UROŠ STANI Č - uni-lj.si

UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO

UROŠ STANIČ

RAZGRADNJA NEKATERIH ZDRAVILNIH U ČINKOVIN IN NJIHOVIH METABOLITOV V SIMULIRANIH POGOJIH

ČIŠČENJA ODPADNIH VODA

DEGRADATION OF SELECTED PHARMACEUTICALS AND THEIR METABOLITES IN SIMULATED WASTE

WATER TREATMENT CONDITIONS

DIPLOMSKA NALOGA

Ljubljana, 2010

Diplomsko delo sem opravljal na Fakulteti za farmacijo in na Odseku za znanosti o okolju

Instituta Jožef Stefan pod mentorstvom prof.dr. Marije Sollner Dolenc in somentorstvom

doc.dr. Ester Heath.

Mentorici prof.dr. Mariji Sollner Dolenc se zahvaljujem za pomoč in usmerjanje v času

diplomskega dela. Somentorici doc.dr. Ester Heath in dr. Tini Kosjek se iskreno

zahvaljujem za pomoč, svetovanje, potrpljenje in podporo tekom celotnega dela. Za pomoč

pri laboratorijskem delu se zahvaljujem Silvi Perko. Za dodatno pomoč pa se zahvaljujem

še Mihi Avberšku in Renatu Babiču.

Izjava

Izjavljam, da sem diplomsko delo samostojno izdelal pod mentorstvom prof.dr. Marije

Sollner Dolenc in somentorstvom doc.dr. Ester Heath.

Ljubljana, september 2010

1

VSEBINA

1 POVZETEK ............................................................................................................................... 2 2 SEZNAM OKRAJŠAV.............................................................................................................. 4 3 UVOD ........................................................................................................................................ 5

3.1 ZDRAVILNE UČINKOVINE KOT OKOLJSKA ONESNAŽILA ........................................ 5

3.1.1 ZDRAVILNE UČINKOVINE IN NJIHOVA UPORABA .............................................. 5

3.1.2 LASTNOSTI IN DELOVANJE PREUČEVANIH SPOJIN ............................................ 6

3.1.3 LETNA PORABA ZDRAVILNIH UČINKOVIN ......................................................... 11

3.1.4 ZDRAVILNE UČINKOVINE V OKOLJU .................................................................... 12

3.1.5 DOLOČANJE OSTANKOV ZDRAVILNIH UČINKOVIN V ODPADNI VODI ....... 15

3.2 BIOLOŠKO ČIŠČENJE ODPADNIH VOD ......................................................................... 19

3.2.1 POGOJI ČIŠČENJA ODPADNIH VOD ........................................................................ 22

3.2.2 FIZIKALNO-KEMIJSKI PARAMETRI ........................................................................ 26

3.2.3 MEJNE VREDNOSTI PARAMETROV ODPADNE VODE ........................................ 29

4 NAMEN DELA........................................................................................................................ 30 5 MATERIALI IN METODE ..................................................................................................... 31

5.1 MATERIALI .......................................................................................................................... 31

5.2 METODE ............................................................................................................................... 33

5.2.1 PRIPRAVA RAZTOPIN STANDARDOV .................................................................... 33

5.2.2 IZKORISTEK EKSTRAKCIJE IN KALIBRACIJA ...................................................... 34

5.2.3 PILOTNA ČISTILNA NAPRAVA IN VZORČENJE ................................................... 35

5.2.4 DOLOČANJE KEMIJSKIH PARAMETROV ODPADNE VODE ............................... 38

5.2.5 ANALIZNI POSTOPEK DOLOČANJA ANALITOV V VZORCIH............................ 40

6 REZULTATI IN RAZPRAVA ................................................................................................ 45 6.1 IZKORISTKI EKSTRAKCIJE IN LINEARNOST ANALIZNE METODE ........................ 45

6.2 MEJA ZAZNAVNOSTI ANALIZNE METODE ................................................................. 48

6.3 DOLOČANJE KEMIJSKIH PARAMETROV ODPADNE VODE ...................................... 49

6.4 MASNI SPEKTRI PREUČEVANIH SPOJIN....................................................................... 51

6.5 ODSTRANJEVANJE ZDRAVILNIH UČINKOVIN ........................................................... 64

6.6 ODSTRANJEVANJE METABOLITOV............................................................................... 69

6.7 PRIMERJAVA ODSTRANJEVANJA V SKLOPLJENIH IN AEROBNIH REAKTORJIH ...................................................................................................................................................... 71

