USO DE ANTICORPOS

NA PESQUISA

Figure 1-3

Células da Resposta

Imunológica e sua

Formação na

Medula Óssea

Generation of an antibody:

antigen processing

B cell activation

Descoberta dos Anticorpos

• 1899 Jules Bordet, Complement and antibody activity in bacteriolysis

• 1900 Paul Erlich, Antibody formation theory

• 1926 Lloyd Felton & GH Bailey, Isolation of pure antibody preparation

• 1934-8 John Marrack, Antigen-antibody binding hypothesis

• 1941 Albert Coons, Immunofluorescence technique

• 1948 Astrid Fagraeus, Demonstration of antibody production in plasma B cells

• 1959-62 Rodney Porter et al., Discovery of antibody structure

• 1963 Jaques Oudin et al., Antibody idiotypes

• 1964-8 Anthony Davis et al., T and B cell cooperation in immune response

• 1965 Thomas Tomasi et al., Secretory immunoglobulin antibodies

• 1975 Kohler and Milstein, Monoclonal antibodies used in genetic analysis

• 1985 Tonegawa, Hood et al., Identification of immunoglobulin genes

Estrutura básica de uma molécula de anticorpo

A cadeia pesada possui uma região rica em determinados

aminoácidos, a qual confere maleabilidade à estrutura do

anticorpo, denominada região da dobradiça

Classes de Imunoglobulinas

Humanas-determinada pela

cadeia pesada

• IgG - Cadeia Pesada Gama ()

• IgM - Cadeia Pesada Mu ()

• IgA - Cadeia Pesada Alfa ()

• IgD - Cadeia Pesada Delta ()

• IgE - Cadeia Pesada Epsilon ()

Imunoglobulinas Humanas- Tipos

de Cadeias leves

• Kappa ()

• Lambda ()

Os anticorpos são classificados de acordo

com o tipo de cadeia pesada que apresentam

(Isotipos):

γ – IgG (subclasses IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4)

δ – IgD

ε – IgE

α – IgA (Subclasses IgA1 e IgA2)

μ - IgM

Classes of antibodiesIsotype Structure Placenta

transfert

Activates

complementAdditional features

IgMNo Yes First Ab in development and response

IgDNo No B-cell receptor

IgGYes Yes Involved in opsonization and ADCC.

Four subclasses; IgG1, IgG2, IgG3,

IgG4

IgENo No Involved in allergic responses

IgANo No Two subclasses; IgA1, IgA2. Also found

as dimer (sIgA) in secretions.

Imunoglobulinas e Anticorpos

Frações Fab e Fc

As cadeias leves e pesadas possuem duas regiões

distintas, classificadas de acordo com sua seqüência

de aminoácidos: a região constante e a região variável

Nas regiões variáveis, podemos identificar partes denominadas

regiões hipervariáveis, ou mesmo CDRs (Regiões Determinantes

de Complementariedade), que são estruturas que entram em contato

íntimo com o antígeno para o qual o anticorpo é específico

Ligação do Antígeno ao Anticorpo

As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves são mostradas em azul e amarelo.

As cadeias em vermelho compõem o sítio de ligação,

evidenciando os resíduos de aminoácidos, nas regiões determinantes de

complementariedade (CDR), que fazem contato com o antígeno.

Neutralização, Opsonização e Ativação do Complemento

Isotipos, Alotipos e Idiotipos

Características dos Isotipos de Anticorpos:

Estrutura dos Isotipos de Anticorpos:

Os diferentes isotipos de Acs apresentam estruturas variadas

IgM- Neutralizam toxinas

- Fixam o complemento

-Receptor de antígenos na superfície dos Linf. B

-Marcador de fase aguda de doenças infecciosas

IgG- Quatro subclasses: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4

- neutralizam toxinas (todos)

- fazem opsonização (IgG1 e IgG3)

- fixam complemento (IgG1, IgG2 e IgG3)

- são os únicos que podem atravessar a placenta (IgG2)

IgA- neutralizam toxinas

- bloqueiam a ligação de antígenos nas mucosas

-Apresentam-se na forma dimérica ou trimérica

IgE-Levam a degranulação de mastócitos e basófilos.

