Validacija gasno-hromatografskih metoda za odre ivanje ...€¦ · Univerzitet u Nišu Prirodno-matemati čki fakultet Departman za hemiju Validacija gasno-hromatografskih metoda

Univerzitet u Nišu

Prirodno-matematički fakultet

Departman za hemiju

Validacija gasno-hromatografskih

metoda za određivanje organskih zagađivača

− Master rad − Mentor: Autor:

Dr Violeta MItić Bojana Stojanović

Niš, 2015.

ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Редни број, РБР:

Идентификациони број, ИБР:

Тип документације, ТД: монографска

Тип записа, ТЗ: текстуални / графички

Врста рада, ВР: мастер рад

Аутор, АУ: Бојана Стојановић

Ментор, МН: Виолета Митић

Наслов рада, НР: Валидација гасно-хроматографских метода за

одређивање органских загађивача

Језик публикације, ЈП: српски

Језик извода, ЈИ: енглески

Земља публиковања, ЗП: Р. Србија

Уже географско подручје, УГП: Р. Србија

Година, ГО: 2015.

Издавач, ИЗ: ауторски репринт

Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.

Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога)

6 поглавља/ 63 страна/ 13 табела/ 42 слике

Научна област, НО: хемија

Научна дисциплина, НД: аналитичка хемија

Предметна одредница/Кључне речи, ПО: Полициклични ароматични угљоводоници (ПАХ),

валидација аналитичких метода, гасна

хроматографија, масена спектрометрија, УДК

Чува се, ЧУ: библиотека

Важна напомена, ВН:

Извод, ИЗ: У оквиру овог мастер рада извршена је валидација

гасно-хроматографских метода са циљем избора

адекватне методе снимања за квантификацију ПАХ-

ова. Валидирани су СКАН и СИМ мод снимања. За

потребе анализе коришћена су два модел узорка.

ПАХ-ови су из узорка земљишта екстраховани

ацетонитрилом "QuEChERS" екстракцијом и

квантификовани ГЦ/МС анализом. Добијени резултати

показали су да је за потребе квантификације

адекватан СИМ мод снимања. Одликује се највећом

рикавери вредношћу и најмањим вредностима за

релативну стандардну девијацију. Датум прихватања теме, ДП: 15.01.2014.

Датум одбране, ДО:

Чланови комисије, КО: Председник:

Члан:

Члан, ментор:

Образац Q4.09.13 - Издање 1

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

Accession number, ANO: Identification number, INO:

Document type, DT: monograph

Type of record, TR: textual / graphic

Contents code, CC: University master degree thesis

Author, AU: Bojana Stojanović

Mentor, MN: Violeta Mitić

Title, TI: Validation of the gas-chromatographic method for the

determination of organic contaminants

Language of text, LT: Serbian

Language of abstract, LA: English

Country of publication, CP: Republic of Serbia

Locality of publication, LP: Serbia

Publication year, PY: 2015.

Publisher, PB: author’s reprint

Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.

Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes)

Chapter 6/ 63 pages / 13 tables / 42 images

Scientific field, SF: Chemistry

Scientific discipline, SD: analytical chemistry

Subject/Key words, S/KW: Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH), validation of

analytical methods, gas chromatography, mass spectrometry

UC

Holding data, HD: library

Note, N:

Abstract, AB: In this master work was performed validation of the gas-

chromatographic methods with the aim of selecting appropriate

recording methods for the quantification of PAHs. It was

perfomed the validation of the SCAN and SIM mode. For the

purposes of analysis were used two models of sample. PAHs

from the soil sample were extracted with acetonitrile,

"QuEChERS" extraction, and quantified by GC / MS analysis.

The results showed that, for the purposes of quantifying,

adequate was SIM mode. It is characterized by the highest

recovery value and the lowest value for the relative standard

deviation.

Accepted by the Scientific Board on, ASB: 15.01.2014.

Defended on, DE:

Defended Board, DB: President:

Member:

Member, Mentor:

Образац Q4.09.13 - Издање 1

Eksperimentalni deo ovog master rada je urađen u labaratorijama Departmana za hemiju Prirodno - matematičkog fakulteta u Nišu.

Želim da se zahvalim svojoj mentorki, profesorki dr Violeti Mitić, vanrednom profesoru na Departmanu za hemiju Prirodno - matematičkog fakulteta Univerziteta u Nišu, na ukazanoj

pomoći prilikom definisanja teme rada, njenih teorijskih okvira i tokom organizovanja izvođenja eksperimentalnog rada. Takođe, zahvalila bih se i profesorki dr Vesni Stankov Jovanović na

savetima i sugestijama pri pisanju rada. Neizmernu zahvalnost dugujem i doktorantima Mariji Dimitrijević i Jeleni Cvetković, na

nesebičnoj pomoći prilikom izrade eksperimentalnog dela ovog diplomskog rada. Srdačno se zahvaljujem i svojoj porodici i prijateljima na bezgraničnoj podršci tokom studija i

izrade masetr rada.

1

Sadržaj 1. Uvod ............................................................................................................................................ 2

2.Teorijski deo ............................................................................................................................... 4

2.1. Policiklični aromatični ugljovodonici (PAU, PAH) ........................................................ 5

2.1.1. Definicija i struktura PAH–ova ................................................................................. 5

2.1.2. Osobine PAH–ova ....................................................................................................... 9

2.1.3. Mehanizam formiranja PAH–ova ........................................................................... 10

2.1.4. Prisustvo PAH-ova u ljudskom okruženju ............................................................. 11

2.1.5. Toksičnost PAH-ova ................................................................................................. 12

2.1.6. Metabolizam PAH-ova ............................................................................................. 13

2.2. Validacija analitičkih metoda ......................................................................................... 15

2.2.1. Specifičnost/selektivnost ........................................................................................... 16

2.2.2. Linearnost .................................................................................................................. 16

2.2.3. Analitički opseg metode (radno područje) ............................................................. 17

2.2.4. Preciznost ................................................................................................................... 17

2.2.6. Granica detekcije/kvantifikacije.............................................................................. 20

2.2.7. Robusnost................................................................................................................... 21

2.3. Metode pripreme uzorka ................................................................................................. 22

2.4. Metode analize PAH-ova ................................................................................................. 26

2.4.1. Gasna hromatografija (GC) ..................................................................................... 26

2.4.2. Masena spektrometrija ............................................................................................. 28

3. Eksperimentalni deo ............................................................................................................... 32

3.1. Faze eksperimentalnog rada ........................................................................................... 33

3.2. Aparati .............................................................................................................................. 33

3.3. Pribor ................................................................................................................................ 33

3.4. Reagensi ............................................................................................................................ 33

3.5. Priprema uzoraka zemljišta za anlizu primenom QuEChERS ekstrakcije ............... 34

3.6. Priprema serije standardnih rastvora smeše PAH-ova za izradu kalibracione prave................................................................................................................................................... 35

3.7. Parametri metode............................................................................................................. 36

3.8. Obrada rezultata .............................................................................................................. 38

4. Rezultati i diskusija................................................................................................................. 42

5. Zaključak ................................................................................................................................. 61

6. Literatura................................................................................................................................. 63

2

1.Uvod

3

Intenzivna urbanizacija, razvoj industrije, saobraćaj i poljoprivredne delatnosti dovode

do prekomernog zagađenja životne sredine, uključujući i zemljište. Opterećenje površinskih slojeva zemljišta velikim količinama otpadnih materija koje se ne mogu razgraditi procesima samoprečišćavanja dovodi do degradacije zemljišta i poremećaja normalnih procesa u njemu, sa negativnim posledicama po ekosistem i zdravlje ljudi.

Sastav i sanitarno stanje zemljišta direktnim, ali i indirektnim uticajem preko zagađenja površinskih i podzemnih voda, vazduha i životnih namirnica predstavlja faktore od značaja za zdravlje populacije.

Organski zagađivači koji nastaju pre svega kao posledica ljudske aktivnosti obuhvataju grupu brojnih jedinjenja različite strukture i fizičko-hemijskih osobina. Svrstani su u grupu perzistentnih organskih zagađivača, koja se dalje može podeliti na podgrupe u koje spadaju: pesticidi (dihloro difenil trihloroetan – DDT, heksabromo bifenil i heksahloro cikloheksan – HCH, hlordan, endrin, heptachlor, aldrin, heksahloro benzene – HCB); organski halogeni derivati (polihlorovani bifenili – PCBs, heksahloro benzene – HCB, polihlorovani dibenzo-p-dioksini/ dioksini/ - PCDDs, polihlorovani dibenzo-p-furani/ furani/ - PCDFs); i policiklični aromatični ugljovodonici.

Policiklični aromatični ugljovodonici − PAU, (Polycyclic aromatic hydrocarbons − PAH), su najzastupljeniji organski polutanti koji predstavljaju hemijska jedinjenja sa dva ili više kondenzovanih benzenovih prstenova, koji ne sadrže hetero atome niti su supstituisani. Formiraju se u procesu nepotpunog sagorevanja uglja, nafte, gasa, drveta, otpada i drugih organskih materija.

U zemljištu većina PAH-ova je snažno sorbovana na organskoj materiji, što ih čini relativno nedostupnim za procese degradacije, pa stoga PAH-ovi mogu ostati u zemljištu tokom nekoliko vekova, što predstavlja dugoročnu opasnost za životnu sredinu.

Analiza policikličnih aromatičnih ugljovodonika i njihovih proizvoda degradacije u uzorcima žemljišta, obuhvata primenu velikog broja metoda kako u pripremi uzoraka za analizu, tako i za njihovo određivanje. Njihova identifikacija veoma je složena, a praćenje niskih koncentracija u nekim slučajevima nalaže primenu veoma osetljivih analitičkih tehnika, gasne hromatografije (GC), tečne hromatografije visokih performansi (HPLC), superkritične tečne hromatografije (SPF), kapilarne elektorforeze. GC metoda sa masenom spektrometrijom ima primat u ispitivanjima, zbog veće selektivnosti i osetljivosti u odnosu na druge metode analize.

Cilj rada bio je da se validiraju odgovarajuće metode za kvantifikaciju policikličnih

aromatičnih ugljovodonika u zemljištu primenom GC−MS metode. Za analizu su korišćeni PAH-ovi koje Evropska Unija propisuje kao važne pokazatelje zagađenja životne sredine: antracen, acenaften, benzo[a]antracen, benzo[a]piren, benzo[b]fluoranten, benzo[ghi]perilen, benzo[k]fluoranten, krizen, dibenzo[a,h]antracen, fluoranten, fluoren, naftalen, fenantren, piren.

4

2.Teorijski deo

5

2.1. Policiklični aromatični ugljovodonici (PAU, PAH)

2.1.1. Definicija i struktura PAH–ova

Policiklični aromatični ugljovodonici (PAU, PAH) su grupa složenih organskih jedinjenja

koja sadrže dva ili više kondenzovana aromatična prstena. Po definiciji, PAH–ovi sadrže samo atome ugljenika i vodonika, međutim pošto se ugljenikovi atomi u benzenovim prstenovima mogu lako supstituisati atomima azota, sumpora i kiseonika u i na taj način formirati hetericiklična aromatična jedinjenja sva i na taj načlin nastala jedninjenja zajednički su grupisana pod nazivom policiklični aromatični ugljovodonici.

