USA - Bio-Rad Laboratories · 2018. 12. 12. · QXDx™ BCR-ABL %IS Kit Bruksanvisning 96 USA: 12006134 UNITED STATES, Bio‑Rad Laboratories, Inc., 5731 W. Las Positas Blvd., Pleasanton,

QXDx™ BCR-ABL %IS Kit

Bruksanvisning

96

USA:

12006134

UNITED STATES, Bio‑Rad Laboratories, Inc., 5731 W. Las Positas Blvd., Pleasanton, CA 94588, 510‑724‑7000

FRANCE, Bio‑Rad, 3 boulevard Raymond Poincaré, 92430 Marnes‑la‑Coquette

August 201712006672NOrevB

ii 12006672NOrevB


Oversettelser

Produktdokumenter kan være tilgjengelige på flere språk på elektroniske medier.

Symbolforklaring

Europeisk samsvar Produsent Autorisert representant i EU

Lotnummer Utløpsdato Til in vitro-diagnostisk bruk

Temperaturgrenser Katalognummer Se bruksanvisning

Antall tester For bruk med Serienummer

Kun på resept Inneholder lateks

BIO-RADS TEKNISKE STØTTEFor hjelp og teknisk rådgivning ta kontakt med Bio‑Rads avdeling for teknisk støtte. I Norge er avdelingen for teknisk støtte åpen mandag–torsdag kl. 8,00 til 16,45 og fredag kl. 8,00 til 15,00.

Tlf.: 00 800 00 24 67 23

Faks: +47 23 38 41 39

E‑post: nordic_helpdesk@bio‑rad.com

Nettbasert teknisk støtte og verdensomspennende kontaktinformasjon er tilgjengelig på www.consult.bio‑rad.com.

JURIDISKE MERKNADERIngen del av denne publikasjonen kan reproduseres eller overføres i noen form eller på noen måte, elektronisk eller mekanisk, inkludert fotokopi, opptak eller et hvilket som helst lagrings‑ eller gjenfinningssystem, uten skriftlig tillatelse fra Bio‑Rad Laboratories.

Bio‑Rad forbeholder seg retten til når som helst å endre sine produkter og tjenester. Denne bruksanvisningen kan endres uten varsel. Selv om dokumentet er nøye utarbeidet, påtar Bio‑Rad seg ikke noe ansvar for feil, eller for eventuelle skader som følge av anvendelsen eller bruken av denne informasjonen.

Excel og Microsoft er varemerker for Microsoft Corporation.

FAM og VIC er varemerker for Applera Corporation.

TaqMan er et varemerke for Roche Molecular Systems, Inc.

Alle andre varemerker tilhører deres respektive selskaper.

12006672NOrevB iii


Bio‑Rads termosyklere og sanntidstermosyklere er dekket av en eller flere av følgende amerikanske patenter eller deres utenlandske motparter som eies av Eppendorf AG: Amerikansk patentnummer 6 767 512 og 7 074 367.

Dette produktet og/eller dets bruk er dekket av krav fra amerikanske patenter og/eller ventende amerikanske og ikke‑amerikanske patentsøknader eid av eller under lisens til Bio‑Rad Laboratories, Inc. Innkjøp av produktet inkluderer en begrenset, ikke‑overførbar rett under slik intellektuell eiendom for bruk av produktet utelukkende til intern forskning og diagnostiske formål. Ingen rettigheter gis for bruk av produktet til kommersielle bruksområder av noe slag, inkludert, men ikke begrenset til produksjon, kvalitetskontroll eller kommersielle tjenester, for eksempel kontraktstjenester eller gebyr for tjenester. Informasjon om en lisens for slike bruksområder kan fås fra Bio‑Rad Laboratories. Det er kjøperens/sluttbrukerens ansvar å skaffe seg eventuelle andre immaterielle rettigheter som kan være påkrevd.

SIKKERHETS- OG FORSKRIFTSKRAVQX200™‑systemet er testet og funnet å være i samsvar med alle gjeldende krav til følgende sikkerhetsstandarder og elektromagnetiske standarder:

1. IEC 61010‑1:2010 (3. utg.), EN 61010‑1:2010 (3. utg.). Elektrisk utstyr for måling, kontroll og laboratoriebruk – del 1: Generelle krav

2. EN 61326‑1:2006 (klasse A). Elektrisk utstyr for måling, kontroll og laboratoriebruk. EMC‑krav, del 1: Generelle krav

3. UL 61010‑1:2004, Laboratorieutstyr, test‑ og måleutstyr og industrielle prosesskontroller

4. CAN/CSA 22.2 nr. 61010‑1‑04, Sikkerhetskrav for elektrisk utstyr for måling, kontroll og laboratoriebruk, del 1: Generelle krav

5. Dette utstyret genererer, bruker og kan utstråle radiofrekvensenergi, og hvis det ikke installeres og brukes i samsvar med bruksanvisningen, kan det forårsake skadelig interferens med radiokommunikasjon. Drift av dette utstyret i et boligområde vil sannsynligvis forårsake skadelig forstyrrelse, i så fall vil brukeren bli pålagt å korrigere forstyrrelsen på egen bekostning

CE‑merket indikerer at produsenten sikrer at produktet er i samsvar med de grunnleggende kravene i det europeiske direktivet for medisinsk utstyr til in vitro‑diagnostikk 98/79/EF.

TCSA‑merket indikerer at et produkt er testet til kanadiske og amerikanske standarder, og det oppfyller kravene til de gjeldende standardene.

Dette utstyret har blitt testet og funnet å overholde grensene for en Klasse A digital enhet i henhold til del 15 i FCC‑reglene. Disse grensene er utformet for å gi rimelig beskyttelse mot skadelig forstyrrelse når utstyret drives i et kommersielt miljø.

Symbolet for direktivet om avfall fra elektrisk og elektronisk utstyr indikerer at når sluttbrukeren ønsker å kassere dette produktet, må det sendes til separate innsamlingsanlegg for gjenvinning og resirkulering.

Dette instrumentet skal kun brukes av opplært personell.

Ikke plasser utstyret slik at det er vanskelig å betjene støpselet til strømforsyningen. Støpselet til strømforsyningen brukes til å koble fra enheten.

Ingen deler som kan vedlikeholdes på innsiden.

iv 12006672NOrevB


ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER FOR QXDX BCR-ABL %IS KIT FOR QX200 SYSTEMFor in vitro‑diagnostisk bruk. For bruk av helsepersonell.

Dette testsettet skal kun håndteres av kvalifisert personell som er opplært i laboratorieprosedyrer og kjent med potensielle farer. Bruk egnet verneutstyr, hansker og øye‑/ansiktsbeskyttelse, og håndter hensiktsmessig i henhold til prinsippene for god laboratoriepraksis.

PVU-OPPLÆRING (PERSONLIG VERNEUTSTYR)Riktig bruk av hansker anbefales med bruk av oljer og prøveplater. OSHA‑krav til PVU er angitt i CFR (Code of Federal Regulations) i 29 CFR 1910.132 (generelle krav), 29 CFR 1910.138 (håndvern) og 29 CFR 1926.95 (kriterier for standard personlig verneutstyr). Alle hansker med nedsatt beskyttelsesevne skal kastes og erstattes. Ta hensyn til kjemikalienes toksisitet og faktorer som eksponeringstid, lagring og temperatur når du bestemmer deg for å gjenbruke hansker som har vært eksponert for kjemikalier. Egenskaper som hjelper med valg av hansker for håndtering av maskiner, analyser, oljer og rengjøringsmidler:

• Butyl‑hansker er laget av syntetisk gummi og beskytter mot peroksid, hydrofluorsyre, sterke baser, alkoholer, aldehyder og ketoner.

• Naturlige (lateks) gummihansker er behagelige å bruke og har utmerket strekkfasthet, elastisitet og temperaturbestandighet.

• Neoprenhansker er laget av syntetisk gummi og gir god pålitelighet, fingerferdigheter, høy tetthet og slitemotstand. De beskytter mot alkoholer, organiske syrer og alkalier.

• Nitrilhansker er laget av kopolymer og gir beskyttelse mot klorerte løsemidler som trikloretylen og tetrakloreten. De gir beskyttelse ved arbeid med oljer, fett, syrer og kaustiske stoffer.

12006672NOrevB 1


Innhold

Bio‑Rads tekniske støtte ..................................................................................................................... iiJuridiske merknader ............................................................................................................................ iiSikkerhets‑ og forskriftskrav ............................................................................................................... iiiAdvarsler og forholdsregler for QXDX BCR‑ABL %IS kit for QX200 system .................................... ivPvu‑opplæring (personlig verneutstyr) ............................................................................................... ivTiltenkt bruk .........................................................................................................................................3Prinsippene for prosedyren .................................................................................................................3

Rapporteringsformat: %IS og MR ..............................................................................................3Oversikt over arbeidsflyt for QXDx BCR‑ABL %IS ....................................................................4

Reagenser og instrumenter ................................................................................................................5Medfølgende materialer .............................................................................................................5Oppbevaring og håndtering .......................................................................................................6

Nødvendige materialer som ikke medfølger .......................................................................................6Reagenser og forbruksvarer ......................................................................................................6Instrumenter ...............................................................................................................................7Andre reagenser og forbruksvarer .............................................................................................8

Generelle forholdsregler og advarsler .................................................................................................8Innsamling, transport og oppbevaring av prøve .................................................................................9QXDX BCR‑ABL %IS testprotokoll .....................................................................................................9

Oversikt ......................................................................................................................................9Plateoppsett ...............................................................................................................................9

Preanalytiske trinn .............................................................................................................................10Klargjøring av RT‑reaksjon ................................................................................................................11ddPCR‑oppsett og dråpegenerering .................................................................................................13

Beste praksis for opphenting av et tilstrekkelig volum med cDNA: .........................................14PCR‑amplifisering (termosykling) .....................................................................................................17Dråpelesing .......................................................................................................................................17

Klargjøre for datainnsamling ....................................................................................................17Datainnsamling.........................................................................................................................18

Analyse ..............................................................................................................................................19Dataeksport ..............................................................................................................................20Resultater .................................................................................................................................20

Kvalitetskontroll .................................................................................................................................21Kontroller ..................................................................................................................................21Kalibratorkontroller ...................................................................................................................21Ukjente prøver ..........................................................................................................................21

Tolkning av resultatene .....................................................................................................................21Feilsøking ..........................................................................................................................................22

2 12006672NOrevB


Egenskaper for analytisk ytelse ........................................................................................................24LoB (grense for blank) ..............................................................................................................24LoD (deteksjonsgrense) ...........................................................................................................25LoQ (grense for kvantifisering) .................................................................................................25Presisjon ...................................................................................................................................25Linearitet ...................................................................................................................................26

Rapporterbart område ......................................................................................................................27Sporbarhet ................................................................................................................................27Analytisk spesifisitet .................................................................................................................27

Egenskaper for klinisk ytelse ............................................................................................................28Begrensninger ...................................................................................................................................28Referanser .........................................................................................................................................29Vedlegg A: Termosyklere ...................................................................................................................30Vedlegg B: Navneendring .................................................................................................................31

12006672NOrevB 3


TILTENKT BRUKTesten QXDx BCR‑ABL %IS, utført på Bio‑Rads QXDx™ Droplet Digital PCR‑system, er en in vitro nukleinsyreamplifiseringstest for kvantifisering av BCR‑ABL1 og ABL1 kromosomtranskripter i total RNA fra fullblod fra diagnostiserte t(9;22)‑positive pasienter med kronisk myelogen leukemi (KML) som uttrykker BCR‑ABL1‑fusjonstranskript type e13a2 og/eller e14a2. Testen måler e13a2‑ og/eller e14a2‑transkripter av BCR‑ABL1, normalisert til ABL1 endogen kontroll. Resultatene rapporteres som prosentvis reduksjon fra en grunnlinje på 100 % på den internasjonale skalaen (%IS) og på en log‑skala for molekylær reduksjon (MR).