-Participam da imunidade contra helmintos

IgD-Receptor de antígenos na superfície dos linf. B

Antibody and VDJ recombination

Antígeno

-Toda molécula reconhecida como estranha pelo

organismo – interage com Ac e TCR

-Epitopo – menor fração de um antígeno capaz de ser

reconhecida por anticorpos ou se ligar a TCRs.

-Antigenicidade: capacidade de um antígeno de ser

reconhecido pelo sistema imunológico

-Imunogenicidade: capacidade do antígeno de ativar

uma resposta imunológica

Antígeno

Qualquer molécula biológica é potencialmente

um antígeno! Self e Non-Self!

Anticorpos podem se ligar a toda e qualquer

espécie de molécula biológica!

TCRs se ligam somente a peptídeos

processados e apresentados por APCs!

Determinantes Antigênicos

A estrutura íntegra do antígeno é primordial

para seu reconhecimento ideal

FORÇAS DE INTERAÇÃO AG-AC

Diversos tipos de ligações químicas podem estar envolvidas

ao mesmo tempo na ligação Ag-Ac

Ligação do Antígeno ao Anticorpo

A ligação entre Ag e Ac é resultado da conformação do Ag e

do Fab do Ac e das interações químicas entre eles

Complexo Ag-AC

A quantidade de um antígeno e de um anticorpo em uma

solução é fundamental para a formação de complexos Ag-Ac

Valência, Avidez e Afinidade

Afinidade – representa a força da ligação entre o Ag e o Ac (único epítopo)

Avidez – representa o somatório de todas essas forças (soma das afinidades de

todos os epítopos)

Commercial production of antibodies:

polyclonal vs monoclonal• Host animals ca be used to raise

antibodies against a given

antigen

• Selected clones from a polyclonal each recognizing

a single epitope can be fused to a tumor cell

(hybridoma) to proliferate indefinitely

Physiological roles of antibodies

• Protect against– Viral infections

– Bacterial infections

– Foreign bodies

• Antigens

• Deleterious in– Autoimmune diseases

• Reumathoid arthritis Lupus

• Type 1 diabetes Crohn’ disease

– Graft rejection and hypersensitivity

responses

Clinical use of antibodies

• Diagnostic

– Detection of peptides and other molecules in various diseases

• Endocrine diseases: hyperinsulinemia, diabetes, hyperparatyroidism

• Tumor antigens (p53 tumor suppressor, PSA, -foetoprotein)

• Antibodies against viral proteins (AIDS, hepatitis)

• Therapeutic

– Neutralizing antibodies

• Anti-ErbB2 for breast and ovarian cancer

• Anti-CD20 for B-cell non-Hodgkin's lymphoma

• Antisera and antidotes (viruses and venoms)

• Autoimmune antibodies, cytokines TNF-

Reatividade cruzada

Dois Ag diferentes apresentam um epítopo idêntico

Ac específicos para um epítopo se ligam a um epítopo não relacionado, mas com propriedades químicas similares.

Cross reactivity

Metodologias que utilizam anticorpos

Não marcados

• Reação de precipitação

• Reação de aglutinação

Marcados

• RIA

• ELISA

• Imunohistoquímica

• Imunofluorescência

• Western Blot

• Citometria

Anticorpos não marcados

Detectam / quantificam as conseqüências da ligação Ag – Ac

Interação: ac - ag solúvel forma uma

rede que pode desenvolver um

precipitado visível.