Ova grupa hemjskih jedinjenja sadrzi preko 100 različitih PAH–ova čiji kondenzovani prstenovi mogu biti postavljeni u linearnom, ugaonom ili loptastom rasporedu. Fizičko – hemijske osobine su u korelaciji sa brojem prstenova dok male razlike u svakom homologom prstenu mogu biti pripisane međusobnom rasporedu prstenova (Lundstedt S., 2003.).

PAH–ovi se detaljno proučavaju zbog svoje toksičnosti, perzistentnosti a sve sa ciljem zaštite životne sredine. Takve studije su često zasnovane na kvantifikaciji 16 PAH–ova označenih kao prioritetnim zagađivačimae od strane Agencije za zaštitu životne sredine (eng. Environmental Protection Agency, EPA). Njihovi nazivi i strukturne formule prikazani su u Tabeli 1.

Tabela 1: Prioritetni policiklični aromatični ugljovodonici

8

Fenantren i antracen su najprostiji PAH–ovi, sačinjeni od po tri kondenzovana prstena. Najčešće se susreću PAH–ovi sa po pet ili šest kondenzovanih aromatičnih prstenova. PAH–ovi koji sadrže pet ili više od pet aromatičnih prstenova se nazivaju “teškim” PAH–ovima (heavy PAHs), a oni sa manje od pet prstenova su “laki” PAH–ovi (light PAHs). Članovi obeju grupa su nepolarna jedinjenja sa izrazitim lipofilnim karakterom, sa tim što su “teški” PAH–ovi stabilniji i toksičniji u odnosu na “lakše”. Zbog dostupnosti uzoraka “malih” PAH–ova, istraživanja se uglavnom izvode na njima.

9

2.1.2. Osobine PAH–ova

Fizičko – hemijska svojstva u velikoj meri određuju ekološko ponašanje PAH–ova,

toksičnost i njihov uticaj na biološke sisteme. Iako se fizičko – hemijske karakteristike svakog pojedinačnog jedinjenja koje se sastoji od dva ili više kondenzovana aromatična prstena međusobno znatno razlikuju, njihova zajednička osobina, polu ili laka isparljivost, čini PAH-ove visoko mobilnim kroz životnu sredinu. PAH-ovi se transportuju kroz vazduh na velike udaljenosti i zato prisustvo PAH-ova u atmosferi predstavlja univerzalni, globalni problem. Osnovne fizičko – hemijske karakteristike 16 prioritetnih PAH–ova prikazane su u Tabeli 2. Može se uočiti da vrednosti fizičko-hemijskih konstanti variraju i po nekoliko redova veličine za različite pripadnike ove grupe jedinjenja.

PAH–ovi u čvrstom stanju su bele, žute, bledo zelene boje, ali mogu biti i bezbojni. Odlikuju se karakterističnim UV spektrima koji pružaju mogućnost njihove kvantifikacije, otpornošću na fotorazgradnju, a u pobuđenom stanju mogu da fluoresciraju. Imaju visoku tačku ključanja i malu vrednost napona pare, ali i pri takvim vrednostima, PAH–ovi mogu isparavati i lako se transportovati na velike udaljenosti kroz atmosferu.

Generalno PAH–ovi su lipofilne materije sa povećanim afinitetom prema organskoj materiji. Slabo se rastvaraju u vodi dok je njihova rastvorljivost u organskim rastvaračima znatno bolja. Sa porastom molekulske mase rastvorljivost u vodi opada a raste stabilnost molekula. Zbog tih karakteristika molekuli sa većom molekuskom masom više su zastupljeni u zemljištu nego u vodi i atmosferi (Lundstedt S., 2003.).PAH–ovi su hemijski inertna jedinjenja, a mogu da podčežu reakcijama elektrofilne supstitucije i adicije.

10

Tabela 2: Fizičke osobine policikličnih aromatičnih ugljovodonika

2.1.3. Mehanizam formiranja PAH–ova

Policiklični aromatični ugljovodonici predstavljaju najstabilniji oblik ugljovodonika, a pošto imaju mali odnos atoma vodonika i ugljenika najčešće se javljaju u kompleksnim mešavinama, pre nego kao izdvojena jedinjenja (Ravindra et al., 2008.).

Policiklični aromatični ugljovodonici se formiraju tokom termalne razgradnje organske materije koja dominantno sadrži ugljenik i vodonik, u procesima pirolize i nepotpunog sagorevanja. Iako PAH-ovi dospevaju u životnu sredinu i prirodnim putem, požarima i vulkanskim erupcijuama, smatra se da najveći doprinos prisustvu PAH-ova u životnoj sredini daju antropogene aktivnosti.

11

PAH-ovi se relativno lako u laboratorijskim uslovima sintetišu iz zasićenih ugljovodonika u anaerobnim uslovima. Pirosinteza i piroliza su dva glavna mehanizma koja mogu objasniti formiranje poličikličnih aromatičnih ugljovodonika (Gaga i Tuncel, 2003; Ravindra et al., 2008.). Niži ugljovodonici (poput metana, etana) formiraju PAH-ove pirosintezom. Kada temperatura pređe 5000C, raskidanjem ugljovodonične i ugljeničnih veza formiraju se slobodni radikali. Radikali se kombinuju do acetilena, koji se dalje kondenzuje sa aromatičnim prstenastim strukturama otpornim na termalnu degradaciju. Slika 1 ilustruje formiranje policikličnih aromatičnih ugljovodonika, sa etanom kao početnim jedinjenjem.

Slika 1. Pirosinteza PAH-a sa etanom kao početnim jedinjenjem (Ravindra et al., 2008)

2.1.4. Prisustvo PAH-ova u ljudskom okruženju

PAH-ovi kao jedna od najrasprostranjenijih grupa organskih zagađivača mogu se naći u

vazduhu, vezani za čestice prašine, rastvoreni u vodi, biljkama i hrani. Neki PAH-ovi se koriste u industriji boja, plastike i pesticida. Mogu se naći i u asfaltu, sirovoj nafti, uglju, čađi i katranu.

PAH-ovi u životnu sredinu dospevaju iz prirodnih i antropogenih izvora. Najznačajniji prirodni izvori PAH-ova su vulkanska aktivnost i šumski požari. Znatne količine PAH-ova se emituju iz antropogenih izvora. Ovako formirani PAH-ovi se akumuliraju u vodi, vazduhu i zemljištu, a kroz lanac ishrane dospevaju do čoveka.

U vazduhu, PAH-ovi se nalaze u obliku čestica i u gasovitoj fazi. Koncentracija PAH-ova u vazduhu varira od 5 do 200000 ng/m3. Deo PAH-ova se u površinskim vodama vezujeza suspendovane čestice, a deo se dalje transportuje procesom isparavanja. Njihova koncentracija u vodi je jako mala (do 100 ng/L), zbog niske rastvorljivosti u ovoj sredini, pa je to glavni razlog akumulacije PAH-ova u zemljištu i vodenim organizmima.

12

Unutar zemljišta većina PAH-ova biva snažno sorbovana na organskoj materiji, što ih čini relativno nedostupnim za procese degradacije, pa stoga PAH-ovi mogu ostati u zemljištu tokom nekoliko vekova. To predstavlja dugoročnu opasnost za životnu sredinu, iako su se PAH-ovi male molekulske mase delimično izbubili kroz process degradacije, pretvaranjem u paru i luženjem. Efekat sorpcije se generalno povećava kako broj benzenovih prstenova u molekulu PAH raste, jer to podrazumeva veću lipofilnost. Dokazano je da se razgradnja i mogućnost ekstrakcije organskih jedinjenja u tlu povećava sa produživanjem vremena kontakta PAH-ova sa tlom, i to predstavlja fenomen nazvan “starenje”. “Starenje” je uglavnom rezultat spore difuzije u organskoj materiji zemljišta, ali i drugih mehanizma koji se odvijaju pri formiranju vezanih ostataka i fizičkih klopki unutar mikropora u tlu. Procese sorpcije i “starenja” limitira sa jedne starne razgradnja zagađivača, a sa druge strane, ovi procesi smanjuju toksičnost zagađivača, smanjujući nivo zagađivača dostupan živim organizmima (Lundstedt S., 2003.).

Koncentracije PAH-ova kao sve prisutnijih zagađivača dosta variraju u zavisnosti od okoline. Koncentracije su generalno veće u blizini izvora emisije poput proizvodnje ili upotrebe fosilnih goriva, ili proizvoda dobijenih iz fosilnih goriva, kao što su katran ili kerozin.

Istraživanjem je ustanovljeno da su najveći prirodni izvori PAH-ova sagorevanje čvrstog goriva u domaćinstvima i toplanama u toku zimskog perioda. Većina studija ukazuje da emisije izduvnih gasova motornih vozila koje potiču od sagorevanja dizela, kao i olovnog i bezolovnog benzina, najviše doprinose koncentracijama PAH-ova u urbanim sredinam. Opšta populacija je svakodnevno izložena aktivnoj ili pasivnoj inhalaciji duvanskim dimom, koji kao produkat sagorevanja cigarete sadrži PAH-ove.

Velika kolilčina PAH-ova može nastati i pri procesima prerade hrane, kao što su dimljenje i sušenje, kao i kuvanje, roštiljanje i pečenje. Već na temperarurama većim od 200 0C, pirolizom masti dolazi do formiranja PAH-ova, a na temperaturama višim od 5000C, veze ugljenik-vodonik i ugljenik-ugljenik se kidaju uz formiranje radikala koji kao krajnji proizvod reakcija mogu da nagrade PAH-ove. Druge organske supstance prisutne u hrani, kao što su proteini i ugljeni hidrati, pirolizom mogu doprineti formiranju PAH-ova, dok se piroliza masti smatra glavnim izvorom nastanka PAH-ova. Tokom termičke obrade mesa na roštilju osim količine masti u mesu, znatan uticaj na formiranje PAH-ova ima blizina plamena. Neka istraživanja ukazuju na prisustvo ovih jedinjenja u hrani koja nije termički obrađena. Najčešće prisutan PAH u uzorcima hrane je benzo[a]piren, pa je njegova količina odličan indikator za zagađenost hrane PAH-ovima.

2.1.5. Toksičnost PAH-ova

Policiklični aromatični ugljovodonici su sveprisutni u atmosferi i jedni su od prvih

polutanata koji su identifikovani kao visoko kancerogeni, toksični i mutageni. Neki od PAH-ova imaju dokazane kancerogene i/ili mutagene karakteristike, tako da je prisustvo i ponašanje

13

policikličnih aromatičnih ugljovodonika u urbanim i industrijskim oblastima postao neophodan i imperativan predmet istraživanja (Venkataraman et al., 1999.). Najznačajniji metabolit banzo[a]pirena je benzo[a]piren-7-8-diol-9,10-epoksid, koji ima jako izraženo kancerogeno dejstvo zbog interakcije sa proteinima ili DNK. Ipak, samo se nekoliko policikličnih aromatičnih ugljovodonika (PAH sa četiri, pet i šest aromatičnih prstenova) smatra veoma aktivnim kancerogenim supstancama. Sa povećanjem molarne mase raste i kancerogenost PAH-ova, dok se akutna toksičnost smanjuje (Purcaro et al., 2013).

