Univerzitet u Nišu Prirodno-matematički fakultet

Departman za hemiju

Niš, 2014

Uticaj temperature na stabilnost katehina i procijanidina u kakao prahu: Kinetika

degradacije

-master rad-

Mentor: Student: dr Aleksandra Pavlović, vanr. prof. Kristina Mladenović, 51

ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Редни број, РБР: Идентификациони број, ИБР: Тип документације, ТД: Монографска Тип записа, ТЗ: текстуални / графички Врста рада, ВР: Мастер рад Аутор, АУ: Кристина Младеновић Ментор, МН: Александра Павловић Наслов рада, НР: Утицај температуре на стабилност катехина и

процијанидина у какао праху: Кинетика деградације Језик публикације, ЈП: Српски

Језик извода, ЈИ: Енглески Земља публиковања, ЗП: Р. Србија Уже географско подручје, УГП: Р. Србија Година, ГО: 2014. Издавач, ИЗ: ауторски репринт Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33 Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога) 50 стр., 6 табеле, 29 сликe, 42 референце Научна област, НО: Хемија Научна дисциплина, НД: Аналитичкa хемија Предметна одредница/Кључне речи, ПО: катехини, процијанидини, укипни флавоноиди,

кинетика деградације, HPLC,UV/Vis spektrofotometrija УДК [544.032.4 + 678.048 : 663.914 ] : 531.3

Чува се, ЧУ: Библиотека Важна напомена, ВН:

Извод, ИЗ: У раду је испитана деградација катехина ((-)-епикатехина и (+)-катехина) и процијанидина (Б1, Б2, Б3 и Б4), као и укупних флавоноида у узорцима какао праха током чувања и загревања. Добијени резултати показују да брзина деградације прати кинетику реакција првог реда. Нестабилнији од испитиваних катехина је (-)-епикатехин, а од процијанидина, процијанидини Б3 и Б4. Енергија активације деградације укупних флавоноида током чувања и загревања кретале су се од 121,3 кЈ/мол до 144,2 кЈ/мол. Повећањем температуре загревања од 95 ºC на 125 ºC, константа брзине реакције ( k ) се повећала око 9 пута, тј. од 3,4×10-3 min-1 дo 29,1×10-3 min-1. Добијени резултати су такође показали да је време полураспада ( 2/1t ) укупних флавоноида током чувања у интервалу од 6,1 h нa 4ºC дo 0,9 h нa 35ºC, а током загревања 3,4 h нa 95ºC дo 0,4 h нa 125ºC.

Датум прихватања теме, ДП: Датум одбране, ДО:

Чланови комисије, КО: Председник: Члан:

Члан, ментор:

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

Accession number, ANO: Identification number, INO: Document type, DT: Monograph Type of record, TR: textual / graphic Contents code, CC: University Degree Thesis Author, AU: Kristina Mladenović Mentor, MN: Aleksandra Pavlović Title, TI: Effect of the temperature on the stability of catechins and

procyanidins in cocoa powder: Kinetics of degradation Language of text, LT: Serbian Language of abstract, LA: English Country of publication, CP: Republic of Serbia Locality of publication, LP: Serbia Publication year, PY: 2014 Publisher, PB: author’s reprint Publication place, PP: Niš, Višegradska 33 Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes) 50 p., 6 tables, 29 figures, 42 references Scientific field, SF: Chemistry Scientific discipline, SD: Analytical Chemistry Subject/Key words, S/KW: catechins, procyanidins, total flavonoids, kinetics of

degradation, HPLC, UV/Vis spectrophotometry UC [544.032.4 + 678.048 : 663.914 ] : 531.3 Holding data, HD: Library Note, N:

Abstract, AB: The aim of this study was to investigate influence of the temperature on the degradation of catechins ((-)-epicatechin and (+)-catechin), procyanidins (B1, B2, B3 and B4) and the total flavonoids in cocoa powder samples during storage and heating. The obtained results show that the rate of degradation follows first order reaction kinetics. Between catechins, more unstable is (-)-epicatechin and among procyanidins, B3 and B4. The activation energy of the reaction of degradation of total flavonoids during storage and heating were ranged from 121.3 kJ/mol to 144.2 kJ/mol. By increasing the heating temperature from 95°C to 125°C, the reaction rate constant ( k ) was increased about 9 times, from 3.4×10-3 min-1 to 29.1×10-3 min-1. The obtained results also showed that the half-life time ( 2/1t ) of the total flavonoids during storage was from 6,1 h at 4°C to 0.9 h at 35°C, and during heating from 3.4 h at 95°C to 0.4 h at 125°C.

Accepted by the Scientific Board on, ASB:

Defended on, DE: Defended Board, DB: President: Member: Member, Mentor:

Eksperimentalni deo ovog Master rada je rađen u naučno-istraživačkoj laboratoriji Katedre za analitičku i fizičku hemiju, Prirodno-matematičkog fakulteta, Univerziteta u Nišu.

Iskreno se zahvaljujem svom mentoru prof. dr Aleksandri Pavlović, na pomoći

pri definisanju teme master rada, strpljenju, sugestijama i stručnimi savetima koje mi je pružila tokom izrade ovog rada. Takođe se zahvaljujem Jeleni Brcanović i Jovani Krstić na vremenu koje su mi posvetile i na ukazanoj pomoći tokom eksperimentalnog rada.

Zahvaljujem se i svojim roditeljima i sestri na podršci, strpljenju i

razumevanju tokom studiranja i pisanja ovog rada. Veliko hvala!

Sadržaj: 1. Uvod ............................................................................................................................. 1 2. Teorijski deo ........................................................................................................ 3

2.1. Poreklo kakaoa ................................................................................................................ 4 2.2. Karakteristike biljke kakao .............................................................................................. 4

2.2.1. Podela kakao zrna ..................................................................................................... 6 2.3. Funkcionalne karakteristike kakaoa ................................................................................ 7 2.4. Polifenolna jedinjenja ...................................................................................................... 9

2.4.1. Flavonoidi ............................................................................................................. 10 2.4.2. Antocijani .............................................................................................................. 11 2.4.3. Flavan-3-oli ........................................................................................................... 13 2.4.4. Flavonoli ............................................................................................................... 14 2.4.5. Fenolne kiseline ..................................................................................................... 15

2.5. Uticaj fermentacije i sušenja na sadržaj fenolnih jedinjenja u kakao zrnu .................. 16 2.6. Antioksidativno dejstvo fenolnih jedinjenja ................................................................ 17 2.7. Analitičke metode ......................................................................................................... 20

2.7.1. Spektrofotometrija ................................................................................................. 21 2.7.1.1. Snimanje UV/Vis spektara .................................................................................... 21

2.7.2. Tečna hromatografija visoke efikasnosti (HPLC) ..................................................... 23 3. Eksperimentalni deo ........................................................................................... 26

3.1. Reagensi ....................................................................................................................... 27 3.2. Aparatura i pribor ......................................................................................................... 27 3.3. Uzorci ........................................................................................................................... 27 3.4. Priprema uzoraka .......................................................................................................... 28

3.4.1. Proces zagrevanja ................................................................................................... 28 3.4.2. Određivanje sadržaja ukupnih flavonoida ................................................................ 28 3.4.3. Analiza katehina i procijanidina korišćenjem HPLC metode ..................................... 29

3.5. Statistička obrada podataka .......................................................................................... 29 4. Rezultati i diskusija .......................................................................................... 30

4.1. Uticaj temperature čuvanja i zagrevanja na sadržaj katehina, procijanidina i ukupnih flavonoida u uzorcima kakaoa u prahu.......................................................................... 31

5. Zaključak .......................................................................................................... 45

6. Literatura........................................................................................................... 47

1

1. UVOD

2

Sirovi kakao, u zrnu, komadićima ili u prahu, smatra se, prema svojim nutritivnim svojstvima, jednom od najhranjivijih namirnica na svetu.

Ovu biljku su u velikoj meri koristili Inke, Maje i Asteci kao sredstvo protiv umora, napetosti,

bolova, loše probave, za poboljšanje apetita, a njime su lečili i gubitak kose, reumatizam, posekotine i opekotine. U Evropu ga je iz Amerike prvi doneo Kristofer Kolumbo 1502. godine.

Kakao, osim što je ukusan, poznat je i kao lek za mnoge bolesti, a dokazano je da štiti mozak i

srce od infarkta i sprečava nastanak krvnih ugrušaka. Takođe, redovnim konzumiranjem snižava loš holesterol i pritisak. Mnoge objavljene studije pokazale su zdravstvenu prednost crne čokolade i kakaoa, naročito njihov antioksidativni efkat. Kakao je bogat antioksidansima koji štite od slobodnih radikala i usporavaju proces starenja. Jedni od najvažnijih antioksidanasa koji se nalazi u kakao zrnu jesu flavonoidi. Osnovni flavonoidi u kakaou i čokoladi su flavan-3-oli, katehin i epikatehin (monomerne jedinice) i proantocijanidini - polimerna jedinjena koja sadrže subjedinice katehina i epikatehina. Upravo su oni odgovorni za blagotvorno dejstvo na zdravlje ljudi. Kakao sadrži i minerale koji podstiču razvoj vezivnog tkiva i deluju na nervni sistem, poboljšavaju krvnu sliku i obezbeđuju normalno i pravilno funkcionisanje svih organa ljudskog tela. Naučna istraživanja su potvrdila i da kakao podstiče mozak na stvaranje endorfina, koji dovodi do opuštanja, otklanjanja stresa i ublažavanja bola. Stimuliše i lučenje dopamina i serotonina, koji podižu nivo raspoloženja. Zato nije ni čudo što mnogi konzumiraju čokoladu kao lek od depresije. Međutim, treba znati da čokolada sadrži i šećere i značajnu energetsku vrednost, pa je zbog te činjenice treba konzumirati u maloj količini koja je dovoljna za pozitivno dejstvo na srce i krvne sudove. Pri tome bi isto tako trebalo birati čokoladu sa što većim udelom kakaоa, jer se na taj način postiže veći kardioprotektivni učinak. Flavonoidi u kakao proizvodima nisu dovoljno istraženi, za razliku od crnog i zelenog čaja, kao i crvenog vina, koji su privukli pažnju ovim istraživanjima. Otkriveno je da su katehini i procijanidini osetljivi na toplotu, kao i na degradaciju tokom zagrevanja i čuvanja. Precizno poznavanje kinetičkih parametara reakcije degradacije je od velike važnosti kako bi se predvideo kvalitet promena koje se dešavaju tokom procesa zagrevanja i čuvanja. Mnoge namirnice koje sadrže flavonoide se pre potrošnje termički obrađuju, što dosta utiče na sadržaj flavonoida u krajnjem proizvodu.

Zbog značajnih bioloških efekata polifenola, cilj ovog rada je ispitivanje uticaja temperature na

stabilnost katehina, procijanidina i ukupnih flavonoida u komercijalno dostupnim kakao prahovima, koji se koriste za pripremu napitaka od kakaoa.

Za identifikaciju i određivanje polifenolnih jedinjenja, kao i za praćenje uticaja temperature na

stabilnost ispitivanih polifenola korišćena je UV/Vis spektrofotmetrija i tečna hromatografija pod visokim pritiskom (HPLC).

3

2. TEORIJSKI DEO

4

2.1. Poreklo kakaoa

Veruje se da biljka kakao vodi poreklo iz Amazona ili basena Orinoko. Od 1500 p. n. e. Olemek indijanci su prvi sadili kakao biljku kao domaći usev. Olemeci, veoma sofisticirano društvo, preneli su veći deo svoje kulture Majama, uključujući i xocoatl (sho-kwa-til, odnosno kakao). Konzumacija kakaoa bila je dostupna samo eliti Majanskog društva u obliku nezašećerenog kakao pića dobijenog iz mlevenog semena kakaoa pomešanog sa vodom, crnim biberom, vanilom i drugim začinima. Maje su oko 600. godine migrirale ka severnom delu Južne Amerike osnivajući najstariju plantažu kakaoa na Jukatanu. Kakao zrna bila su veoma vredna roba i korišćena su kao sredstvo plaćanja i jedinica računanja.

Asteci su smatrali da im je kakao podario bog vatre Quetzalcoatl koji je kakao drvo ukrao iz raja. Kao i Maje i oni od kakaoa prave gorko piće zvano cacahuatl i služe ga na sobnoj temperaturi, sa raznim začinima kao aromama, pa čak i ljutim papričicama. Smatrali su ga eliksirom zdravlja. Verovali su da mudrost i snaga dolaze jedući ovo voće, a pridavali su mu i afrodizijačke kvalitete.