Testen skiller ikke mellom e13a2‑ og e14a2‑transkripsjoner og overvåker ikke andre sjeldne fusjonstranskripter som skyldes t(9;22). Denne testen er ikke ment for diagnose av KML.

PRINSIPPENE FOR PROSEDYRENTesten QXDx BCR‑ABL %IS bruker tilfeldig primet revers transkripsjon i kombinasjon med teknologien Droplet Digital PCR (ddPCR). BCR‑ABL‑translokasjonene e13a2 (b2a2) og e14a2 (b3a2) amplifiseres, registreres og kvantifiseres samtidig. Testen QXDx BCR‑ABL %IS kvantifiserer kopiene av de to BCR‑ABL‑fusjonstranskripsjonene e13a2 (b2a2) og/eller e14a2 (b3a2) i FAM‑kanalen og ABL‑transkriptet som en endogen kontroll i HEX‑kanalen, ved bruk av totalt RNA ekstrahert fra humant blod1‑4. QXDx BCR‑ABL %IS kvantifiserer mengden BCR‑ABL‑transkript som et forhold mellom BCR‑ABL/ABL, og returnerer deretter verdien på den internasjonale skalaen.

QXDx BCR‑ABL %IS Kit er ment for bruk på Bio‑Rad QXDx Droplet Digital PCR (ddPCR) System. QXDx AutoDG™ ddPCR Systemet består av den automatiske dråpegeneratoren (AutoDG) og dråpeleseren (DR). QXDx BCR‑ABL %IS Kit inkluderer reagenser som er tilstrekkelig for 96 prøver inkludert kalibratorer og kontroller. Hvert sett inneholder to lotavstemte IS‑kalibratorkontroller. IS‑kalibratorkontrollene er formulert ved omtrent 0,1 % BCR‑ABL/ABL, som er ved punktet for størst molekylær respons (MMR eller MR3), og ved omtrent 10 % BCR‑ABL/ABL (MR1). IS‑kalibratorkontrollene er sporbare til WHOs første internasjonale genetiske referansepanel (09/138)5.

Foruten en endogen kontroll (ABL), inkluderer QXDx BCR‑ABL %IS Kit også tre eksterne kontroller: høy positiv kontroll, lav positiv kontroll og BCR‑ABL‑negativ / ABL‑positiv kontroll (negativ kontroll).

Rapporteringsformat: %IS og MR

To mål brukes ofte til å overvåke KML.

1. Prosentandel på internasjonal skala (%IS), beregnet ved å dividere antall kopier av BCR‑ABL med antall kopier av referanse‑ABL, multiplisert med 100, og deretter multiplisert med en laboratoriespesifikk korreksjonsfaktor (KF) (Baccarani, et al. 2006)1.

2. Molekylært logreduksjonsnivå (MR) (Hughes et al. 2006, Branford et al, 2006, 2008)4, som er en log10‑transformasjon av %IS.

%IS = BCR – ABL copies

* 100 * CFABL copies

MR = log10(100%IS) – log10(%IS) = 2 – log10(%IS)

%IS rapporteres i lineær skala, mens MR er %IS forholdskonvertert til log10‑skala og trukket fra grunnlinjen, MR0,0 er 100 %IS. Vi vil bruke betegnelsen MRx,y for å angi MR‑nivå, hvor x,y er den numeriske verdien av målingen. For eksempel viser MR3,0 til en tusen gangers (10^3) reduksjon fra nominell MR0,0. Det betyr også et forhold på 0,1 % mellom registrerte BCR‑ABL‑kopier over ABL‑kopier, korrigert til IS.

4 12006672NOrevB


Testen QXDx BCR‑ABL %IS rapporterer både %IS‑ og MR‑verdier. Som mellomliggende resultater kan registrerte kopier av BCR‑ABL‑ og ABL‑transkripter rapporteres og brukes til å vurdere sikkerheten eller styrken til målingen. %IS‑verdiene er sporbare til WHOs primære referansematerialer («standarder») (White et al 2010)5, som retter seg mot fire %IS‑nivåer: 10 %IS, 1 %IS, 0,1 %IS, 0,01 %IS eller henholdsvis MR1, MR2, MR3 og MR4.

Statistiske enheter som et gjennomsnitt eller et standardavvik i dette dokumentet uttrykkes i enten MR‑ eller %IS‑enheter. Tabell 1 nedenfor viser forholdet mellom %IS‑verdier og deres tilhørende MR‑verdier for utvalgte nivåer.

%IS MR

10 1,0

1 2,0

0,32 2,5

0,1 3,0 (MMR)

0,032 3,5

0,01 4,0

0,0032 4,5

0,002 4,7

0,001 5,0

Tabell 1: %IS‑verdier og tilhørende MR‑verdier

Oversikt over arbeidsflyt for QXDx BCR-ABL %IS

Testens standard arbeidsflyt og tidsforbruket for hvert trinn vises i tabell 2, nedenfor.

Trinn Beskrivelse BruksområderAnslått manuell

arbeidstidAnslått

instrumenttid

1Ekstraher RNA fra fullblod i EDTA‑rør Variabel Variabel Variabel

2 RT‑reaksjon < 30 min ~60 min

3Plateoppsett og dråpegenerering

< 30 min~1 min/test

~48 min/plate

4 PCR‑amplifisering < 5 min ~120 min.

12006672NOrevB 5


Trinn Beskrivelse BruksområderAnslått manuell

arbeidstidAnslått

instrumenttid

5 Dråpelesing < 5 min~2,5 min/test

~120 min/plate

6Manuell

terskelbestemmelse, eksportere CSV‑fil

10–20 min/plate Ikke aktuelt

7Aggregering av data og

rapportering

~15 min/plate

eller

Variable with 3‑d party tools

Ikke aktuelt

Tabell 2: QXDx BCR‑ABL %IS – CE‑IVD‑arbeidsflyt

RNA‑ekstraksjon, trinn 1, kan utføres med en rekke standardmetoder, inkludert Maxwell® CSC RNA Blood Kit, Qiagen RNeasy® Mini og Trizol‑ekstraksjon. Trinn 2–5 utføres med reagenser og instrumenter levert av Bio‑Rad, se nedenfor. Manuell terskelbestemmelse og eksport gjøres med QuantaSoft v 1.7.4. Det siste trinnet med dataaggregering og rapportering kan gjøres enten med verktøy som er laboratorieutviklede eller fra tredjeparter.

REAGENSER OG INSTRUMENTER

Medfølgende materialer

QXDx BCR‑ABL %IS Kit inneholder tilstrekkelige reagenser til å behandle 96 prøver eller kvalitetskontrollprøver ved kjøring i 2 brønner per prøve. Settet inneholder følgende elementer:

6 12006672NOrevB


Katalognr. Navn ANT (rør) Volum Oppbevaringsbetingelser12006134 QXDx BCR-ABL %IS Kit 1 --- -25 °C til -15 °C12004581 QXDx BCR‑ABL Primers & Probes 1 250 μl ‑25 °C til ‑15 °C12004586 QXDx Nuclease Free Water 2 1500 μl ‑25 °C til ‑15 °C12004569 QXDx 5x iScript Select Reaction Mix 1 500 μl ‑25 °C til ‑15 °C12004572 QXDX 2X Supermix 3 1000 μl ‑25 °C til ‑15 °C12004571 QXDx iScript Advanced Reverse

Transcriptase1 125 μl ‑25 °C til ‑15 °C

12004582 QXDx RT Primers 1 500 μl ‑25 °C til ‑15 °C12004585 QXDx BCR‑ABL 0,1%IS 2 50 μl ‑25 °C til ‑15 °C12004588 QXDx BCR‑ABL 10%IS 2 50 μl ‑25 °C til ‑15 °C12004584 QXDx BCR‑ABL H‑CTRL 2 50 μl ‑25 °C til ‑15 °C12004583 QXDx BCR‑ABL L‑CTL 2 50 μl ‑25 °C til ‑15 °C12004573 QXDx BCR‑ABL Neg‑CTRL 2 50 μl ‑25 °C til ‑15 °C12006672 QXDx BCR-ABL %IS Kit IFU, CE-IVD 1

MERKNAD: Sikkerhetsdatablad (SDB) er tilgjengelige på www.bio‑rad.com

Oppbevaring og håndtering• Oppbevar alle cDNA‑ og ddPCR‑komponenter ved ‑25 °C til ‑15 °C i en fryser med konstant temperatur.

• Oppbevar alle RNA‑kontrollene ved ‑80 °C.

• Ikke vortex‑miks revers transkriptasen (RT).

• Hold RT nedfryst til bruk og plasser tilbake i fryseren umiddelbart etter bruk.

• Unngå forlenget eksponering for lys for BCR‑ABL1/ABL1‑primer‑/probeblandingen ved romtemperatur.

• Bland BCR‑ABL1/ABL1‑primer‑/probeblanding nøye for å sikre homogenitet, samtidig som bobler unngås.

• Bland forsiktig ved bruk av vortex‑mikser og sentrifuger alle andre rør før de åpnes.

• Ikke vortex‑miks rør med kalibrator eller kontroll.

• Ikke frys/tin QXDx supermiks mer enn fem ganger.

• Utløpsdatoer for hver av reagensene er angitt på de individuelle komponentetikettene.