Imajući u vidu da su PAH-ovi prisutni u vazduhu, vodi, zemljištu i hrani, glavni načini unošenja ovih jedinjenja u organizam su respiratorni i peroralni dok je unošenje dermalnim putem slabije izraženo. Efekti na živi svet su raznovrsni. Oni utiču na rast, razvoj, metabolizam, izazivaju formiranje i razvoj tumora, dovode do akutne toksičnosti, razvojne i reproduktivne toksičnosti, citotoksičnosti i genotoksičnosti. Kada se PAH-ovi nađu u organizam, dospevaju u limfu i krv i metabolišu se u jetri i bubrezima (Agency for Toxic Substances and Disease Registry, 2009).

Nesupstituisani PAH-ovi nisu originalna jedinjenja koja reaguju sa DNK. PAH-ovi zahtevaju metabolitičku aktivaciju i konverziju da bi pokazali svoja genotoksična i kancerogena svojstva. To se dešava jer se PAH-ovi metabolišu u višim organizmima. Oni se ne akumuliraju na isti način kao i neka druga lipofilna organska jedinjenja. Umesto toga, oni se konvertuju u forme koje su u vodi rastvorne, što olakšava njihovu naknadnu ekstrakciju iz organizama. Nažalost, to može da dovede do formiranja reaktivnih intermedijera koji mogu reagovati sa DNK i formirati adukte koji sprečavaju normalno funkcionisanje gena i izazivaju pojavu karcinoma.

2.1.6. Metabolizam PAH-ova

PAH-ovi ispoljavaju karcinogenu aktivnost nakon transformacije u hemijski reaktivne

intermedijere koji mogu kovalentno da se vezuju za ćelijske makromolekule (DNK) i tako dovedu do mutacija i inicijacije tumora. Reaktivni proizvodi metabolizma PAH-ova su epoksidi, dihidrodioli, fenoli i hinoni. Diolni epoksidi se lako konvertuju do karbonijum jona koji je mutagen i inicijator karcinogeneze.

Preduslov za konverziju u diolne epokside je prisustvo citohroma P-450 i drugih odgovarajućih enzima, pa se karcinogeni potencijal PAH-ova može predvideti na osnovu stepena indukcije ovih enzima. Od posebnog značaja za metabolizam PAH-ova je indukcija arilhidrokarbon hidrolize (AHH). Indukcijom ovog enzima od strane benzo(a)pirena, formira se reaktivni intermedijer, 7,8-dihidrodiol, koji je identifikovan u toku epitela kože. Vezivanjem za Ah receptor dolazi do ekspozicije Ah gena i indukcije enzima citohrom P-450 oksidaza. Smatra se da je nastajanje tumora kod ljudi upravo vezano za navedene mehenizme. Mehanizam dejstav benzo[a]pirena prikazana je na Slici 2 (Lundstedt S., 2003.).

14

Slika 2. Metabolotička aktivacija benzo[a]pirena

15

2.2. Validacija analitičkih metoda

Osnovni zadatak svake analitičke laboratorije je postizanje brzih, tačnih i verodostojnih rezultata analize. Zbog toga je potrebno opisati analitičke metode u onom obliku i opsegu kako bi se njenom primenom mogli da dobiju tačni i pouzdani rezultati. Najbolji način izbegavanja problema tokom primene metode je validacija analitičke metode. Iako se samom validacijom ne mogu predvideti svi problemi koji se mogu javljati tokom primene metode, postupci razvoja i validacije metode upućuju na one najčešće.

Validacija analitičkih metoda predstavlja postupak kojim se osiguravaju tačni, precizni i reproduktivni rezultati tokom dugoročnog korišćenja metode. Takođe, validacijom se mogu utvrditi uzroci mogućih problema prilikom izvođenja metode, čime se postiže veliki stepen pouzdanosti i pogodnosti metode.

Osnovna načela validacije prilikom razvoja metode svi savesni analitičari su primenjivali i davno pre, jer je to ono što nalaže struka i logika rada u analitičkoj laboratoriji. Međutim, tada se taj postupak nije nazivao validacijom analitičkih metoda i nije bilo propraćen danas potrebnom, temeljnom i opsežnom dokumentacijom. Međutim, validaciju analitičkih metoda ne treba prvenstveno smatrati kao regulatorni zahtev, već kao proveru postupka analitičke metode.

Analitičke metode se trebaju validovati, verifikovati ili revalidovati prilikom • razvoja i uvođenja nove metode • promene bilo kojeg dela analitičke metode koja je već bila validirana

− pri promeni parametara metode koji su izvan izvornoga opsega postojeće metode

− poboljšanje i prilagođavanje postojeće metode

− prenošenje metode u drugu laboratoriju

− prenošenje metode na drugi instrument Koraci validacije uključuju izradu validacionog protokola sa podrobnim uputstvima, i

• definiciju svrhe i opsega korišćenja metode • definisanje parametara izvođenja i njihovih granica prihvatljivosti • definisanje validacionih eksperimenata • definisanje svojstava opreme, kvaliteta hemikalija i analitičkih standarda • izvođenje predvalidacionih ispitivanja u cilju prilagođavanja granica prihvatljivosti • izvođenje validacionih eksperimenata • definisanje detalja metode za njenu uobičajenu primenu • definiranje parametara i granica testa prikladnosti sastava • dokumentovanje validacionih eksperimenata i izrada validacionog izveštaja.

16

Optimalni redosled izvođenja validacionih eksperimenata zavisi od same metode, no najčešće se primenjuje sledeći raspored kojim se određuje

• specifičnost/selektivnost

• linearnost

• analitički opseg metode (radon područje)

• preciznost - ponovljivost (eng. repeatability) - međupreciznost (eng. intermediate precision) - reproduktivnost (eng. reproducibility)

• tačnost (rikaveri vrednost)

• granica kvantifikacije

• granica detekcije

• robusnost Kombinacijom ovih parametara oblikuje se plan validacije za svaku metodu.

2.2.1. Specifičnost/selektivnost

Specifičnost/selektivnost je svojstvo metode da tačno i specifično odredi željeni analit u

prisustvu ostalih komponenata u matriksu uzorka pod utvrđenim uslovima ispitivanja. Iako se u praksi često poistovećuju, specifičnost i selektivnost su dva različita svojstva metode. Specifična metoda je ona kojom se može odrediti samo jedan specifičan analit (instrumentalni signal daje samo jedan analit). Metoda kojom se može određivati više komponenata istovremeno, ali pod uslovom da te komponente pri određivanju ne smetaju jedna drugoj, naziva se selektivnom. U praksi samo mali broj analitičkih metoda daje odgovor na samo jedan analit, zato formu selektivnosti mnogo češće koristimo od specifičnosti. Način prikazivanja rezultata zavisi od karakteristike metode koja se koristi u navedenu svrhu.

2.2.2. Linearnost

Linearnost predstavlja mogućnost da se metodom, unutar radnog opsega koncentracije

analita, dobije linearna zavisnost analitičkog signala od koncentracije analita. Opseg linearnosti zavisi od prirode analita i tipa detektora. U praksi se linearnost određuje merenjem odziva metode na različite poznate koncentracije referentnog materijala (preporučuje se najmanje pet koncentracija uz tri ponavljanja). Procenjuje se matematički i grafički.

Matematički način procene se vrši na taj način što se primenom linearne regresije izrazi jednačina pravca (y = ax + b) i izračuna koeficijent korelacije (r). Nagib pravca (a) parameter je koji ukazuje na osetljivost metode. Što je veća vrednost nagiba pravca metoda je osetljivija. Odsečak pravca (b) može ukazivati na sistematsku grešku. Za koeficijent korelacije obično se

postavlja kriterijum r ≥ 0,99. Za vrlo niske koncentracije prihvata se uslov r ≥ 0,98.

17

Najčešće se upotrebljavaju dva načina grafičkog prikaza: • grafički prikaz odstupanja od regresijskog pravca u odnosu na koncentracu ili logaritam koncentracije – za linearna područja odstupanja su jednako raspoređena između pozitivnih i negativnih vrednosti (Slika 3a) • grafički prikaz relativnih signala (odnos signala i odgovarajuće koncentracije) na osi y i odgovarajućih koncentracija na osi x log skale. Dobijena linija treba da bude horizontalna u celom linearnom području, a područje linearnosti prestaje pri koncentracijama gde linija relativnog odziva seče paralelne linije koje odgovaraju 95% ili 105% koncentraciji (Slika 3b).

Slika 3. Dva načina grafičkog prikaza linearnosti

2.2.3. Analitički opseg metode (radno područje)

Opseg analitičke metode predstavlja interval između gornjeg i donjeg nivoa koncentracije

merenog analita u uzorku (uključujući i te koncentracije) u kome se analiza može vršiti sa određenom tačnošću, preciznošću i linearnošću. Za određivanje ovog parametra nije potrebno izvoditi zasebne eksperimente, opseg se može odrediti ispitivanjem tačnosti i linearnosti metode. U puno slučajeva područje je određeno svrhom metode i nema potrebe za ispitivanjem krajnjih mogućnosti metode. Naprotiv, sužavanjem područja na koncentracijski raspon uzorka postižu se bolja tačnost i preciznost.

2.2.4. Preciznost

Preciznost je parametar koji daje procenu reproduktivnosti rezultata tj. slaganja između

numeričkih vrednosti dva ili više merenja izvedenih na isti način. Eksperimenti preciznosti vrše se na homogenom autentičnom uzorku, dok se postupak merenja izvodi najmanje pet puta.

Preciznost se izražava kao: Ponovljivost (Repeatability) je parameter validacije kojim se izražava preciznost

rezultata analiza istog uzorka kojeg pod istim uslovima analizira isti analitičar, u istoj laboratoriji, na istoj opremi u kratkom vremenskom razdoblju

18

Srednja preciznost (Intermediate precision) je tip preciznosti koja odgovara merenjima izvršenim pod maksimalno promenljivim uslovima u jednoj laboratoriji. Merenje se vrši istom metodom, na istom uzorku, u istoj laboratoriji, a izvodi ga različit operater, na različitoj opremi u , srednje dugom vremenskom period razmaka između merenja.

Reproduktivnost predstavlja podudaranje rezultata dobijenih uzastopnim merenjem nekoliko istih uzoraka istom metodom u različitim laboratorijama (različit operater, različiti radni uslovi unutar specifičnih parametara metode). Preciznost se izražava standardnom devijacijom S (1), koeficijentom varijacije Cv (2) i varijancom S2 (3).

(1) S - standardna devijacija xi - pojedinačni sadržaj svake probe, dobijen određivanjem

- srednja vrednost određivanja

(2)

Cv – koeficijent varijacije S - standardna devijacija

- srednja vrednost određivanja

(3) S2 - varijanca xi - pojedinačni sadržaj svake probe, dobijen određivanjem n - broj određivanja

- srednja vrednost odeđivanja Važno je napomenuti da preciznost ne podrazumeva tačnost. Tačnost mernog sistema je

bliskost izmerene količine njenoj stvarnoj (pravoj, sertifikovanoj) vrednosti, dok preciznost,

19

takođe zvana i ponovljivost ili reproduktivnost, jeste stepen u kojem ponovljena merenja pod neporomenjenim uslovima pokazuju isti rezultat.