Kolumbo je 1502. godine iz Južne Amerike doneo kakao zrna kralju Ferdinandu, međutim ona nisu privukla njegovu pažnju.

Španski osvajač Kortez je osvajajući 1519. godine Meksiko probao je xocolatl, topli kakaov napitak koji mu je ponudio astečki vladar Montezuma u velikim zlatnim peharima, ali njega nije mnogo interesovao ukus kakaoa, već njegova vrednost kao sredstvo za plaćanje. Ne dugo zatim osniva plantažu kakaoa sa ciljem da "uzgaja novac" i tako u ime Španije započinje monopol u kakaou. 1527. godine Kortez osvaja astečko carstvo i donosi kakao, opremu i recepte za spremanje u Španiju. Međutim, na kakao su stavljeni veliki porezi i u njemu su mogli da uživaju samo pojedinci.

Upravo Evropljani su bili ti koji su od kakao zrna počeli da prave čokoladu. Skriveni u manastirima, kako bi recept ostao tajna, monasi su pravili tečnu čokoladu u koju bi dodali šećer i cimet. Međutim, ovaj tajni recept nije uspeo ostati sakriven. Iz Španije se čokolada raširila po Evropi, a kasnije i po svetu (http://www.chocoline.rs/node/293).

Čokoladu kakvu poznajemo danas dugujemo holandskom hemičaru Conradu J. Van Houtenu, koji je 1828. godine patentirao hidrauličnu presu koja je mrvila zrna kakaovca iz kojeg bi nastao kakao prah.

2.2. Karakteristike biljke kakao

Kakao je plod kakaovca (slika 1), malo (4–8 m visine) listopadno drvo iz porodice Sterculiaceae

koje je rasprostranjeno u tropskim predelima Meksika i SAD-a. Botaničko ime ovog drveta, Theobroma cacao, dao je švedski botaničar Linne, što u prevodu znači "hrana bogova".

5

Slika 1. Kakaovac (Theobroma cacao)

Postoje dve značajnije teorije o poreklu kakaovca. Jedna grupa naučnika veruje da su originalne jedinke kakaovca rasle od jugoistočnog Meksika sve do reke Amazon, a kasnije bile kultivirane na ravnicama Južne Amerike. Najnovija proučavanja genetike te biljke pokazuju da kakaovac potiče iz tropskih područja Amazona, a posle od strane čoveka biva rasprostranjen do Srednje, čak i Severne Amerike (http://www.seeds-gallery.com/sr/kakao-seme.html).

Ova biljka danas uspeva u ravničarskim područjima ispod Anda na visinama od 200–400 m, oko reka Amazon i Orinoko. Za dobar rast i razvoj zahteva vlažnu klimu i vlažno zemljište.

Drvo kakaovac počinje da daje cvetove treće godine od zasada, a plodove oko pet godina od zasada. Prosečan život drveta je oko dvadeset godina. Cvetovi rastu direktno iz stabla iz kojih pet meseci kasnije nastaju plodovi, dugački oko 20 cm, ovalnog oblika u kome su u nizu postavljena kakao zrna od 30 do 40 po plodu.

Plod tokom zrenja menja boju. Po boji i zvuku kada se kucne u plod, zaključuje se koji se plod može obrati. Plod se seče vrlo pažljivo, tako da se ne ošteti mala peteljka koja drži plod, jer iz nje ponovo raste cvet. Zatim se plod pažljivo preseca kako se kakao zrno ne bi oštetilo. Kakao zrna se vade zajedno sa pulpom koja ga okružuje i pažljivo postavlja na podlogu od lišća banane. Zatim se sve prekriva lišćem banana, tako da zrna budu potpuno pokrivena. Na taj način počinje fermentacija koja traje oko šest dana. Kakao zrna od purpurne boje prelaze u čokoladnu braon i počinju da ispuštaju miris čokolade. Nakon minimum desetodnevnog sušenja kakao zrna na suncu, šalje se u fabrike. Izgled ploda i semena kakao biljke prikazani su na slici 2.

6

Slika 2. Seme i plod kakao biljke

Priprema kakao zrna, podrazumeva čišćenje pri čemu nastaje otpad i lom, termičku obradu radi uništenja mikroorganizama, hlađenje, drobljenje, mlevenje i skladištenje. Tretiranjem kakаo loma bazom podiže se pH vrednost u cilju menjanja boje i ukusa kakao praha i poboljšanja suspenzije čvrstih kakao materija u vodi. Obradom kakao zrna dolazi do gubitka vlage, razgradnje amino kiselina i denaturacije proteina. Mlevenjem kakao loma dobija se niži viskozitet. Dobijanje kakao maslaca čini oko polovinu mase kakao jezgra, a dobija se pomoću hidraulične prese primenom visokog pritiska pri čemu nastaju kakao pogače sa sadržajem masti od 10-24% (Hii i sar., 2009). Mlevenjem kakao pogače dobija se kakao prah definisane finoće.

Ukus i kvalitet čokolade upravo zavisi od svih ovih parametara; kvaliteta zrnevlja kakaovca,

načina obrade, dodataka i svežine, zatim od pravilne fermentacije i sušenja, naročito prirodnim putem, na suncu umesto u sušarama. Takođe, vrlo je važna mešavina zrna od koje je čokolada napravljena.

2.2.1. Podela kakao zrna

Postoje tri osnovne vrste kakao zrna: • Kriolo • Forastero • Trinitario

Kriolo Ovu vrstu zrna (slika 3) zovu Rols Rojs među kakao

zrnima. Pokriva samo 10% svetske proizvodnje kakao zrna. Slika 3. Kriolio kakao zrno

7

Uglavnom potiče iz zemalja iz kojih kakao ima najstarije poreklo, kao što su Meksiko, Venecuela, Nikaragva. Ovo zrno se skoro uvek koristi u mešavini sa nekim drugim, jer bi bilo veoma skupo da se koristi samo. Ukus zrna je blag, ali sa izraženom čokoladnom notom. Forastero

Ova vrsta zrna je mnogo otpornija i lakša za uzgajanje. Čini 80% svetske poizvodnje. Čokolada najčešće najstaje od mešavine raznih podvrsta ovog zrna. Samo zrno je jakog i gorkog ukusa.

Trinitario Trinitario je hibridno zrno (slika 4) koje se dobija

ukrštanjem prethodna dva zrna. Ime potiče od ostrva Trinidad. Uglavnom se koristi u mešavini zrna i pokriva 10-15% svetske proizvodnje (http://www.cokolada.co.rs/o-cokoladi/o-kakao-zrnu.20.html).

Slika 4. Trinitario kakao zrno Osnovne vrste kakao zrna imaju mnogo podvrsta i potrebno je veliko znanje i dugogodišnje

iskustvo da bi se napravila kavalitetna mešavina za dobru čokoladu.

2.3. Funkcionalne karakteristike kakaoa

Kakao, osim što je ukusan, poznat je i kao lek za mnoge bolesti. U samom zrnu kakao biljke se nalazi preko 300 sastojaka koji mogu pomoći našem organizmu (http://www.biodar.hr/sirovi-kakao.html). Uloga kakaoa je da:

• štiti organizam od uticaja slobodnih radikala • smanjuje stres i depresiju • štiti od bolesti srca i krvnih sudova • štiti od mnogih vrsta kancera • odličan je izvor gvožđa • smanjuje opasnost od srčanog udara • pomaže u regulaciji krvnog pritiska

Kakao zrno je prirodni plod koji možda sadrži najveću količinu antioksidanasa koji štite od slobodnih radikala i usporavaju proces starenja. Mnoge objavljene studije pokazale su antioksidativni efkat kakaoa i crne čokolade (Ding i sar., 2006; Cooper i sar., 2008). U kakao zrnu se nalazi duplo više antioksidanasa nego u crnom i crvenom vinu i tri puta više nego što to sadrži zeleni čaj. Međutim, flavonoidi u kakao proizvodima nisu dovoljno istraženi, za razliku od crnog i zelenog čaja (Ananingsih i sar., 2013; Zhu i sar., 1997) i crvenog vina (Castillo-Sáncheza i sar., 2008; García-Falcón i sar., 2007; Waterhouse i Laurie, 2006), koji su privukli pažnju ovim istraživanjima. Borovnice su voće koje zauzima treće mesto na listi voća koje sadrži antioksidanse,

8

ali u borovnicama se nalazi 32 antioksidansa, dok u kakao plodu 621. To su najviše polifenoli flavonoida – katehin, epikatehin i procijanidin (Balzer i sar., 2008; Schroeter i sar., 2006).

Procijanidini, jedinjenjenja iz grupe polifenola, štite od koronarnih srčanih bolesti, a pored kakaoa, ima ih mnogo u voću i povrću. Istraživanja na kalifornijskom univerzitetu potvrdila su teoriju po kojoj procijanidini doprinose zdravlju kardiovaskularnog sistema. Mehrinfar i Frishman (2008) u preglednom članku govore o kardioprotektivnim uticajima flavanola i o njihovom mehanizmu delovanja.

Deset zdravih dobrovoljaca konzumiralo je različite vrste čokolade, one koje sadrže visoki i one koje sadrže niski nivo procijanidina. Nakon dva sata koncentracija procijanidinovih metabolita u plazmi bila je 20 puta veća kod pacijenata koji su jeli čokoladu sa visokim nivoom procijanidina. Kod tih osoba zabeleženo je i znatno smanjenje nivoa leukotriena, jedinjenja koje postiče trombocite na povezivanje - što povećava opasnost od stvaranja ugrušaka. Istraživači su iste rezultate dobili kad su i ćelije uzete iz aorte, najveće krvne žile, izložili delovanju procijanidina.

Kakao sadrži minerale koji podstiču razvoj vezivnog tkiva i blagotvorno deluju na nervni sistem, poboljšavaju krvnu sliku i obezbeđuju normalno i pravilno funkcionisanje svih organa ljudskog tela.

Predstavlja jedan od najbogatijih izvora magnezijuma, koji je odgovoran za veliki broj procesa u organizmu i obezbeđuje normalno i pravilno funkcionisanje svih organa ljudskog tela. Sadrži bakar koji podstiče razvoj vezivnog tkiva i blagotvorno deluje na nervni sistem. Bogat je još i kalcijumom i gvožđem, koji poboljšavaju krvnu sliku, zatim cinkom, kalijumom i manganom. Posebno je bogat sumporom, koji pomaže izgradnju tkiva i štiti jetru (Steinberg i sar., 2003).

Kakao sadrži stimulans teobromin, alkaloid iz porodice kofeina. Teobromin je stimulans

centralnog nervnog sistema, ali je mnogo blaži od kofeina. Ima antibakterijska svojstva, a takođe je dokazano da efikasno deluje protiv kašlja.

Naučna istraživanja su potvrdila i da kakao podstiče mozak na stvaranje endorfina, koji dovodi do opuštanja, otklanjanja stresa i ublažavanja bola. Stimuliše i lučenje dopamina i serotonina, koji podižu nivo raspoloženja. Zato nije ni čudo što mnogi konzumiraju čokoladu kao lek od depresije.

Kakao zrno sadrži otprilike 50% masti, a najzastupljenije su dve zasićene masne kiseline (palmitinska i stearinska) i jedna mononezasićena masna kiselina (oleinska). Kakao maslac i čokolada ne izazivaju podizanje nivoa holesterola u krvi, međutim unos mlečne čokolade, kod koje deo ukupnog sadržaja masti čine i mlečne masti, može negativno uticati na holesterol. Zrno kakaoa takođe sadrži i ugljenohidrate, od kojih je najviše skrob, kao i rastvorljiva i nerastorljiva prehrambena vlakna. Kakao sam po sebi sadrži vrlo malo jednostavnih šećera, a većina ih se dodaje prilikom proizvodnje čokolade.

100 g kakao praha sadrži: 398 kalorija, 5,88 g belančevina, 84,52 g ugljenih hidrata, 4 g masti, 3,5 g celuloze, 6 mg holesterola, 1,5 g vode, 0,10 mg vitamina B1, 0,57 mg vitamina B2, 0,59 mg vitamina B3, 0,89 mg vitamina B5, 0,11 mg vitamina B6, 1,32 mg vitamina B12, 1,8 mg vitamina C, 0,80 mg vitamina K, 141 mg kalcijuma, 0,29 mg bakra, 1,19 mg gvožđa, 83 mg magnezijuma, 315 mg fosfora, 712 mg kalijuma, 0,5 g natrijuma, 1,46 mg cinka, 0,27 mg mangana, 5 mg selena.