NØDVENDIGE MATERIALER SOM IKKE MEDFØLGER

Reagenser og forbruksvarer

Til bruk med QX200 AutoDG ddPCR Dx System:

Katalognr. Navn ANT (rør) Volum Oppbevaringsbetingelser12001922 QXDx AutoDG Consumable Pack 1 15 °C til 30 °C12003015 ddPCR Pierceable Foil Seals 50 15 °C til 30 °C12003185 ddPCR 96 Well Plates 15 15 °C til 30 °C12003016 DG32™ Cartridges w/ Gaskets 15 15 °C til 30 °C12003010 Pipet Tip for AutoDG (Racks) 10 15 °C til 30 °C12003017 AutoDG Oil for Probes 1 50 ml 15 °C til 30 °C

12006672NOrevB 7


Katalognr. Navn ANT (rør) Volum Oppbevaringsbetingelser12002526 QXDx Droplet Reader Oil Pack 112002526 QXDx Droplet Reader Oil Pack 1 1 l 15 °C to 30 °C

For bruk med QX200 Droplet Generator (manuell dråpegenerator):

Katalognr. Navn ANT (rør) Volum Oppbevaringsbetingelser12001921 QXDx Consumable Pack 15 °C to 30 °C12003185 ddPCR 96‑Well Plates 5 15 °C to 30 °C12003015 ddPCR Pierceable Foil Heat Seal 50 15 °C to 30 °C12003020 Droplet Generation Oil for Probes 2 7 ml 15 °C to 30 °C12003018 DG8™ Cartridges 24 15 °C to 30 °C12003021 DG8 Gaskets 24 15 °C to 30 °C12005493 Bruksanvisning 1

Katalognr. Navn ANT (rør) Volum Oppbevaringsbetingelser12002526 QXDx Droplet Reader Oil Pack 112002526 QXDx Droplet Reader Oil Pack 1 1 l 15 °C to 30 °C

Instrumenter

Beskrivelse Katalognr.QX200 AutoDG Droplet Digital PCR Dx System 17002229

QX200 Droplet Reader, CE‑IVD 12001045QX200 Automated Droplet Generator, CE‑IVD 12001630

eller

Beskrivelse Katalognr.QX200 AutoDG Droplet Digital PCR System 1864100

QX200 Droplet Reader, IVD 1864003QX200 Automated Droplet Generator, IVD 1864101

eller

Beskrivelse Katalognr.QX200 Droplet Digital PCR Dx System 17000034

QX200 Droplet Reader, IVD 12001045QX200 Droplet Generator, IVD 12001049

eller

Beskrivelse Catalog #QX200 Droplet Digital PCR System 1864101

QX200 Droplet Reader 1864003QX200 Droplet Generator 1864002

8 12006672NOrevB


BeskrivelseTermosykler

Påkrevd: Termosykler med spesifikasjoner som tilsvarer følgende:• Nøyaktighet: +/‑ 0,2 °C

• Ensartethet: +/‑ 0,4 °C mellom brønnene innen 10 s

• Justerbar rampekapasitet med nødvendig rampehastighet: inntil 2 °C/s

• Temperaturområde: 0–100 °C

Beskrivelse Katalognr.PX1™ PCR Plate Sealer 1814000

BeskrivelseGenerelt laboratorieutstyr

• Pipetter (Rainin eller Eppendorf)

| 1–10 μl, 10–100 μl, 20–200 μl og 100–1000 μl Platesentrifuge eller sentrifugemaskin

• Vortex‑pipetter (Rainin eller Eppendorf)

| 1–10 μl, 10–100 μl, 20–200 μl og 100–1000 μl

Andre reagenser og forbruksvarer

BeskrivelseReagenser for RNA-rensing

Alle kommersielt tilgjengelige, laboratoriegodkjente metoder for prøveklargjøring er godtatt. Eksempel: Qiagen, Trizol, Promega Maxwell RNA Blood Kit

Beskrivelse Katalognr.ddPCR 2x Control Buffer 1863052

For bruk i tomme brønner med Droplet Generation Oil

GENERELLE FORHOLDSREGLER OG ADVARSLER• Kun til in vitro‑diagnostisk (IVD) bruk.

• Kun til bruk av profesjonelle.

• Alle biologiske prøver skal behandles som om de kan overføre infeksiøse agenser. Alle humane prøver skal behandles med standard forholdsregler. Retningslinjer for prøvehåndtering er tilgjengelig fra World Health Organization eller U.S. Centers for Disease Control and Prevention.

• Bruk riktige laboratoriesikkerhetsprosedyrer for å arbeide med kjemikalier og håndtere prøver.

• Bytt hansker ved transport og arbeid med ulike reagenser.

• Bruk 10 % blekemiddel etterfulgt av 70 % alkohol for å tørke av overflateområdene til arbeidsplassen.

• Påse at Droplet Generator og Droplet Reader har en dedikert plass i separate områder for å unngå amplikonkontaminering.

• Unnlatelse av å overholde prosedyrer og betingelser som er beskrevet i dette dokumentet og bruk av andre reagenser enn de som medfølger i dette settet, kan gir ukorrekte resultater og bivirkninger.

• Ikke bytt ut reagenser i QXDx BCR‑ABL %IS Kit med andre reagenser.

12006672NOrevB 9


• Ikke bland reagenser fra ulike lot av QXDx BCR‑ABL %IS Kit.

• Hvis samme termosykler brukes til RT og PCR, plasser termosykleren ved siden av Droplet Generator eller på et annet sted enn leseren.

MERKNAD: Platen forsegles med folie under PCR‑amplifisering.

• Utfør testoppsett og tilsetning av mal på ulike steder, med dedikerte pipetter.

• Grunnet ekstrem følsomhet for RNA og ddPCR, må hele testen utføres under RNAse‑/DNAse‑frie forhold.

• Optimaliser arbeidsflyten og arbeidsplassen for å eliminere overføringskontaminering.

• Påse at vanlig vedlikehold og kalibrering utføres på alt utstyr i henhold til produsentens anbefalinger.

• Bruk nukleasefrie spisser og reagenser, og rengjør pipettene regelmessig.

• Påse at kun en anbefalt protokoll for termosykling brukes for optimale resultater.

• Ikke bruk DEPC‑behandlet vann for PCR‑amplifisering

• Noen stoffer kan påvirke testen: visse legemidler (f.eks. heparin), prøver med høyt fettinnhold, hemolyserte prøver, ikteriske prøver eller prøver med høye nivåer av protein.

• Ta kontakt med institusjonens miljøavfallspersonell for informasjon om riktig avhending av brukte plater, forbruksvarer og reagenser. Dette materialet kan ha egenskaper som omfattes av Federal EPA Resource Conservation and Recovery Act (RCRA) som omhandler farlig avfall som har spesifikke krav til avhending.

• Kontroller statlige og lokale forskrifter for avhending. Institusjoner bør sjekke kravene til avhending av farlig avfall i sitt land.

• Kvaliteten på testresultatene er stort sett avhengig av mengden og kvaliteten på prøven som analyseres. Det anbefales at kvaliteten og kvantiteten av RNA‑prøven måles som angitt i denne håndboken.

INNSAMLING, TRANSPORT OG OPPBEVARING AV PRØVE• Ta minst 5 ml helblod i rør med EDTA som antikoagulant.

• Når de ikke er i bruk, oppbevar blodprøver ved 2–8 °C i inntil 72 timer.

QXDX BCR-ABL %IS TESTPROTOKOLL

Oversikt

Settet inneholder nok reagenser til å kjøre totalt 192 ddPCR‑brønner. Når alle prøvene, kontrollene og kalibratorene kjøres i to‑brønns format, er de medfølgende reagensene tilstrekkelig for 84 prøver. Når høyere sensitivitet er nødvendig, kan ukjente prøver kjøres i mer enn 2 brønner, for eksempel i 4, 6, 8 osv. I dette tilfellet vil reagensene i settet være tilstrekkelig for færre prøver.

Plateoppsett

Hver plate må kjøres med seks kjente prøver: No Template Control (NTC, kontroll uten mal), QXDx High Positive Control (Hi Pos, høy positiv kontroll), QXDx negative Control (Neg, negativ kontroll), QXDx Low Positive Control (Lo Pos, lav positiv kontroll), Calibrator‑check QXDX ~10%IS Cal (kalibratorkontroll ~10 %IS) og Calibrator‑check QXDx ~0,1%IS Cal (kalibratorkontroll ~0,1 %IS). Alle disse kjente prøvene kjøres alltid i to brønner hver. Analysekvaliteten bestemmes fra dataene som produseres fra disse kontrollene og kalibratorkontrollene, se nedenfor. De ukjente prøvene må kjøres i minst to brønner. Når høyere sensitivitet er påkrevd, kan de ukjente prøvene kjøres i 4‑brønns, 6‑brønns, 8‑brønns formater osv. Data fra alle brønnene med samme prøve aggregeres digitalt for å beregne det totale antallet molekylære mål og %IS‑ og MR‑verdiene for prøven.

10 12006672NOrevB


En spesiell prøvetype som kalles 2x‑kontrollbuffer kan kjøres, men vil ikke analyseres eller rapporteres. 2x‑kontrollbuffer må brukes i bufferbrønner i alle tomme brønner i hver kolonne med prøver (se figur 1‑3).

Kjente Ukjente1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A NTC NTC Prøve 3 Prøve 3 Prøve 11 Prøve 11 Prøve 19 Prøve 19 Prøve 27 Prøve 27 Prøve 35 Prøve 35

B Hi Pos Hi Pos Prøve 4 Prøve 4 Prøve 12 Prøve 12 Prøve 20 Prøve 20 Prøve 28 Prøve 28 Prøve 36 Prøve 36

C Neg Neg Prøve 5 Prøve 5 Prøve 13 Prøve 13 Prøve 21 Prøve 21 Prøve 29 Prøve 29 Prøve 37 Prøve 37

D Lo Pos Lo Pos Prøve 6 Prøve 6 Prøve 14 Prøve 14 Prøve 22 Prøve 22 Prøve 30 Prøve 30 Prøve 38 Prøve 38

E ~0,1% IS ~0,1% IS Prøve 7 Prøve 7 Prøve 15 Prøve 15 Prøve 23 Prøve 23 Prøve 31 Prøve 31 Prøve 39 Prøve 39

F ~10% IS ~10% IS Prøve 8 Prøve 8 Prøve 16 Prøve 16 Prøve 24 Prøve 24 Prøve 32 Prøve 32 Prøve 40 Prøve 40

G Prøve 1 Prøve 1 Prøve 9 Prøve 9 Prøve 17 Prøve 17 Prøve 25 Prøve 25 Prøve 33 Prøve 33 Prøve 41 Prøve 41

H Prøve 2 Prøve 2 Prøve 10 Prøve 10 Prøve 18 Prøve 18 Prøve 26 Prøve 26 Prøve 34 Prøve 34 Prøve 42 Prøve 42

Figur 1: Et plateoppsett når alle kjente og ukjent prøver kjøres i et 2‑brønns format. Det er 42 ukjente prøver på en plate.

Kjente Ukjente1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A NTC NTC Prøve 3 Prøve 3 Prøve 11 Prøve 11

B Hi Pos Hi Pos Prøve 4 Prøve 4 Prøve 12 Prøve 12

C Neg Neg Prøve 5 Prøve 5 Prøve 13 Prøve 13

D Lo Pos Lo Pos Prøve 6 Prøve 6 Prøve 14 Prøve 14

E ~0,1% IS ~0,1% IS Prøve 7 Prøve 7 buffer buffer

F ~10% IS ~10% IS Prøve 8 Prøve 8 buffer buffer

G Prøve 1 Prøve 1 Prøve 9 Prøve 9 buffer buffer

H Prøve 2 Prøve 2 Prøve 10 Prøve 10 buffer buffer

Figur 2: Et plateoppsett med mindre enn 42 ukjente prøver. De siste 8 brønnene er fylt med buffer (ikke avlest) for å fylle ut 8 prøver per kolonne. Gjenværende tomme kolonner fylles eller leses ikke.