Rezultati na Slici 4(a) su precizniji za razliku od onih na slici 4(b). Veća preciznost rezultata na Slici 4(a) ne znači i da je taj set rezultata precizniji. U stvari, oba seta razultata mogu biti vrlo naprecizna. Kao i kod tačnosti, preciznost zavisi od faktora koji utiču na odnos između signala i analita.

Slika 4. Dva određivanja koncentracije u serumu, pokazujući efekat preciznosti. Podaci na prvoj slici su manje rasuti, i stoga, precizniji nego oni na slici b.

2.2.5. Tačnost (Recovery vrednost)

Tačnost analitičke metode je stepen saglasnosti između stvarne i vrednosti dobijene primenom analitičkog postupka određeni broj puta, odnosno ona ukazuje na ispravnost merenja.

U praksi se tačnost analitičke metode proverava: - Analizom Standardnih Referentnih Materijala -SRM - Određivanjem procenta prinosa - rikaveri vrednosti - Upoređivanjem sa drugom metodom, (ili sa više) koja je potvrđena kao tačna Dobijena tačnost u velikoj meri zavisi od načina pripreme uzorka, matriksa i koncentracije

uzorka. Za određivanje tačnosti treba koristiti najmanje tri različite koncentracije analita u uzorcima i analizu ponoviti tri puta.

Određivanje procenta prinosa ili tzv. “recovery” vrednost se tako što se uzorku i slepoj probi doda se poznata količina čistog standarda i meri se porast analitičkog signala.

Za svaku probu Recovery vrednost se izračunava na osnovu sledećeg izraza

Recovery [%] = ��(��)

��(��)))))x100 (4)

20

Slikovita ilustracija pojmova preciznost i tačnost određivanja prikazana je na Slici 5.

mala tačnost velika tačnost mala preciznost mala preciznost

mala tačnost velika tačnost velika precizna velika preciznost

Slika 5. Ilustracija preciznosti i tačnosti metode

2.2.6. Granica detekcije/kvantifikacije

Granica detekcije se još naziva i Limit detekcije (LOD). Najniža koncentracija analita koja

se može detektovati u uzorku, ali ne i kvantitativno odrediti, naziva se granicom detekcije (eng. Limit of Detection – LOD). Postoji nekoliko pristupa određivanju LOD:

− vizuelno

− na osnovu odnosa signal/šum bazne linije (S/N)

− na osnovu standardne devijacije odgovora detektora i nagiba kalibracione prave (S/N) se određuje merenjem signala analita koji se nalazi u poznatoj, veoma niskoj koncentraciji i uzorka bez analita, pri čemu se utvrđuje najniža koncentracija analita koju je moguće detektovati. Za granicu detekcije obično se uzima vrednost koncentracija koje daju S/N = 3 ili S/N = 2. Teorijski limit detekcije se izračunava po formuli:

LOD = �.��

� (5)

21

gde je: σ standardna devijacija odgovora detektora dobijena višestrukim merenjem slepe probe, a– nagib kalibracionog grafika. σ se dobija kao standardna devijacija serije merenja signala uzorka bez analita, ili kao

standardna devijacija odsečka na ordinate dobijenog iz kalibracione prave sa koncentracijama bliskim LOD.

Granica kvantifikacije se naziva i Limit kvantifikacije (LOQ) i definiše se kao najmanja količina analita u uzorku koja se može kvantitativno odrediti sa prihvatljivom preciznošću i tačnošću. Ovaj parameter je naročito važan kod analize nečistoća ili degradacionih produkata. Određuje se analogno određivanju detekcionog limita, koristeći S/N = 10, ili korišćenjem jednačine:

LOQ = ��

� (6)

gde je: σ – standardna devijacija odgovora detektora dobijena višestrukim merenjem slepe

probe, a – nagib kalibracionog grafika.

2.2.7. Robusnost

Robusnost se definiše kao mera otpornosti analitičkog postupka na male, namerne promene radnih uslova metode. Ispitivanje robusnosti je važan deo razvoja metode jer pomaže otkrivanju optimalnih uslova za izvođenje metode i na taj način upućuje na one parametre koje treba kontrolisati. Tokom eksperimenata menjaju se radni uslovi unutar stvarnih granica i prati kvantitativna promena rezultata. Ako promena nekog radnog uslova ne utiče bitno na rezultat, kaže se da je on u području robusnosti metode. Uslove za koje je utvrđeno da utiču na rezultat treba držati pod nadzorom i to jasno naznačiti u opisu metode. Prema podacima o robusnosti postavljaju se parametri za ispitivanje pogodnosti sistema. Robustnost, kao karakteristika izvođenja metode, nije neophodno određivati u svakoj laboratoriji. Kada se koristi standardizovana metoda razumno je da se prihvati da je robustnost metode određena procedurom standardizacije.

22

2.3. Metode pripreme uzorka

Priprema uzorka je važan korak u svakom analitičkom postupku. Priprema uzorka podrazumeva dekompoziciju i rastvaranje organskih i neorganskih uzoraka, u zatvorenim ili otvorenim sistemina primenom termalne ili energije zračenja.

Da bi bilo moguće analizirati željeni analit u nekom odabranom uzorku, potrebno je taj analit izolovati, a po potrabi i koncentrovati. Metode izolovanja, odnosno ekstrahovanja mogu biti različite i mogu se kombinovati, zavisno od vrste analita, ali i vrste uzorka.

Neke od najčešće korišćenih metoda ekstrakcije analita iz uzorka su: - ultrazvučna ekstrakcija smešom rastvarača, - Soxhletova ekstrakcija, - mikrotalasna ekstrakcija, - ekstrakcija organskim rastvaračima na koloni, - ekstrakcija superkritičnim fluidima, - mikroekstrakcija čvrstom fazom, - QuEChERS.

Ultrazvučna ekstrakcija smešom rastvarača: je jednostavan postupak koji uključuje upotrebu zvučnih talasa kako bi se izdvojio analit iz uzorka koji je uronjen u organskom rastvaraču. Ultrazvučna ekstrakcija uglavnom se koristi za analizu uzoraka u čvrstom stanju. Uzorak sa odgovarajućom smešom rastvarača se stavlja u ultrazvučnu kadu koja je prikazana na Slici 6. Preporučuje se da se uzorci koji sadrže male koncentracije PAH-ova ekstrahuju najmanje dva puta, uvek svežom porcijom rastvarača. Od rastvarača je najbolje pripremiti smešu aceton/metilen hlorid (1:1, v/v) ili aceton/heksan (1:1, v/v). Ultrazvučna ekstrakcija osigurava delotvorniju ekstrakciju od mućkanja u balonu i Soxhlet-ove ekstrakcije. Uzrok povećanoj delotvornosti ultrazvučne ekstrakcije je mnogo bolji kontakt između čvrste materije i rastvarača. Prednosti ovog postupka su njena relativna brzina, jednostavnost, smanjenje čestica, ubrzani prenos mase i ne zahteva skupocenu opremu, dok su nedostaci potreba za većom zapreminom upotrebljenog rastvarača i potreba za čestom višekratnom ekstrakcijom.

Slika 6. Šematski prikaz uređaja za ultrazvučnu ekstrakciju: ultrazvučna kada i ultrazvučna

sonda

23

Soxhletova ekstrakcija: se najčešće koristi za ekstrakciju praškastih uzoraka pri čemu se bira rastvarač u kojem je rastvorljivost analita veća. Rastvarač ili smeša rastvarača koja se koristi za ekstrakciju moraju imati veliki afinitet prema analitu, mali afinitet prema uzorku, malu viskoznost i veliku isparljivost tako da se lako uklanjaju iz ekstrahovanog uzorka. Soxhletova ekstrakcija izvodi se tako da se rastvarač pogodno upari, kondenzuje i zatim propušta kroz usitnjeni i homogenizovani čvrsti uzorak koji se nalazi u celuloznu čauru, šema aparature prikazana je na Slici 7. Nakon toga se rastvarač vraća u tikvicu zajedno sa ekstraktom. Osnovni nedostaci Soxhlet ekstrakcije su dugo trajanje (10-24h), zagađenje okoline zbog velike potrošnje organskih zagađivača (300 ml/uzorak), a spojevi koji se ekstrahuju moraju biti stabilni na temperature ključanja rastvarača. Iskorišćenje Soxhlet ekstrakcije je od 50-100% .

Slika 7. Soxhlet aparatura za ekstrakciju

Mikrotalasna ekstrakcija: za razliku od Soxhletove ekstrakcije mikrotalasna ekstrakcija, čiji je uređaj prikazan na Slici 8, omogućava smanjenje vremena trajanja ekstrakcije i količine potrebnog rastvarača za ekstrakciju. Upotrebom mikrotalasnog zračenja može se izbeći i razgradnja uzorka zbog visoke temperature, a energija mikrotalasa olakšava desorpciju analita iz metrice. Loša svojstva mikrotalasne ekstrakcije su: - potreba za razdvajanje ekstrakta od uzorka dekantovanjem, filtriranjem ili centrifugiranjem - hlađenje ćelije za mikrotalasnu ekstrakciju nakon ekstrahovanja na sobnoj temperature pre

otvaranja, čime se gubi dosta vremena koje se dobija ovom brzom metodom ekstrakcije.

24

Slika 8. Uređaj za mikrotalasnu ekstrakciju

Tečna ekstrakcija pod pritiskom: je moderna metoda ekstrakcije. Uzorak (često pomešan sa sredstvom za sušenje) je smešten u ekstrakcionu ćeliju od nerđajućeg čelika koja je pod pritiskom, zagreva se i puni rastvorom za ekstrakciju. Princip rada je prikazan na Slici 9. Visoka temperatura povećava brzinu difuzije, topljenje analita i time ubrzava ekstrakciju. Nakon ekstrakcije je potrebno dodatno čišćenje ekstrakta, a kod usled korišćenja povišenih temperatura moguća je razgradnja nestabilnog analita pa ovo čini glavne nedostatke metode.

Slika 9. Tečna ekstrakcija pod pritiskom

QuEChERS (Quick Easy Cheap Effective Rugged Safe): je skraćenica za veoma koristan analitički pristup koji znatno pojednostavljuje analizu kompleksnih uzoraka. Predstavlja brzu i prikladnu zamenu za tradicionalne postupke ekstrahovanja sa minimalnim brojem koraka pripreme i uz značajno smanjenu potrošnju rastvarača. Prednosti QuEChERS metode su: visoka iskorišćenja, efikasnost, jednostavnost, manja potrošnja ostalih reagenasa, robusnost, mogućnost obrade većeg broj uzoraka, niska cena kao i adekvatnost za rutinski rad u laboratoriji. Pomenuta metoda ima i svoje nedostatke zbog čega nije uvek primenjiva u svim

25

laboratorijama. Glavni nedostatak QuEChERS metode je manja koncentracija u konačnom ekstraktu nego u sličaju tradicionalnih postupaka i činjenica da zahteva upotrebu osetljivih i visokoselektivnih hromatografskih sistema, uz dodatno koncentrisanje ekstrakta ili injektovanje velikih zapremina ekstrakta. Za uspešnu primenu QuEChERS metode nužno je da je laboratorija opremljena visokoselektivnim sistemima. Analiza krajnjeg ekstrakta može se direktno izvršiti GC ili LC hromatografijom. Procedura QuEChERS ekstrakcije data je na Slici 10.