7 SKLEP ...................................................................................................................................... 72 8 LITERATURA ......................................................................................................................... 74

2

1 POVZETEK

Zdravilne učinkovine in mnogi njihovi presnovki so biološko aktivne spojine, ki po

uporabi v humani ali veterinarski medicini po različnih poteh preidejo v okolje. Številne

raziskave so potrdile njihovo prisotnost v odpadnih, površinskih in podtalnih vodah, zato

smo lahko njihovemu vplivu posredno izpostavljeni z uživanjem pitne vode. Naraščajoča

poraba zdravilnih učinkovin je v začetku devetdesetih let prejšnjega stoletja pripeljala do

začetka obsežnejšega preučevanja njihovega vpliva na okolje.

V diplomskem delu smo preučevali odstranjevanje izbranih zdravilnih učinkovin in

njihovih presnovkov v pilotni čistilni napravi pod aerobnimi in anoksičnimi pogoji ter v

sklopljenem sistemu anoksični-aerobni reaktor. Z merjenjem vrednosti različnih kemijskih

parametrov (amonij, nitrat, nitrit, ortofosfat, kemijska in biokemijska potreba po kisiku)

smo potrdili procesa nitrifikacije v aerobnih ter denitrifikacije v anoksičnih pogojih. Kot

modelne spojine smo izbrali nesteroidne protivnetne učinkovine ibuprofen, naproksen,

ketoprofen in diklofenak, antiepileptik karbamazepin, klofibrinsko kislino, humani

presnovek lipidnega regulatorja klofibrata, presnovka karbamazepina akridin in akridon ter

1-(2,6-diklorofenil)indolin-2-on, presnovek diklofenaka. Visoka letna poraba učinkovin je

potrdila smiselnost njihovega izbora. Spojine smo iz vodnih vzorcev izolirali z ekstrakcijo

na trdnem nosilcu, pri tem smo raztopinam dodali interna standarda devteriran ibuprofen

za zdravilne učinkovine ter 9-kloroakridin za presnovke. Sledila je derivatizacija z N-

metil-N-(tercbutildimetilsilil)-2,2,2-trifluoroacetamidom. Ločbo in analizo smo izvedli s

plinskim kromatografom z masno spektrometričnim detektorjem.

Izkoristki ekstrakcije so bili za vse spojine višji od 76 %. Odstranjevanje ibuprofena,

naproksena, ketoprofena in akridina v aerobnih pogojih je bilo več kot 90-odstotno,

medtem ko so se ostale spojine odstranjevale v manjši meri. V anoksičnih pogojih sta se

najbolje odstranjevala naproksen (87 %) in akridin (64 %), ostale spojine so se

odstranjevale manj kot 13-odstotno. V sklopljenih sistemih so se ibuprofen, naproksen in

ketoprofen statistično značilno bolje odstranjevali kot v posameznih reaktorjih, medtem ko

za druge spojine tega ne moremo trditi.

3

ABSTRACT

Pharmaceuticals and many of their metabolites are biologically active substances that

are used in human and veterinary medicine and subsequently reach the environment

through different pathways. Numerous studies have confirmed their presence in

wastewater, surface and subterranean water, thus we can be subject to their influence

indirectly through consuming drinking water. In the beginning of the 1990s, the increase in

consumption of pharmaceutical products led to the widespread study of their influence on

the environment.

In our work, we have studied the elimination of selected pharmaceuticals and their

metabolites in a pilot wastewater treatment plant under aerobic and anoxic conditions and

in the coupled anoxic-aerobic reactor system. By measuring various chemical parameters

(ammonia, nitrate, nitrite, orthophosphate, chemical and biochemical oxygen demand) we

have confirmed the processes of nitrification in aerobic conditions and denitrification in

anoxic conditions. The model substances used were the non-steroidal anti-inflammatory

drugs ibuprofen, naproxen, ketoprofen and diclofenac, the antiepileptic carbamazepine,

clofibric acid, the human metabolite of the lipid regulator clofibrate, the metabolites of

carbamazepine acridine and acridone, and 1-(2,6-dichlorophenyl)indolin-2-one, a

metabolite of diclofenac. The substantial yearly consumption of the pharmaceuticals

justified our selection. We have used solid phase extraction to isolate the compounds from

the water samples, adding the internal standards deuterated ibuprofen and 9-chloroacridine

(for pharmaceuticals and metabolites respectively) in the process. This was followed by

derivatization with N-methyl-N-(tert-butyldimethylsilyl)-2,2,2-trifluoroacetamide. We

have used gas chromatography coupled with a mass spectrometry detector to perform the

separation and analysis.