Anticorpos bivalentes

+

Antígenos multivalentes

Reação de Precipitação

PRECIPITADO

Reação de precipitação em soluções

TÉCNICAS DE PRECIPITAÇÃO EM GEL

IMUNODIFUSÃO

• Coloca-se agarose sobre uma lâmina:

Imunodifusão Dupla:

• Faz-se em seguida, pequenos orifícios no gel e são adicionadas as

soluções testes de Ag e Ac, como por exemplo, é mostrado abaixo:

Ac

IMUNODIFUSÃO DUPLA

Ac

Ag Ag

Ac

Ag Ag

49

Ac

Ag Ag

Utilização: muito usada em

pesquisa e diagnóstico de

algumas doenças, como

cisticercose

As soluções sofrem difusão e, quando o Ag e o Ac seencontram em zona de equivalência, se observa a reação pelaformação de uma linha de precipitação:

Pode ser visualizada pós lavagem do gel, para remoção dasproteínas solúveis, por coloração dos arcos de precipitação comcorante

Permite a quantificação doantígeno ou do anticorpo.

O processo continua até seratingida a zona de equivalência,com os complexos precipitando-se em um anel (halo) em tornodo orifício.

IMUNODIFUSÃO RADIAL

Poços onde são

colocados padrões

e amostras a serem

dosadosAgarose

contendo

anticorpos

anti-IgG humana

Halo de precipitação

IgG – anti-IgG

Utilização: dosagem

de IgG, IgA e IgM e

proteínas séricas.

Pode-se fazer comparação de misturas complexas de Ag que são separados em gel de agarose, pela aplicação de uma corrente elétrica.

As moléculas migram para o pólo negativo, distribuindo-se no gel de acordo com os seus PM e cargas elétricas.

Uma canaleta é recortada entre os poços e preenchida com Ac, que se difunde.

Ag e Ac formam arcos de precipitação.

IMUNOELETROFORESE

51

+ -

Ag

Ag

1- Separação de antígenos 2- Anti-soro na coluna

canaleta

2- Anti-soro na canaleta

canaleta

3- Difusão e precipitação

Reações de Aglutinação

Ac + Ag particulado

aglutininas

Agregação visível de partículas

Eritrócitos

Bactérias

Fungos

látex

53

2) Reagente (anticorpo anti A, B):

AGLUTINAÇÃO DIRETA

1) Amostra de sangue na placa teste:

Exemplo: tipagem sanguínea em lâminas (sistema ABO)

Células ou partículas insolúveis + Ac = Aglutinação

54

3) Controle negativo:

4) Mistura-se:

AGLUTINAÇÃO DIRETA

55

5) Leitura do resultado:

Um resultado positivo é indicado por uma aglutinação

visível (aglomeração dos eritrócitos na placa teste), como

ilustrado acima.

negativo positivo

AGLUTINAÇÃO DIRETA

AGLUTINAÇÃO INDIRETA (PASSIVA)

Exemplo: Hemaglutinação Passiva para a Doença de

Chagas:

• As hemácias são revestidas com Ag do T. cruzi (ligação

covalente) e então distribuídas nos poços da placa.

• O soro teste e os controles positivos e negativos,

devidamente diluídos, são adicionados aos poços da

referida placa.

• Se houver Ac específico contra o Ag, as hemácias se

aglutinam e formam uma camada no fundo do poço.

Quando não existe Ac específico, as células formam um

botão no fundo do poço.Aglutinação Positiva

Negativa

Ag solúveis associados a outras superfícies

(Partículas de látex ou superfície de hemácias)

Anticorpos Marcados

Detectam / quantificam diretamente a ligação Ag - Ac

Técnicas Imunohistológicas

• São técnicas que utilizam

anticorpos específicos para

identificar constituintes teciduais e

celulares (antígenos) intra ou

extracelulares in situ.