9

2.4. Polifenolna jedinjenja

Polifenolna jedinjenja ili polifenoli, su najvažnija grupa sekundarnih biljnih metabolita koji se nalaze u mnogim biljkama, koncentrisani u semenkama i pokožici voća i povrća, žitaricama, kori drveća, lišću i cveću.

To su supstance koje u strukturi imaju jedan ili više aromatičnih prstenova sa jednom ili više hidroksilnih grupa. Ove supstance se mogu naći u slobodnom obliku ili češće u obliku glikozida sa različitim šećernim ostacima ili u obliku kompleksa sa organskim kiselinama, aminima, lipidima, ugljenim hidratima i drugim polifenolnim jedinjenjima.

Do danas je poznato više od 8000 različitih struktura polifenolnih jedinjenja, a njihovu osnovnu strukturu čini aromatični prsten na koji može biti vezana jedna ili više hidroksilnih grupa. Prema osnovnoj hemijskoj strukturi dele se na:

• Flavonoide • Neflavonoide- fenolne kiseline, fenole i ostala srodna jedinjenja.

Međutim, najčešća klasifikacija se zasniva na broju ugljenikovih atoma vezanih za osnovni skelet fenola što je prikazano u tabeli 1 (Wollgast i Anklam, 2000).

Tabela 1. Klasifikacija polifenolnih jedinjenja

Klasa Osnovni skelet

Prosti fenoli C6

Benzohinoni

Fenolne kiseline C6-C1

Fenilsirćetne kiseline C6-C2

Acetofenoni

Cimetna kiselina

C6-C3 Fenilpropeni

Kumarini

Hormoni

Naftohinoni C6-C4

Ksantoni C6-C1-C6

Stilbeni C6-C2-C6

Antrahinoni C6-C2-C6

Flavonoidi C6-C3-C6

Lignini, neolignini (C6-C3)2

Lignini (C6-C3)n

10

Polifenolna jedinjenja nisu ravnomerno rasprostranjena u biljnim tkivima. Najznačajniji izvori polifenolnih jedinjenja, a time i izvori antioksidanasa su razni napici (crno vino, voćni sokovi, zeleni i crni čaj, kafa, pivo), kakao, crna čokolada, jezgrasto voće (lešnik, badem, kikiriki), šljive, grožđe, borovnice, brusnice, itd.

2.4.1. Flavonoidi

Flavonoidi su grupa polifenolnih jedinjenja, različite hemijske strukture i karakteristika, koji se nalaze u raznim vrstama biljaka. Identifikovano je preko 4000 vrsta flavonoida. Flavonoidi su odgovorni za boju voća i povrća, mada u prirodi su takođe prisutni i bezbojni flavonoidi.

Flavonoidi imaju 15 C-atoma, sadrže dva benzenova jezgra koja su međusobno povezana tročlanim ugljovodoničnim nizom. Hemijska struktura flavonoida bazira se na C15 skeletu sa hromanovim prstenom za koji je vezan bezenov prsten u položajima najčešće 2, ređe 3 ili 4 (slika 5). Flavonoidi predstavljaju jednu od najkarakterističnijih klasa jedinjenja viših biljaka. Mnogi flavonoidi se lako prepoznaju kao biljni pigmenti u mnogim familijima Angiosmermija (cvetnica). Međutim, oni se ne nalaze samo u cvetovima, već u svim delovima biljaka.

Slika 5. Hemijska struktura flavonoida

Klasifikacija flavonoida varira u zavisnosti od stepena oksidacije u strukturi prstena. Pet najčešćih tipova flavonoida na osnovu toga jesu flavoni, flavonoli, flavanoli, flavanoni i antocijanidini. Strukture ovih flavonoida prikazane su na slici 6 (Tapas i sar., 2008).

Flavoni Flavonoli

11

Flavan-3-oli Flavanoni

Antocijanidini

Slika 6. Struktura različitih klasa flavonoida

Flavonoidi, naročito flavoni i flavonoli, štite biljke od oštećenja UV radijacijom. Na primer, reakcije tamnjenja fenolnih jedinjenja katalisane polifenoloksidazama su od velikog značaja za preradu voća i povrća, zbog mogućnosti formiranja nepoželjnih komponenata, aroma i gubitka nutrijenata. Takođe, oksidativne promene fenolnih jedinjenja tokom tehnološke prerade su važne za razvoj željene boje i arome određenih namirnica, kao što su kakao i čaj.

Uglavnom se razlike među flavonoidima baziraju na hidroksilovanju i/ili metilovanju delova tricikličnog sistema. Pojedine biljne vrste sintetišu određene flavonoide. Ta osobina flavonoida je iskorišćena za njihovu primenu u proučavanju filogrenetskih odnosa među višim biljkama.

2.4.2. Antocijani

Antocijani su klasa flavonoidnih jedinjenja koja predstavljaju prave biljne pigmente. Njihovo ime je izvedeno od grčke reči antho što znači cvet i kyanos što znači plav. Mogu se naći u svim delovima biljke, od cveta do korena, a osim što biljci daju obojenost, štite je i od prekomerne i UV svetlosti i od štetnog dejstva slobodnih radikala.

Flavanoni R=H, OH, OMe

Flavoni R=H, OH

Flavanoli R=H-katehin,R=OH-galokatehin

Flavonoli R1, R2=H, OH

Antocijanini

12

Antocijani strukturno pripadaju flavonima. To su glikozilirani, polihidroksi ili polimetoksi derivati 2-fenilbenzopirilijuma ili flavijum katjona i sadrže dva benzoil prstena (A i B) razdvojena heterocikličnim prstenom C (slika 7). Strukturne varijacije antocijana se javljaju usled različitog broja hidroksi grupa i njihovog stepena metilovanja, prirode i broja šećera povezanih za fenolni (aglikonski deo) molekula, kao i položaja tih supstituenata i prirode i broja alifatičnih i aromatičnih kiselina vezanih za šećer (Ćujić i sar., 2013). Najčešće grade glikozide sa glukozom, ali i sa ramnozom, arabinozom ili galatkozom, kao i sa nekim disaharidima. Ovi šećeri mogu biti vezani za položaj 3 i 5 na prstenovima A i C. Varijacije i raznolikost u strukturi antocijana su najviše javljaju zbog acilovanja šećernih grupa različitim kiselinama. Kiseline mogu biti alifatične kao što su sirćetna kiselina, p-kumarinska kiselina, kafeinska kiselina, malonska kiselina, maleinska, ferulična kiselina, oksalna i ćilibarna (Markakis,1982).

Slika 7. Struktura antocijana

Aglikoni antocijana (deo bez šećera) poznati su kao antocijanidini, a u prirodi je do sad poznato 6 antocijanidina: pelargonidin, cijanidin, peonidin, delfinidin, petunidin i malvidin.

Antocijanidini su aglikoni koji se sastoje od aromatičnog prstena, kondenzovanog heterociklusa koji sadrži kiseonik, za koga je takođe vezan C-C vezom treći aromatični prsten. Svi antocijanidini imaju hidroksilnu grupu na položaju 3 C prstena, a većina antocijana su penta- ili heksa-supstituisani, pri čemu se supstituenti (hidroksilna ili metoksi grupa) nalaze u položajima 5 i 7 A prstena, i 3’, 4’ i 5’ B prstena. Supstitucija sa H, OH i OCH3 na B prstenu je uzrok postojanja 6 različitih antocijanidina (tabela 2).

Tabela 2. Osnovne klase antocijanidina

Jedinjenja R3' R5' R3

Pelargonidin H H H

Cijanidin OH H H

Delfinidin OH OH H

Petunidin OCH3 OH H

Malvidin OCH3 OCH3 H

Peonidin OCH3 H H

13

Jedna od najvažnijih karakteristika antocijana je što kiseonik u heterocikličnom prstenu može da ima pozitivno naelektrisanje. Zahvaljujući ovoj osobini antocijani se u kiseloj sredini ponašaju kao katjoni i grade soli sa kiselinama, a u alkalnoj sredini kao anjoni i grade soli sa bazama. Mnogi činioci kao što je pH sredine, kompleksiranje s metalima, prisustvo tanina i dr. utiču na boju antocijana. Boja antocijana zavisi i od broja hidroksilnih grupa na prstenu B. Antocijani sa manjim brojem hidroksilnih grupa su crvene, a sa većim brojem, plave boje.

Reaktivna su i dosta nestabilna jedinjenja. Reverzibilno trpe strukturne transformacije sa promenom pH što ima najveći uticaj na boju. pH je određen kao uzročnik najveće nestabilnosti antocijana i od pH u najvećoj meri zavisi njihova pigmentacija. Promena boje antocijana sa promenom vrednosti pH data je na slici 8. Na niskim pH vrednostima antocijani su prisutni u obliku veoma stabilnih, u vodenoj sredini crveno obojenih, flavonijum katjona. Pri povećanju pH vrednosti flavonijum katjon može preći ili u plavo-ljubičasto obojenu konjugovanu bazu hinonoidalne strukture, ili može doći do njegove transformacije u poluacetalni oblik, čijom hidrolizom nastaju bezbojni do žuto obojeni halkoni (Ćujić i sar., 2013).

Slika 8. Uticaj pH vrednosti na antocijane

Antocijani su polarni molekuli, tako da su se kao najefikasniji rastvarači za ekstrakciju pokazale

smeše polarnih rastvarača, kao što su etanol, metanol i aceton.

2.4.3. Flavan-3-oli

Flavan-3-oli su gradivne jedinice tanina. Tanini su polikondenzovana jedinjenja velikih molekulskih masa. Na osnovu gradivnih jedinica oni se mogu podeliti na hidrolizujuće i kondenzovane tanine.

Hidrolizirajući tanini su poliestri galne kiseline ili njenih derivate i centralnog molekula šećera. Kao što im samo ime kaže, lako hidrolizuju sa kiselinam, bazama i toplom vodom. Kondenzovani tanini (proantocijanidoli ili proantocijanidini) se sastoje iz dve ili više različito vezane jedinice

14

flavan-3-ola ili flavan-3,4-diola, pri čemu stereohemija supstituenata na C2 i C3 atomu pojedinih jedinica, kao i stereohemija međusobno povezanih jedinica ima važnu ulogu (Wollgast i Anklam, 2000). Najčešće jedinice proantocijanidola su: (-)-epikatehin sa 2,3 cis i (+)-katehin sa 2,3 trans položajem supstituenata. U zavisnosti od broja OH grupa u prstenu B i položaja supstituenata na C2 i C3 atomu razlikuju se katehinska i galokatehinska serija flavan-3-ola (slika 9).

Slika 9. Struktura flavan-3-ola

Procijanidini nastaju oksidativnom kondenzacijom flavan-3-ola koja se najčešće odigrava između C4 atoma heterocikličnog prstena jedne i C8 ili C6 atoma susedne monomerne jedinice. Mogu biti prisutni kao pojedinačni monomeri, a u nekim slučajevima i kao oligomeri (Rios i sar., 2002).

2.4.4. Flavonoli Flavonoli su flavonoidi pronađeni u mnogim biljnim vrstama, uglavnom u obliku glikozida,

povezani sa glukozom ili ramanozom, ali i sa drugim šećerima (Manach i sar., 2004).

Hidroksilne grupe u B prstenu flavonola mogu se nalaziti na C-4, C-3' i C-4' i C-3', C-4' i C-5', pa su u voću i proizvodima od voća prisutni kemferol, kvercetin i miricetin (slika 10).

Slika 10. Struktura flavonola

Jedinjenje R1 R2 R3

(+)Katehin OH H H

(-)Epikatehin H OH H

(-)Epigalokatehin H OH OH

(+)Galokatehin OH H OH

Jedinjenje R1 R2

Kvercetin OH H

Rutin H OH

Mircetin OH OH

Kamferol H H

15

2.4.5. Fenolne kiseline

Fenolne kiseline su derivati benzoeve i cimetne kiseline. Fenolne kiseline su prisutne u voću u glikozidnoj formi, iz koje se mogu osloboditi kiselom hidrolizom.

Derivati benzoeve kiseline imaju C6-C1 strukturu. Varijacije u strukturi derivata ove kiseline

nastaju hidroksilovanjem ili metilovanjem aromatičnog jezgra. Na slici 11 prikazana je opšta formula derivate benzoeve kiseline. Ove kiseline se retko nalaze u slobodnom obliku, osim u prerađenoj hrani koja je prošla kroz proces zamrzavanja, sterilizacije ili fermentacije (Manach i sar., 2004).