The extraction efficiency was above 76% for all studied compounds. The elimination

of ibuprofen, naproxen, ketoprofen and acridine in aerobic conditions was over 90%, while

other compounds were eliminated in a lesser degree. In anoxic conditions, only naproxen

(87%) and acridine (64%) were eliminated substantially, the elimination of all other

compounds was below 13%. The elimination of ibuprofen, naproxen and ketoprofen was

greater in the coupled system than in individual reactors to a statistically significant degree,

while we could not confirm the same for other compounds.

4

2 SEZNAM OKRAJŠAV

OKRAJŠAVA POMEN BPK5 biokemijska potreba po kisiku v petih dneh COX ciklooksigenaza (cyclooxygenase) DKFI 1-(2,6-diklorofenil)indolin-2-on DMS dimetilsilil GC plinska kromatografija (gas chromatography)

GC-MS plinska kromatografija sklopljena z masno spektrometrijo (gas chromatography- mass spectrometry)

KPK kemijska potreba po kisiku LC tekočinska kromatografija (liquid chromatography) LLE ekstrakcija tekoče-tekoče (liquid-liquid extraction) LOD meja zaznavnosti (limit of detection) MS masna spektrometrija (mass spectrometry) MTBSTFA N-metil-N-(tercbutildimetilsilil)-2,2,2-trifluoroacetamid RSD relativna standardna deviacija SCAN snemanje čez celotno masno območje SD standardna deviacija SIM snemanje izbranih ionov (selected ion monitoring) SPE ekstrakcija na trdnem nosilcu (solid phase extraction)

SPME mikroekstrakcija na trdnem nosilcu (solid phase microextraction)

TBDMS terc-butildimetilsilil TBMS terc-butilmetilsilil TOC celotni organski ogljik (total organic carbon)

5

3 UVOD

3.1 ZDRAVILNE UČINKOVINE KOT OKOLJSKA ONESNAŽILA

3.1.1 ZDRAVILNE UČINKOVINE IN NJIHOVA UPORABA

Zdravilo je vsaka snov ali kombinacija snovi, ki se uporablja za zdravljenje ali

preprečevanje bolezni pri ljudeh in živalih, oz. se dajejo, da bi se ponovno vzpostavile,

izboljšale ali spremenile fiziološke funkcije prek farmakološkega, imunološkega ali

presnovnega delovanja ali da bi se določila diagnoza (1).

Številne novo odkrite zdravilne učinkovine so tekom dvajsetega stoletja imele

velikanski vpliv na družbo, predvsem na znatno podaljšanje pričakovane življenjske dobe

in kakovosti življenja posameznika. Mnoge, v preteklosti smrtonosne bolezni, kot so npr.

nekatere bakterijske infekcije, so postale le manjša skrb za javno zdravje. Povečana

pričakovana življenjska doba pa je pripeljala tudi do večje pojavnosti npr. rakavih obolenj,

nevrodegenerativnih in avtoimunih bolezni, posledica česar je povečana potreba po

zdravstveni oskrbi (in zdravilnih učinkovinah) ter vse večji stroški javnega zdravstva (2).

Poleg želenih pa imajo zdravilne učinkovine praviloma tudi neželene učinke, ki so

lahko bolj ali manj škodljivi. Te se skuša tekom razvoja, predkliničnih in kliničnih študij

opredeliti in čim bolj zmanjšati. Pomembno vlogo ima farmakovigilanca, tj. spremljanje in

poročanje o neželenih učinkih zdravil v četrti, t. i. postregistracijski (marketinški) fazi

kliničnih preskušanj, kjer lahko pride do pojava toksičnosti zaradi dolgoročne izpostavitve,

kar je včasih težje ovrednotiti v časovno krajših prvih treh fazah (2).

