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Vacina Oral Anti-coccídica Veiculada em Lactobacillus sp para
Imunização de Frangos de Corte
Depto Biologia GeralDepto MicrobiologiaDepto Bioquímica-Imunologia
Depto Medicina PreventivaDepto Tecnologia e Inspeção UNEB
PROJETO DE PESQUISA E DESENVOLVIMENTO
Introdução
Coccidiose aviária é uma doença parasitária
gastrointestinal debilitante e às vezes fatal.
Agente etiológico – protozoários parasitas
apicomplexa do gênero Eimeria (9 espécies).
Prejuízos em granjas da ordem de US$ 1,5 bilhões
anuais. US$ 60 milhões só no Brasil.
Anatomia da galinha
Espécie Ciclo (d) Localização da infecção
E. acervulina 5Alça duodenal e intestino delgado superior
E. praecox 4Alça duodenal e intestino delgado superior
E. mitis 5 Intestino delgado
E. maxima 7 Intestino delgado
E. necatrix 7 Intestino delgado e cecos
E. tenella 7 Cecos
E. brunetti 6 Intestino delgado e cecos
• Sítios de infecção em Gallus gallus domesticus
CICLO DE VIDACICLO DE VIDA
Lesão causada por Eimeria tenella em ceco.
1. Isolamento e seleção de cepas de Lactobacillus spp. com elevada capacidade de adesão em porções definidas do trato gastrointestinal de aves de corte;
2. Identificação e clonagem de genes de coccídios com potencial imunogênico. Construção de vetores para expressão de proteínas heterólogas (antígenos) em lactobacilos isolados de frangos;
3. Imunização experimental de aves com lactobacilos recombinantes expressando antígenos de coccídios. Avaliação dos parâmetros imunológicos nas aves vacinadas após desafio;
4. Produção em escala industrial das bactérias recombinantes e testes-piloto de imunização de frangos em granjas.
Objetivos
Endereçamento celular
IntracelularIntracelular
SecretadaSecretada
AncoradaAncorada
DNADNA
Construção plasmidial do cassete de expressão de proteínas antigênicas de Eimeria
Construção plasmidial do cassete de expressão de proteínas antigênicas de Eimeria
Eritromicina (1,2 kb)
L
GFP (720pb)
Ancora (600pb)
(344)
BamH IBamH I
BamH IApa I Xho I
Xho IEcoR V /
EcoR I
EcoR I
Hind III
EcoR I
Bst XI
Promotor t7 – M13 Forward LacZ α ATG - M13 Reverse
Vacina Oral Anti-coccídica Veiculada em
Lactobacillus sp para Imunização de Frangos de
CorteIsolamento, Identificação Molecular
e Modificação Genética de
Lactobacilos de Frangos
João Luiz Silva Moreira
Álvaro Cantini Nunes / Jacques R. Nicoli
Frangos abatidos precocemente
(criação intensiva)
Aditivos alimentares
(antimicrobianos e promotores de crescimento)
• Alteração da microbiota
• Depressão imunológica
• Resíduos indesejáveis
Avicultura
UTILIZAÇÃO DE PROBIÓTICOS
(Suplemento com microorganismos vivos)