Slika 11. Opšta formula derivata benzoeve kiseline

Derivati cimetne kiseline imaju C6-C3 strukturu. Najzastupljeniji derivati cimetne kiseline i opšta

formula dati su na slici 12. Derivati cimetne kiseline su prisutni u različitim konjugovanim formama kao estri i amidi. Ova kiselina se može naći u svim delovima voća, ali je najzastupljenija u spoljnim delovima zrelog voća.

Slika 12. Opšta formula derivata cimetne kiseline

R1 R2 R3 R4

p-hidroksi benzoeva H H OH H

Vanilinska H OCH3 OH H

Prokatehinska H OH OH H

Galna H OH OH OH

R2 R3 R4 R5

Kumarinska H H OH H

Kafena H OH OH H

Ferulna H OCH3 OH H

16

2.5. Uticaj fermentacije i sušenja na sadržaj polifenolnih jedinjenja u kakao zrnu

Pravilna fermentacija i sušenje kakao zrna je značajna kako bi se dobio odgovarajući ukus

kakaoa i čokolade. Nakon što se mahune, odnosno plod pažljivo seče, zrna se zajedno sa pulpom prebacuju u kutije ili korpe za fermentaciju, koja traje 5-6 dana. Tokom prvog dana, sa porastom temperature pulpa prelazi u tečnost i otiče. Pod anaerobnim uslovima mikroorganizmi proizvode sirćetnu kiselinu i etanol. Ovi procesi inhibiraju klijanje semena i dovode do strukturnih promena u fermentisanom zrnu. Ćelijska tečnost prolazi kroz ćelijske zidove i širi se u celom kakao zrnu. Ovo se događa uglavnom 24-48 h nakon fermentacije zrna. Do trećeg dana masa zrna je ravnomerno zagrejana do 45˚C i ostaje između ove temperature i 50˚C do kraja fermentacije. Nakon fermentacije, zrna se prebacuju u posude za sušenje, koje se može vršiti na suncu ili u sušarama (Wollgast i Anklam, 2000).

Posle ovih procesa sadržaj vlage u kakao zrnu treba biti 5-7%, ukoliko je sadržaj vlage preko 8%

moguć je razvoj plesni prilikom transporta i skladištenja (Kealey i sar., 1998).

Tokom fermentacije, polifenoli podležu oksidaciji do kondenzovanih visoko molekulskih, uglavnom nerastvorljivih tanina. Pojava reakcije kondenzacije potvrđuje se naglim smanjanjem sadržaja epikatehina tokom drugog i trećeg dana fermentacije. Sadržaj epikatehina i rastvorljivih polifenola tokom fermentacije je 10-20%. Takođe je dokazano da je sadržaj epikatehina kod zrna koja nisu fermentisana veći nego kod fermentisanih. Tokom sušenja i (-)-epikatehin i procijanidini se oksiduju i kao rezultat dobija se braon pigment. Primećeno je da u periodu degradacije i čuvanja kakaoa dolazi do smanjenja sadržaja polifenolnih jedinjenja, posebno (-)-epikatehina (Kyi i sar., 2005).

Prisutni flavan-3-oli u kakao zrnu su uglavnom (-)-epikatehina, (+)-katehina i u tragovima (+)-galokatehina, (-)-epigalokatehina. I pored smanjenja sadržaja epikatehina tokom fermentacije, njega ima najviše (35%) (Wollgast i Anklam, 2000; Steinberg i sar., 2003). Prema istraživanjima u Holandiji, putem čokolade se zadovoljava 20% dnevnog unosa katehina (Yilmaz, 2006).

Procijanidini su najzastupljeniji polifenoli u kakao zrnu. Oni utiču na ukus čokolade, a veći sadržaj izaziva njen gorak ukus. Procijanidini su uglavnom flavan-3,4-dioli koji su 4→6 ili 4→8 vezama povezani sa kondenzovanim dimerima, trimerima ili oligomerima sa epikatehinom. Na osnovu toga postoje sledeće vrste (Wollgast i Anklam, 2000; Rios i sar., 2002):

• procijanidin B1 predstavlja epikatehin-(4β→8)-katehin, • procijanidin B2- epikatehin-(4β→8)-epikatehin, • procijanidin B3- katehin-(4α→8)-katehin, • procijanidin B4- katehin-(4α→8)-epikatehin, • procijanidin B5- epikatehin-(4β→6)-epikatehin, • procijanidin C1- epikatehin-(4β→8)-epikatehin-(4β→8)-epikatehin, • procijanidin D- epikatehin-(4β→8)-epikatehin-(4β→8)-epikatehin-(4β→8)-epikatehin, • viši oligomeri i polimeri, uglavnom homolozi epikatehina sa 2-18 monomernih jedinica.

17

Na slici 13 prikazana je hemijska struktura procijanidina B-tipa pronađenih u kakaou.

Slika 13. Struktura procijanidina B tipa

Antocijani tokom procesa fermentacije hidrolizuju do antocijanidina. On u reakciji

polimeraizacije sa katehinom formira kompleks tanina. Antocijani obično brzo nestaju tokom procesa fermentacije (nakon 4 dana 93%), pa se sadržaj antocijana smatra dobrim parametrom za određivanje stepena fermentacije. Frakcija antocijana u kakao zrnu se sastoji uglavnom od cijanidin-3-α-L-arabinozida i cijanidin-3-β-D-galaktozida (Wollgast i Anklam, 2000).

Flavonoli prisutni u kakao zrnu su u vidu kvercetin glikozida i to najčešće kao kvercitin-3-O-α-

D-arabinozid i kvercitin-3-O-β-D-glukopiranozid. Dok se u veoma malim koncentracijama može naći kvercitin-3-O-galaktozid (Wollgast i Anklam, 2000).

Kafena, galna, p-kumarna i ferulna kiselina se takođe mogu naći u kakao proizvodima, ali u veoma malim koncentracijama.

2.6. Antioksidativno dejstvo fenolnih jedinjenja

Antioksidansi su supstance koje u niskim koncentracijama odlažu, ili sprečavaju nastanak slobodnih radikala i time štite ćelije od oksidacionog delovanja (Shahidi i Naczak , 2004). Naša tela proizvode sopstvene antioksidanse, ali takođe koriste i antioksidanse iz hrane koju unosimo u organizam.

Antioksidansi mogu ispoljavati svoju aktivnost različitim mehanizmima. Mogu delovati kao hvatači slobodnih radikala, kao donori elektrona ili donori H-atoma, peroksil ili hidroksil radikalima ili da deluju kao akceptori elektrona i akceptori H-atoma ugljenikovih slobodnih radikala (slika 14).

18

Slika 14. Način delovanja antioksidanasa

Antioksidansi se mogu klasifikovati prema nivou i načinu delovanja u ljudskom organizmu na:

• preventivne antioksidanse, • "skevendžer" antioksidanse i • "reparacione" antioksidanse.

Preventivni antioksidansi sprečavaju nastanak slobodnih radikala. "Skevendžer" antioksidansi poseduju sposobnost da "hvataju" slobodne radikale. "Reparacioni" antioksidansi deluju posebnim mehanizmima, obnavljujući ili uklanjajući oštećene vitalne biomolekule koji nastaju u uslovima oksidativnog stresa (Mitić, 2011).

Polifenolna jedinjenja se smatraju vodećim jedinjenjima sa antioksidativnim delovanjem. Smatra se da je antioksidativna aktivnost polifenolnih jedinjenja prvenstveno rezultat njihove sposobnosti da budu donori vodonika slobodnim radikalima nakon čega nastaju manje reaktivni fenoksil radikali:

Ph-OH + ROO˙→ Ph-O˙ + ROOH

Relativno velika stabilnost fenoksil radikala se objašnjava delokalizacijom elektrona uz postojanje više rezonantnih formi (slika 15).

Slika 15. Stabilizacija fenoksil radikala rezonancijom

19

Sa povećanjem stabilnosti nastalog fenoksil radikala povećava se mogućnost nastajanja reakcija koje dovode do slobodno radikalskih procesa kod flavonoida, kumarina i fenolnih kiselina.

Kao snažni antioksidansi, fenolna jedinjenja različitim mehanizmima neutrališući slobodne radikale u ćelijama, mogu da spreče oksidativna oštećenja DNK i širenje tumora, a sprečavaju i oksidaciju LDL.

Jedni od najvažnijih antioksidanasa koji se nalazi u kakao zrnu jesu flavonoidi. Antioksidativno dejstvo flavonoida se ispoljava na nekoliko načina (Procházková i sar., 2011):

• s obzirom na to da mogu da helatizuju teške metale preko orto-dihidroksilnih grupa prstenova A i B , oni smanjuju koncentraciju jona teških metala u biološkim sistemima, a poznato je da su oni inicijatori i promotori lipidne peroksidacije (produkcije slobodnih radikala);

• molekuli flavonoida mogu predati svoj H-atom slobodnom radikalu i na taj način ga mogu neutralisati. Pri tome oni sami postaju radikali, ali su ti o-semihinon radikali mnogo stabilniji od radilkala koje neutrališu (hidroksi, peroksi, superoksi radikala) zbog rezonancione delokalizacije nesparenog elektrona. Ovako nastali slobodni radikali rezonantno su stabilizovani i nemaju dovoljno energije da pokrenu lančanu reakciju sa supstratom:

ROO∙ + Flavonoid-OH → ROOH + Flavonoid-O∙ OH∙ + Flavonoid-OH → H2O + Flavonoid-O∙

• molekuli flavonoida mogu da deluju kao hvatači slobodnih radikala ''skvendžer efekat'' i pri

tome nastaju veoma stabilni o-semihinon radikali koji su stabilizobvni rezonancionom delokalizacijom.

Na slici 16 prikazana je reakcija između flavonoid fenoksil radikala (Fl-O*) i nekog drugog radikala pri čemu nastaje hinonska struktura i dolazi do odvajanja vodonika (Procházková i sar., 2011).

Slika 16. Mehanizam odavanja atoma vodonika flavonoida

Različiti flavonoidi u zavisnosti od strukture pokazuju različitu antioksidativnu aktivnost.

Aglikoni generalno pokazuju veću antioksidativnu aktivnost od svojih glikozida. Strukturni elementi flavonoida koji im omogućavaju antioksidativno deistvo su:

20

• 2,3-dvostruka veza piranskog prstena u konjugaciji sa keto grupom na C4-atomu (zbog delokalizacije nesparenog elektrona i rezonancione stabilizacije ariloksi anjona),

• broj hidroksilnih grupa u prstenu B, • orto-dihidroksilne grupe prstena B, • prisustvo OH-grupa u položajima C3 i C5 kao hvatača (skvendžera) slobodnih radikala.

Samim tim što smanjuju koncentraciju slobodnih radikala u živim organizmima, flavonoidi sprečavaju pojavu oksidacionog oštećenja ćelija i brojne mutagene i kancerogene procese koji mogu biti izazvani delovanjem slobodnih radikala. Imajući u vidu slobodno-radikalsku teoriju starenja po kojoj je proces starenja posledica destruktivnog delovanja slobodnih radikala i slabljenja antioksidativne zaštite organizma, to se može reći da flavonoidi usporavaju ove procese i smanjuju destrukciju kolagena (Taps i sar., 2008).

Veliki broj studija pokazao je da je i sadržaj antocijana povezan sa visokom antioksidativnom aktivnošću i da ima pozitivan efekat na degenerativne i hronične bolesti. Antocijani pokazuju veću antioksidativnu aktivnost nego vitamini C i E. I ova jedinjenja su sposobna da uhvate slobodne radikale doniranjem vodonika iz fenolnih grupa (Ćujić i sar., 2013).

Antioksidativna aktivnost fenolnih kiselina je takođe značajna u odbrambenim mehanizmima bioloških sistema. Galna kiselina je najbolji antioksidans od svih hidroksibenzoevih kiselina. Antioksidativna aktivnost fenolnih kiselina je u vezi sa supstituentima i njihovim položajem na aromatičnom prstenu i strukturom bočnog niza. Prisustvo CH=CH-COOH grupe kod hidroksi derivata cimetne kiseline je razlog za znatno veću aktivnost nego COOH grupe kod hidroksi derivata benzoeve kiseline. Veći broj hidroksilnih i metoksi gupa na fenolnom prstenu povećava antioksidativnu aktivnost (kafena kiselina).

2.7. Analitičke metode

Polifenoli se mogu kvalitativno i kvantitativno određivati primenom različitih tehnika kao što su: • UV/VIS spektrofotometrija • HPLC (Visoko efikasna tečna hromatografija) • TLC (Tankoslojna hromatografija) • Masena spektrometrija.