Kjente Ukjente1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A NTC NTC Prøve 3 Prøve 3 Prøve 3 Prøve 3 Prøve 3 Prøve 3 Prøve 3 Prøve 3

B Hi Pos Hi Pos Prøve 4 Prøve 4 Prøve 4 Prøve 4 Prøve 4 Prøve 4 Prøve 4 Prøve 4

C Neg Neg Prøve 5 Prøve 5 Prøve 5 Prøve 5 Prøve 5 Prøve 5 Prøve 5 Prøve 5

D Lo Pos Lo Pos Prøve 6 Prøve 6 Prøve 6 Prøve 6 buffer buffer buffer buffer

E ~0,1% IS ~0,1% IS Prøve 7 Prøve 7 Prøve 7 Prøve 7 buffer buffer buffer buffer

F ~10% IS ~10% IS Prøve 8 Prøve 8 Prøve 8 Prøve 8 buffer buffer buffer buffer

G Prøve 1 Prøve 1 Prøve 9 Prøve 9 buffer buffer buffer buffer buffer buffer

H Prøve 2 Prøve 2 Prøve 10 Prøve 10 buffer buffer buffer buffer buffer buffer

Figur 3: Et plateoppsett hvor noen ukjente prøver kjøres i 2‑, 4‑ eller 8‑brønns formater. Buffer brukes til å fylle ut åtte prøver per kolonne. Gjenværende tomme kolonner fylles eller leses ikke.

Det anbefales at prøver spres mellom brønnene i horisontal retning. På denne måten hvis det er en feil på et dråpebrettnivå (kolonne), kan de andre brønnene gi tilstrekkelig informasjon til at prøven beregnes. Bruk 2x‑kontrollbuffer fortynnet 1:1 med vann i alle tomme brønner i hver kolonne.

MERKNAD: Som for enhver PCR‑basert molekylær test, må det beskyttes mot nukleinsyrekontaminering ved rutinemessig dekontaminering av arbeidsplassen og pipetter, separering av RNA/DNA‑håndtering fra analyseklargjøringsområder og tilstrekkelig PVU. Vi anbefaler at malfrie områder og malområder adskilles fysisk i form av rom, har egne pipetter og verktøy, og dekontamineres rutinemessig.

12006672NOrevB 11


PREANALYTISKE TRINNTotal RNA ekstrahert via vanlige metoder for prøveklargjøring fra fullblod eller buffy coat er kompatible med Droplet Digital PCR‑metoder. De vanligste metodene for RNA‑ekstraksjon er Maxwell® CSC RNA Blood Kit, Qiagen RNeasy® Mini‑ og Trizol‑ekstraksjon. For optimale resultater bør minst 10 millioner (1 x 107) celler med kjerne innsamles og ekstraheres til RNA. Siden RNA er kjent for å utsettes for nedbryting av utbredte RNAer som er til stede i humane prøver, anbefales det å minimere prøvehåndteringstrinnene og behandle blodprøvene innen 24 timer etter innsamling for å oppnå den mest sensitive målingen av BCR‑ABL‑mengder (Hughes et al, 2006)4. RNA‑kvalitet, ‑renhet og ‑mengde kan påvirke resultatene i stor grad. Derfor anbefales det, men det er ikke påkrevd, at renset total RNA evalueres for kvalitet og renhet etter standardmetoder for spektrofotometri. Den tilsvarende OD260‑konsentrasjonen bør være ~100 ng/μl, renhet som estimert av forholdet OD260/OD280 bør være > 1,6 og forholdet OD260/OD230 bør være > 1,2.

Testens sensitivitet er avhengig av tilsatt RNA. Det anbefales å validere en RNA‑isoleringsmetode som gir mer enn 100 ng/μl og å ta sikte på totalt 750–1250 ng tilsatt RNA per test. Renset total RNA bør justeres til en målkonsentrasjon på ~100 ng/μl for effektivt testoppsett og skal testes umiddelbart etter ekstraksjon eller oppbevares nedfryst ved ‑80 °C til det er klart for testing.

Kategori Målspesifikasjon

Blodvolum 1,5–10 ml

Celleantall ≥ 1E+07

RNA‑konsentrasjon 75–125 ng/μl

RNA‑renhetOD260/OD280‑forhold > 1,6 OD260/OD230‑forhold > 1,2

KLARGJØRING AV RT-REAKSJON1. Tin renset RNA ved romtemperatur i inntil 10 minutter, plasser deretter på is eller en kald blokk.

MERKNAD: Ikke vortex‑miks. Du kan sentrifugere rørene.

2. Juster RNA‑prøver til ~100 ng/μl, hvis det ikke allerede er utført.

3. Plasser QXDx iScript Advanced Reverse Transcriptase på is eller en kald blokk som er tatt fra fryseren når den er klar til å brukes.

MERKNAD: Ikke vortex‑miks avansert revers transkriptase.

4. Tin følgende komponenter til romtemperatur i inntil 15 minutter.

a. QXDx 5x iScript Select Reaction Mix

b. QXDx RT Primers

c. QXDx Nuclease‑free water

5. Bland eller vortex‑miks hvert komponentrør i trinn 4 grundig med lokket lukket, og sentrifuger kort for å samle innholdet i bunnen av røret.

6. Plasser hver av komponentene på is eller en kald blokk.

7. Klargjøring av RT Mastermiks og lasting av RT‑plate:

a. Klargjør RT Mastermiks i henhold til antall prøver, kontroller og kalibratorer som skal behandles.

b. Se tabell 3 for klargjøring av RT Mastermix‑volumer

c. MERKNAD: RT‑platen kan plasseres på is mens platen lastes.

12 12006672NOrevB


RT Mastermiks-volum Antall prøver* (prøver + overskudd) VolumAntall prøver 1 16 32 48 96

Plater 1/3 Plate 2/3 Plate 1 Plate 2 PlatesKomponent Volume 1x (16+2)x (32+3)x (48+4)x (96+4)x

QXDx Nuclease-Free Water

μl ~3,75 ~67,50 ~131,25 ~195 ~375

QXDx 5x iScript Select Reaction Mix

μl 5 90 175 260 500

QXDx RT Primers (Nonamers)

μl 5 90 175 260 500

QXDx iScript Advanced Reverse Transcriptase

μl 1,25 22,5 43,75 65 125

RNA-prøve* (750–1250 ng)

μl 10

Totalt μl 25 450 875 1300 2500

Tabell 3: Mastermiks‑volum basert på antall prøver.

MERKNAD: * Prøve(r) inkluderer pasientprøver, kontroller og kalibratorer som skal kjøres på platen.

8. For flere prøver anbefales det å klargjøre RT Mastermiks sammen med komponentene ovenfor (unntatt RNA), og deretter tilsette den i hver reaksjonsbrønn.

a. Se figur 4 for nødvendig plateoppsett

Kjente Ukjente1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A NTC Prøve 3 Prøve 11

B Hi Pos Prøve 4 Prøve 12

C Neg Prøve 5 Prøve 13

D Lo Pos Prøve 6 Prøve 14

E ~0,1% IS Prøve 7 buffer

F ~10% IS Prøve 8 buffer

G Prøve 1 Prøve 9 buffer

H Prøve 2 Prøve 10 buffer

Figur 4: Nødvendig RT‑plateoppsettb. Bland alle RT Mastermiks‑komponentene (unntatt RNA) i brønnen og tilsett 15 μl per prøve i annen

hver kolonne på 96‑brønns PCR‑platen.

MERKNAD: En elektronisk repeterende pipette kan brukes for økt effektivitet.

c. Tilsett 10 μl kalibratorer og kontroller i de aktuelle RT‑brønnene.

d. Tilsett 10 μl av ekstrahert RNA‑prøvevolum i de aktuelle RT‑brønnene.

e. Bland reaksjonsbrønnene forsiktig ved pipettering (10 ganger), vær forsiktig så du unngår å lage bobler.

f. Dekk til platen med folieforsegling ved bruk av en PX1 PCR Plate Sealer.

i. Still PX1‑plateforsegleren til 180 grader i 5 sekunder (ikke standardbetingelser).

ii. Plasser RT‑platen på den romtempererte aluminiumsblokken.

iii. Dekk til platen med et ark perforerbar forseglingsfolie, hvor den røde stripen skal være synlig når folien plasseres på platen.

iv. Trykk på knappen Seal for å forsegle platen (dette vil lukke døren og starte varmeforseglingen).

MERKNAD: Ikke bruk metallrammen.

12006672NOrevB 13


v. Fjern platen og blokken fra PX1‑plateforsegleren.

vi. Påse at alle brønnene i platen er forseglet ved å kontrollere at fordypningene i brønnene er synlige i folien.

MERKNAD: For mer detaljerte instruksjoner se i bruksanvisningen til PX1‑plateforsegleren.

g. Sentrifuger platen i 1 minutt ved 1000 rcf for å fjerne eventuelle bobler. Hvis det fremdeles finnes bobler, sentrifuger platen på nytt.

h. Når platen er forseglet og sentrifugert er den klar for termosykling (PCR).

MERKNAD: Husk å fjerne metallblokken fra PX1 PCR Plate Sealer for å unngå å overopphete blokken.

9. Overfør platen til termosykleren og kjør protokollen som vises i tabell 4.

Primerbinding 10 min ved 25 °C

Revers transkripsjon 45 min ved 42 °CRT‑inaktivering 5 min ved 85 graderVenting Inntil 24 timer ved 4 °C

Tabell 4: Termosyklerprotokoll*MERKNAD: Oppbevaring av RT‑reagensen ved 4 °C lar brukeren vente i inntil 24 timer før prosessering.

MERKNAD: Ved bruk av C1000 Thermal Cycler, still prøvevolumet til 25 μl og lokktemperaturen til 105 °C.

10. Når RT‑reaksjonen (cDNA) er ferdig, sentrifuger platen i 1 minutt ved 1000 rcf for å samle opp kondens.

11. Oppbevar cDNA på is og bruk umiddelbart. Eventuelt kan det oppbevares ved 4 °C i inntil 24 timer hvis det ikke brukes umiddelbart.

ddPCR-OPPSETT OG DRÅPEGENERERINGADVARSEL: Før alle komponenter fjernes, påse at arbeidsplassen er skikkelig rengjort med 10 % blekemiddel og 70 % alkohol.

1. Tin følgende komponenter til romtemperatur i omtrent 15 minutter.

a. QXDx 2x Supermix

b. QXDx BCR‑ABL Primers & Probes

c. Plate for cDNA‑prøve(r)* (~640 ng/test)

2. Bland individuelle komponentrør grundig ved bruk av en vortex‑mikser for å sikre homogenitet, og gransk nøye etter utfellinger. Hvis det finnes utfellinger, bland innholdet i røret grundig og sentrifuger.

MERKNAD: Supermiks‑løsninger er mer viskøse enn andre komponenter.

3. Sentrifuger alle komponentrørene i 30 sekunder ved 1000 rcf for å samle innholdet på bunnen av rørene.

4. Klargjør ddPCR Mastermiks for antallet reagenser i henhold til tabell 5.

ddPCR-volum Antall prøver* (prøver + overskudd) volumKomponent Volum 1x (16+2)x (32+3)x (48+4)x (96+4)x

QXDx Nuclease-Free Water

μl 6,5 117 227,5 338 650

QXDx ddPCR Supermix μl 25 450 875 1300 2500QXDx 20X BCR-ABL

Primers/Probesμl 2,5 45 87,5 130 250

cDNA-prøve(r)* μl 16 Totalt μl 50 900 1750 2600** 5000*

Tabell 5: ddPCR Plate‑volumer basert på antall prøver (etablert for RT‑plate).