Melhoram o equilíbrio microbiano intestinal
1. Exclusão competitiva;
2. Modulação imunológica;
3. Inibição da ação de toxinas;
4. Produção de metabólitos bactericidas (AL, H2O2).
PRINCIPAIS GÊNEROS DE BACTÉRIAS DO ÁCIDO LÁTICO
Objetivos
1. Isolamento de lactobacilos de frangos caipira e de granja;
2. Identificação Molecular por PCR-ARDRA dos espaçadores 16S-23S rRNA;
3. Seleção de isolados de lactobacilos com propriedades probióticas;
4. Transformação dos lactobacilos nativos com plasmídio repórter expressando GFP.
Metodologias para determinação de polimorfismos
genéticos• PCR GENE-ESPECíFICO: amplificação específica de genes
polimórficos
• RAPD: amplificação aleatória de polimorfismos
• ARDRA: digestão com enzimas de restrição de genes
polimórficos (p.ex., ITS 16S-23S rDNA)
• DGGE/SSCP: diferenciação dos genes por diferenças na
composição de bases (p.ex., 16S rDNA)
• REP-FINGERPRINTING: amplificação por PCR de elementos
repetitivos bacterianos (p.ex., GTGn)
PCR-DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)
Molecular Diversity of Lactobacillus spp. and Other Lactic Acid Bacteria in the Human Intestine as Determined by Specific Amplification of 16S Ribosomal DNA
H.G.H.J. HEILIG, E.G. ZOETENDAL, E.E. VAUGHAN, P. MARTEAU, A.D.L. AKKERMANS and W.M. DE VOS
APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY,.68(1): 114–123 (2002)
PCR-DGGE da Região V3 do Gene 16S de Bactérias do
Ácido Láticoa = Pediococcus acidilactici DSM 20333
b = Pediococcus pentosaceus DSM 20336c = Enterococcus casseliflavus ATCC 25788
d = Enterococcus durans ATCC 11576e = Enterococcus faecalis ATCC 19433f = Enterococcus faecium ATCC 19434
g = Lactobacillus sakei DSM 20017h = Lactobacillus curvatus LTH 1432
i = Lactobacillus casei ATCC 334j = Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis DSM 20072k = Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus DSM
20081l = Lactobacillus helveticus ATCC 15009m = Lactobacillus plantarum NCDO 1193
n = Leuconostoc mesenteroide subsp. mesenteroides DSM 20343
o = Lactococcus lactis subsp. lactis DSM 20481p = Lactococcus lactis subsp. cremoris DSM 4645
q = Lactococcus lactis subsp. hordniae DSM 20450r = Lactococcus garvieae DSM 20684
s = Leuconostoc lactis DSM 20202t = Weissella paramesenteroides DSM 20288u = Streptococcus thermophilus CNRZ 302
PCR-SSCP (Single-Strand Conformation Polymorphism)
Applied and Environmental Microbiology, 66(3): 930-936 (2000) Succession of Microbial Communities during Hot Composting as Detected by PCR-Single-Strand-Conformation Polymorphism-Based Genetic Profiles of Small-Subunit rRNA Genes Sabine Peters, Stefanie Koschinsky, Frank Schwieger, and Christoph C. Tebbe
Os primers PCR foram desenhados para amplificar as regiões V4 e V5 hipervariáveis eubacterianas dos genes 16S rDNA
RAPD-PCR (Random Amplified Polymorphic DNA)
Identification and Phylogenetic Analysis of Lactobacillus Using Multiplex RAPD-PCR
A.K. DAUD KHALED, B.A. NEILAN, A. HENRIKSSON, P.L. CONWAY
FEMS MICROBIOLOGY LETTERS 153: 191-197 (1999)
PCR-ARDRA (Amplified Ribosomal
DNA Restriction Analysis)
HpaII HaeIII
Journal of Clinical Microbiology, 39(10): 3555-3562 (2001)
Identification of Clinical Isolates of Actinomyces Species by Amplified 16S Ribosomal DNA Restriction Analysis
Val Hall, P. R. Talbot, S. L. Stubbs, and B. I. Duerden
Identification of Lactobacillus Isolates from the gastrointestinal Tract, Silage, and Yoghurt by 16S-23S rRNA Gene Intergenic Spacer Region Sequence Comparisons
G. W. TANNOCK, A. TILSALA-TIMISJARVI, S. RODTONG, J. NG, K. MUNRO, AND T. ALATOSSAVA
APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY 65 (9): 4264–4267, 1999.