Prvo se vrši izolovanje određenih klasa polifenola iz analiziranog materijala ekstrakcijom pomoću rastvarača različite polarnosti, u zavisnosti od toga koju klasu polifenola želimo da izolujemo. Posle toga sledi razdvajanje individualnih polifenolnih jedinjenja hromatografijom (najčešće TLC) i na kraju njihova identifikacija i strukturno određivanje UV/VIS, NMR ili masenom spektrometrijom.

21

2.7.1. Spektrofotometrija

Spektrofotometrija je apsorpciona metoda koja se zasniva na proučavanju zavisnosti apsorbance od talasne dužine zračenja koje je prošlo kroz analiziranu supstancu. Apsorpcija se može pratiti kako u UV i Vis oblasti tako i u IC, mikrotalasnoj i radiofrekventnoj oblasti.

Ultraljubičasta/Vidljiva (UV/Vis) spektrofotometrija je spektroskopska metoda koja obuhvata proučavanje apsorpcije elektromagnetnog zračenja u oblasti između 200 i 800 nm. Kako veliki broj organskih jedinjenja ne apsorbuje u ovom delu spektra, to UV/Vis spektrofotometrija, u poređenju sa drugim strukturnim metodama (IC, NMR, MS), ima daleko manju primenu za strukturna određivanja i uglavnom se koristi kao komplementarna metoda za identifikaciju delova molekula koji apsorbuju u navedenoj oblast. Međutim, ova vrsta spektrofotometrije, tj. UV/Vis spektri dobijeni na ovaj način, pružaju veoma korisne informacije o strukturi ispitivanog jedinjenja. Na primer, ona je nezamenljiva pomoćna (a često i glavna) metoda za identifikaciju prirodnih konjugovanih jedinjenja, kao što su: biljni pigmenti (karotenoidi), poliacetileni, porfirini, flavonoidi, itd.

Pored primene za identifikaciju organskih jedinjenja, UV/Vis spektrofotometrija se danas dosta primenjuje u kvantitativnoj analizi. Njene prednosti nad ostalim metodama su u izuzetno velikoj osetljivosti i jednostavnom rukovanju instrumentom.

Većina standardnih spektrofotometara radi u delu elektromagnetnog spektra između 200 i 800 nm. Taj deo je podeljen na blisku ultraljubičastu (200-400 nm) i vidljivu oblast (400-800 nm). Na nižim talasnim dužinama (< 200 nm) nalazi se vakuumska ultraljubičasta oblast, koja nije od interesa za strukturna određivanja zbog apsorpcije kiseonika iz vazduha, tako da je neophodno da uzorak bude u evakuisanom stanju.

UV/Vis spektrofotometrija se najčešće koristi za kvalitativna i kvantitativna određivanja rastvora prelaznih metala ili konjugovanih organskih molekula. Prolaskom zračenja iz vidljivog dela spektra kroz obojeni rastvor, joni prelaznih metala apsorbuju deo svetlosti pri čemu se pobuđuju elektoni iz d-orbitale, dok se kod organskih molekula najčešće pobuđuju π-elektroni. Najčešće se snimaju spektri razblaženih rastvora, a mogu se snimati i spektri gasova ili para (Todorović i sar., 2007).

2.7.1.1. Snimanje UV/Vis spektara

Spektrofotometar se sastoji iz svetlosnog izvora iz koga se svetlost deli na dva jednaka zraka (referentni i analitički), monohromatora, detektora i uređaja za pojačavanje, merenje i beleženje signala (pisača). Kao izvor zračenja koristi se kombinacija volframove (za vidljivu oblast, λ>375 nm) i deuterijumske lampe za blisku ultraljubičastu oblast. Kao detektor se najčešće koristi fotomultiplikator. Na slikama 17 i 18 prikazan je izgled spektrofotometra i šema načina rada spektrofotometra.

22

Slika 17. Spektrofotometar

Koncentracija uzorka zavisi od intenziteta apsorpcije i podešava se tako da vrh apsorpcionog maksimuma bude u oblasti najveće tačnosti. Najbolje je napraviti koncentrovaniji rastvor od kojeg se postupnim razblaživanjem dobija rastvor koncentracije pogodne za snimanje.

Pripremljeni rastvor se prebacuje u analitičku ćeliju (standardne debljine od 1 cm) od kvarca (sistem propustljiv za blisku UV i vidljivu oblast) ili stakla (sistem propustljiv samo za vidljivu oblast). Takođe se priprema i istovetna referentna ćelija sa čistim rastvaračem. Za vreme kontinualne promene talasne dužine porede se intenziteti referentnog (I0) i analitičkog (I) signala. Spektar se beleži pomoću pisača, najčešće kao zavisnost apsorbance (A) od talasne dužine (λ) (Todorović i sar., 2007).

Slika 18. Šema spektrofotometra

23

2.7.2. Tečna hromatografija visoke efikasnosti (HPLC)

Hromatografija je naziv za grupu laboratorijskih tehnika za razdvajanje komponenti iz smeša. Naziv potiče od grčkih reči chroma-boja i grafein-pisati.

Hromatografske metode razdvajanja se zasnivaju na različitoj raspodeli komponenata uzorka između dve faze, od kojih je jedna nepokretna (stacionarna), a druga pokretna (mobilna). Mobilna faza može biti tečna ili gasovita. Stacionarna faza je nepokretna faza, koja je fiksirana u koloni (GC i LC) ili ploči (npr. silika-gel u TLC), na čijoj se površini određeno vreme zadržavaju supstance (analiti) koje se razdvajaju.

Hromatografske metode uključuju kretanje ispitivane smeše, rastvorene u "mobilnoj fazi", kroz "stacionarnu fazu" (eluiranje), čime se delovi smeše razdvajaju na komponente. Vreme za koje analit prođe kroz hromatografski sistem pod određenim uslovima (temperatura i pritisak) naziva se retenciono vreme (tR), a vizuelni prikaz rezultata hromatografskog postupka naziva se hromatogram.

Hromatografija može biti analitička i preparativna. U analitičkoj hromatografiji se obično radi sa malim uzorcima i meri se relativni odnos komponenata u smeši. Preparativna hromatografija se bavi razdvajanjem komponenti iz smeše radi dalje obrade, pa se može smatrati metodom prečišćavanja.

Hromatografske metode se dele prema fizičkom stanju faza, prema fizičko-hemijskim reakcijama koje se dešavaju prilikom razdvajanja komponenti ili mehanizmu razdvajanja (slika 19).

Slika 19. Podela hromatografskih metoda

24

Tečna hromatografija visoke efikasnosti (tečna hromatografija pri visokim pritiscima) ili HPLC (High performance liquid chromatography ili high pressure liquid chromatography) predstavlja vrstu hromatografije kojom se postiže izuzetno dobra rezolucija pri razdvajanju čak i veoma kompleksnih smeša (zbog toga se nekada naziva i tečnom hromatografijom visoke rezolucije). HPLC je vrsta eluacione hromatografije na koloni, koja je našla široku primenu u analitičkoj hemiji i biohemiji i koristi se za razdvajanja, identifikaciju i kvantitativno određivanje različitih jedinjenja.

HPLC razdvajanja se zasnivaju na različitoj raspodeli supstance između dve faze: tečne (mobilne faze) koja nosi smešu analita kroz porozni materijal (stacionarnu fazu), pri čemu, usled različite vrste interakcija analita sa stacionarnom fazom, dolazi do razlike u vremenu migracije komponenti analiziranog uzorka. Ono što je razlikuje od ostalih metoda je to što je mobilna faza izložena dejstvu visokog pritiska. Visok pritisak omogućava kontinuirani protok mobilne faze i uspostavljanje dinamičke ravnoteže sa stacionarnom fazom. Dinamička ravnoteža je uslov dobre selektivne raspodele komponenti u ispitivanom uzorku. Dejstvo visokog pritiska dovodi i do efikasnog i brzog eluiranja komponenti smeše sa kolone.

HPLC instrument je veoma složen i skup. Njegova najveća prednost je u tome što se mogu analizirati i razdvajati neisparljive supstance i što se analize vrše na sobnoj temperaturi. Osnovni delovi HPLC sistema su:

• pumpa - stvara pritisak od oko 106 Pa i omogućavaju kontinualnu promenu brzine mobilne faze,

• kolona (najvažniji deo HPLC sistema). • detektor - najčešće se koriste UV/Vis detektori. UV/Vis detektori kao izvor zračenja

najčešće koriste deuterijumsku lampu koja ima veoma širok emisioni spektar zračenja (200-700 nm), (slika 20 i slika 21).

Slika 20. HPLC aparat Slika 21. Šema HPLC aparata

Tipičan HPLC sistem sastoji se od relativno polarne mobilne faze i nepolarne stacionarne faze. Voda (ili pufer) se koristi kao slab rastvarač i acetonitril, metanol, ili manje zastupljen tetrahidrofuran, kao jak rastvarač. Stacionarna faza (HPLC kolona) je materijal sa silika česticama. Koji će tip kolone biti izabran zavisi od jedinjenja i cilja analize.

25

Mobilne faze koje se koriste u HPLC su vodeno-organske smeše. Najčešće korišćeni organski modifikatori su metanol, acenonitri i/ili kombinacija ova dva modifikatora. Rastvarači za mobilnu fazu treba da budu mešljivi i ne treba da dovode do taloženja kada se pomešaju.

Izbor odgovarajućeg detektora zavisi od osobina analita. Postoje različiti tipovi detektora, UV-VIS, detektori na bazi merenja fluorescencije, indeksa refrakcije, plameno-jonizacioni detektori (FID), maseni (MS), NMR i drugi. Pravilan izbor detekcione talasne dužine je kritičan deo razvoja metode.

Temperatura takođe utiče na određivanja kod tečne hromatografije, posebno kada je reč o rastvorima male molekulske mase. Povišena temperatura poboljšava difuznost uzorka i smanjuje viskoznost pokretne faze, pa se time poboljšavaju kinetički parametri. Međutim, maksimalno dozvoljena temperatura je niža za oko 20oC od temperature ključanja pokretne faze (Mitić, 2011).

26

3. EKSPERIMENTALNI DEO

27

3.1. Reagensi

• (+)-katehin (Sigma Aldrich, Steineheim, Germany) • (-)-epikatehin (Sigma Aldrich, Steineheim, Germany) • procijanidin B1, B2 i B3 (Sigma Aldrich, Steineheim, Germany) • heksan, sirćetna kiselina, mravlja kiselina, acetonitril i aceton (Merck®, Darmstadt,

Germany) • 5% NaNO2 (Merck®, KGaA, Darmstadt, Germany) • 1% AlCl3 (Merck®, KGaA, Darmstadt, Germany) • 1 M NaOH (Merck®, KGaA, Darmstadt, Germany) • dejonizovana voda (λ = 0,05 µS/cm)

3.2. Aparatura i pribor

• UV/Vis spektrofotometar (Agilant 8453, Agilant Technologies, Santa Clara, California, USA)

• kiveta (1 cm) • HPLC (model 1200, Agilant Technologies, Santa Clara, California, USA) • analitička kolona (5μm, 4,6 x 150mm, C18 Zorbax Eclipse XDB-C18, Agilant

Technologies, Santa Clara, California, USA) • aparat za dejonizovanu vodu (MicroMed, TKA Wasseraufbereitungs systeme GmbH,

Niederelbert, Germany) • analitička vaga Mettler Toledo AB-204-S • varijabilne automatske pipete

3.3. Uzorci

Kao uzorci u ovom radu korišćeno je 8 vrsti (K1-K8) komercijalno dostupnih kakaoa u prahu (tabela 3). Uzorci su čuvani na tamnom mestu, na tri različite temperature (4oC, 22oC i 35oC). Sadržaj katehina i procijanidina je praćen tokom 30 dana, a sadržaj ukupnih flavonoida tokom 45 dana.

28

Tabela 3. Uzorci kakao praha

Oznaka uzorka Brend K1 Povicom K2 365 K3 Omega K4 Moravka K5 C K6 Yumis K7 Gold K8 Aleva

3.4. Priprema uzoraka

10g kakao praha odmašćeno je 3-5 puta sa 10 ml heksana i ostatak je osušen. Odmašćeni materijal, oko 1 g (sa tačnošću na četiri decimale), je ekstrahovan tri puta sa 10 ml aceton-voda-sirćetna kiselina (70:29:0.5 v/v/v ili 70:28:2) ultrazvučno (na 37°C, 10 min). Nakon toga je rastvor centrifugiran 10 min na 3000 obrtaja. Supernatant je odekantovan (proceđen kroz mikrofiltre) u normalni sud od 50 ml i dopunjen dejonizovanom vodom do crte (Adamson i sar., 1999).