14 12006672NOrevB


MERKNAD:** Totalt volum på 2600 μl for 48 prøver (1 plate) og 5000 μl for 96 prøver (2 plater) er mer enn 2 ml‑rør kan inneholde. Det anbefales 5 ml‑rør for disse prøvene.

MERKNAD:* Prøve(r) inkluderer pasientprøver, kontroller og kalibratorer som skal kjøres på platen.

5. For flere prøver anbefales det å klargjøre en ddPCR Mastermiks av komponentene ovenfor (unntatt cDNA‑prøve), og deretter tilsette cDNA i hver reaksjonsbrønn på ddPCR‑platen.

a. Se figur 5 for nødvendig plateoppsett.

b. Bland alle ddPCR Mastermiks‑komponentene grundig ved bruk av en vortex‑mikser.

c. Tilsett 34 μl/brønn av ddPCR Mastermiks (uten cDNA‑prøve) i platen i henhold til figur 5.

d. Ved bruk av en 50, 100 eller 200 μl 8‑kanals dråpeteller med filterspisser, punkter folieforseglingen til cDNA‑platen.

MERKNAD: Vanlig praksis har vist at P20‑pipettespisser ikke bryter folieforseglingen. Unngå å bruke P20‑pipetter til dette trinnet.

Beste praksis for opphenting av et tilstrekkelig volum med cDNA:i. Sett en pipette til volumet som skal pipetteres og punkter folieforseglingen på platen uten å bruke

stempelet. Pipettespissene skal ikke stikke lenger ned enn 2 mm under forseglingen.

ii. Når hullene er dannet, løft pipettespissene over forseglingen og trykk ned stempelet.

iii. Med stempelet nedtrykt, før spissene til bunnen av brønnene og gjør hullene større ved å bevege spissene forsiktig frem og tilbake. Hullene i folieforseglingen må gjøres større slik at pipettespissene kan nå ned til bunnen av brønnene. Dette er viktig for å hente opp hele volumet med cDNA som kreves for optimal ytelse.

iv. Mens pipettespissene står urørlige i cDNA, aspirer det påkrevde volumet veldig sakte. Etter aspirering, la pipettespissene stå i brønnene i ytterligere 5 sek for utjevning av trykket.

e. Tilsett 16 μl cDNA‑prøve (pasient, kontroll, kalibrator eller buffer) i hver brønn på ddPCR‑platen.

f. Forsiktig pipetter opp og ned ~5 ganger for å blande med ddPCR Mastermiks, trykk deretter ut hele prøven.

g. Gjenta trinn f for alle prøvene.

h. Etter at alle cDNA‑prøvene er tilsatt platen, bruk en 50 eller 100 μl dråpeteller (kan ha flere kanaler) og still den til 35 μl.

i. Pipetter hver reagens opp og ned minst 15 ganger ved 50 % (25 μl) av totalvolumet (50 μl), vær forsiktig så ikke bobler dannes.

ADVARSEL: Det er avgjørende at du pipetterer 15 ganger for å sikre at viskøst materiale er godt blandet.

j. Overfør 25 μl av hver prøve til nabobrønnen for å danne duplikatbrønner som vist i figur 5.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12





E ~0,1%IS Prøve 7 buffer




1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12





E ~0,1%IS Prøve 7 buffer




Figur 5: ddPCR‑plateoppsett

12006672NOrevB 15


MERKNAD: Hvis det totale antallet prøver og kontroller er mindre enn et multiplum av 8 (dvs. 8, 16, 24 osv.), fyll de gjenværende brønnene med 25 μl ddPCR‑kontrollbuffer eller overflødig reagens. Dråper vil ikke dannes hvis brønnene er tomme.

6. Forsegl platen med folieforsegling ved bruk av PX1‑plateforsegleren.


ii. Plasser RT‑platen på den romtempererte blokken.

iii. Dekk til platen med et ark perforerbar forseglingsfolie. Den røde stripen skal være synlig når folien plasseres på platen.

iv. Trykk på knappen Seal for å forsegle platen. Dette vil lukke døren og starte varmeforseglingen.



7. Sentrifuger platen kort i 30 sekunder ved 1000 rcf for å samle innholdet i bunnen av platen og fjerne bobler.

Dråpegenerering

Figur 6: Oppsett for Automated Droplet Generator‑system for elementer

MERKNAD: Se i håndboken til QX200 Automated Droplet Generator for detaljert og fullstendig bruksanvisning.

ADVARSEL: Før oppsett, påse at arbeidsbenken og instrumentoverflateområdet er skikkelig rengjort med 10 % blekemiddel og 70 % alkohol.

1. Samle alle forbruksmaterialene som er nødvendige for oppsett av Droplet Generator.

• DG32‑patroner, pipettespisser, dråpegenereringsolje, prøveplate, dråpeplate (hvor genererte dråper vises ved fullført økt).

MERKNAD: Påse at avfallsbeholderen er i riktig posisjon på AutoDG.

2. Åpne AutoDG‑døren og sett inn 96‑brønns ddPCR‑prøveplate i QX200 Automated Droplet Generator i posisjonen Sample Plate. Indikatorlampen skal lyse grønt.

3. Trykk på knappen Configure Sample Plate i AutoDG‑grensesnittet og velg et passende antall kolonner som prøvene befinner seg i. (Platenavn og platemerknader er valgfritt.) Klikk på OK.

16 12006672NOrevB


MERKNAD: Hvis totalt antall prøver og kontroller er mindre enn et multiplum av 8 i en enkel kolonne på platen, fyll de gjenværende kolonnebrønnene med 25 μl ddPCR 1X‑kontrollbuffer eller overflødig 1X Mastermiks for å sikre dråpegenerasjon.

MERKNAD: Kun fulle kolonner kan velges på AutoDG‑konfigurasjonsskjermen (se figur 7).

Figur 7: Plate A har 96 brønner valgt for 48 prøver. Plate B har 48 brønner valgt for 24 prøver. 4. Basert på antallet kolonner valgt på prøveplaten, identifiserer gule indikatorlamper forbruksvarer som må

lastes på instrumentet.

5. Åpne AutoDG‑døren og last de aktuelle forbruksvarene til tilhørende indikatorlamper lyser grønt.

a. Sett inn DG32‑patronene (med grønne pakninger til høyre) på plateholderne bak på systemet. Holderne er kodet for riktig orientering, og når de plasseres riktig, vil lyset bli grønt.

b. Sett inn pipettespisser langs den midtre raden av instrumentet etter at plastinnpakningen og lokket på boksen er fjernet.

ADVARSEL: Kun fulle spissbokser skal lastes på systemet.

c. Sett inn en tom 96‑brønns dråpeplate med en blå kjøleblokk i plassen for dråpeplaten. Lyset bør skifte til grønt.

d. Sett på AutoDG‑olje på venstre side ved å fjerne hetten og vri flasken inn i tårnet. Velg typen AutoDG‑olje i instrumentets brukergrensesnitt Droplets for Probes. Oljetypen som velges, vil bli blå. Oljenivåikonet på skjermen vil bli blått og vise det gjeldende oljenivået i flasken.

MERKNAD: Dette trinnet er påkrevd kun hvis oljenivået ikke er tilstrekkelig for kjøringen.

6. Når alle indikatorene på AutoDG er grønne, trykk på den blå knappen Start Droplet Generation.

ADVARSEL: Påse at du trekker deg bort fra instrumentet siden dette vil gjøre at døren lukkes og kjøringen starter.

7. AutoDG‑brukergrensesnittet vil be brukeren bekrefte «Start Run». kjøringen vil ikke starte før brukeren trykker på knappen Start Run.

MERKNAD: Tiden som gjenstår til dråpene er generert og ferdige, vises på skjermen. Hvis dråpegenerering stanser av en hvilken som helst årsak, vises meldingen «Run Terminated» på AutoDG‑skjermen. Hvis kjøringen avbrytes, fastslå årsaken til feilen og følg instruksjonene i avsnittet om feilsøking.

8. Ved fullført dråpegenering, fjern og forsegl «dråpeplaten» med en perforerbar forseglingsfolie innen 30 minutter etter fullført kjøring.

ADVARSEL: Ved fullført AutoDG-kjøring er det viktig å forsegle platen med folie og starte termosykling innen 30 minutter.


ii. Plasser RT‑platen på den romtempererte blokken.

12006672NOrevB 17


iii. Dekk til platen med et ark perforerbar forseglingsfolie. Den røde stripen skal være synlig når folien plasseres på platen.

iv. Trykk på knappen Seal for å forsegle platen. Dette vil lukke døren og starte varmeforseglingen.



9. Nå er dråpeplaten klar for termosykling (PCR).

PCR-AMPLIFISERING (TERMOSYKLING)Når 96‑brønns platen som inneholder dråpene er forseglet, plasser den i termosykleren for PCR‑amplifisering.

ADVARSEL: Før montering, påse at arbeidsbenken og instrumentoverflateområdet er skikkelig rengjort med 10 % blekemiddel og 70 % alkohol.

Følg protokollen for termosykling i tabell 6 for optimale QXDx BCR‑ABL‑resultater.

SyklustrinnAntall

sykluserTemperatur

(°C)Tid Rampehastighet

Enzymaktivering 1 95 10 min

2 °C/s

Denaturering 5 94 30 s

Hybridisering/forlengelse 60 1 min

Denaturering 35 94 30 s

Hybridisering/forlengelse 64 1 min

Enzymdeaktivering 1 95 10 min

Dråpestabilisering 1 4 30 min

Venting (valgfritt) 1 4 24 timer

Tabell 6: BCR‑ABL/ABL1‑protokoll for termosyklisk arbeidsforløp

ADVARSEL: Det er avgjørende å sette rampehastigheten til 2 °C/s, siden standard rampehastighet er annerledes for ulike syklere.

MERKNAD: Hvis du bruker en C1000 Touch Thermal Cycler, bruk oppvarmet lokk (heated lid) innstilt til 105 °C og angi prøvevolumet til 40 μl (standard prøvevolum er 30 μl). Se i tillegg i håndboken til C1000 Touch Thermal Cycler for konfigurering av protokollen.

For andre termosyklere, se vedlegg A for foreslåtte innstillinger.

DRÅPELESING

Klargjøre for datainnsamling1. Før avlesning av platen, konfigurer en malfil for platen. Dette kan gjøres enten på instrumentets datamaskin

eller på en arbeidsstasjon som kjører QuantaSoft 1.7.4. Plateinnstillingene er som følger:

• Experiment: RED

• Supermix: ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)

• Target1: Name: BCR‑ABL

• Target1: Type: Ch1 Unknown

• Target2: Name: ABL

• Target2: Type: Ch2 Unknown

18 12006672NOrevB


Figur 8 viser et bilde av QuantaSoft‑panelet og innstillingene.

Figur 8: Oppsett‑parametre for Droplet Reader2. Hver prøve i de brukte brønnene bør navngis. Standardnavnene for de kjente prøvene er:

• NTC – kontroll uten mal.

• Hi Pos – høy positiv kontroll.

• Neg – negativ kontroll

• Lo Pos – lav positiv kontroll.

• ~0,1 %IS – kalibratorkontroll med omtrent 0,1 %IS.