Slika 10. Procedura QuEChERS ekstrakcije Upotrebom QuEChERS tehnike jedan analitičar može pripremiti 8 uzoraka za 45 min, koristeći potrošni material u vrednosti od 1-3 €.

Pored toga što se za ovu metodu koristi manje rastvarača u odnosu na konvencionalne SPE metode, QuEChERS procedure omogućuju pogodno pojednostavljeno prečišćavanje ekstrakta.

26

2.4. Metode analize PAH-ova Metode koje se koriste pri analizi PAH-ova su:

- Gasna hromatografija (GC) - Tečna hromatografija visokih performansi (HPLC) - Superkritična tečna hromatografija (SFC) - Kapilarna elektroforeza (CE)

Imajući u vidu da su koncentracije ovih jedinjenja u uzorcima iz životne sredine vrlo male,

pri radu potrebno je koristiti pogodne metode čija osetljivost i specifičnost zadovoljava potrebe analize. Najširu primenu u analizi PAH-ova danas ima metoda tečne hromatografije visokih performansi (HPLC) i gasna hromatografija kuplovana sa masenim detektorom (GC/MS). Zbog veće selektivnosti i osetljivosti u odnosu na druge metode analize gasna hromatografija u kombinaciji sa masenom spektrometrijom ima primat u analizi PAH-ova.

2.4.1. Gasna hromatografija (GC)

Gasna hromatografija (GC) je metoda razdvajanja i detekcije lako isparljivih organskih

jedinjenja. Ovaj vid hromatografije primenjuje se za analizu onih jedinjenja koja se bez degradacije mogu prevesti u gasovito stanje. Kod gasne hromatografije mobilna faza je ujedno i noseći gas, obično inertan (najčešće argon ili helijum) ili gas koji ne reaguje sa ispitivanim uzorkom (najčešće azot). Stacionarna faza je mikroskopski sloj tečnosti ili polimer na inertnoj čvrstoj podlozi, unutar dela stakla ili metalne cevi koja se naziva kolona.

Ispitivani uzorak rastvoren u pokretnoj, mobilnoj fazi, kreće se kroz nepokretnu, stacionarnu fazu, čime se njegove komponente razdvajaju, pa ih je moguće dalje analizirati i određivati, čak iako su slične strukture ili fizičko-hemijskih osobina. Različite komponente uzorka imaju različit afinitet ka stacionarnoj fazi, pa usled interakcija koje se tom prilikom odvijaju, dolazi do usporenog kretanja istih kroz kolonu. Svaka komponenta se distribuira između dve faze i uspostavlja se dinamička ravnoteža, definisana koeficijentom raspodele, K:

K = ��

��

Nakon eluiranja, analit dospeva do detektora, koji je povezan sa računarom na čijem se

ekranu dobija hromatogram. Svaki signal, u takvom hromatogramu, odgovara jednom hemijskom jedinjenju i okarakterisan je kvalitativno i kvantitativno retencionim vremenom i površinom.

27

Gasni hromatogram sastoji se iz sledećih delova (Slika 11): - boca sa nosećim gasom i regulatorom pritiska - autosempler - injector - peć za regulisanje temperature - kolona - detektor - monitor ili štampač

Slika 11. Šema gasnog hromatograma

Radi dobijanja boljih rezultata, pored dobre pripreme uzorka, korišćenje autosemplera omogućava dobru ponovljivost i oprimizaciju vremena, što je osnovna prednost autosemplera nad manuelnim uzorkovanjem. Za unošenje uzorka u kolonu koristi se injektor.

Prema nameni, kolone za gasnu hromatografiju se dele na preparativne i analitičke, ali je mnogo rasprostranjenija podela prema načinu pripreme i prečniku, i to na:

− punjene kolone, koje su izrađene od nerđajućeg čelika ili stkla i inertnog punjenja presvučenog tečnom ili čvrstom stacionarnom fazom. Dužine su od 1,5 do 10 m, prečnika od 2 do 4 mm, sadržaj tečne faze iznosi od 5 do 10%, a prosečni prečnik zrna inertnog nosača od 100 do 150 µm. Inertni nosači obično su izrađeni od materijala na bazi dijatomejske zemlje.

− kapilarne kolone, čiji su zidovi obloženi nekom aktivnom materijom. Većina kapilarnih kolona je napravljena od stopljenog silika gela sa poliimidnom oblogom. Dužina im doseže čak i do 60 m dok je prečnik izrazito mali, 0,125-0,256 mm.

28

U gasnoj hromatografiji se koristi više vrsta detektora. Najpoznatiji i najkorišćeniji među njima su plameno jonizacioni detektor (FID) i termalno provodljivi detektor (TCD). Oba detektora mogu detektovati veliki broj komponenanta u širokom intervalu koncentracija. Termalno provodljivi detektori su za nijansu šire primenljivi i mogu detektovati većinu komponenti čija je termalna provodljivost veća od termalne provodljivosti nosećeg gasa na zadatoj temperaturi. Plameno jonizacioni detektori su osetljiviji na ugljovodonična jedinjenja i ne mogu detektovati vodu. Takođe, prednost TCD detektora nad FID detektorom je da ne uništava ispitivane komponente (plameno jonizacioni ih sagoreva) i mogu se postaviti u seriji prilikom analize što omogućava dodatna ispitivanja za jednu te istu komponentu. Detekcija organskih jedinjenja je najefektnija ako se koristi plameno jonizovani detector.

Čistoća nosećeg gasa koji se koristi u gasnoj hromatografiji je 99.995% ili čak i više. Protok nosećeg gasa utiče na analizu u istom obimu kao i varijacija temperature. Brži protok omogućava i bržu analizu, ali i smanjuje mogućnost potpunog razdvajanja komponenti smeše (kraće zadržavanje pojedinih komponenti na teoretskim podovima kolone). Protok nosećeg gasa se zato optimizuje zajedno sa optimizacijom dužine kolone i temperaturnim režimom. Gasni hromatografi imaju mogućnost elektronskog merenja i kontrole protoka nosećeg gasa, čime je omogućeno da se pritisak i brzina protoka nosećeg gasa može veoma precizno kontrolisati i tokom trajanja same analize, što daje veću efikasnost metode

2.4.2. Masena spektrometrija

Masena spektrometrija je analitička metoda koja zbog svoje osetljivosti, brzine i granice

detekcije zauzima vodeće mesto među ostalim analitičkim metodama. Primenu je našla u oblastima organske, neorganske, organometalne, analitičke, medicinske, farmaceutske hemije kao a u drugim disciplinama.

Maseni spektrometar je analitički instrument koji razdvaja naelektrisane čestice prema odnosu mase i naelektrisanja, a u kome se dešavaju sledeći procesi:

- nastanak jona iz uzorka u jonizacionom izvoru - razdvajanje jona prema njihovim m/z vrednostima u masenom analizatoru - fragmentisanje selektivnih jona i analiziranje fragmenata u drugom analizatoru - detektovanje jona koji nastaju iz poslednjeg analizatora i merenje njihovih intenziteta

detektorom koji konvertuje jone u električne signale - obrađivanje signala iz detektora koji su preneti od računara i kontrolisanje instrumenata

kroz povratne informacije. Maseni spektrometar, prikazan na Slici 12, se sastoji od:

- sistema za uvođenje uzorka - jonskog izvora - masenog analizatora - detektora

29

Slika 12. Blok šema masenog spektrometra

Jonski izvor je deo masenog spektrometra u kom nastaju joni analiziranih molekula,

putem izbijanja elektrona, zahvata elektrona, protonovanja, deprotonovanja ili građenja adukata. Pri tom procesu može doći i do fragmentacije molekula u dva ili više fragmenata, što u ovom delu masenog spektrometra nije poželjno. Jedan deo jona ostaje ceo i u spektru daje signal s najvećom vrednosti mase. Taj jon se naziva molekulski jon i pokazuje molarnu masu molekula.

Postoji više načina jonizacije, koji se razlikuju po količini energije koja se predaje molekulu. Razlikuju se metode visoko energetske jonizacije ( engl. hard method) i metode nisko energetske jonizacije (eng. soft method).

U zavisnosti od vrste izvora energije za jonizaciju razlikuju se sledeće metode jonizacije: - EI (engl. Electron Impact-elektronski udar) jonizacija - CI ( engl. Chemical ionization) - FD&FI (engl. Field desorption/ionization - desorpcija/jonizacija u jakom polju) - FAB (engl. Fast Atom Bombardment – bombardovanje brzim atomima) jonizacija - MALDI (engl. Matrix Assisted Laser Desorption – laserska desorpcija sa matriksa)

jonizacija - ESI (engl. Electrospray Ionization – jonizacija elektrosprejom) Najčešće korišćena tehnika u masenoj spektrometriji, u kombinaciji sa gasnom

hromatografijom je jonizacija elektronima, na Slici 13 prikazana je šema jednog elektronskog jonizatora.

30

Slika 13. Šema elektronskog EI jonizatora

Kod ESI metode izvor jona se nalazi na atmosferskom pritisku. ESI omogućava maseno-spektralnu analizu velikih i termonestabilnih polarnih molekula pa je zbog toga izuzetno pogodna za analizu bio-molekula. Pruža mogućnost određivanja analita u niskim koncentracijama i u kompleksnim matriksima, vrlo je pogodna za kuplovanje sa HPLC, a nalazi primenu u organskij hemiji.

Maseni analizator je deo masenog spektrometra, gde se joni razdvajaju na osnovu odnosa mase i naelektrisanja (m/z). Tu dolazi do disocijacije jona indukovane kolizijom. Joni u masenom analizatoru bivaju razdvojeni prema njihovim masama, koje moraju biti determinisane. Fizičko svojstvo koje je mereno masenim analizatorom je m/z vrednost, a ne samo masa m.

Postoji više vrsti masenih analizatora koji se razlikuju po tome što koriste statičko ili dinamičko, električno ili magnetno polje ili njihovu kombinaciju, dele se na:

- kontinualne

− kvadripolni

− magnetni - pulsne

− jon trap analizatori

− analizator na bazi vremena preleta

− sa dvostrukim fokusiranjem Najčešće se koristi kvadripolni analizator (Slika 14), koji se sastoji od četiri međusobno

paralelne elektorde, kojima se saopštava osnovni potencijal. Osnovni potencijal dve susedne elektrode je istog intenziteta, ali različitog predznaka. Dok prolaze kroz analizator, joni se razdvajaju na osnovu m/z vrednosti, tako da samo pojedini bivaju propušteni, jer imaju stabilnu putanju, dok su ostali razelektrisani na elektrodama.

31

Odabirom odgovarajuće radio frekvencije i potencijala, analizator će propustiti jone većeg m/z odnosa do detektora, a joni manjeg m/z odnosa bivaju privučeni ka elektrodama.