Zdravilne učinkovine so kompleksne, biološko aktivne spojine, med katerimi vlada

velika raznolikost tako po fizikalno-kemijskih kot po bioloških lastnostih. Delimo jih lahko

glede na delovanje ali pa glede na kemijsko strukturo. Večinoma gre za lipofilne snovi, kar

olajša prehajanje bioloških membran, vendar pa ovira njihovo izločanje. Zato so pogosto

podvržene metabolični transformaciji, ki jo delimo v dve fazi:

- fazo I, v kateri pride do uvedbe ali izpostavitve funkcionalne skupine,

najpogosteje so to reakcije oksidacije, ter

- fazo II, v kateri pride do konjugacije z endogenimi spojinami, npr. glukuronsko

kislino, kar poveča njihovo vodotopnost in tako pospešuje izločanje.

6

To lahko izkoriščamo pri načrtovanju zdravilnih učinkovin v primeru predzdravil, kjer

pride do metabolične pretvorbe biološko neaktivnih v aktivne spojine. V nekaterih

primerih pa imajo lahko metaboliti celo večjo aktivnost in so bolj toksični od osnovne

spojine (2, 3, 4).

3.1.2 LASTNOSTI IN DELOVANJE PREUČEVANIH SPOJIN

V okviru diplomskega dela smo preučevali ibuprofen, naproksen, ketoprofen,

diklofenak in njegov metabolit 1-(2,6-diklorofenil)indolin-2-on, klofibrinsko kislino

(aktiven metabolit klofibrata) ter karbamazepin in njegova metabolita akridin in akridon.

Ibuprofen, naproksen, ketoprofen in diklofenak uvrščamo med nesteroidne protivnetne

učinkovine (NSAID). Prvi trije so derivati propanojske kisline, diklofenak pa je derivat

fenilocetne kisline. Delujejo kot neselektivni inhibitorji encima ciklooksigenaza (COX).

COX katalizira pretvorbo arahidonske kisline v prostaglandine in tromboksane. V telesu se

pojavlja v treh oblikah:

- COX-1 je konstitutiven encim, ki se normalno pojavlja v večini tkiv in sodeluje

pri homeostazi, npr. agregaciji trombocitov, zaščiti gastrointestinalnega trakta

ter regulaciji pretoka skozi ledvice,

- COX-2 je inducibilen encim, kar pomeni, da se izraža le ob določenih dražljajih

(rastni faktorji, citokini, oksidativni stres, razne poškodbe ipd.) in sodeluje pri

vnetnem procesu ter pojavu povišane telesne temperature. Izjemoma se v

nekaterih tkivih (možgani, ledvice) nahaja tudi konstitutivno, vendar njegova

vloga v teh primerih še ni pojasnjena,

- COX-3 se nahaja konstitutivno v možganih, srcu in aorti (2, 4).

Neselektivni inhibitorji ciklooksigenaze delujejo tako na COX-1 kot na COX-2. Imajo

protivnetno in protibolečinsko delovanje ter znižujejo povišano telesno temperaturo.

Običajne indikacije so revmatična obolenja, glavobol, postoperativna bolečina, putika,

dismenoreja ipd. Najbolj pogost neželen učinek je iritacija gastrointestinalnega trakta, ki v

hujših primerih lahko privede celo do ulkusne razjede in je posledica inhibicije COX-1.

Drugi neželeni učinki so motnje pretoka krvi v ledvicah in strjevanja krvi (4).

Klofibrinska kislina je aktiven metabolit klofibrata, ki nastane po hidrolizi esterske

skupine učinkovine. Klofibrat uvrščamo med fibrate. Ti znižujejo nivo plazemskih lipidov,

med drugim znižajo nivo VLDL (posledično tudi trigliceridov) in LDL ter zvišujejo

koncentracijo HDL. Delujejo kot agonisti jedrskih receptorjev PPARα. Glavni učinki so

7

povečanje transkripcije genov za lipoproteinsko lipazo (ta hidrolizira lipide v lipoproteinih)

in povečanje privzema LDL v jetrih, med drugim pa vplivajo tudi na izboljšanje glukozne

tolerance in znižujejo plazemski nivo C-reaktivnega proteina. Med neželene učinke sodi

miozitis, ki se sicer pojavi redko, vendar v hujših oblikah lahko pride celo do rabdomiolize

z mioglobinurijo in akutno odpovedjo ledvic. Do tega največkrat pride pri ljudeh s

poslabšano funkcijo ledvic. Klofibrat tudi poveča verjetnost nastanka žolčnih kamnov in se

zato največkrat uporablja pri bolnikih, ki jim je bil odstranjen žolčnik (4).