• ~10 %IS – kalibratorkontroll med omtrent 10 %IS.

• Buffer – prøver som ikke vil leses, disse tilsettes for å utfylle delvis brukte kolonner.

3. Navngi de ukjente prøvene i henhold til dine laboratorieprosedyrer. Se i programvarehåndboken for mer informasjon.

ADVARSEL: Påse at alle de åtte brønnene i kolonnene som skal leses, er fylt. Bruk bufferløsning til å fylle en tom brønn ved behov.

Datainnsamling1. På instrumentdatamaskinen, start QuantaSoft og last malfilen for at platen skal kjøres. Påse at all

informasjon er fullstendig og riktig.

2. Trykk på knappen Run i det venstre panelet. Leseren vil starte å lese dråper fra de valgte brønnene og vil utføre midlertidig automatisk analyse. Du kan se fremdriften og datakvaliteten under økten.

ADVARSEL: Ikke forstyrr innsamlingsprosessen: ikke bruk datamaskinen til noen andre oppgaver og minimer vibrasjoner rundt systemet.

3. Etter fullført kjøring lagres en «*.qlp»‑fil på harddisken til instrumentets datamaskin. Denne filen kan analyseres på den samme datamaskinen eller på en arbeidsstasjon som kjører QuantaSoft 1.7.4.

4. Kast platen i henhold til lokale, statlige eller føderale lover og forskrifter om avfallshåndtering.

12006672NOrevB 19


ANALYSELast QLP‑filen som er generert av leseren og velg Analyze i det venstre panelet.

1. Kontroller godkjente hendelser.

a. Velg alle brønner.

b. Klikk på knappen Events og avmerkingsboksen Total.

c. Alle brønner med mindre enn 10 000 godtatte hendelser skal ekskluderes fra videre analyse.

d. Registrer alle brønner som skal ekskluderes.

2. Klargjør for terskelbestemmelse.

a. Klikk på knappen 2D Amplitude.

b. Klikk på Options og velg fixed for å låse aksen.

3. Bekreft positive kontroller og terskler.

a. Velg brønnene med Hi Pos‑prøven.

b. Angi terskler ~ 1/3 mellom de negative og de positive klyngene i hver kanal. 2D‑plottet skal se ut som i figur 9.

Figur 9: 2D for positiv kontrollc. Registrer terskelverdier.

4. Angi terskler for hele platen.

20 12006672NOrevB


a. Velg alle brønner.

b. Bruk vanlige platenivåterskler for utvalget ved å bruke nivåene for Hi Pos‑tersklene.

5. Kontroller andre kontroll‑ og kalibratorterskler.

a. NTC‑er – Hvis mer enn 10 ABL‑kopier eller 1 BCR‑ABL‑kopi registreres, mislykkes analysen.

b. Alle andre kjente prøver – bekreft at terskler ikke går gjennom noen klynger.

6. Inspiser tersklene på ukjente prøver.

a. Bekreft at de ikke går rett gjennom klynger.

b. Kontroller om det finnes andre uvanlige fenotyper.

| Se i vedlegg for eksempler på uvanlige fenotyper.

c. Ekskluder utsatte brønner fra videre analyse eller juster tersklene ved behov.

Dataeksport1. Velg alle brønnene og fjern merkingen på ekskluderte brønner ved å Ctrl‑klikke på hver av dem.

2. Velg Both i rullegardinboksen og klikk på Export CSV for å lagre data i sammenslåtte format og enkeltbrønnformat til en CSV‑fil.

Alle prøver med mer enn én godkjent brønn vil slås sammen på et digitalt dråpenivå. Alle prøver med kun én godkjent brønn vil rapporteres på enkeltbrønnnivå. Digital sammenslåing er den mest nøyaktige metoden for dataaggregering og vil gi de mest sensitive og robuste målingene.

Resultater

CSV‑filen inneholder data i tabellformat. Hver rad er en individuell prøve (sammenslått eller ikke). Når sammenslåing er brukt, endres brønnbetegnelsen til Mxx for å angi sammenslåtte brønner. Når brønner ikke er sammenslått, bevares opprinnelig navngiving (dvs. A01, A02 osv.). Kolonnen med topptekst Ratio inneholder forholdet mellom BCR‑ABL/ABL‑kopier. Bruk disse formlene for å beregne %IS‑forhold og MR‑nivå.

%IS = Ratio × 100 × CF

MR = log10(100%IS) – log10(%IS) = 2 – log10(%IS)

CF er den lotspesifikke konverteringsfaktoren og finnes i pakningsvedlegget til settet.

Hvis brønner er ekskludert, kan noen prøver ha bare en enkelt brønn rapportert. Resultater (BCR‑ABL og ABL) fra disse enkeltbrønnene finnes i CSV‑filen under resultatene fra de sammenslåtte brønnene.

12006672NOrevB 21


KVALITETSKONTROLL

Kontroller

Settet leveres med tre kontroller. For å rapportere de ukjente prøvene må følgende kriterier oppfylles:

Kontrollnavn Funksjon Forventet resultat

Hi Pos Høy positiv kontroll MR0,3–MR1 (10–50 %IS)

Neg Negativ kontroll Neg. (mindre enn MR5,3 / 0,0007 %IS)

Lo Pos Lav positiv kontroll MR3–MR5 (0,001–0,1 %IS)

Kalibratorkontroller

To kalibratorkontroller medfølger. De brukes til å sikre at settet kan kvantifisere på riktig måte. Verdiene som oppnås for hver kalibratorkontroll brukes ikke til å endre rapporterte verdier i de ukjente prøvene. Påse at de rapporterte %IS‑verdiene er som forventet:

Kalibratorkontrollnavn Forventet resultat

~0,1 %IS Mellom min. og maks verdi angitt i vedlegget

~10 %IS Mellom min. og maks verdi angitt i vedlegget

Ukjente prøver

Testen tillater å bruke to eller flere brønner per ukjente prøve. Hver brønn skal rapportere minst 10 000 ABL‑kopier per kryssanbefalinger6. Du kan velge å bruke brønner med mindre enn 10 000 ABL‑kopier, men dette kan føre til lavere sensitivitet for denne prøven. Digital sammenslåing samler alle kopiene av ABL‑ og BCR‑ABL‑transkripter fra alle brønnene som ble brukt til å gi et totalt forhold mellom BCR‑ABL/ABL‑kopier, uttrykt som %IS og MR‑nivå. Ytterligere kontroller for samsvar mellom brønnene kan utføres ved behov.

ADVARSEL: I tilfeller hvor kun én brønn per prøve er gyldig, kan det hende at antallet ABL‑kopier ikke er tilstrekkelig til å få høye MR‑nivåer. Kontroller ABL‑kopier per brønn i CSV‑filen for å bekrefte sensitiviteten.

TOLKNING AV RESULTATENENår alle kontroll‑ og kalibratorkontroll‑testene er godkjent, kan resultater fra ukjente prøver rapporteres. Generelt vil bruk av flere brønner per prøve gi høyere sensitivitet.

Gjeldende anbefalinger fra European LeukemiaNet (ELN) er oppsummert som følger:

BCR-ABL (IS) 3 måneder 6 måneder 12 måneder > 12 måneder

> 10 %

1 %–10 %

0,1 %–< 1 %

< 0,1 %

Kode Kliniske betraktninger

RØD Evaluer pasientetterlevelse og legemiddelinteraksjoner Mutasjonsanalyse

GUL Evaluer pasientetterlevelse og legemiddelinteraksjoner Mutasjonsanalyse

GRØNN Overvåk respons og bivirkninger

22 12006672NOrevB


FEILSØKINGddPCR er en svært sensitiv teknologi som tillater deteksjon og karakterisering av problemer med prøven, reagens eller instrumentering på en robust og pålitelig måte. Følgende lister opp de vanligste feilmodi med sine fenotyper, beskrivelser og foreslåtte løsninger.

Fragmentering – noen dråper fragmenteres, vanligvis ved avlesning (se figur 10).

Løsning: Ikke bruk dataene, ekskluder brønnen. Hvis problemet vedvarer, kontroller om det kan være partikkelkontaminering i laboratoriet.

Problem NormalProblem Normal

Figur 10: Fragmentering – problem kontra normal

12006672NOrevB 23


Delte klynger – dråpepopulasjoner er ikke tydelig separert, vanligvis pga. problemer med RT‑reagensen (se figur 11).

Løsning: Juster brønntersklene hvis mulig. Ofte endres ikke antallene vesentlig. Ellers, ekskluder brønnen.


Figur 11: Delte klynger – problem kontra normal

Speiling – dråper med to ulike størrelser (se figur 12).

Løsning: Ekskluder brønnen fra analysen.


Figur 12: Speiling – problem kontra normal

24 12006672NOrevB


Termosyklersvikt – temperaturprofilavvik fører til dårlig PCR (se figur 13).

Løsning: Ekskluder brønnen fra analysen. Sjekk ytelsen til termosykler.


Figur 13: Termosyklisk arbeidsforløp – problem kontra normal

Plateforseglingssvikt – plateforsegling mislyktes, fordampning har ført til ulike dråpevolum (se figur 14)

Løsning: Ekskluder brønnen fra analysen. Kontroller ytelsen til plateforsegleren..


Figur 14: Plateforseglingssvikt – problem kontra normal

12006672NOrevB 25


EGENSKAPER FOR ANALYTISK YTELSE

LoB (grense for blank)

Denne studien fulgte CLSI EP17‑A2, Evaluation of Detection Capability for Clinical Laboratory Measurement Procedures. 36 prøver fra ikke‑leukemiske humane RNA‑prøver som var antatt negative for BCR‑ABL ble brukt. Hver negative prøve ble testet i et 2‑brønns sett med 1 instrument, 1 operatør, 2 lot over 3 dager, for totalt 72 uavhengige målinger. Alle resultatene ble rangert etter totalt antall registrerte BCR‑ABL‑kopier. 95‑prosentkvantilen var mellom prøvenummer 68 og 69, som begge hadde 0 BCR‑ABL‑kopier. Dermed er LoB ved 95 % 0 BCR‑ABL‑kopier i 2 brønner.

I tillegg ble 48 NTC‑prøver (kontroll uten mal) kjørt i 2 brønner med 1 operatør, 1 instrument, 3 kjøringer og 2 lot. Prøvene ble rangert etter totalt antall registrerte BCR‑ABL‑kopier, med en 95‑prosentkvantil mellom nummer 46 og 47. For begge lottene var LoB 0 BCR‑ABL‑kopier.

LoD (deteksjonsgrense)

Denne studien fulgte CLSI EP17‑A2, Evaluation of Detection Capability for Clinical Laboratory Measurement Procedures. Tre positive BCR‑ABL RNA‑pasientprøvepuljer ble klargjort for å oppnå omtrent MR4,0‑verdier. Pulje 1 inneholdt en blanding av 15 pasienter som var positive for E13a2‑ og/eller E14a2‑variantene. Pulje 2 inneholdt 5 pasienter som var positive for E13a2‑varianten. Pulje 3 inneholdt 5 pasienter som var positive for E14a2‑varianten. En negativ BCR‑ABL RNA‑prøvepulje ble klargjort og brukt i fortynningen av de positive pasientprøvepuljene. Hver positive pulje ble fortynnet i serie med den negative puljen. De resulterende MR‑nivåene spredte seg mellom MR4,0 og MR6,0. Fortynningene ble testet i 20 replikater av 1 operatør på 1 system med 2 uavhengige lot, i 2 brønner per test. Analyser med Probit‑metoden ga en LoD på 95 % konfidensnivå ved MR4,7 (0,002 %IS).