Slika 14. Šema kvadripolnog analizatora

Posle ubrizgavanja, joni različitih masa se nalaze u jon trap-u i sada moraju biti analizirani

na osnovu svojih masa. Na osnovu masa bivaju izbačeni u detektor, koji konvertuje jone u električni signal, koji se može registrovati na pisaču, računaru ili na nekom drugom uređaju. Električni signali se detektuju u vidu masenih spektara.

Postoje dva načina prikupljanja podataka tokom MS analize: - SCAN- podrazumeva snimanje masenih spektara u određenim vremenskim intervalima, tako da se za svaku vrednost retencionog vremena sa gasnog hormatograma može pripisati odgovarajući maseni spektar; ova metoda pruža mogućnost izbora jona koji će se koristiti za kvalitativnu i/ili kvantitativnu analizu - SIM (Selected Ion Monitoring) – posle snimanja hromatograma, unapred se zadaju vrednosti m/z za jone koji se koriste u kvalitivnoj I/ili kvantitativnoj analiziprate se samo odabrani joni

SCAN tehnika podrazumeva skeniranje mase u zadatom opsegu uz istovremeno praćenje retencionog vremena. Ovo omogućava identifikaciju analita i koristi se u kvalitativnoj analizi. Zadati maseni opseg i brzina skeniranja hromatograma određuju vreme praćenja određene mase (dwell time).

SIM tehnika se koristi u kvantitativnim određivanjima. Pre njene upotrebe, da bi se postigli optimalni uslovi, mora se izvesti analiza SCAN metodom. SIM tehnikom detektuju se vrednosti m/z samo reprezentativnih jona posmatranog molekula. Vreme praćenja jona je duže pa se samim tim povećava i osetljivost čak 100 do 1000 puta. Karakteristični joni, vreme početka snimanja (start time) i vreme prećenja jona (dwell time) odabiraju se na osnovu podataka dobijenih pomoću SCAN tehnike.

Hromatogram se dobija kao zavisnost ukupne abudance sabrane tokom analize od vremena, a daje podatke o kvalitetu (retenciono vreme) i kvantitetu (površina pika) posmatrane komponente. Svaka tačka u hromatogramu predstavlja zbir zastupljenosti posmatranih jona.

32

3. Eksperimentalni deo

33

3.1. Faze eksperimentalnog rada

Eksperimentalni rad obuhvatao je sledeće faze: - Priprema serije standardnih rastvora smeše PAH-ova različitih koncentracija - Primena i validacija različitih metoda snimanja na GC-MS snimanjem standardnih

rastvora - Priprema uzoraka zemljišta QuEChERS tehnikom - Određivanje policikličnih aromatičnih ugljovodonika primenom metoda gasne

hromatografije sa masenom spektrometrijom (GC-MS)

3.2. Aparati

- Triple Quadrupole GC/MS system – Agilent 7000 Series - Vaga, Shimadzu AX20 - Centrifuga, Humax 14k , Srbija, - Sušnica, SSW – 800, Srbija - Aparat za dejonizovanu vodu – TKA MICROMED

3.3. Pribor

- Kiveta za centrifugu - Vijale za GC - Automatska pipeta - Menzura - Normalni sudovi - QuEChERS kivete od 50 i 2 ml

3.4. Reagensi

- Acetonitril– for HPLC, gradient grade, SIGMA-ALDRICH - PSA – Primary – secondary amine – Selectra UCT – Bulk Sorbents - PAH Kit 601 – N – Supelco, Bellefonte, Pennsylvania; koji sadrži:, antracen,

benzo[a]antracen, benzo[a]piren, benzo[b]fluoranten, benzo[ghi]perilen, benzo[k]fluoranten, krizen (93%), dibenzo[a,h]antracen, fluoranten, fluoren, naftalen, fenantren, piren, acenaften, u čvrstom obliku. Rastvor PAH mix 14 napravljen je rastvaranjem PAH-ova u smeši aceton/metanol (1:1, v/v) ukupne koncentracije 700

µg/ml, pri čemu je koncentracija pojedinačnih PAHova u smeši 50 µg/ml.

34

- Deuterisani acenaften d10, perilen d12 – Supelco, Bellefonte, Pennsylvaniaprimenjeni kao unutrašnji stranadrdi obliku rastvora u dihlormetanu polazne koncentracije 80 µg/mL.

- MgSO4, SIGMA-ALDRICH - NaCl, Merck

3.5. Priprema uzoraka zemljišta za anlizu primenom QuEChERS

ekstrakcije

Za pripremu uzoraka za analizu u ovom radu primenjena je metoda QuEChERS ekstrakcije. Odmerena količina uzoraka (10 g prosejane zemlje) prenese se u kivetu za centrifugiranje (50 ml), doda se 10 ml dejonizovane vode, energično promućka, potom se dodaje rastvarač za ekstrakciju (acetonitril) i dobro promućka (Slika 15).

Slika 15. Dodavanje acetonitrila i mućkanje

Nakon ovoga, dodaje se sadržaj QUEChERS pack – a (8 g MgSO4 i 2 g NaCl), meša se energično (Slika 16).

Slika 16. Dodavanje QuEChERS adsorbenasa

35

Nakon ovog postupka centrifugira se 10 min na 3500 rpm

U kivetu u kojoj se nalazi 150 mg MgSO4 i 50 mg PSA dodati 1 ml acetonitrilnog ekstrakta. Kivete energično mućkati 5 minuta a zatim centrifugirati 10 minuta na 8000 rpm. Nakon centrifugiranja preneti 0.6 ml ekstrakta u GC vijalu i dodati unutrašnji standard pa prebaciti u autosempler aparata (Slika 17).

Slika 17. Prenošenje ekstrakta u GC vialu i autosempler aparata

U cilju provere metode izvršeno je spajkovanje zemljišta. U čistu, nezagađenu, zemlju

dodaje se precizno odmerena količina PAH mix-a i tako dobija model uzorak, u našem slučaju napravljena su dva model uzorka koji se upotrebljavaju kao zamena za realni uzorak u toku testiranja metode.

Model uzorak 1: uzorku čiste zemlje dodato je 15 µl PAH mix koncentracije 3.3830 mg/ml. Koncentracija ukupnih PAH-ova je 5 ppm.

Model uzorak 2: uzorku čiste zemlje dodato je 22 µl PAH mix koncentracije 3.3830 mg/ml. Koncentracija ukupnih PAH-ova je 7.5 ppm.

3.6. Priprema serije standardnih rastvora smeše PAH-ova za izradu

kalibracione prave

Za pripremu serije standardnih rastvora dodati redom 990, 950, 900, 750, 500, 375 i 250 µl (Z0, Z1, Z2, Z3, Z4, Z5, Z6, Z7, Z8) smeše rastvarača, aceton/metanol (1:1, v/v) u 10, 50, 100, 250, 500, 625, 750 i 1000 µl standardnog rastvora koncentracije 700 µg/ml (Mix 14) (Tabela 6).

Unutrašnji standardi su analiti ili grupa analita (tačno poznate koncentracije) dodati uzorku koji služe za kalibraciju i kvantifikaciju. Unutrašnji standard je hemijski sličan kao određivani analit. Obično se dodaje pri analizi PAH-ova primenom GC-MS metode. U kivete sa

36

standardnim rastvorima, odnosno uzorcima, dodavano je po 200 µl rastvora unutrašnjih standarda (deuterisani acenaften d10 i perilen d12) koncentracije 80 µg/ml. Surogat standardi su hemijska jedinjenja sa poznatom koncentracijom. Koriste se zbog utvrđivanja ekstrakcione efikasnosti i obično su hemijski slični ekstrahovanim jedinjenjima. U ovom radu korišćen je p – terpfenil d14 kao surogat standard koncentracije 100 µg/ml i dodavan je uzorke u zapremini od 100µl.

Tabela 6. Koncentracija serije standardnih rastvora PAH-ova

3.7. Parametri metode

Za analizu pripremnljenih uzoraka korišćena je metoda gasne hromatografije sa masenom spektrometrijom. Snimanje serije standardnih rastvora i uzoraka rađeno je na aparatu Triple Quadrupole GC/MS system – Agilent 7000 Series, u SCAN i SIM modu. Parametri metode prikazani su u Tabeli 7.

Oznake Koncentracija

pojedinačnih PAHova

(µg/ml)

Zapremina upotrebljenog

Mix 14 (µl)

Dodata zapremina smeše

rastvarača (µl)

Z1 0.3846 10 990 Z2 1.9231 50 950

Z3 3.8462 100 900

Z4 9.6154 250 750

Z5 19.2308 500 500

Z6 24.0385 625 375

Z7 28.8462 750 250

Z8 38.4615 1 000 /

37

Tabela 7. Parametri metode za SCAN i SIM module

Parametri SCAN mod SIM mod

Unošenje uzorka GC GC

Izvor injektovanja PAL Sampler PAL Sampler

Maseni spektrometar omogućeno omogućeno

Injektovana zapremina 2.5 µl 1 µl

Vreme trajanja procesa splitless splitless

Ravnotežno vreme 0 min 0 min

Maksimalna temperatura 325 0C 325 0C

Sporo hlađenje isključeno isključeno

Temperaturni programa inicijalno 3 min/75 0C ,

temperaturni gradijent 6 0C do 3000C, održavano 10 min

inicijalno 3 min/75 0C , temperaturni gradijent 6 0C do

3000C, održavano 10 min

Radno vreme 50,5 min

1.8942 min (posle rada) na 280 0C

50,5 min 1.8942 min (posle rada) na 280

0C

Vrsta kolone

Agilent 19091S-433; 812.83871 HP-5MS; 5% phenyl methyl

siloxane 3250C;

Agilent 19091S-433; 812.83871 HP-5MS; 5%

phenyl methyl siloxane 3250C;

Dimenzije kolone 30m x 250 µm x 0.25 µm 30m x 250 µm x 0.25 µm

38

3.8. Obrada rezultata

Za obradu dobijenih rezultata analize korišćen je program Mass Hunter. Nakon pokretanja programa iz File menija odabrati radnju New Batch i iz foldera odabrati željenu datoteku. Nakon toga iz sekcije File/Add Sample odabrati željene uzorke za analizu ( Slika 18).

Slika 18. Postavljanje nove serije uzoraka i standarda

Za postavljanje nove metode bira se standard sa najvećom koncentracijom, markiranjem kursorom miša, a zatim se odabere sekcija Method/Edit ( Slika 19).

39

Slika 19. Postavljanje nove metode kvantifikacije

Odabirom sektora Method Setup Task/MRM Compound Setup može se dobiti uvid u podatke o jedinjenjima i jonima koje ispitujemo. Uvid u retenciona vremena svake komponente postiže se odabirom sekcije Method Setup Task/Retention Time Setup. U ovom odeljku mogu se izvršiti ponovna podešavanja u vezi sa retencionim vremenima. Za odabir unutrašnjih standarda za svaku od komponenata koja se analizira u odeljku ISTD Compound Name iz sekcije Method Setup Task/ISTD Setup odabere se odgovarajući unutrašnji standard u odeljku ISTD Concentration unese njegova koncentracija ( Slika 20).