TÉCNICAS IMUNOHISTOLÓGICAS

CORTES

CONGELADOS

CORTES

PARAFINADOS

SUSPENÇÃO

CELULAR

Diagnóstico

rápido

Fixação rápida

Aplicação direta

dos anticorpos

Preservação da morfologia

Controle do tempo de

fixação

Exige tratamento prévio:

desparafinização e

hidratação

Resultados

rápidos

Exige

permeabilização

TÉCNICAS IMUNO-HISTOLÓGICAS

MICROSCOPIA

ELETRÔNICA

Preservação da morfologia

Uso de anticorpos

conjugados a partículas de

ouro coloidal

Método direto

O anticorpo primário é conjugado à molécula marcadora.

Método indireto

O anticorpo primário não é marcado. Um segundo anticorpo,

dirigido ao primário é conjugado a uma molécula marcadora.

Tipos de marcadores:

Fluoróforos

Enzimas

Ouro coloidal

Radioisótopos

Biotina

Técnicas Imunohistológicas

Técnicas Imunohistoquímicas: os anticorpos

são conjugados a enzimas.

Técnicas Imunofluorescentes: os anticorpos

são conjugados a fluorocromos.

• Material parafinado • Material congelado

1) Desparafinização e hidratação

2) Revelação antigênica

3) Bloqueio

4) Anticorpo primário

5) Lavagem

6) Anticorpo secundário

7) Lavagem

8) Revelação da ligação ag/ac

9) Coloração

10) Montagem

Recuperação antigênica

• Procedimento no qual as ligações

aldeídicas do fixador com o tecido são

rompidas, expondo o antígeno à reação

com o anticorpo.

Recuperação antigênica

Físico

Calor

Químico

Tripsina

Pronase

Pepsina

Quimiotripsina

Proteinase K

Recuperação antigênica através de calor

Solução pH

Ácido clorídrico 2N 1.0

Ácido fórmico 10% 2.0

Tampão citrato 6.0

Tampão citrato-EDTA 6.2

EDTA 8.0

Tampão Tris-EDTA 9.0

TBS 9.0

Fatores que influenciam

• Condições do tecido

• Tempo de fixação

• Temperatura X tempo

• pH

• Sais metais

Recuperação antigênica pelo calor

Bloqueio

Ligações inespecíficas

• Sítios Fc

• Carga elétrica do tecido

• Enzimas endógenas

• Peroxidase

• Fosfatase alcalina

• Biotina

Tampões

• Soluções diluentes de anticorpos

• Solução de lavagem

• O pH ajuda na ligação antígeno/anticorpo

• Os mais utilizados são PBS (Phosphate

Buffered Saline) e TBS (Tris Buffered

Saline)

Titulação

AC 1ario/

AC 2ario

1:200 1:400 1:800 1:1000

1: 300 +++ ++ +/- -

1:500 +++ +++ ++ -

1:1000 ++++ +++ ++ +

1:2000 ++ + - -

Fluorocromos (1)

• Isotiocianato de Fluoresceína – excitação 495nm

e emissão 520nm

• Rodamina e derivados:

Isotiocianato de tetrarodamina (TRITC)-excitação 554nm e emissão 576nm.

Texas Red sulfonyl chloride - excitação

592nm e emissão 610nm.

• Ficoeritrina:

R-Ficoeritrina - excitação 480 nm, 565nm e

emissão 578nm.

B-Ficoeritrina - excitação 546nm, 565nm e

emissão 575nm.

Fluorocromos (2)

• AMCA (7-amino-4-methyl-coumarin-3-

acetic-acid) - excitação 347nm e emissão

445nm.

• Cyanines:

• Cy3.18 - excitação 554nm e emissão 565nm.

• Cy5.18 - excitação 649nm e emissão 667nm.

• BODIPY (4,4-difluora-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diazaindacene-3-propionic acid) - excitação 503nm e emissão 511nm.

Fluorocromos (3)

• Cascade Blue (Pyrenyloxytrisulfonic acid) -excitação 376nm, 399nm e emissão 423nm.

• Lucifer Yellow - excitação 428nm e emissão 533nm.

• Quantum Red (Cy5+R-Ficoeritrina) - excitação

488nm e emissão 670nm.