I tillegg ble en prøve fra College of American Pathologists (CAP) ferdighetstestprogram ved CAP tilordnet MR4,7 analysert i 60 enkeltbrønner (20 uavhengige RT‑reaksjoner, hver med 3 ddPCR‑uavhengige reaksjoner, 1 operatør, 1 lot, 1 instrument). In silico‑kombinasjon av individuelle brønner i 2‑brønns tester og 4‑brønns tester gav samme LoD ved MR4,7 i 2‑brønns og LoD på MR5,0 i 4‑brønns tester.

LoQ (grense for kvantifisering)

Denne studien fulgte CLSI EP17‑A2, Evaluation of Detection Capability for Clinical Laboratory Measurement Procedures. Det samme settet med prøver og eksperimenter som i LoD‑studien ble brukt. Fortynninger var spente fra MR4,0 til MR6,0. Målt %CV var mindre enn 76 % ned til MR4,7‑nivå (0,002 %IS). Grensen for kvantifisering er MR 4,7 (0,002 %IS) i 2 brønner.

Presisjon

Presisjonen ble bekreftet som SD ≤ 0,25 for MR‑verdier ≤ 4,6. Denne studien fulgte CLSI EP5‑A3, Evaluation of Precision of Quantitative Measurement Procedures. Studien ble kjørt over 3 dager med 2 instrumenter og 3 reagenslot, av 2 operatører og 3 like økter. Prøver ved 8 ulike %IS‑nivåer – MR0,7, MR1,4, MR2,4, MR2,8, MR3,3, MR3,6, MR4,1 og MR4,6 – ble testet. Tabell 7 oppsummerer den målte totale unøyaktigheten i MR‑ og %IS‑enheter.

26 12006672NOrevB


MR %IS

Prøvenavn N Gjennomsnitt SD %CV N Gjennomsnitt SD %CV

Hi Pos 108 0,7 0,02 2,4 108 20,1 0,8 3,8

MR1 96 1,4 0,03 2,2 108 4,3 0,3 7,0

MR2 108 2,4 0,05 1,9 108 0,4 0,04 10,3

MR2,5 108 2,8 0,05 1,8 108 0,2 0,02 11,1

MR3 108 3,3 0,08 2,5 108 0,05 0,01 17,9

MR3,5 108 3,6 0,1 2,9 108 0,03 0,006 22,3

MR4 108 4,1 0,17 4,0 108 0,008 0,003 37,0

Lo Pos 107 4,6 0,25 5,4 108 0,003 0,002 70,7

Tabell 7: Presisjonsoppsummering

Linearitet

Lineariteten ble demonstrert fra minst MR0,3 (50 %IS) til MR4,7 (0,002 %IS). Denne studien fulgte CLSI EP6‑A2, Evaluation of the Linearity of Quantitative Measurement Procedures. 10 KML‑positive humane prøver med de to transkripsjonene e13 og e14 (5 hver) ble blandet og fortynnet i en KML‑negativ human blodprøve. Fortynningsnivåene strakte seg fra MR0,3 (50 %IS) til MR4,7 (0,002 %IS). For e14‑blandingen ble ytterligere RNA, ekstrahert fra en ikke‑reaktiv positiv 3t3‑cellelinje, tilsatt for å normalisere til 100 ng/μl. Den negative humane prøven ble stimulert av en negativ HeLa‑cellelinje for å øke ABL‑nivået. Testing ble utført med 2 termosyklere og 2 lesere over 4 dager av en enkelt operatør. Både e13‑ og e14‑blandingene utviste linearitet med R2 på 0,996 for begge (se figur 15 og 16). Målte stigningstall var henholdsvis 1,03 og 1,04. I tillegg ble 2. og 3. ordens polynomiske passformer vurdert. Fra 2. ordens passform, var de absolutte avvikene fra 1. ordens linearitet ≤ 0,09 MR‑enheter for alle nivåer.

Forventet %IS

Mål

t %IS

Figur 15: e13a2‑linearitet

12006672NOrevB 27


Forventet %IS

Mål

t %IS

Figur 16: e14a2‑linearitet

RAPPORTERBART OMRÅDEDet rapporterbare området strekker seg fra den øvre grensen for linearitet ved MR0,3 (50 %IS) til LoQ MR4,7 (0,002 %IS).

Sporbarhet

Sporbarheten til WHOs primære referansematerialer ble bekreftet med stigningstall på 1,0 og skjæringsparameter på 0,0–0,1. Sporbarheten til WHOs første internasjonale genetiske referansepanel for kvantifisering av BCR‑ABL‑translokasjon ved RQ‑PCR (NIBSC‑kode: 09/138) ble demonstrert ved å måle WHOs referansepanel med 3 lot med kalibratorkontroller og 5 lot med uavhengige reagenslotter og sammenligne de målte verdiene med verdiene publisert i referansepanelets bruksanvisning (NIBSC, 2012). Hver av WHOs 4 referansepanelmedlemmer ble testet med 5 reagenslotter i 4 replikasjoner på tvers av 5 økter (1 økt per lot).

De målte MR‑verdiene for hvert nivå med WHOs primære panel ble justert med en felles avledet korreksjonsfaktor, KF=0,93. De målte MR‑verdiene ble sammenlignet med de publiserte MR‑verdiene i en ekstra regresjonsanalyse for å bestemme stigningstall og skjæringsverdier. Analysen viste utmerket korrelasjon med R2‑verdier på 1,0. Stigningstallet for linjene var mellom 0,98 og 1,04 og skjæringspunktene ble beregnet til mellom ‑0,06 og 0,07.

Analytisk spesifisitet

Analytisk spesifisitet støtter utelukkende deteksjon av BCR‑ABL1‑transkripsjonene e13a2 og e14a2, ingen kryssreaktivitet med transkripsjonene e1a2 (p190) og e19a2 (p230) til minst MR5,0‑nivå. 2 prøver ble klargjort ved å blande in vitro‑transkribert p190 eller p230 med RNA ekstrahert fra normalt humant blod fra 2 donorer. 4 fortynninger av hver prøve ble klargjort ved å variere mengden negativt RNA brukt til å oppnå nivåer på 0,005–30 % forhold. Alle prøvene ble testet på 1 instrument med 1 lot av 1 operatør i minst 4 replikasjoner. Alle målingene rapporterte 0,000 %IS for både e13a2 og e14a2. Settet er angitt til minst MR5,0‑nivå.

28 12006672NOrevB


EGENSKAPER FOR KLINISK YTELSE34 kliniske prøver ble innsamlet og behandlet ved et uavhengig klinisk laboratorium i Europa. Standard laboratorieprosedyrer ble fulgt for prøvebehandling og analyse av den laboratorieutviklede qPCR‑testen, som var kalibrert til WHOs IS‑standard. Testen QXDx™ BCR‑ABL %IS ble utført i fire brønner. Analyse av dataene ble utført både i 4‑brønns og i 6 2‑brønns par (format vises i figur 17). Reproduserbarhet vurdert fra de 6 2‑brønns replikasjonene var utmerket, med maksimal %CV på 46 % (i %IS‑rom) for prøven nær MR4,0, sammenlignbar med verdiene fra de analytiske reproduserbarhetsstudiene.

Samsvar mellom den laboratorieutviklede kliniske qPCR‑testen og QXDx BCR‑ABL %IS‑testen var også utmerket, R2 på 0,976 og stigningstall på 1,03. Samsvar i MMR‑status (MR3 eller 0,1 %IS) var utmerket på 98 %. En enkelt uoverensstemmende prøve var feil med 0,35 log.

qPCR klinisk test, MR

QXD

xTM

BSR

‑ABL

%IS

‑test

, MR

Figur 17: Klinisk ytelse

BEGRENSNINGERTesten er kun utformet til å registrere e13a2‑ og e14a2‑fusjonstranskripsjoner og ikke e1a2, e19a2 eller andre sjeldne transkripsjoner som stammer fra t(9;22).

12006672NOrevB 29


REFERANSER1. Baccarani M, et al. European LeukemiaNet recommendations for the management of chronic myeloid

leukemia: 2013. Blood 2013, 122:872‑884.

2. Branford S, et al. Desirable performance characteristics for BCR‑ABL measurement on an international reporting scale to allow consistent interpretation of individual patient response and comparison of response rates between clinical trials. Blood 2008, 112:3330‑38.

3. Brown JT, et al. Establishment of a standardized multiplex assay with the analytical performance required for quantitative measurement of BCR–ABL1 on the international reporting scale. Blood Cancer Journal 2011, 1:e13.

4. Hughes T, et al. Monitoring CML patients responding to treatment with tyrosine kinase inhibitors: review and recommendations for harmonizing current methodology for detecting BCR‑ABL transcripts and kinase domain mutations and for expressing results. Blood 2006, 108:28‑37.

5. White HE et al. Establishment of the first World Health Organization International Genetic Reference Panel for quantitation of BCR‑ABL mRNA. Blood 2010, 116: e111–e117.

6. Cross NC et al. Laboratory recommendations for scoring deep molecular responses following treatment for chronic myeloid leukemia. Leukemia. 2015 May;29(5):999‑1003. doi: 10.1038/leu.2015.29.

7. National Comprehensive Cancer Network (NCCN). Clinical Practice Guidelines in Oncology: Chronic Myelogenous Leukemia. v.1.2015.

8. https://www.leukemia‑net.org/content/leukemias/cml/recommendations/

30 12006672NOrevB


VEDLEGG A: TERMOSYKLEREPåkrevde spesifikasjoner: Termosykler med spesifikasjoner som tilsvarer følgende:

| Nøyaktighet: +/‑ 0,2 °C

| Ensartethet: +/‑ 0,4 °C mellom brønnene innen 10 s

| Justerbar rampekapasitet med nødvendig rampehastighet: inntil 2 °C/s

| Temperaturområde: 0–100 °C

Termosyklere: En studie ble utført for å demonstrere at ulike termosyklerinstrumenter var ekvivalente for bruk med QXDx™ BCR‑ABL %IS Kit. Termosykleren nedenfor oppfyller spesifikasjonskravene angitt ovenfor. Denne studien evaluerer følgende fire termosyklere:

Termosykler Katalognummer Instrumenttype Rampeinnstilling95 % KI m/

± 0,5 log som referanse

Bio‑Rad C1000 Touch™ Thermal Cycler with 96–Deep Well Reaction Module

185‑1197 Referanse 2 °C/s

Bio‑Rad C1000 Touch Thermal Cycler with 96‑Well Fast Reaction Module

185‑1196 Test 2 °C/s Godkjent

Life Technologies Veriti Dx 96‑well Thermal Cycler, 0,2m

4452300 Test2 °C/s (93 %

rampehastighet)Godkjent

Eppendorf Mastercycler® Pro, with Control Panel, 230 V/50 – 60 Hz

6321000515 Test20 %

rampehastighetGodkjent

For hver prøve ble det tillatte området beregnet som den gjennomsnittlige MR‑verdien oppnådd på referansetermosykleren (Bio‑Rad C1000 Touch Thermal Cycler with 96 Deep well reaction module) pluss eller minus 0,5 log. Alle prøvene som ble testet, oppfylte 95 % konfidensintervallet (KI).