3.4.1. Proces zagrevanja

U erlenmajerima je odmerena masa kakaoa oko 40 g i uzorci su zagrevani na temperaturama između 95 i 125°C. Temperatura je kontrolisana korišćenjem laboratorijskog termometra (±1ºC). Kada su postignuti izotermalni uslovi, uzorci su uzimani u različitim vremenskim intervalima u zavisnosti od temperature zagrevanja i odmah hlađeni na ledu kako bi se zaustavila termalna degradacija.

3.4.2. Određivanje sadržaja ukupnih flavonoida

Flavonoidi imaju osobinu da sa metalima grade odgovarajuće metalne komplekse. Naročito je važan kompleks sa Al3+. Koncentracija flavonoida određena je primenom AlCl3 kao reagensa, spektrofotometrijskom metodom (Yang i sar., 2004; Zhishen i sar., 1999).

Standardni rastvor katehina pripremljen je na sledeći način: 5 mg katehina rastvoreno je u u 5 ml etanola i dopunjeno dejonizovanom vodom do crte u normalnom sudu od 10 ml. Koncentracija tako dobijenog rastvora bila je 0,5 mg/ml. Od ovog rastvora je pripremljena serija standardnih rastvora pomoću kojih je konstruisana kalibraciona kriva.

29

Reakciona smeša je pripremljena mešanjem 0,25 ml uzorka, 3 ml dejonizovane vode i 0,3 ml 5% NaNO2. Nakon 5 min dodato je 3 ml AlCl3, nakon 5 min još 2 ml NaOH (1M) i dejonizovana voda do 10 ml. Apsorbancija je merena na 510 nm. Na osnovu vrednosti apsorbancije, sa kalibracione krive katehina određena je koncentracija (mg/ml) flavonoida u uzorcima, pri čemu je sadržaj flavonoida izražen kao miligram ekvivalenta katehina po gramu uzorka (mg CE/g).

3.4.3. Određivanje katehina i procijanidina korišćenjem HPLC metode

Tečna hromatografija sa UV/Vis i fluorescentnim detektorom visoke rezolucije primenjena je za razdvajanje i kvantifikaciju polifenolnih jedinjenja u pripremljenim uzorcima. Hromatografsko razdvajanje izvršeno je na kolini Zorbax Eclipse C18 (XDB-C18, 5μm, 4,6 × 150 mm) koja je termostatirana na 25 oC. Protok mobilne faze iznosio je 0,8 mL/min, a pomoću autosemplera injektovano je 20 μL uzorka. Katehini su detektovani pomoću UV detektora na 289 nm, a procijanidini pomoću fluorescentnog detekrora na talasnim dužinama 275-322 nm. Binarna mobilna faza se sastojala od rastvarača A (5% mravlja kiselina u vodi) i rastvarača B (80% acetonitril i 5% mravlja kiselina u vodi). Razdvajanje komponenti je izvedeno primenom 45-o minutnog linearnog gradijenta (Gu i sar., 2006): 0-10 min, 0% B; 10-28 min, 0-25% B; 28-30 min, 25% B; 30-35 min, 25-50% B; 35-40 min, 50-80% B; 40-45 min, 80-0% B. Pojedinačni katehini i procijanidini su anlizirani u toku 50 minuta. Identifikacija je izvršena poređenjem njihovih retencionih vremena i spektara sa retencionim vremenom i spektrom standarda za svaku komponentu ili poređenjem sa podacima iz literature (procijanidin B4) (Adamson i sar., 1999; Porter i sar., 1991). Kvantitativno određivanje pojedinačnih polifenola izvršeno je korišćenjem kalibracione prave za svaki standard.

3.5. Statistička obrada podataka

Sva merenja su izvršena u najmanje dva ponavljanja, a rezultati predstavljeni kao srednja vrednost dva ponavljanja (csr ± SD). Interval poverenja iznosio je 95% (Miller i Miller, 2005).

30

4. REZULTATI I DISKUSIJA

31

4.1. Uticaj temperature čuvanja i zagrevanja na sadržaj katehina, procijanidina i ukupnih flavonoida u uzorcima kakaoa u prahu

Rezultati sadržaja pojedinačnih polifenola u ispitivanim uzorcima dati su u tabeli 4. Sadržaj katehina i procijanidina opada sa vremenom čuvanja na različitim temperaturama. Sa povećanjem temperature raste i procenat degradacije katehina i procijanidina. Nestabilniji od ispitvanih katehina je (-)-epikatehin, a od procijanidina, procijanidini B3 i B4.

Sadržaj (-)-epikatehina je veći nego (+)-katehina u svim uzorcima. Najzastupljeniji procijanidin

je B2, zatim po zastupljenosti slede B1, B3 i B4. Ovi podaci su u skladu sa literarnim podacima (Cooper i sar., 2007).

Hromatogram standarda i uzorka kakao praha prikazan je na slici 22.

a)

32

Slika 22. Hromatogram a) standarda i b) uzorka kakao praha snimljen na fluorescentnom detektoru: 1 - procijanidin B1, 2 - (+)-katehin, 3 - procijanidin B2, 4 - (-)-epikatehin,

5 - procijanidin B3, 6 - procijanidin B4

b)

33

Tabela 4. Sadržaj katehina i procijanidina (mg/g)* u uzorcima kakao praha tokom čuvanja na različitim temperaturama

Uzorak Dan

(-)-epikatehin (+)-katehin csr±SD

csr±SD

4°C 22°C 35°C 4°C 22°C 35°C

K1 7 0.194 ± 0.003 0.188 ± 0.003 0.167 ± 0.003 0.035 ± 0.001 0.033 ± 0.001 0.031 ± 0.001

15 0.178 ± 0.003 0.145 ± 0.003 0.136 ± 0.002 0.032 ± 0.001 0.029 ± 0.001 0.026 ± 0.001

30 0.147 ± 0.002 0.096 ± 0.001 0.085 ± 0.001 0.027 ± 0.001 0.023± 0.001 0.019 ± 0.001

K2 7 0.262 ± 0.004 0.247 ± 0.004 0.222 ± 0.004 0.037 ± 0.001 0.035 ± 0.001 0.032 ± 0.001

15 0.237 ± 0.003 0.206 ± 0.003 0.187 ± 0.003 0.034 ± 0.001 0.030 ± 0.001 0.026 ± 0.001

30 0.196 ± 0.002 0.148 ± 0.002 0.126 ± 0.002 0.029 ± 0.001 0.023 ± 0.001 0.019 ± 0.001

K3 7 0.286 ± 0.004 0.275 ± 0.004 0.251 ± 0.003 0.152 ± 0.002 0.147 ± 0.002 0.142 ± 0.002

15 0.259 ± 0.003 0.233 ± 0.003 0.220 ± 0.003 0.145 ± 0.002 0.124 ± 0.002 0.116 ± 0.002

30 0.246 ± 0.003 0.207 ± 0.003 0.182 ± 0.002 0.123 ± 0.002 0.089 ± 0.001 0.074 ± 0.001

K4 7 0.193 ± 0.003 0.182 ± 0.003 0.164 ± 0.003 0.031 ± 0.001 0.028 ± 0.001 0.025 ± 0.001

15 0.185 ± 0.003 0.145 ± 0.002 0.136 ± 0.002 0.028 ± 0.001 0.024 ± 0.001 0.020 ± 0.001

30 0.163 ± 0.002 0.118 ± 0.001 0.092 ± 0.001 0.024 ± 0.001 0.017 ± 0.001 0.016 ± 0.001

K5 7 0.266 ± 0.004 0.258 ± 0.004 0.243 ± 0.004 0.266 ± 0.005 0.262 ± 0.004 0.257 ± 0.004

15 0.235 ± 0.003 0.225 ± 0.003 0.217 ± 0.003 0.258 ± 0.005 0.246 ± 0.004 0.225 ± 0.004

30 0.195 ± 0.002 0.178 ± 0.002 0.178 ± 0.002 0.226 ± 0.004 0.213 ± 0.003 0.183 ± 0.003

K6 7 0.467 ± 0.007 0.456 ± 0.006 0.433 ± 0.006 0.437 ± 0.005 0.431 ± 0.005 0.426 ± 0.005

15 0.431 ± 0.006 0.426 ± 0.005 0.401 ± 0.005 0.424 ± 0.005 0.414 ± 0.005 0.398 ± 0.005

30 0.396 ± 0.004 0.398 ± 0.004 0.365 ± 0.004 0.391 ± 0.005 0.383 ± 0.005 0.343 ± 0.005

K7 7 0.208 ± 0.004 0.197 ± 0.003 0.174 ± 0.002 0.0099 ± 0.0004 0.0094 ± 0.0004 0.0091 ± 0.0003

15 0.177 ± 0.003 0.165 ± 0.002 0.147 ± 0.002 0.0093 ± 0.0003 0.0085 ± 0.0006 0.0080 ± 0.0001

30 0.145 ± 0.002 0.126 ± 0.002 0.104 ± 0.002 0.0085 ± 0.0002 0.0073 ± 0.0001 0.0067 ± 0.0001

K8 7 0.412 ± 0.006 0.404 ± 0.006 0.389 ± 0.005 0.086 ± 0.002 0.0083 ± 0.0002 0.0079 ± 0.0001

15 0.389 ± 0.005 0.376 ± 0.004 0.365 ± 0.005 0.081 ± 0.002 0.0077 ± 0.0002 0.0068 ± 0.0001

30 0.351 ± 0.005 0.335 ± 0.004 0.329 ± 0.004 0.075 ± 0.001 0.0065 ± 0.0001 0.0055 ± 0.0001

34

procijanidin B1 procijanidin B2 csr±SD

csr±SD

4°C 22°C 35°C 4°C 22°C 35°C

0.047 ± 0.002 0.044 ± 0.002 0.040 ± 0.002 0.0125 ± 0.0002 0.0123 ± 0.0002 0.0120 ± 0.0002 0.038 ± 0.001 0.032 ± 0.001 0.029 ± 0.001 0.0107 ± 0.0002 0.0098 ± 0.0001 0.0084 ± 0.0001 0.029± 0.001 0.019 ± 0.001 0.0182 ± 0.0005 0.0093 ± 0.0001 0.0082 ± 0.0001 0.0059 ± 0.0001 0.032 ± 0.004 0.029 ± 0.001 0.026 ± 0.001 0.0188 ± 0.0003 0.0186 ± 0.0003 0.0182 ± 0.0003 0.027 ± 0.001 0.021 ± 0.001 0.0193 ± 0.0005 0.0164 ± 0.0003 0.0143 ± 0.0002 0.0129 ± 0.0002

0.0193 ± 0.0005 0.0168 ± 0.0004 nd 0.0135 ± 0.0002 0.0116 ± 0.0002 nd 0.058 ± 0.002 0.056 ± 0.002 0.052 ± 0.002 0.058 ± 0.002 0.056 ± 0.002 0.054 ± 0.002 0.049 ± 0.001 0.043 ± 0.001 0.039 ± 0.001 0.051 ± 0.002 0.045 ± 0.002 0.039 ± 0.001 0.038 ± 0.001 0.031 ± 0.001 0.026 ± 0.001 0.042 ± 0.002 0.032 ± 0.001 0.026 ± 0.001

0.0188 ± 0.0002 0.0185 ± 0.0003 0.0182 ± 0.0004 0.0138 ± 0.0002 0.0135 ± 0.0002 0.0131 ± 0.0002 0.0179 ± 0.0001 0.0166 ± 0.0001 0.0149 ± 0.0003 0.0116 ± 0.0002 0.0107 ± 0.0001 0.0088 ± 0.0001 0.0157 ± 0.0004 0.0145 ± 0.0001 0.0126 ± 0.0002 0.0095 ± 0.0001 0.0074 ± 0.0001 0.0056 ± 0.0001

0.029 ± 0.001 0.025 ± 0.001 0.023 ± 0.001 0.108 ± 0.003 0.105 ± 0.002 0.101 ± 0.002 0.025 ± 0.004 0.021 ± 0.001 0.0169 ± 0.0004 0.086 ± 0.002 0.072 ± 0.001 0.052 ± 0.002