U sekciji Method task/Calibration curve setup, čekira se FORCE kako bi grafik prošao kroz nulu.

Da bi se izvršila kalibracija u odeljku Method/Create Levels from Calibration Samples za seriju standardnih rastvora potrebno je podesiti željene koncentracije standarda. U slučaju da neki od standarda imaju istu koncentraciju može se izvršiti kopiranje vrednosti koncentracija odabranim jedinjenja sa istim koncentracijama u odeljku Method/Copy Calibration Levels to. Ukoliko su uneti svi potrebni podaci, nova metoda može biti validirana i sačuvana odabirom opcije Validate iz sekcije Save/Exit.

40

Slika 20. Podešavanje unutrašnjeg standarda

Podešavanje integratora vrši se u odeljku Method/Edit/Method Tasks/Advaced Taska. Za sve uzorke podesi se MS-MS metod integracije i zapamtiti podešavanje (Slika 21).

Slika 21. Podešavanje integratora

Analiza serije rezultata vrši se klikom na dugme Analyze Batch, dok se čuvanje podataka postiže odabirom komande Save Batch iz File sekcije ( Slika 22).

41

Slika 22. Analiza i čuvanje rezultata

Ovako dobijeni rezultati se dalje mogu koristiti i obrađivati.

42

4. Rezultati i diskusija

43

Cilj ovog rada je proveravanje valjanosti metoda snimanja masenih spektara, SIM i

SCAN, za kvantifikaciju PAH-ova u odgovarajućim uzorcima zemljišta. Analizirano je 14 PAH-ova koji su prioritetni po EU standardima: antracen, acenaften, benzo[a]antracen, benzo[a]piren, benzo[b]fluoranten, benzo[ghi]perilen, benzo[k]fluoranten, krizen, dibenzo[a,h]antracen, fluoranten, fluoren, naftalen, fenantren, piren. Metoda odvajanja koja je korišćena za izolovanje PAH-ova iz izoraka zemljišta je QuEChERS metoda, PAH-ovi su ekstrahovani acetonitrilom. Kvantifikacija je izvršena primenom GC-MS analize snimanjem u SIM i SCAN modu.

U Tabeli 8 su prikazana retenciona vremena analiziranih PAH-ova dobijena snimanjem hromatograma u SCAN modu.

Tabela 8. Retenciona vremena analiziranih PAH-ova

PAH

Retenciono vreme (min)

Naftalen 12.087

Acenaften 18.759

Fluoren 20.688

Fenantren 24.302

Antracen 24.478

Fluoranten 28.878

Piren 29.696

Benzo[a]piren 32.289

Krizen 34.360

Benzo[a]antracen 34.513

Benzo[b]fluoranten 38.258

Benzo[k]fluoranten 38.347

Dibenzo[a,h]antracen 43.161

Benzo[ghi]perilen 43.964

Kvantitativna analiza PAH-ova u uzorcima izvršena je korišćenjem kalibracionih prava dobijenih analizom serije standardnih rastvora, koja je snimana u SCAN i SIM modu. U Tabeli 9 su prikazane jednačine kalibracionih prava i R2 vrednost za svaki analizirani PAH, za oba načina snimanja.

44

Tabela 9. Jednačine prave (zavisnot odgovora od koncentracije) i R2 vrednosti za ispitivane

PAH-ove

PAH

SCAN

SIM

Jednačina

kalibracione prave R2

Jednačina

kalibracione prave R2

Antracen y = 1.319748*x 0.99290987 y = 0.869407*x 0.99400013

Benzo[a]piren y = 0.993332*x 0.99015775 y = 1.068791*x 0.99505302

Benzo[b]fluoranten y = 1.242692*x 0.95608286 y = 1.437177*x 0.99585228

Benzo[ghi]perilen y = 0.557649*x 0.91980061 y = 0.358646*x 0.93099739

Benzo[k]fluoranten y = 1.587390*x 0.86902120 y = 1.657816*x 0.99706436

Krizen y = 3.612846*x 0.99031517 y = 2.572076*x 0.99110426

Benzo[a]antracen y = 3.416896*x 0.99645269 y = 3.911884*x 0.98864461

Dibenzo[a,h]antracen y = 0.489367*x 0.92677029 y = 0.372085*x +

0.275196 0.91391129

Fluoranten y = 0.937987*x 0.96920094 y = 0.714987 0.97292878

Fluoren y = 1.264707*x 0.99770999 y = 1.840924*x 0.99810118

Naftalen y = 2.280511*x 0.95664024 y = 2.616012*x 0.99658425

Fenantren y = 1.339867*x 0.99236116 y = 1.426939*x 0.99271569

Piren y = 11.610745*x 0.98884567 y = 8.154720*x 0.97075279

Acenaften y = 1.530035*x 0.99926440 y = 1.612326*x 0.99854610

U cilju određivanja adekvatne metode za kvantifikaciju PAH-ova serija standardnih rastvora snimljena je prvo u SCAN a zatim u SIM modu.

45

Hromatogrami dobijeni snimanjem u SCAN modu.

Slika 23. Hromatogram ukupne jonske struje (TIC-toal ion current chromatogram) dobijen

snimanjem Z1 standarda u SCAN modu





46







47





Sa ciljem da se dokaže prisutnost analiziranih PAH-ova u uzorku, sačinjena je Tabela 10 sa masenim spektrima nastali snimanjem najkoncentrovanijeg standarda, Z8.

48

Tabela 10. Maseni spektri najkoncentrovanijeg standarda

PAH

Retenciono

vreme

(min)

Maseni spektri

Antracen 24.450

Benzo[a]piren 39.280

Benzo[b]fluoranten

38.242

Benzo[ghi]perilen

43.975

Benzo[k]fluoranten

38.336

49

Krizen 34.333

Benzo[a]antracen

34.480

Dibenzo[a,h]antracen

43.164

Fluoranten 28.839

Fluoren 20.657

50

Naftalen 12.175

Fenantren 24.265

Piren 29.665

Acenaften 18.725

Upoređivanjem dobijenih MS spektara sa podacima iz biblioteke za GC-MS ustanovili

smo da se radi o navedenim policikličnim aromatičnim ugljovodonicima, čime je SCAN metoda primenjena u svrhu kvalitativne analize. Zatim su na osnovu površine ispod pikova za određene komponente konstruisane kalibracione prave koje predstavljaju zavisnost od koncentracije svakog od PAH-ova. Pošto su za neke komponente dobijeni nesimetrični pikovi, sa podignutim baznom linijom u nekim slučajevima, vršeno je ručno integraljenje, što je dovelo do određenih nedostataka u kvantifikaciji.

Na osnovu podataka o masenim fragmentima dobijenih na osnovu SCAN moda, izabrani su parametric SIM moda. Za svaku od komponenata izabran je karakterističan jon koji se pojavljuje na određenom retencionom vremenu (quantifyier ion - jon za kvantifikaciju) i

51

kvantifikacija je vršena na osnovu njegove zastupljenosti. Na taj način su postignuti bolji analitički rezultati, odnosno vrednosti za tačnost i preciznost metode.

Hromatogrami dobijeni snimanjem u SIM modu.


snimanjem Z1 standarda u SIM modu



52







53







Analizom prikazanih hromatograma standardne serije može se uočiti da hromatogrami dobijeni iz SCAN moda nisu adekvatni za primenu u kvantitativnoj analizi uzoraka. Naime, dobijeni pikovi nisu simetrični, prisutno je preklapanje pikova susednih komponenata a neki prilično odstupaju od bazne linije. Njihovim razmatranjem može se izvršiti samo indetifikacija, kvalitativna analiza prisutnih komponenata u uzorku. Proces određivanja ometaju pikovi koji

54

potiču od onečišćenja prisutnih u uzorku, koji su prikazani na hromatogramima dobijenim u SCAN modu za razliku od onih dobijenih u SIM modu. Na osnovu podataka o prisutnosti određenih komponenti u uzorku, koje omogućava snimanje u SCAN modu, može se pratiti tačno određena komponenta u SIM modu i na osnovu toga izvršiti kvantifikacija. SIM mod omogućava registrovanje pikova samo za zadate komponente, dok su kod SCAN metode registrovane sve prisutne prisutne komponenti uključujući i onečišćenja. SCAN mod se ne preporučuje za kvantitativnu analizu, jer na kraju dobijenih hromatograma dolazi do podizanja bazne linije, oko četrdesetog minuta analize. Do pojave ovog šuma dolazi usled visoke temperature radne kolone, od oko 300 0C imajući u vidu da je maksimalna temperatura kolone 325 0C, usled čega dolazi do curenja kolone. Curenje kolone utiče na onečišćenje analiziranog uzorka te tako i na pojavu šuma na samom kraju hromatografskog snimanja. U cilju preglednijeg prikazivanja i upoređivanja rezultata dobijenih snimanjem dvema različitim metodama sačinjena je Tabela 11 u kojoj su uporedno prikazani parametri tačnosti koji se odnose na SCAN i SIM mod snimanja.

55

Tabela 11. Uporedni pregled tačnosti metode (izražen kao rikaveri) za svaki od analiziranih PAH-ova dobijenih različitim metodama snimanja

PAH

SCAN SIM

Tačnost* (%) Tačnost* (%)

Antracen 80.31 81.73

Benzo[a]piren 102.29 329.53

Benzo[b]fluoranten 98.23 95.93

Benzo[ghi]perilen 99.72 157.99

Benzo[k]fluoranten 89.29 99.90

Krizen 88.21 87.01

Benzo[a]antracen 89.83 95.52

Dibenzo[a,h]antracen 99.11 157.31

Fluoranten 84.00 77.86

Fluoren 95.18 84.70

Naftalen 86.06 94.79

Fenantren 78.85 77.47

Piren 104.36 120.30

Acenaften 85.95 87.66

* Tačnost (Recovery) [%] = ��(��)

��(��)))))x100

Iz Tabele 11 se može uočiti da se SIM mod snimanja odlikuje u većini slučajeva većom tačnošću, koja se ogleda kroz veće vrednosti tačnosti. Većina dobijenih rikaveri vrednosti se nalazi u intervalu od 50 – 120 % što je analitički poželjno. Izuzetno visoke rikaveri vrednosti koje se uočavaju kod benzo[a]pirena su posledica njegovog detektovanja na trideset devetom minutu analize kada se temperatura radne kolone povećava na 300 0C. Usled povišene

56

temperature dolazi do laganog otapanja kolone što prouzrokuje pojavu onečišćenja unutar uzorka, a to rezultuje podizanjem bazne linije. Zato se sa sigurnošću ne može potvrditi da se dobijeni rezultati odnose isključivo na benzo[a]piren.

Uporedni prikaz parametara preciznosti dva različita modula snimanja dat je u Tabeli 12.