Laser usado para excitação Corantes recomendados Cor da fluorescência emitida

Diodo -405nm DAPI, Alexa Fluor 405, calcofluor

white azul

Argônio-458nm CFPciano

Argônio- 488nm FITC, Alexa Fluor 488, GFP,

EGFP, Acridine Orange, DIO, Cy 2,

Oregon Green

verde

Argônio- 514nm YFP, EYFPamarelo

HeNe- 543nm Alexa Flruor 543, Cy 3laranja

HeNe- 633 Alexa Fluor 633, 647, Cy5vermelho

Principais contra-corantes para

imunofluorescência

• Pontamine sky blue (Cowen et al. 1985)

• Azul de Evans

• Methyl green (Schenk & Churukian, 1974)

• DAPI

Visualizando a reação antígeno anticorpo

Marcadores fluorescentes:

Vantagens:

• Visibilidade imediata.

• Pode ser usado sobrecortes congelados,parafinados e suspensãode células.

• Pode ser contrastadocom fundo escuro.

• Pode-se marcar dois ou mais antígenos diferentes.

Desvantagens:

• Microscópio especial, preferencialmente com epi-iluminação.

• Diferentes filtros para os diferentes marcadores fluorescentes.

• As preparações não são permanentes.

• A fluorescência tende a diminuir (fade), em virtude da exposição à luz de excitação.

• Autofluorescência

http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/fluorescence/gallery/cells/header/3t3headerlarge.html

Enzimas

• Peroxidase (Avrameas & Uriel, 1966; Nakane

& Pierce, 1966)

• Fosfatase alcalina (Mason & Sammons, 1978)

• B Galactosidase (Bondi et al., 1982)

• Glucose oxidase (Suffin et al., 1979)

Ação enzimática

Enzima + Substrato

Enzima/Substrato + Cromógeno (DAB)

(Cromógeno doador de elétrons)

Enzima + Produto colorido

(DAB oxidado)

Principais cromógenos da peroxidase

• Diaminobenzidina (DAB): marrom

• 3-Amino-9-ethilcarbazole (AEC): vermelho

• 4-chloro-1-naphtol: azul cinzento

• Phenol tetrazolium: Azul escuro

Cromógenos da Fosfatase Alcalina:

Substrato Naphtol

phosphate:

• Fast Blue BB salt

• Fast Red TR salt

Substrato BCIP

(método Indoxyl):

• Tetra nitro blue

tetrazolium (TNBT)

Produtos finais insolúveis:

Azul

Vermelho

Azul escuro/púrpura

Marcadores enzimáticos:

• Glucose Oxidase

• -D- galactosidase

- Preparação permanente

com produto final azul

escuro

- Preparação permanente

com produto final azul

turquesa

Visualizando a reação antígeno-anticorpo

Marcadores enzimáticos:

Vantagens:

• É possível formar preparações permanentes ou mais estáveis que a imunofluorescência.

• Formam produtos coloridos, facilmente visíveis ao microscópio óptico.

• Podem ser usados em qualquer tipo de preparação tecidual.

Desvantagens:

• Enzimas endógenas do

mesmo tipo do marcador

devem ser inibidas.

• Alguns produtos finais

da reação enzimática

com seu substrato são

solúveis em solventes

alcoólicos e agentes

clarificadores.

LN-CD20

Método Avidina Biotina

Método Avidina - Biotina:

A Biotina é uma vitamina solúvel em água, de baixopeso molecular (244dal), presente na gema do ovoe em uma variedade de tecidos animais e vegetais.Sua simples estrutura permite que ela encaixe emum dos sítios da avidina.

A Avidina é uma glicoproteína (P.M. 67kdal) presentena clara de ovo, que consiste em quatrosubunidades, cada qual, representada por umasimples cadeia polipeptídica com 128 resíduos deaminoácidos. Em cada uma dessas subunidades háuma região hidrofóbica que tem alta afinidade pelaBiotina. Esta molécula pode ligar-se a diferentesmarcadores (fluorocromos, enzimas, ouro coloidal eferritina).