0.0196 ± 0.0005 0.0188 ± 0.0004 0.0144 ± 0.0004 0.071 ± 0.002 0.052 ± 0.001 0.034 ± 0.001 0.056 ± 0.002 0.054 ± 0.002 0.051 ± 0.002 0.067 ± 0.002 0.065 ± 0.003 0.060 ± 0.002 0.049 ± 0.002 0.043 ± 0.002 0.039 ± 0.002 0.061 ± 0.002 0.053 ± 0.002 0.049 ± 0.002 0.038 ± 0.001 0.032 ± 0.001 0.026 ± 0.001 0.053 ± 0.002 0.039 ± 0.001 0.031± 0.001 0.039 ± 0.001 0.038 ± 0.001 0.035 ± 0.001 0.0191 ± 0.0003 0.0189 ± 0.0003 0.0185 ± 0.0003 0.033 ± 0.001 0.031 ± 0.001 0.022 ± 0.001 0.0172 ± 0.0003 0.0167 ± 0.0002 0.0154 ± 0.0001 0.025± 0.001 0.022 ± 0.001 0.0147 ± 0.0002 0.0149 ± 0.0002 0.0124 ± 0.0001 nd 0.027 ± 0.001 0.025 ± 0.001 0.023 ± 0.001 0.048 ± 0.002 0.046 ± 0.002 0.042 ± 0.002 0.022 ± 0.001 0.0193± 0.0005 0.0136 ± 0.0003 0.041 ± 0.002 0.035 ± 0.002 0.029 ± 0.001

0.0178 ± 0.0003 0.0156 ± 0.0004 0.0095 ± 0.0002 0.033 ± 0.001 0.029 ± 0.001 0.0187 ± 0.0004

35

procijanidin B3 procijanidin B4 csr±SD

csr±SD

4°C 22°C 35°C 4°C 22°C 35°C

0.0067 ± 0.0002 0.0065 ± 0.0002 0.0062 ± 0.0002 0.0056 ± 0.0002 0.0052 ± 0.0002 0.0048 ± 0.0001 0.0061 ± 0.0002 0.0054 ± 0.0001 0.0048 ± 0.0001 0.0049 ± 0.0001 0.0041 ± 0.0001 nd 0.0052 ± 0.0002 0.0041 ± 0.0001 0.0033 ± 0.0001 0.0040 ± 0.0001 0.0029 ± 0.0001 nd 0.0121 ± 0.0003 0.0118 ± 0.0003 0.0114 ± 0.0002 0.0105 ± 0.0003 0.0101 ± 0.0002 0.0098 ± 0.0002 0.0116 ± 0.0002 0.0107 ± 0.0002 0.0099 ± 0.0001 0.0099 ± 0.0002 0.0087 ± 0.0002 0.0073 ± 0.0001 0.0102 ± 0.0002 0.0082 ± 0.0001 0.0071 ± 0.0001 0.0089 ± 0.0001 0.0065 ± 0.0002 0.0051 ± 0.0001 0.0161 ± 0.0003 0.0158 ± 0.0003 0.0155 ± 0.0003 0.0126 ± 0.0003 0.0124 ± 0.0003 0.0120 ± 0.0003 0.0154 ± 0.0002 0.0142 ± 0.0002 0.0139 ± 0.0002 0.0119 ± 0.0002 0.0093 ± 0.0002 0.0087 ± 0.0002 0.0143 ± 0.0002 0.0129 ± 0.0002 0.0102 ± 0.0002 0.0108 ± 0.0002 0.0069 ± 0.0002 0.0061 ± 0.0002 0.0125 ± 0.0003 0.0123 ± 0.0002 0.0120 ± 0.0002 0.0116 ± 0.0002 0.0113 ± 0.0003 0.0109 ± 0.0003 0.0119 ± 0.0002 0.0112 ± 0.0002 0.0104 ± 0.0002 0.0108 ± 0.0002 0.0094 ± 0.0002 0.0087 ± 0.0002 0.0110 ± 0.0002 0.0086 ± 0.0001 0.0069 ± 0.0001 0.0097 ± 0.0001 0.0065 ± 0.0001 0.0056 ± 0.0001 0.0097 ± 0.0002 0.0094 ± 0.0002 0.0092 ± 0.0002 0.0089 ± 0.0001 0.0086 ± 0.0001 0.0082 ± 0.0001 0.0090 ± 0.0002 0.0082 ± 0.0002 0.0076 ± 0.0001 0.0081 ± 0.0001 0.0071 ± 0.0001 0.0066 ± 0.0001 0.0079 ± 0.0001 0.0065 ± 0.0001 0.0053 ± 0.0001 0.0072 ± 0.0001 0.0049 ± 0.0001 nd 0.0235 ± 0.0003 0.0232 ± 0.0003 0.0229 ± 0.0003 0.0084 ± 0.0002 0.0082 ± 0.0002 0.0079 ± 0.0002 0.0228 ± 0.0003 0.0229 ± 0.0003 0.0195 ± 0.0003 0.0078 ± 0.0002 0.0069 ± 0.0001 0.0062 ± 0.0001 0.0119 ± 0.0002 0.0178 ± 0.0002 0.0134 ± 0.0002 0.0067 ± 0.0001 0.0047 ± 0.0001 0.0041 ± 0.0001 0.0114 ± 0.0002 0.0112 ± 0.0002 0.0109 ± 0.0002 0.0049 ± 0.0001 0.0046 ± 0.0001 0.0042 ± 0.0001 0.0107 ± 0.0002 0.0096 ± 0.0001 0.0091 ± 0.0001 0.0041 ± 0.0001 0.0034 ± 0.0001 0.0032 ± 0.0001 0.0098 ± 0.0001 0.0073 ± 0.0001 nd 0.0032 ± 0.0001 0.0022 ± 0.0001 nd 0.0162 ± 0.0003 0.0160 ± 0.0002 0.0157 ± 0.0002 0.0073 ± 0.0002 0.0071 ± 0.0002 0.0068 ± 0.0002 0.0155 ± 0.0002 0.0147 ± 0.0002 0.0132 ± 0.0002 0.0065 ± 0.0002 0.0059 ± 0.0001 0.0053 ± 0.0001 0.0146 ± 0.0002 0.0116 ± 0.0002 0.0093 ± 0.0001 0.0054 ± 0.0001 0.0042 ± 0.0001 nd

*csr±SD (n = 2), **nd- nije detektovan

Sadržaj katehina i procijanidina tokom vremena čuvanja na različitim temperaturama prikazan je i grafički na slikama 23 i 24.

36

Slika 23. Sadržaj katehina u kakao uzorcima tokom vremenja čuvanja na različitim temperaturama

37

38

Slika 24. Sadržaj procijanidina u kakao uzorcima tokom vremena čuvanja na različitim temperaturama

Za određivanje sadržaja ukupnih flavonoida korišćena je odgovarajuća kalibraciona prava (slika 25).

0 2 4 6 8 100.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

A

ckatehin, mg/L

Slika 25. Kalibraciona prava za određivanje sadržaja ukupnih flavonoida u uzorcima kakaoa u prahu

39

Primenom kompjuterskog programa ORIGIN 7.0 dobijena je jednačina prave:

A = 0,02486cx - 0,00507 R = 0,99941

gde je cx nepoznata koncentracija u mg/L, a R koeficijent korelacije. Sadržaj ukupnih flavonoida u ispitivanim uzorcima izračunat je na osnovu jednačine prave i

sadržaj je izražen kao miligram ekvivalenta katehina po gramu uzorka (mg CE/g). Uticaj temperature čuvanja i zagrevanja na degradaciju flavonoida u uzorcima kakao praha

prikazan je u tabeli 5. Tabela 5. Uticaj temperature čuvanja i zagrevanja na degradaciju ukupnih flavonoida u uzorku

kakao praha Temperatura čuvanja (ºC)

Vreme (dan)

csr±SD mg/g

RSD (%)

Temperatura zagrevanja (ºC)

Vreme (min)

csr±SD mg/g

RSD (%)

4

7 14.0 ± 0.3 2.14

95

25 12.3 ± 0.1 0.82 15 13.8 ± 0.3 2.17 50 11.6 ± 0.2 1.72 30 13.5 ± 0.2 1.48 70 10.7 ± 0.1 0.99 45 13.0 ± 0.2 1.54 100 10.1 ± 0.1 0.99

22

7 13.7 ± 0.3 2.19

100

25 11.9 ± 0.2 1.68 15 12.8 ± 0.2 1.56 50 10.2 ± 0.1 0.98 30 11.5 ± 0.2 1.74 70 9.6 ± 0.1 1.04 45 10.3 ± 0.2 1.94 100 8.1 ± 0.1 1.23

35

7 13.2 ± 0.3 2.27

110

10 11.5 ± 0.2 1.73 15 11.7 ± 0.2 1.71 20 10.9 ± 0.2 1.83 30 9.8 ± 0.2 2.04 30 9.9 ± 0.1 1.01 45 7.9 ± 0.1 1.27 40 8.9 ± 0.1 1.12

125

5 11.4 ± 0.4 3.51 10 10.5 ± 0.3 2.86 15 9.5 ± 0.2 2.11 20 8.0 ± 0.2 2.51

c0 = 14.2 ± 0.3 mg/g

Kinetički parametri degradacije flavonoida tokom čuvanja i zagrevanja dati su u tabeli 6 i na slikama 26 i 27.

40

Tabela 6. Uticaj temperature čuvanja i zagrevanja na vrednost konstante brzine (k), vremena poluraspada (t1/2) i energije aktivacije (Ea) degradacije ukupnih flavonoida u uzorcima kakao praha

Temperatura

(ºC)

k×103

(min-1) R2 t1/2

(h)

Ea

(kJ/mol)

4 1.9 ± 0.1 0.9905 6.1

121.3 22 6.9 ± 0.3 0.9961 1.7

35 13.2 ± 0.4 0.9971 0.9

95 3.4 ± 0.1 0.9899 3.4

144.2 100 5.6 ± 0.2 0.9945 2.1

110 11.8 ± 0.4 0.9959 1.0

125 29.1 ± 0.7 0.9847 0.4

Temperatura čuvanja utiče na stepen degradacije flavonoida, pri čemu je degradacija brža na 35 oC nego na sobnoj (22 oC) i temperaturi od 4oC. Brzina degradacije je data kao zavisnost ln(c/c0) od vremena čuvanja (slika 26) i sledi reakciju prvog reda. Ovi podaci su u skladu sa rezultatima istraživanja Kyi-ja i saradnika (2005).

Vreme poluraspada ukupnih flavonoida kreće se od 6,1 h do 0,9 h za uzorak kakao praha koji je čuvan na temperaturama od 4oC do 35oC. Čuvanje na 4oC doprinosi trostrukom povećanju vremena poluraspada u odnosu na sobnu temperaturu (tabela 6). Degradacija flavonoida je još više usporena kada je uzorak čuvan u frižideru na temperaturi od 4 oC (tabela 5, slika 26). Nakon 45 dana stajanja na temperaturi od 4oC uzorak kakao praha sadržao je preko 91% ukupnih flavonoida, dok je isti uzorak na sobnoj temperaturi sadržao preko 72%. Prethodna istraživanja su pokazala da temperatura čuvanja takođe utiče i na sadržaj antocijana u različitim sokovima (Buckow i sar., 2010; Gancel i sar., 2011) i na sadržaj katehina u čajevima (Bazinet i sar., 2010).

41

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50-0.7

-0.6

-0.5

-0.4

-0.3

-0.2

-0.1

0.0

ln(c

/c0)

Vreme (dan)

4ºC 22ºC 35ºC

Slika 26. Grafički prikaz degradacije ukupnih flavonoida u kakao prahu tokom čuvanja

Temperatura zagrevanja značajno utiče na degradaciju flavonoida. Brzina degradacije je data kao zavisnost ln(c/c0) od vremena zagrevanja (slika 27) i reakcija sledi kinetiku prvog reda. Visoke vrednosti koeficijenta korelacije, R2, potvrđuju ovu tvrdnju (tabela 6). Sa slike se može videti da degradacija raste sa povećanjem temperature i vremena zagrevanja. Takođe, degradacija flavonoida je mnogo brža na višim temperaturama. Tako, zagrevanje uzorka na 95oC u toku 20-25 minuta dovodi do degradcije flavonoida za oko 13%, a na 125oC za oko 44%. Dobijeni rezultati su u skladu sa literarnim podacima (Kyi i sar., 2005). Vreme poluraspada ukupnih flavonoida kreće se od 3,4 h do 0,4 h za uzorak kakao praha koji je zagrevan na temperaturama od 95oC do 125oC.