Karbamazepin sodi med najbolj uporabljane antiepileptične učinkovine. Deluje na

napetostno odvisne natrijeve kanalčke, in sicer se veže na kanalčke v inaktiviranem stanju.

S tem prepreči prehod kanalčkov iz inaktiviranega v mirujoče stanje ter tako zmanjša

število kanalčkov na voljo za tvorbo akcijskega potenciala, saj depolarizacija nevrona

poveča število kanalčkov v inaktiviranem stanju. Ta sposobnost diskriminacije med

različnimi stanji kanalčka omogoča, da preferenčno blokira vzdraženje celic, ki generirajo

veliko število akcijskih potencialov. Za epileptične napade je značilno visokofrekvenčno

sproščanje električnih impulzov skupine nevronov v možganih, zato se karbamazepin

lahko uporablja za zdravljenje in preprečevanje epileptičnih napadov, učinkovit je

predvsem pri parcialnih in tudi tonično-kloničnih napadih. Druge indikacije so npr.

trigeminalna nevralgija in bipolarne motnje. Med neželene učinke sodijo slabost,

vrtoglavica, ataksija, zadrževanje vode (posledično hipernatriemija) ter različne

gastrointestinalne in kardiovaskularne motnje. Verjetnost pojava neželenih učinkov je sicer

manjša kot pri drugih antiepileptikih. Karbamazepin je tudi močan induktor jetrnih

mikrosomalnih encimov in tako lahko pospešuje presnovo številnih drugih zdravilnih

učinkovin (npr. varfarina, oralnih kontraceptivov, kortikosteroidov itd.) ter s tem zmanjša

njihov učinek (4).

Na slikah 1–6 so predstavljene

njihovih metaboličnih produktov

Slika 1: Ibuprofen in nekateri njegovi pride do njihovega nastanka

Slika 2: Ketoprofen

Slika 3: Naproksen

8

so predstavljene strukturne formule preučevanih spojin in nekaterih

produktov.

: Ibuprofen in nekateri njegovi biotransformacijski produkti ter pogojipride do njihovega nastanka

evanih spojin in nekaterih

transformacijski produkti ter pogoji, pod katerimi

Slika 4: Klofibrat in njegov

Slika 5: Diklofenak in njegov

Slika 6: Karbamazepin in njegova

9

: Klofibrat in njegov humani metabolit klofibrinska kislina

njegov biotransformacijski produkt 1-(2,6-diklorofenil)indolin

in njegova biotransformacijska produkta akridin in akridon

diklorofenil)indolin-2-on

transformacijska produkta akridin in akridon

Na Sliki 7 je predstavljena predlagana pot

akridina in akridona, ki pote

do 10,11-epoksi derivata, sledi kontrakcija sedem

nastane akridin-9-karbaldehid. Po odcepu karbonilne skupine nastane akridin, po nadal

hidroksilaciji pa 9-hidroksiakridin, ki je enolna tavtomerna oblika akridona.

Slika 7: Predlagana pot razgradnje karbamazepina do akridina in akridona

10

Sliki 7 je predstavljena predlagana pot metabolične razgradnje

, ki poteče pod vplivom mikroorganizmov. Najprej pote

epoksi derivata, sledi kontrakcija sedemčlenskega obroča do šest

karbaldehid. Po odcepu karbonilne skupine nastane akridin, po nadal

hidroksiakridin, ki je enolna tavtomerna oblika akridona.

: Predlagana pot razgradnje karbamazepina do akridina in akridona

ne razgradnje karbamazepina do

. Najprej poteče oksidacija

ča do šestčlenskega,

karbaldehid. Po odcepu karbonilne skupine nastane akridin, po nadaljnji

hidroksiakridin, ki je enolna tavtomerna oblika akridona.