12006672NOrevB 31


VEDLEGG B: NAVNEENDRING

9. juni 2017

Emne: Endring av merkevarenavn for ddPCR-diagnostikkprodukt

Til verdsatte kunde

Siden den første lanseringen av Bio‑Rad Droplet Digital PCR‑plattformen har Bio‑Rad brukt QX200 Droplet Digital PCR til å identifisere systemets merkevare.

Som en del av Bio‑Rads teknologiske overgang fra RUO‑verktøy til en diagnostisk løsning, har vi på Bio‑Rad besluttet å identifisere den diagnostiske produktlinjen med et nytt produktfamiliemerke som heter: QXDx™. Derfor vil vi jobbe for å oppdatere ethvert nåværende og fremtidig diagnostikkprodukt med en merkevareprefiks QXDx™.

Produktmerket og den resulterende navnendringen påvirker ikke formen, egnetheten, funksjonen eller kravene til de spesifikke produktene.

Fra 15. juni 2017 vil kommersiell dokumentasjon oppdateres i en etappevis prosess over en tidsperiode for å gjenspeile merkevaren QXDx™ som skal identifisere diagnostisk produktlinje for digital PCR.

I denne etappevise prosessen vil vi henvise til produktet med to navn: Det registrerte navnet og et proprietært/vanlig navn til vi har fullført registreringen av det vanlige navnet som det registrerte navnet.

Prøvedokumentasjon vil bruke det proprietære og det registrerte navnet. Og deretter hurtig gå over til å bruke det proprietære navnet i resten av bruksområdene. Produktene som vil ha et proprietært navn er som følger:

Instrumentasjonssystem:

Katalognr. Registrert navn Proprietært/vanlig navn (nytt)

17002229 QX200 AutoDG™ Droplet Digital PCR Dx System QXDx AutoDG ddPCR System

12001045 QX200 Droplet Reader, IVD QXDx Droplet Reader

12001630 QX200 Automated Droplet Generator, IVD QXDx Automated Droplet Generator

17000034 QX200 Droplet Digital PCR Dx System QXDx ddPCR System

12001045 QX200 Droplet Reader, IVD QXDx Droplet Reader

12001049 QX200 Droplet Generator, IVD QXDx Droplet Generator

32 12006672NOrevB


Reagenser og forbruksvarer:

Katalognr. Registrert navn Proprietært/vanlig navn

17001378 ddPCR Dx Universal Kit for AutoDG QXDx Universal Kit for AutoDG ddPCR System

12001922 ddPCR Dx AutoDG Consumable Pack QXDx AutoDG Consumable Pack

12003031 ddPCR Dx AutoDG Supermix Pack QXDx AutoDG Supermix Pack

12002526 ddPCR Dx Droplet Reader Oil Pack QXDx Droplet Reader Oil Pack

17001379 ddPCR Dx Universal Kit for QX200 ddPCR System QXDx Universal Kit for ddPCR System

12001921 ddPCR Dx Consumable Pack QXDx Consumable Pack

12002544 ddPCR Dx Supermix Pack QXDx Supermix Pack

12002526 ddPCR Dx Droplet Reader Oil Pack QXDx Droplet Reader Oil Pack

Med vennlig hilsen

markedsføringsleder,

Bio‑Rad, Digital Biology Center

12006672NOrevB 33


Clinical Diagnostics Group

4000 Alfred Nobel Drive Hercules, California 94547Telephone (510) 724-7000FAX (510) 741-6373www.bio-rad.com/diagnostics

Australia, Bio-Rad Laboratories Pty. Ltd., Level 5, 446 Victoria Road, Gladesville NSW 2111 • Phone 61-2-9914-2800 • Telefax 61-2-9914-2888Austria, Bio-Rad Laboratories Ges.m.b.H., Hummelgasse 88/3-6, A-1130 Vienna • Phone 43-1-877-8901 • Telefax 43-1-876-5629Belgium, Bio-Rad Laboratories N.V., Winninglaan 3, BE-9140 Temse • Phone +32 (3)710-53-00 • Telefax +32 (3)710-53-01Brazil, Bio-Rad Laboratórios Brasil Ltda, Rua Alfredo Albano da Costa, 100, Lagoa Santa - MG, CEP: 33400-000 • Phone +55 (31)3689-6600 • Telefax +55 (31)3689-6611Canada, Bio-Rad Laboratories, Ltd., 2403 Guénette Street, Montréal, Québec H4R 2E9 • Phone 1-514-334-4372 • Telefax 1-514-334-4415China, Bio-Rad Laboratories Shanghai Ltd., 3rd Floor, #18 Dong Fang Road, Bldg E, Poly Plaza, Pudong, Shanghai, PRC 200120 • Phone 86-21-61698500 • Telefax 86-21-61698599Czech Republic, Bio-Rad spol. s r.o., Nad ostrovem 1119/7, 147 00 Prague 4 • Phone 420-241-430-532 • Telefax 420-241-431-642Denmark, Bio-Rad Laboratories, Symbion Science Park, Fruebjergvej 3, DK-2100 Copenhagen East • Phone +45-4452-1000 • Telefax +45-4452-1001Finland, Bio-Rad Laboratories, Linnanherrankuja 16, FIN-00950 Helsinki • Phone 358-9-804-22-00 • Telefax 358-9-7597-5010France, Bio-Rad, 3 boulevard Raymond Poincaré, 92430 Marnes-la-Coquette • Phone 33-1-47-95-60-00 • Telefax 33-1-47-41-91-33Germany, Bio-Rad Laboratories GmbH, Heidemannstrasse 164, D-80939 Munich • Phone +49 (0)89-318-840 • Telefax +49 (0)89-31884-100Greece, Bio-Rad Laboratories M E.P.E, 2-4 Mesogeion Street, Fourth Floor 115 27 Athens • Phone 30-210-7774396 • Telefax 30-210-7774376Hong Kong, Bio-Rad Pacific Ltd., Unit 1101, 11/F DCH Commercial Centre, 25 Westlands Road, Quarry Bay • Phone 852-2789-3300 • Telefax 852-2789-1290Hungary, Bio-Rad Hungary Ltd., H-1082 Budapest, Futo Street 47-53, Hungary • Phone +36-1-459-6100 • Telefax +36-1-459-6101India, Bio-Rad Laboratories (India) Pvt. Ltd., Bio-Rad House, 86-87, Udyog Vihar Phase IV, Gurgaon, Haryana 122 015 • Phone 1800-180-1224 • Telefax 91-124-2398115Israel, Bio-Rad Laboratories Ltd., 14 Homa Street, New Industrial Area, Rishon Le Zion 75655 • Phone 972-3-9636050 • Telefax 972-3-9514129Italy, Bio-Rad Laboratories S.r.l., Via Cellini 18/A, 20090 Segrate, Milan • Phone +39-02-216091 • Telefax +39-02-21609553Japan, Bio-Rad Laboratories K.K., Tennoz Central Tower 20F, 2-2-24 Higashi-Shinagawa, Shinagawa-ku, Tokyo 140-0002 • Phone 81-3-6361-7070 • Telefax 81-3-5463-8481Korea, Bio-Rad Korea Ltd., 10th Floor, Hyunjuk Building, 832-41, Gangnam-gu, Seoul 135-080 • Phone 82-2-3473-4460 • Telefax 82-2-3472-7003Mexico, Bio-Rad, S.A., Avenida Eugenia 197, Piso 10-A, Col. Narvarte, C.P. 03020 Mexico, D.F. • Phone +52 (55)5488-7670 • Telefax +52 (55)1107-7246The Netherlands, Bio-Rad Laboratories B.V., Postbus 222, 3900 AE Veenendaal • Phone +31-318-540666 • Telefax +31-318-542216New Zealand, Bio-Rad New Zealand, 189 Bush Road Unit B, Albany, Auckland • Phone 64-9-415-2280 • Telefax 64-9-415-2284Norway, Bio-Rad Laboratories, Nydalsveien 33, 0484 Oslo • Phone +47-23-38-41-30 • Telefax +46(0)8-5551-2780 Poland, Bio-Rad Polska Sp. z o.o., Nakielska Str. 3, 01-106 Warsaw • Phone 48-22-3319999 • Telefax 48-22-3319988Portugal, Bio-Rad Laboratories, Lda., Edificio Prime, Ave. Quinta Grande, 53 – Fracção 3B Alfragide 26114-521 Amadora • Phone 351-21-472-7700 • Telefax 351-21-472-7777Russia, Bio-Rad Laboratorii, 117105, Russian Federation, Moscow, Varshavskoe sh., 9, Bldg., 1B • Phone +7-495-721-1404 • Telefax +7-495-721-1412Singapore, Bio-Rad Laboratories (Singapore) Pte. Ltd., 27 International Business Park, #01-02 iQuest @IBP, Singapore 609924 • Phone 65-6415-3170 • Telefax 65-6415-3189South Africa, Bio-Rad Laboratories (Pty) Ltd., 34 Bolton Road, Parkwood, Johannesburg 2193 • Phone 27-11-442-85-08 • Telefax 27-11-442-85-25Spain, Bio-Rad Laboratories, S.A., C/ Caléndula, 95, Edificio M. Miniparc II, El Soto de la Moraleja, 28109 Madrid • Phone 34-91-590-5200 • Telefax 34-91-590-5211Sweden, Bio-Rad Laboratories A.B., Box 1097, Solna Strandväg 3, SE-171 54, Solna • Phone +46-8-555-127-00 • Telefax +46-8-555-127-80Switzerland, Bio-Rad Laboratories AG, Pra Rond 23, CH-1785 Cressier • Phone +41 (0)26-674-55-05/06 • Telefax +41 (0)26-674-52-19Taiwan, Bio-Rad Laboratories Taiwan Ltd., 14F-B, No. 126 Nan-King East Road, Sec. 4, Taipei, Taiwan 10546 R.O.C. • Phone 886-2-2578-7189 • Telefax 886-2-2578-6890Thailand, Bio-Rad Laboratories Ltd., 1st & 2nd Floor, Lumpini I Bldg., 239/2 Rajdamri Road., Lumpini, Pathumwan, Bangkok 10330 • Phone 662-651-8311 • Telefax 662-651-8312United Kingdom, Bio-Rad Laboratories Ltd., Bio-Rad House, Maxted Road, Hemel Hempstead, Herts HP2 7DX • Phone +44 (0)20-8328-2000 • Telefax +44 (0)20-8328-2550

For further information, please contact the Bio-Rad office nearest you or visit our website at www.bio-rad.com/diagnostics

Bio-Rad Laboratories, Inc.

Documents

USA - Bio-Rad Laboratories · 2018. 12. 12. · QXDx™ BCR-ABL %IS Kit Bruksanvisning 96 USA: 12006134 UNITED STATES, Bio‑Rad Laboratories, Inc., 5731 W. Las Positas Blvd., Pleasanton,