Método Avidina - Biotina:

Desvantagens:

1) Os resíduos oligossacarídicos da Avidina nãoafetam a ligação com a Biotina, porém podemreagir com proteínas endógenas como as lectinas.

2) O ponto isoelétrico da Avidina no pH usualmenteneutro dos procedimentos imunohistológicos,fazem com que essa proteína ligue-se acomponentes teciduais carregados negativamente,como por exemplo, membrana e o núcleo.

3) Alguns tecidos, como fígado e rim, são ricos emBiotina, podendo produzir reações inespecíficas.

Estreptavidina:

É uma proteína (P.M.60kdal) extraída dabactéria Streptomyces avidinii, quesemelhante à Avidina, apresenta quatrosítios de ligação de alta afinidade paraBiotina. A diminuição dos resíduosoligossacarídicos e o ponto isoelétriconeutro da estreptavidina, previnem asligações inespecíficas.

Adesivos de lâminas

• Gelatina

• Cascolar

• Poly-L-lysine

• Aminopropyltrietoxysilane

• Vectabond

Tampões:

• Utilizados como tampão de lavagem ediluente de anticorpos e outras soluções.

• O pH do tampão pode estabilizar a ligaçãoantígeno-anticorpo.

• Soluções tampões utilizadas mais utilizadas:PBS e TBS. A) PBS (tampão salina fosfato)0.01M, pH 7.0-7.4. B)TBS/HCl 0.01M comNaCl a 0,9% (tampão Tris salina), pH 7.6

Revelação antigênica

Métodos químicos

• Digestão enzimática:

tripsina

pepsina

Métodos físicos

• Banho-maria

• Panela de cozimento a

vapor

• Autoclave

• Panela de pressão

• Microondas

• Ultrasom

Soluções tampões empregadas na

recuperação antigênica

• Tampão citrato de sódio pH 6.0

• Tampão Tris/HCL pH 8.0

• EDTA

• EGTA

Principais causas de marcações

inespecíficas

• Cargas positivas de componentes teciduais

• Receptores Fc

• Reações cruzadas

• Presença de enzimas endógenas

• Autofluorescência

Intensificando a visualização da

reação antígeno-anticorpo

Consiste em aumentar o número demoléculas marcadoras no sítio deligação do antígeno com o anticorpo

ou

Intensificar a cor do produto finaldas enzimas sobre os substratos ecromógenos.

Intensificação do produto final da

reação Peroxidase/DAB/H2O2

1) Durante a reação da Peroxidase:

Adição de metais pesados (cobre e níquel) na

solução reveladora – azul escuro a preto

Imidazole – marrom escuro

2) Após a reação da Peroxidase:

Sulfato de cobre – marrom escuro

Cloreto de Ouro – preto

Sais de prata

Múltipla marcação

Consiste em identificar diferentes

antígenos em uma mesma amostra:

1) Método direto com diferentes marcadores.

2) Método Indireto com eluição

3) Método Indireto sem eluição

Ligações inespecíficas

1) Fazer testes de titulação de todos os reagentes.

2) Checar os controles negativos, verificando a atividade dos anrticorpos

secundários e terciários.

3) Fatores do tecido (sítios de ligação não específicas, receptores Fc,

proteínas básicas):

(i) aumentar a concentração da proteína/soro na solução de bloqueio.

(ii) adicionar detergente ao tampão de lavagem (Tween 20 a 2,5%).

(iii) aumentar a concentração de cloreto de sódio no diluente do

anticorpo.

(iv) aumentar o pH para 9.0.

(v) usar anticorpos Fab quando houver interferência dos receptores Fc.

(vi) Adicionar 2mg de poli-L-lysina (P.M. 3000-6000) a cada ml de

anticorpo diluído.