Tabela 12. Preciznost metoda SCAN i SIM GC-MS analize

PAH

SCAN SIM

Srednja

vrednost±SD* (%)

Srednja

vrednost±SD* (%)

Antracen 80.31 ± 4.31 81.72 ± 2.18

Benzo[a]piren 102.29 ± 5.61 129.5251 ± 7.58

Benzo[b]fluoranten 98.22 ± 6.74 95.93 ± 3.2567

Benzo[ghi]perilen 99.72 ± 4.13 127.9854 ± 3.44

Benzo[k]fluoranten 89.28 ± 3.61 99.90 ± 2.84

Krizen 88.21 ± 2.64 87.01 ± 2.32

Benzo[a]antracen 89.83 ± 3.74 95.58 ± 3.259

Dibenzo[a,h]antracen 99.10 ± 4.69 157.308 ± 3.97

Fluoranten 84.00 ± 2.25 77.86 ± 2.60

Fluoren 95.175 ± 7.00 84.69 ± 4.29

Naftalen 86.06 ± 3.61 94.79 ± 3.29

Fenantren 78.85 ± 4.36 77.48 ± 3.46

Piren 104.36 ± 7.97 120.30 ± 4.48

Acenaften 85.95 ± 4.37 87.66 ± 3.47

*RSD= ((stadnardna devijacija/srednja vrednost)*100) Tabelarni prikaz ukazuje da se za većinu komponenata SIM mod odlikuje manjom vrednošću relativne standardne devijacije, što ukazuje na veću preciznost određivanja. Kao izuzetak javlja se benzo[a]piren, sa izrazito većom vrednošću relativne standardne devijacije pa se određuje sa manjom preciznošću.

57

Analiza model uzoraka zemljišta

Dobijeni hromatogrami za uzorak 1 i 2 prikazani su na slikama 39-42.

Model uzorak 1 dobija se dodavanjem 15 µl PAH mix koncentracije 3,3830 mg/ml uzorku čistom žemljištu. Koncentracija nastalog model uzorka je 5ppm.

Model uzorak 2 nastaje tako što se uzorku čistog zemljišta dodaje 22,2µl PAH mix koncentracije 3,3830 mg/ml. Koncentracija dobijenog model uzorka je 7.5 ppm.

Model uzorak 1

Slika 39. Hromatogram ukupne jonske struje (TIC-toal ion current chromatogram) za uzorak 1

dobijen u SCAN modu

Zapaža se da je i kod ovog uzorka bazna linija posle retencionog vremena 40 minuta podigunta, što dovodi do problema u kvantifikaciji.

Slika 40. Hromatogram ukupne jonske struje (TIC-toal ion current chromatogram) za uzorak 1 dobijen u SIM modu

U SIM modu je bazna linija ravna, pa ovde očekujemo bolje rezltate kvantifikacije.

58

Tabelama 13 i 14 prikazane su tačnost i preciznost, koje su najvažniji validacioni

parametri dobijeni analizom model uzorka 1 i 2, u SCAN i SIM modu GC − MS metode.

Tabela 13. Uporedni prikaz tačnosti i preciznosti rezultata, dobijenih snimanjem u SCAN i SIM modu za uzorak 1

PAH

SCAN SIM

B1 ± SD µµµµg/ml B1 ± SD µµµµg/ml

Antracen 0.0016 ± 0,0003 0.0282 ± 0.0034

Benzo[a]piren 0.3440 ± 0.0259 1.3015 ± 0. 1120


Benzo[ghi]perilen ND* ND*


Krizen ND* ND*

Benzo[a]antracen ND* ND*

Dibenzo[a,h]antracen ND* ND*

Fluoranten ND* 0.0092 ± 0.0005

Fluoren 0.0055 ± 0.0012 0.0180 ± 0.0007

Naftalen 0.1391 ± 0.0014 0.1755 ± 0.0229

Fenantren 0.0016 ± 0.00031 0.0149 ± 0.0011

Piren ND* 0.0101 ± 0.0018

Acenaften 0.1719 ± 0.0143 0.1698 ± 0.0228

ND* − ispod granice detekcije metode U analiziranom model uzorku, na osnovu prikazanih podataka, sa najvećom preciznošću određuje se fluoren a sa najvećom tačnošću benzo[a]piren. Uočava se da se SIM mod odlikuje većom preciznošću za gotovo sve detektovane komponente.

59

Model uzorak 2

Slika 41. Hromatogram ukupne jonske struje (TIC-toal ion current chromatogram) dobijen za uzorak 2 u SCAN modu

Sa datog hromatograma opet se uočava podizanje bazne linije posle retencionog vremena od 40 minuta, to će i u ovom slučaju usloviti ometanje kvantifikacionog određivanja.

Slika 42. Hromatogram ukupne jonske struje (TIC-toal ion current chromatogram) dobijen za

uzorak 2 u SIM modu SIM mod i u ovom sučaju daje ravnu baznu liniju što će omogućiti bolje rezultate kvantifikacije.

60

Tabela 13. Uporedni prikaz tačnosti i preciznosti rezultata, dobijenih snimanjem u SCAN i SIM modu, za model uzorak 2

PAH

SCAN SIM

B2 ± SD µg/ml B2 ± SD µg/ml

Antracen 0.0013 ± 0.0003 0.0374 ± 0.0382

Benzo[a]piren 0.5617 ± 0.0345 1.2751 ± 0.0139


Benzo[ghi]perilen ND* ND*


Krizen ND* ND*

Benzo[a]antracen ND* ND*

Dibenzo[a,h]antracen ND* ND*

Fluoranten ND* 0.0125 ± 0.0003

Fluoren 0.0084 ± 0.0052 0.0325 ± 0.0027

Naftalen 0.2626 ± 0.02333 0.3250 ± 0.0101

Fenantren 0.0033 ± 0.0031 0.0206 ± 0.0011

Piren ND* 0.0216 ± 0.0067

Acenaften 0.3202 ± 0.0021 0.3206 ± 0.0093

ND* − ispod granice detekcije metode

Sa najvećom preciznošću i tačnošću u SIM modu određuje se benzo[a]piren. Generalno sve komponente SIM modom se određuju mnogo preciznije u odnosi na SCAN mod.

61

5. Zaključak

62

Policiklični aromatični ugljovodonici (PAU, PAH) su široko rasprostranjeni ekološki

zagađivači. Nastaju kao rezultat nepotpunog sagorevanja i pirolitičkih procesa. Ova jedinjenja su dugotrajni, slabo razgradivi zagađivači, akumuliraju se u zemljištu i sedimentima, površinskim vodama i atmosferi. Zbog njihovih mutagenih i kancerogenih svojstava 16 PAH-ova su klasifikovana kao visoki zagađivači od strane Agencije za zaštitu prirodne sredine (EPA): acenaftilen, antracen, acenaften, benzo[a]antracen, benzo[a]piren, benzo[b]fluoranten, benzo[ghi]perilen, benzo[k]fluoranten, krizen, dibenzo[a,h]antracen, fluoranten, fluoren, indeno[1,2,3-cd]piren, naftalen, fenantren, piren.

Cilj rada bio je da se izvršiti validacija odgovarajuće metode snimanja, SCAN ili SIM, radi kvantifikacije PAH-ova u uzorcima zemljišta. Za postupak kvantifikacije korišćena je GC/MS tehnika. PAH-ovi su iz zemljišta ekstrahovani primenom QuEChERS ekstrakcije i acetonitrila kao rastvarača. Korišćena je QuEChERS ekstrakcija jer se metoda izvodi za najkraće vreme primenom vrlo jednostavne i lako dostupne laboratorijske opreme, uz korišćenje minimalne količine organskih rastvarača i drugih potrebnih reagenasa. U toku rada praćena su 14 PAH-a radi jednostavnosti izvođenja analize

SIM mod snimanja uzorka se odlikuje većom rikaveri vrednošću i manjom vrednošću za relativnu standardnu devijaciju, te se ona preporučuje kao podesna metoda za kvantifikaciju PAH-ova u uzorcima zemljišta. SCAN mod snimanja se više preporučuje za kvalitativnu analizu, jer pruža detaljne informacije o svim prisutnim komponentama u uzorku uključujući i prisutna onečišćenja. Ove podatke možemo iskoristiti i u SIM modu zadati odgovarajuću komponentu kao cilj njene pretrage čime dobijamo preciznu kvatifikaciju zadane komponente.

63

6. Literatura

64

1. Agency for Toxic Substances and Disease Registry (2009), Case Studies in Environmental Medicine Toxicity of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs)

2. Agilent MassHunter Workstation Software, Quantitative Analysis, Familiarization Guide (2012), Agilent Technologies Inc

3. Cvetković J., Dimitrijević M., Stankov Jovanović V., Mitić V. (2013), Analiza policikličnih aromatičnih ugljovodonika u hrani i uzorcima iz životne sredine, Hemijskipregled, god. 54, broj 6, Srpsko hemijsko društvo

4. COMMISSION REGULATION (EU) No 836/2011 of 19 August 2011 Official Journal of the European Union

5. Fagbote O.; Olanipekun E. (2013), Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) and polychlorinated biphenyls (PCBs) in soil of Agbabu, Nigeria, 1 st Annual International Interdisciplinary Conference, AIIC 2013, 24-26 April, Azores, Portugal

6. Gaga EO, Tuncel SG (2003): Occurence and Distribution of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Ankara Precipitation. Water, Air, and Soil Pollution: Focus 3, 127–134

7. https://www.google.rs/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=5&cad=rja&uact=8&ved=0CDMQFjAE&url=http%3A%2F%2Fbib.irb.hr%2Fprikazi-rad%3Frad%3D482228&ei=AK0lVaeKIon0Uou5g9AN&usg=AFQjCNHU1yT1MamQwtWxZ0VtqYr8xvaocQ&bvm=bv.90237346,bs.1,d.bGQ

8. http://www.cecra.dh.pmf.uns.ac.rs/pdfww2011/Leovac%20Anita-Organski%20polutanti.pdf

9. http://www.tehnologijahrane.com/enciklopedija/maseni-spektrometar 10. http://www.belupo.hr/Default.aspx?sid=6941 11. Jira W., Ziegenhals K., Speer K., 2006., PAH in smoked meat products according to EU

standards, Fleischwirtschaft International, 4, 11-17 12. Lundstedt S. (2003), Analysis of PAHs and their transformation products in

contaminated soil andremedial processes, Umeå University, Sweden 13. Marjanović N., Kravić S., Suturović Z., Švarc-Gajić J. (2004), Determination of

sensitivity limit in quantative analysis of polycyclic aromatic hydrocarbons by GC-MS 14. Karajović Zogović M., Matović V., (2006) VALIDACIJA METODA ISPITIVANJA,

Festival kvaliteta 15. Purcaro G., Moret S.,Conte L., (2013), Overview on polycyclic aromatic hydrocarbons:

Occurrence, legislation and innovative determination in foods.Talanta 105, 292–305 16. Ravindra K, Sokhi R, Van Grieken R (2008): Atmospheric polycyclic aromatic

hydrocarbons: Source attribution, emission factors and regulation. Atmospheric Environment, DOI:10.1016/j.atmosenv.2007.12.010

17. Venkataraman C, Thomas S, Kulkarni P (1999): Size distributions of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons - Gas/particle partitioning to urban aerosols. Journal of Aerosol Science 30, No. 6, 759-770

Documents

Validacija gasno-hromatografskih metoda za odre ivanje ...€¦ · Univerzitet u Nišu Prirodno-matemati čki fakultet Departman za hemiju Validacija gasno-hromatografskih metoda