Comparação das sequências de DNA da região intergênica 16S-
23S rDNA
SSU rDNA operon
espaçador16S-23S
espaçador23S-5S
16S 23S 5S
Diversidade Microbiana em Amostras de fezes humanas
Purificação de gel de agarose do fragmento de 500 pb da PCR 16-23S
PCR ITS 16S-23S SSU rDNA
Amplificação das Regiões ITS do rDNA de Diferentes
Lactobacillus sp
SEQUENCIAMENTO
Identificação Molecular
SSU rDNA operon
Primer senso (16S): 5'-GAATCGCTAGTAATCG-3'
Primer Reverso (23S): 5'-GGGTTCCCCCATTCGGA-3'
Resultados
Identificação Molecular por PCR-ARDRA dos espaçadores 16S-23S rDNA
3G14C (Lactobacillus reuteri)
1 Kb SphI NcoI NheI SspI SfuI EcoRV DraI VspI HincII EcoRI HindIII
1 Kb SphI NcoI NheI SspI SfuI EcoRV DraI VspI HincII EcoRI HindIII
3G14L (Lactobacillus johnsonii)
2G14E (Lactobacillus acidophilus )
5G14L (Lactobacillus crispatus)
1 Kb SphI NcoI NheI SspI SfuI EcoRV DraI VspI HincII EcoRI HindIII
4G14C (Lactobacillus vaginalis)
2GB26 (Lactobacillus salivarius)
1AC41 (Lactobacillus agilis)
Seleção das cepas de Lactobacillus sp com propriedades probióticas
1. Seleção de cepas com resistência a suco gástrico
2. Seleção de cepas com resistência a sais biliares
0 2 4 6 8 10 120,0
0,2
0,4
0,6
16%
OD
60
0 n
m
Tempo (h)
1C14P-CT 1C14P-SB
0 2 4 6 8 10 120,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
58%
OD
60
0 n
m
Tempo (h)
2M14L-CT 2M14L-SB
0 2 4 6 8 10 120,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
12%
OD
60
0 n
m
Tempo (h)
1G14P-CT 1G14P-SB
0 2 4 6 8 10 120,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
72%
OD
60
0 n
m
Tempo (h)
2C14E-CT 2C14E-SB
0 2 4 6 8 10 120,0
0,2
0,4
0,6
24%
OD
60
0 n
m
Tempo (h)
3C14L-CT 3C14L-SB
0 2 4 6 8 10 120,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
43%
OD
60
0 n
m
Tempo (h)
4C14C-CT 4C14C-SB
0 2 4 6 8 10 120,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
36%
OD
60
0 n
m
Tempo (h)
3D14L-CT 3D14L-SB
0 2 4 6 8 10 120,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
OD
60
0 n
m
Tempo (h)
5C14E-CT 5C14E-SB
3. Teste de Hidrofobicidade
Isolado Espécie Hidrofobicidade (%) Isolado Espécie Hidrofobicidade (%)
1M14C1M14C L. reuteriL. reuteri 8989 5D14E5D14E L. acidophilusL. acidophilus 8383
1M14E1M14E L. johnsoniiL. johnsonii 3535 2G14E2G14E L. acidophilusL. acidophilus 5555
2M14C2M14C L. reuteri L. reuteri 5858 3G14C3G14C L. reuteriL. reuteri 6767
2M14L2M14L L. acidophilusL. acidophilus 5252 3G14L3G14L L. johnsoniiL. johnsonii 4545
3M14C3M14C L. reuteriL. reuteri 4242 4G14C4G14C L. vaginalisL. vaginalis 2525
3M14L3M14L L. johnsoniiL. johnsonii 6161 4G14L4G14L L. reuteriL. reuteri 3535
4M14C4M14C L. reuteriL. reuteri 6464 5G14C5G14C L. salivariusL. salivarius 6666
4M14L4M14L L. reuteriL. reuteri 3636 5G14L5G14L L. crispatusL. crispatus 3535
5M14C5M14C L. reuteriL. reuteri 7878 2C14E2C14E L. acidophilusL. acidophilus 5555
1D14C1D14C L. salivariusL. salivarius 6060 2C14L2C14L L. acidophilusL. acidophilus 7878
2D14C2D14C L. vaginalisL. vaginalis 6767 3C14C3C14C L. reuteriL. reuteri 8484
2D14E2D14E L. acidophilusL. acidophilus 7676 3C14L3C14L L. johnsoniiL. johnsonii 8383
3D14C3D14C L. reuteriL. reuteri 8383 4C14C4C14C L. salivariusL. salivarius 9292
3D14L3D14L L. crispatusL. crispatus 8888 5C14C5C14C L. salivariusL. salivarius 8383
4D14C4D14C L. reuteri L. reuteri 8888 5C14E5C14E L. acidophilusL. acidophilus 6464