42

0 50 100-0.8

-0.7

-0.6

-0.5

-0.4

-0.3

-0.2

-0.1

0.0

950C1000C1100C1250C

ln(c

/c0)

Vreme (min)

Slika 27. Degradacija ukupnih flavonoida u uzorcima kakao praha tokom zagrevanja

Linearna zavisnost potvrđuje da je reakcija degradacije flavonoida u uzorku kakao praha prvog reda (slika 26 i 27). U ovom slučaju reakcija prvog reda data je jednačinom (1) (Kirca i Cemerogul, 2003; Harbourne i sar., 2008): )exp(0 tkcc ⋅−⋅= (1) gde je:

c - koncentracija ukupnih flavonoida nakon vremena t (mg/g),

0c - početna koncentracija ukupnih flavonoida (mg/g), t - vreme trajanja reakcije (min), k - degradaciona konstanta reakcije prvog reda (min-1).

Vreme poluraspada ( 2/1t ) flavonoida je vreme potrebno da se početna koncentacije ukupnih

flavonoida smanji na polovinu i izračunava se prema jednačini (2):

kkt /693.0/)5.0ln(2/1 =−= (2)

Iz izraza (2) može se videti da je poluvreme reakcije prvog reda 2/1t u obrnutoj proporcionalnosti sa konstantom brzine k i da ne zavisi od koncentracije učesnika reakcije.

43

Zavisnost konstane brzine degradacije od temperature data je Arenijusovom jednačinom:

RTEaekk /

0−×= (3)

gde je:

0k - predeksponencijalni faktor (s-1),

aE - energija aktivacije (kJ/mol), R - univerzalna gasna konstanta (8,314 J/molK) T - apsolutna temperatura (K).

Zavisnost logaritma konstante brzine od temperature čuvanja i zagrevanja grafički je prikazana na slikama 28 i 29.

0.0032 0.0033 0.0034 0.0035 0.0036 0.0037

-6.5

-6.0

-5.5

-5.0

-4.5

-4.0

lnk

1/T (K_1)

Slika 28. Zavisnost logaritma konstante brzine degradacije ukupnih flavonoida od temperature

čuvanja

44

0.0024 0.0025 0.0026 0.0027 0.0028 0.0029

-6.0

-5.5

-5.0

-4.5

-4.0

-3.5

lnk

1/T (K-1)

Slika 29. Zavisnost logaritma konstante brzine degradacije ukupnih flavonoida od temperature zagrevanja

Izračunata vrednost energije aktivacije za reakciju degradacije flavonoida tokom čuvanja je 121,3 kJ/mol, a tokom zagrevanja 144,2 kJ/mol. Visoka vrednost energije aktivacije ukazuje da temperatura ima veliki uticaj na degradacija katehina i procijanidina, kao i na antocijane. Zbog toga je potrebno voditi računa o temperaturi tokom čuvanja i zagrevanja. Dobijeni rezultati su u skladu sa literarnim podacima (Wollgast i Anklam, 2000; Patras i sar., 2010). Generalno, temperatura i vreme trajanja zagrevanja imaju veliki uticaj na stabilnost polifenola.

45

5. ZAKLJUČAK

46

U ovom radu je ispitana degradacija katehina ((-)-epikatehina i (+)-katehina) i procijanidina (B1, B2, B3 i B4), kao i ukupnih flavonoida u uzorcima kakao praha tokom čuvanja i zagrevanja.

Dobijeni rezultati pokazuju da brzina degradacije prati kinetiku reakcija prvog reda. Nestabilniji

od ispitvanih katehina je (-)-epikatehin, a od procijanidina, procijanidini B3 i B4. Energije aktivacije degradacije ukupnih flavonoida tokom čuvanja i zagrevanja kretale su se od 121,3 kJ/mol do 144,2 kJ/mol. Zavisnost konstante brzine ( k ) od energije aktivacije ( aE ) data je Arenijusovom jednačinom.

Povećanjem temperature zagrevanja od 95ºC na 125ºC, konstanta brzine reakcije ( k ) se

povećala oko 9 puta, tj. od 3,4×10-3 min-1 do 29,1×10-3 min-1. Dobijeni rezultati su takođe pokazali da je vreme poluraspada ( 2/1t ) ukupnih flavonoida tokom

čuvanja u intervalu od 6,1 h na 4ºC do 0,9 h na 35ºC, a tokom zagrevanja od 3,4 h na 95ºC do 0,4 h na 125ºC.

Flavonoidi u uzorcima kakao praha se tokom zagrevanja i povećanja temperature veoma brzo raspadaju. Na osnovu toga, može se reći da se veća stabilnost flavonoida postiže ukoliko zagrevanje traje kraće i vrši se na nižim temperaturama, što treba uzeti u obzir tokom pravljenja kakao napitka od kakao praha.

47

6. LITERATURA

48

Adamson G.E., Lazarus S.A., Mitchell A.E., Prior R.L., Cao G., Jacobs P.H., Kremers B.G., Hammersone J.F., Rucker R.B, Ritter K.A. Schmitz H.H., HPLC method for the quantification of procyanidins in cocoa and chocolate samples and correlation to total antioxidant capacity, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 47, 4184-4188, 1999.

Ananingsih V.K., Sharma A., Zhou W., Green tea catechins during food processing and storage: A review on stability and detection, Food Research International, 50, 469-479, 2013.

Balzer J., Rassaf T., Heiss C., Kleinbongard P., Lauer T., Merx M., Heussen N., Gross H.B., Keen C.L., Schroeter H., Kelm M., Sustained benefits in vascular function through flavanol-containing cocoa in medicated diabetic patients : A double-masked, randomized, controlled trial, Journal of the American College of Cardiology, 51, 2141–2149, 2008.

Bazinet L., Araya-Farias M., Doyen A., Trudel D., Tetu B., Effect of process unit operation and long-term storage on catechin contents in EEGCG-enriched tea drink, Food Research Inrenational, 43, 1692-1701, 2010.

Buckow R., Kastell A., Terefe N.S., Versteeg C., Pressure and temperature effects on degradation kinetics and storage stability of total anthocyanins in blueberry juice, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 58, 10076-10084, 2010.

Castillo-Sáncheza J.X., García-Falcónc M.S., Garridob J., Martínez-Carballoc E., Martins-Diasa L.R., Mejutoc X.C., Phenolic compounds and colour stability of Vinhão wines: Influence of wine-making protocol and fining agents, Food Chemistry, 106, 18-26, 2008.

Cooper K.A., Campos-Gimenez E., Alvarez D.J., Nagy K., Donovan J.L., Williamson G., Rapid reversed phase ultra-performance liquid chromatography analysis of the major coca polyphenols and inter-relationship of their concentrations in chocolate, Journal of Agricultural Food Chemistry, 55, 2841-2847, 2007.

Cooper K.A., Donovan J.L., Waterhouse A.L., Williamson G., Cocoa and health: A decade of research, British Journal of Nutrition, 99, 1-11, 2008.

Ćujić N., Kundaković T., Šavikin K., Antocijani- hemijska analiza i biološka aktivnost, Lekovite sirovine, 33, 19-37, 2013.

Ding E.L., Hutfless S.M., Ding X., Girotra S., Chocolate and prevention of cardiovascular disease, a systematic review, Mutrition and Metabolism, 3, 1-12, 2006.

Gancel A. L., Feneuil A., Acosta O., Perez A., M., Villant F., Impact of industrial processing and storage on major polyphenols and the antioxidant capacity of tropical highland blackberry (Rubin adenotrchus), Food Research International, 44, 2243-2251, 2011.

García-Falcón M.S., Pérez-Lamela C., Martínez-Carballo E., Simal-Gándara J., Determination of phenolic compounds in wines: Influence of bottle storage of young red wines on their evolution, Food Chemistry, 105, 248–259, 2007.

49

Gu L., House S.E., Wu X., Ou B., Prior R.L., Procyanidin and catechin contents and antioxidant capacity of coca and chocolate products, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54, 4057-4061, 2006.

Harbourne N., Jacquier J.C., Morgan D.J., Lyng J.G., Detremination of the degradation kinetics of anthocyanins in a model juice system using isothermal and non-isothermal methods, Food Chemistry, 111, 204-208, 2008.

Hii C.L., Law C.L., Suzannah S., Cloke M., Cloke M., Polyphenols in cocoa (Theobroma cacao L.), Asian Journal of Food and Agro-Industry, 2, 702-722, 2009.

http://www.biodar.hr/sirovi-kakao.html

http://www.chocoline.rs/node/293

http://www.cokolada.co.rs/o-cokoladi/o-kakao-zrnu.20.html

http://www.seeds-gallery.com/sr/kakao-seme.html

Kealey K.S., Snyder R.M., Romanczyk L.J., Geyer H.M., Myers M.E., Withcare E.J., Hammerstone J.F., Schmitz H.H., Cocoa components, edible products having enhanced polyphenol content, methods of making same and medical uses, Patent Cooperation Treaty (PCT) WO 98/09533, Mars Incorporated, USA, 1998.

Kirca A., Cemeroglu B., Degradation kinetics of anthocyanins in blood orange juice and concentrate, Food Chemistry, 81, 583-587, 2003.

Kyi T.M., Daud W.R.W., Mohammad A.B., Samsudin M.W., Kadhum A.A.H., Talib M.Z.M., The kinetics of polyphenol degradation during the drying of Malaysian cocoa beans, International Journal of Food Science and Technology, 40, 323–331, 2005.

Manach C., Scalbert A., Morand C., Rémésy C., Jiménez L., Polyphenols: food sources and bioavailability, American Society for Clinical Nutrition, 79, 727-747, 2004.

Markakis P., Anthocyanins as Food Colors, Academic Press, New York, 1982.

Mehrinfar R., Frishman W.H., Flavanol-rich cocoa: A cardioprotective nutriceutical, Cardiology in Review, 16, 109-115, 2008.

Miller, J.N., Miller, J.C., Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry, Pearson Education Limited, London, England, 2005.

Mitić M., Kinetika degradacije fenolnih jedinjenja hidroksil radikalima, Doktorska disertacija, Prirodno-matematički fakultet, Niš, 2011.

Patras A., Brunton N.P., O' Donnell C., Tiwari B.K., Effect of thermal processing on anthocyanin stability in foods; mechanisms and kinetics of degradation, Trends in Food Science & Technology, 21, 3-11, 2010.

50

Porter L.J., Ma A., Chan B.G., Cacao procyanidins: major flavonoids and identification of some min or metabolics, Phytochemistry, 30, 1657-1663, 1991.

Procházková D., Boušová I., Wilhelmová N., Antioxidant and prooxidant properties of flavonoids, Fitoterapia, 82, 513–523, 2011.

Rios L.Y., Bennett R.N., Lazarus S.A., Rémésy C., Scalbert A., Williamson G., Cocoa procyanidins are stable during gastric transit in humans, American Society for Clinical Nutrition, 76, 1106-1110, 2002.

Schroeter H., Heiss C., Balzer J., Kleinbongard P., Keen C.L., Hollenberg N.K., Sies H., Kwik-Uribe C., Schmitz H.H., Kelm M., (-)-Epicatechin mediates beneficial effects of flavanol-rich cocoa on vascular function in humans, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 103, 1024-1029, 2006.

Shahidi F., Naczk M., Phenolics in food and nutraceuticals, CRC Press, Boca Raton, FL., 2004.

Steinberg F.M., Bearden M.M., Keen C.L., Cocoa and chocolate flavonoids: Implications for cardiovascular health, Journal of The American Dietetic Association, 103, 215-223, 2003.

Tapas A.R., Sakarkar D.M., Kakde R.B., Flavonoids as Nutraceuticals: A Review, Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 7, 1089-1099, 2008.

Todorović M., Đorđević P., Antonijević V., Optičke metode instrumentalne analize, Hemijski fakultet, Beograd, 2007.

Waterhouse A.L., Laurie V.F., Oxidation of wine phenolics: A critical evaluation and hypotheses, American Journal of Enology and Viticulture, 57, 306-313, 2006.

Wollgast J., Anklam E., Review on polyphenols in Theobroma cacao: changes in composition during the manufacture of chocolate and methodology for identification and quantification, Food Research International, 33, 423-447, 2000.

Yang J., Meyers K.J., Van der Heide J., Liu R.H., Varietal differences in phenol content and antioxidant and antiproliferative activities of onions, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52, 6787-6793, 2004.

Yilmaz Y., Novel uses of catechins in foods, Trends in Food Science and Technology, 17, 64-71, 2006.

Zhishen J., Mengcheng T., Wu Jianming W., The determination of flavonoids content in mulberry and scavenging effect on superoxide radicals, Food Chemistry, 64, 555-559, 1999.

Zhu Q.Y., Zhang A., Tsang D., Huang Y., Chen Z.Y., Stability of green tea catechins, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 45, 4624-4628, 1997.