacocinetica della nicotina

assunta tramite e-cig rispetto all’assunzione tramite fumo tradizionale in volontari

arruolati presso il Centro per la Prevenzione e Cura del Tabagismo (Dip. Di Biomedicina

Clinica e Molecolare - Prof. Polosa research group).

Il progetto (PRE-ELECT) è quindi integrato in uno studio volto a definire i protocolli perIl progetto (PRE-ELECT) è quindi integrato in uno studio volto a definire i protocolli per

lo studio multicentrico nazionale (ELECT).

• RP-HPLC-UV;

• LC/MS/ESI TQD o LC/MS/APCI -TQD;

• GC-NPD;

Metodi di determinazione Metodi di determinazione

citati in letteratura citati in letteratura

• GC-NPD;

• tecniche immunoenzimatiche.

VANTAGGI• Qualità fase preparativa.

• Utilizzo standard interno

(acetalinide).

• Bassi valori di LOD e LOQ (alta

sensibilità).

• Validato per urine e sangue.

SVANTAGGI• Non validato per la caffeina.

• Non tiene conto della

coeluizione della caffeina

con la cotinina.

La caffeina è una sostanza idrofilica simile alla cotinina e ciò può comportare una

coeluizione con conseguente interferenza nel segnale.

Metodo di Massadeh modificato

Abbiamo sviluppato e validato un metodo

RP-HPLC-UV efficace ed efficiente votato

alla determinazione di concentrazioni di

nicotina, cotinina e caffeina in multiresiduo innicotina, cotinina e caffeina in multiresiduo in

campioni ematici.

È stata esclusa la spettrometria di

massa

• costi dispendiosi

• notevole background richiesto

all’operatore

PROBLEMATICA SOLUZIONE

Sovrapposizione standard

interno (dati non confrontabili

con quelli di Massadeh)

Correzione con standard

esterno e prove di recupero

Stabilità del campione

preparato di ~8h

Iniezione di 7-8 campioni per

volta

La nicotina permane in traccia

all’interno della colonna

Separazione analitica con

eluizione isocratica in

tampone + pulizia accessoria

in ACN.

L’HPLC è una tecnica di cromatografia liquida che consente di separare i

composti di una miscela, sfruttando la loro differente affinità nei confronti di una

fase stazionaria, contenuta all’interno di una colonna cromatografica, attraverso

cui fluisce la fase mobile.

Eluizione isocratica: tampone costituito da una miscela di 0,544 g di KH2PO4;

0,368 g di sodio n-eptano-solfonato (donatore di coppia ionica); 1640 ml di

acqua MilliQ e 360 ml di metanolo.

pH della fase mobile ≈ 3,2

flusso: 1,0 mL/min

ʎ: stata programmata a 254 nm da 0 a 18 min e a 260 nm da 18 a 30 minʎ: stata programmata a 254 nm da 0 a 18 min e a 260 nm da 18 a 30 min

Colonna Knauer C18 con precolonna

I recuperi su campioni di plasma fortificato sono stati del 110% per la nicotina, del 110%

per la caffeina e del 91% per la cotinina e le linearità (R2) calcolate sono stata

rispettivamente di 0,9976 per la nicotina, di 0,9991 per la caffeina e di 0,9996 per la

cotinina.

LOD e LOQ sono stati calcolati

sulla scorta del rapporto

segnale/rumore rispettivamente

pari a 3:1 e 6:1.pari a 3:1 e 6:1.

ng/ml LOD LOQ

cotinina 10,9 35

caffeina 7 22,50

nicotina 13,7 43,7

Nello studio pilota (PRE-ELECT) 98 campioni di sangue sono stati raccolti da 14

volontari (selezionati accuratamente tra pazienti del Centro Antifumo del Policlinico di

Catania) che si sono astenuti per 12h dal consumo di caffè e prodotti del tabacco con/e

senza combustione prima dell’esposizione controllata a fumo di sigaretta (volontari della

serie C) e di e-cig (volontari della serie O).

Per testare la capacità di rilevazione del metodo messo a punto abbiamo analizzato 14

campioni ematici di cui 7 da un volontario che aveva fumato e-cig (01-Tx-O) e 7 da uno

cha aveva fumato la sigaretta tradizionale (04-Tx-C).

• 4mL di sangue di ciascun volontario sono stati raccolti in provette con EDTA;

• centrifugati immediatamente a 2800 rpm per 5 min;

• il plasma surnatante è stato raccolto poi in provette eppendorf e qui

congelati a -80°C fino al momento dell'analisi.

Protocollo di estrazione del campione

Raccolta e conservazione

• 0,5 mL di plasma è stato posto in una provetta di vetro 100µL di acetanilide in metanolo al 50% (standard

interno);

• ogni campione è stato alcalinizzato con 100mL di NaOH (2,5M) e vortexato per 30 s.

• l’estrazione è stata eseguita mediante aggiunta di 3mL di una soluzione 1:1 di diclorometthane/diethyletere,

agitazione per 2 min;

• la fase organica separata è stata prelevata accuratamente e trasferita in un nuova provetta di vetro

contenente 20µL di HCl (0,25M);

Protocollo di estrazione del campione

• La fase organica è stata evaporata in corrente di

azoto a temperatura ambiente fino a secchezza

completa;

• La fase organica è ricostituita quindi con 250µL di

fase mobile in vials di vetro da 2mL fornita di

riduttore;

• (100µL) Iniettati nel sistema cromatografico HPLC.• (100µL) Iniettati nel sistema cromatografico HPLC.

Volontario svapatore

Volontario fumatore di sigaretta tradizionale

E-cig

Sigaretta

La lettura dei 14 campioni ha testimoniato la capacità e l’affidabilità del metodo per una

sua applicazione in studi di farmacocinetica della nicotina

La valutazione della caffeina non è una scelta opzionale.

Ad oggi tutti i dati di letteratura (astensione del volontario dal consumo di caffè)

risultano non veritieri dato che l’esposizione inalatoria della caffeina attraverso

il fumo è sempre stata sottostimata o non giustamente considerata.

La disponibilità di dati corretti e più rispondenti alla realtà oggettiva permetterà la

conoscenza della:

• reale concentrazione della nicotina assorbita e della cotinina prodotta;

• reale farmacocinetica della nicotina.

Entrambi questi fattori sono di fondamentale importanza in termini di guadagno in

salute pubblica per le loro implicazioni nella valutazione e gestione dei rischi

derivanti dall’esposizione attiva e passiva a fumo tradizionale e elettronico.