1. Seleção de cepas com capacidade de adesão à epitélio intestinal ou muco;
2. Teste de colonização em modelo murino gnotobiótico;
3. Capacidade de transferência de resistência (in vitro e in vivo);
4. Transformação dos lactobacilos nativos com plasmídio repórter expressando GFP.
Lactobacillus delbrueckii
Lactobacillus rhamnosus
Identificação Molecular de isolados vaginais humanos
Lactobacillus gasseri
Lactobacillus fermentum
Identificação Molecular de isolados vaginais humanos
BARROW, P.A. Probiotics for chickens. In: Probiotics. The scientific basis. London: Chapman & Hall, 1992, p. 225–257.CERQUEIRA, M.M.O.P. Isolamento, seleção e efeitos de um probiótico na modulação da infeccção por Eimeria acervulina e no desempenho de frangos de corte. Belo Horizonte: UFMG, 2000. 95 p. (Tese de Doutorado).CUNNINGHAM-RUNDLES, S., AHRNE, S., BENGMARK, S., JOHANN-LIANG,R., MARSHALL, F., METAKIS, L., CALIFANO, C., DUNN, A.M., GRASSEY, C., HINDS, G. AND CERVIA, J. (2000) Probiotics and immune response. Am. J. Gastroenterol. 95, S22-S25. FULLER, R. Nature of the determinant responsible for the adhesion of lactobacilli to the chicken crop epithelial cell. Journal of General Microbiology, v. 87, p. 245–250, 1975.FULLER, R. Probiotics in man and animals. Journal of Applied Bacteriology, v. 66, p. 365–378, 1989.GEOFFROY M-C, GUYARD C, QUATANNENS B, PAVAN S, LANGE M, MERCENIER A: Use of green fluorescent protein to tag lactic acid bacterium strains under development as live vaccine vectors. Appl Environ Microbiol 2000, 66:383-391.KOS B, SUSKOVIC J, VUKOVIC S, SIMPRAGA M, FRECE J, MATOSIC S: Adhesion and aggregation ability of probiotic strain Lactobacillus acidophilus M92. J Appl Microbiol 2003, 94:981-987.
Referências
MAIOLINO, R.A., FIORETTI, M.L.F., MEO, C. Research on the efficiency of probiotics in the diet for broiler chickens. Nutrition Abstract Review, series B, v. 62, p. 482, 1992.MOREIRA JLS, MOTA RM, HORTA MF, TEIXEIRA SMR, NEUMANN E, NICOLI JR, NUNES AC: Identification to the species level of Latobacillus isolated in probiotic prospecting studies of human, animal or food origin by 16S-23S rRNA restriction profiling. BMC Microbiol 2005, 5:15. RANA, R., AKHTAR, M.S., NAWAZ, M. Residues of sulfaquinoxaline in poultry products. Pakistan Veterinary Journal, v. 45, p. 161–166, 1993.SERROR P, SASAKI T, EHRLICH D, MAGUIN E: Eletrotransformation of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and L. delbrueckii subsp. Lactis with various plasmids. Appl Environ Microbiol 2002, 68:46-52. TILSALA-TIMISJARVI A, ALATOSSAVA T: Development of oligonucleotide primers from the 16S-23S rRNA intergenic sequences for identifying different dairy and probiotic lactic acid bacteria by PCR. Int J Food Microbiol 1997, 35:49-56.WALKER DK, GILLILAND SE: Relationships among bile tolerance, bile salt desconjugation, and assimilation of cholesterol by Lactobacillus acidophilus. J Dairy Sci 1993, 76:956-961.
Referências