Ligações inespecíficas

4) Biotina endógena (Método ABC):

(i) bloquear a biotina endógena.

(ii) usar outro método de revelação

5) Avidina liga-se à mastócitos e outros sítios por carga elétrica:

(i) aumentar o pH para 9.0

(ii) usar avidina modificada ou estreptavidina

6) Bloqueio incompleto da peroxidase endógena:

(i) aumentar o tempo e a concentração do peróxido de hidrogênio.

(ii) usar outro marcador enzimático.

7) Reações cruzadas entre o anticorpo secundário e imunoglobulinas do tecido:

(i) absorver os anticorpos que fazem reação cruzada com soro normal ou imunoglobulinas da mesma espécie do tecido.

(ii) usar anticorpos espécie específicos.

Reações fracas ou ausentes

1) A sensibilidade do método é insuficiente para a pequena quantidade de

antígeno presente:

(i) intensificar a visualização do produto final na imunohistoquímica

ou aumentar o número de marcadoresna reação antígeno-anticorpo.

2) O antígeno está oculto pelo longo período de fixação:

(i) testar o método de revelação antigênica mais apropriado.

3) Deterioração dos anticorpos:

(i) Checar os anticorpos primários em controles positivos.

(ii) Checar os reagentes secundários e terciários com um anticorpo

primário conhecido.

Controles:1) Controle negativo: Serve para confirmar a

especificidade da reação.

(i) Sobre o tecido a ser testado:

Faz-se substituindo o anticorpo primário, secundárioe terciário por soro não imune ou pelo diluente.

(ii) Sobre um tecido que não tenha o antígeno procurado:

Neste caso, faz-se o método inteiro sem substituições.

2) Controle positivo: Têm por objetivo confirmar ascondições de trabalho, tais como, diluições, ordem corretade aplicação dos reagentes, reatividade dos anticorposprimários.

Titulação dos anticorpos

AC 1ário

AC 2ário

1:50 1:100 1:200 1:400

1:150 +++++ ++++ +++ ++

1:300 +++ +++ +++ ++

1:600 +++ ++ ++ +

Dupla marcação

Anticorpos primários de origens diferentes

Anticorpos primários de mesma origem

Método de Eluição

Anticorpos primários de mesma origem

Método de Eluição

Anticorpos primários de mesma origem

Método de Eluição

LSAB

Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima - ELISA

substrato

(incolor)

Qualitativos

Quantitativos Direto = Ag

Indireto = Ac

Ac marcados

com Enzimas + + = CORAg

Fosfatase alcalina

Peroxidase

B-galactosidase

ELISA Indireto

ELISA Direto ou Sanduíche

ELISA Competitivo

Aplicações do ELISA:

Testes de rotina em Laboratórios Clínicos e de Pesquisa

Vantagens:

Teste de alta sensibilidade

Permite quantificar Ag ou Ac das amostras

Seguros e de baixo custo

Citometria de Fluxo

Separação de células ativadas por fluorescência

Anticorpos contra moléculas de membrana ou

Antígenos do Conjunto de Diferenciação (CD)

Cada Ac é marcado com um fluorocromo diferente

Teste qualitativo e quantitativo

CD 4

CD 18

CD 125

CD 147

Tamanho

Granulosidade

Fluorescência

CD4

CD8

CD20

Aplicações:

Determinar o tipo e no de

céls. sanguíneas brancas

isolar populações celulares

distribuição de céls de acordo

com a densidade dos Ag

o tamanho celular.