: Predlagana pot razgradnje karbamazepina do akridina in akridona (5)

11

3.1.3 LETNA PORABA ZDRAVILNIH UČINKOVIN

V Preglednici II so navedene ocenjene letne porabe zdravilnih učinkovin v Nemčiji

(leto 2001) in Sloveniji (leto 2006). Slednje smo izračunali iz števila izdanih receptov

zdravil za posamezno učinkovino (Preglednica I). Diklofenak in naproksen sta med

najpogosteje predpisanimi zdravilnimi učinkovinami, ibuprofen, ketoprofen in

karbamazepin pa so tudi med pogostejšimi v svojih skupinah glede na indikacije. Klofibrat

v Sloveniji ni registriran.

Preglednica I: Število izdanih receptov (Rp) v RS v letu 2008 (6)

Spojina Rp Spojina Rp ibuprofen 36.233 enalapril 295.366 naproksen 276.688 omeprazol 343.576 ketoprofen 72.467 klofibrat - diklofenak 539.638 atorvastatin 233.928 acetilsalicilna kisl. 451.579 amoksicilin 242.585 paracetamol 548.938 amoksicilin in zav. lakt.b. 263.485 karbamazepin 37.200

Preglednica II: Ocenjena letna poraba zdravilnih učinkovin v Nemčiji (7) in Sloveniji

Spojina Porabljena masa v Nemčiji (t/leto)

Porabljena masa v RS (t/leto)

ibuprofen 128 (1,55 g/preb.) 0,93 (0,47 g/preb.) naproksen - 4,07 (2,04 g/preb.) ketoprofen - 0,41 (0,21 g/preb.) diklofenak 49 (0,59 g/preb.) 1,65 (0,83 g/preb.) karbamazepin 78 (0,95 g/preb.) 1,56 (0,78 g/preb.) klofibrinska kislina 15–21 (0,18–0,25 g/preb.) -

3.1.4 ZDRAVILNE UČINKOVINE V OKOLJU

Vse večja poraba zdravilnih u

pripeljala do začetka preu

Assessment, ERA), podobno kot se je to

učinkovine, ki se uporabljajo v humani in veterinarski medicini,

pridejo v površinske oz. podtalne vode in so posledi

kar je prikazano na Sliki 8.

Slika 8: Poti vnosa zdravil za humano medicino v vodno okolje

Zdravilne učinkovine, ki

prek urina in fecesa izločajo v kanalizacijo in pridejo do

spojinah pride do razgradnje

so odpornejše na razgradnjo in

ostajajo v blatu, odvisno od njihovih fizikalno

uporablja kot gnojilo, lahko zdravilne u

podtalnico. Vir zdravilnih u

neuporabljenih zdravil (8).

Večina zdravilnih učinkovin, ki se uporablj

prehaja v prst. Del se jih tudi prek urina in fecesa pašnih živali direktno izlo

koder lahko ogrožajo podtalnico. V ribogojstvu se zdravilne u

hrani, uvajajo neposredno v vodo

teh uporablja kot gnojilo, lahko zdravilne u

(npr. streptomicini) se uporabljajo v sadjarstvu in

12

ČINKOVINE V OKOLJU

ja poraba zdravilnih učinkovin je v začetku devetdesetih let 20. stoletja

preučevanja njihovega vpliva na okolje (Environmental Risk

, podobno kot se je to že izvajalo za toksične snovi.

inkovine, ki se uporabljajo v humani in veterinarski medicini, lahko

v površinske oz. podtalne vode in so posledično lahko prisotne tudi v pitni vodi

: Poti vnosa zdravil za humano medicino v vodno okolje

inkovine, ki se uporabljajo v humani medicini, in njihovi

čajo v kanalizacijo in pridejo do čistilnih naprav

gradnje v čistilnih napravah, druge spojine (oz. njihovi

na razgradnjo in bodisi neovirano prehajajo v površinske vode bodisi

odvisno od njihovih fizikalno-kemijskih lastnosti. Č

uporablja kot gnojilo, lahko zdravilne učinkovine preidejo v prst in od tod tudi v

Vir zdravilnih učinkovin v okolju je lahko tudi neprimerno

činkovin, ki se uporabljajo v veterini, konča

v prst. Del se jih tudi prek urina in fecesa pašnih živali direktno izlo

koder lahko ogrožajo podtalnico. V ribogojstvu se zdravilne učinkovine, ki se dodajajo

neposredno v vodo. Ta prehaja v lokalne čistilne naprave in

teh uporablja kot gnojilo, lahko zdravilne učinkovine preidejo v prst. Nekateri antibiotiki

(npr. streptomicini) se uporabljajo v sadjarstvu in čebelarstvu (8).