Uso de múltiplos anticorpos fluorescentes

HIV , Leucemias

Amostras analisadas em citômetro de fluxo

Material

Sangue periférico, medula óssea, tumores sólidos

Métodos de obtenção de células

1. Gradiente de densidade

2. Lise de hemácias

3. Dissociação de células

Obtenção de amostras

SP

ou

MO

Ficoll Lavagem com

soro fisiológico

Meio de

cultura

1. Gradiente de densidade

Obtenção de amostras

• Linfócitos

• Monócitos

• BlastosCélulas mononucleares

2. Lise de hemácias

SP

ou

MO

100uL

amostra

Solução de

lise de hemáciasLavagem

Soro fisiológio Anticorpo

monoclonal

Todos os leucócitos

Obtenção de amostras

3. Dissociação de células

MCF7 câncer de mama

. Enzimático (tripsina)

. Mecânico

. Ambos

. Linhagens celulares aderentes

. Tumores sólidos

Obtenção de amostras

Aplicação

Marcação com anticorpo monoclonal

1. superfície

2. interna

3. indireta

4. direta

Tipos

1. Marcação de superfície

Aplicações:

Marcação de antígenos celulares de superfície

(membrana plasmática)

Exemplos:

• moléculas de adesão

• glicoproteínas

2. Marcação interna

• marcação de antígenos citoplasmáticos ou nucleares

Aplicações:

Exemplos:

• enzimas citoplasmáticas (kinases, fosfatases, caspases)

• marcação de proteínas nucleares ou de DNA

anticorpo primário puro 30’

• lavagem

• anticorpo secundário fluorescente 30’

• lavagem

• análise em citômetro de fluxo

São necessárias duas incubações

3. indireta

Desvantagens:

• Permite a utilização de apenas um anticorpo

• Risco de marcação inespecífica

4. Marcação direta

• anticorpo primário marcado com fluorocromo 30’

• lavagem

• análise em citômetro de fluxo

Vantagens:

Permite a utilização de mais de um anticorpo

• Minimiza o risco de marcação inespecífica

• Ideal para amostras com número reduzido de células

Imunofenotipagem

Princípio

Cada tipo celular tem um perfil de expressão de proteínas

• determinação da linhagem celular

• clonalidade

• grau de diferenciação celular

• monitoramento de evolução da doença

• detecção de doença residual

• quantificação de células

Características celulares x FACS = identificação celular

Imunofenotipagem

Exemplo 1

• diferença de granulosidade e tamanho

sangue periférico de um indivíduo saudável

FSC

Imunofenotipagem

Exemplo 2: expressão diferencial de antígenos

• linfócitos são iguais no tamanho e complexidade interna

• diferentes na função

FSC

Linfócitos T: helper (CD4)

citotóxico (CD8)

Podem ser do tipo T ou B

CD4 expressão diminuída

CD8 expressão aumentadaAIDS

• rapidez com que se obtém um resultado

• melhor aproveitamento da amostra (marcações duplas, triplas...)

• permite avaliação quantitativa (número de células positivas por

exemplo) e qualitativa (densidade antigênica)

• células mortas podem ser separadas das vivas

Citometria de fluxo

Vantagens:

Considerações finais

• preço do equipamento

• preço dos anticorpos

• não preserva a estrutura de um tecido celular

(dissociar as células)

• em alguns citômetros as células que passaram pelo

aparelho não podem ser reaproveitadas

Desvantagens

Aplicações

Pré requisitos para a utilização:

Laser x absorbância

Transmissão x filtros

• partículas entre 0.2 – 50 micrometros

• células dissociadas (tecido celular)

• em suspensão

• Marcadas ou não com fluorocromos

Poucas exigências = muitas possibilidades

WESTERN BLOTTING

• Eletroforese de

proteínas.

• Identifica

antígenos ou

anticorpos.

WESTERN BLOTTING

WESTERN BLOTTING

Radioimunoensaio RIA

• Hormônio

• proteínas séricas

• drogas

• vitaminas

• Ac

0,0001 microgramas/ mL

Moléculas marcadas com

ISÓTOPO

Marcações:

– I125: emite raios gama

– H3: raios beta

Aplicações:

Testes que necessitem de alta sensibilidade

Triagem vírus da hepatite B em doadores de sangue

Pesquisa

Desvantagem:

Não é um teste seguro!