etku devetdesetih let 20. stoletja

Environmental Risk

čne snovi. Zdravilne

lahko po različnih poteh

hko prisotne tudi v pitni vodi (8),

in njihovi presnovki se

istilnih naprav. Pri nekaterih

njihovi presnovki) pa

bodisi neovirano prehajajo v površinske vode bodisi

. Če se blato nato

inkovine preidejo v prst in od tod tudi v

neprimerno odlaganje

a v gnojnici in tako

v prst. Del se jih tudi prek urina in fecesa pašnih živali direktno izloča v zemljo, od

inkovine, ki se dodajajo

istilne naprave in če se blato iz le-

Nekateri antibiotiki

13

Čistilne naprave so verjetno edina možnost za odstranjevanje zdravilnih učinkovin,

zato je pomembno preučevanje kroženja in razgradnje spojin med samim procesom

čiščenja. Pri biotransformaciji zdravilnih učinkovin imajo največjo vlogo encimske

reakcije. Te so običajno zelo kompleksne, obsegajo različne poti (vzporedne,

kompetitivne), lahko prihaja tudi do indukcije ali inhibicije procesov. Pogosto nastane več

razgradnih produktov, ki lahko:

- ohranijo lastnosti matične spojine,

- izkazujejo večjo toksičnost od matične spojine,

- vodijo v sinergistične ali aditivne farmakološke efekte z drugimi prisotnimi

spojinami,

- izgubijo farmakološko aktivnost (9).

Nekatere spojine so težko razgradljive in se lahko kopičijo v okolju, npr.

sulfametoksazol, klofibrinska kislina, eritromicin ipd. Mnoge lahko tudi povzročijo akutne

ali kronične negativne reakcije tako na ekosistemih kot na ljudeh. Hormoni, npr. estrogen,

lahko v koncentracijskem območju zgolj ng L-1 vplivajo na razmnoževanje ali spolni

razvoj, npr. feminizacijo samcev rib (10).

Preglednica III predstavlja izmerjene koncentracije preučevanih spojin v odpadnih,

površinskih in pitnih vodah v različnih državah. Vidimo lahko, da so vsebnosti v odpadni

vodi približno 5–10-krat višje kot v površinskih vodah. V pitni vodi so navadno prisotne v

1000-krat nižjih koncentracijah, izstopata pa predvsem ZDA in Nemčija, ki imata med

omenjenimi državami največ prebivalcev in posledično tudi največjo porabo ter

obremenitev okolja. Opazimo lahko visoke koncentracije karbamazepina in klofibrinske

kisline, obe spojini se namreč slabo razgrajujeta in se kopičita v okolju.

Preglednica IV predstavlja uspešnost odstranitve izbranih zdravilnih učinkovin v

pilotnih čistilnih napravah pod različnimi pogoji čiščenja. Najbolje se odstranjujejo

ibuprofen, naproksen in ketoprofen, medtem ko se diklofenak, karbamazepin in

klofibrinska kislina odstranjujejo v manjši meri. Naproksen se kot edina spojina dobro

odstranjuje tudi v anaerobnih pogojih.

14

Preglednica III: Vsebnost preučevanih spojin v odpadni (Codp), površinski (Cpov) ter najvišja izmerjena vsebnost v pitni (Cpitmax) vodi v nekaterih državah, a koncentracije na iztoku, b koncentracije na vtoku (3, 10, 11, 12, 13)

Spojina Codp (µg L-1)

Cpov (µg L-1)

Cpitmax (ng L-1)

država

ibuprofen 0,05–3,35a

8,8–14,3b

0,05–0,28

do 0,005

3 8,5

1350

0,6

Nemčija Finska ZDA Švedska Francija

naproksen 6,6–20,2b

0,017–0,313

do 0,009

0,2

Švedska Slovenija Francija

ketoprofen do 0,015

8 3

Finska Francija

diklofenak 0,005–1,59a

0,21–0,7b

0,005–0,49 do 0,033

0,009–0,282

6–35 2,5

Nemčija Francija Švedska Slovenija

karbamazepin do 6,9a do 1,1

do 0,056

60 140–258

43,2

Nemčija ZDA Francija

klofibrinska kislina 0,46–1,56a

0,017–0,025b

0,005–0,3 50–270 5,3

Nemčija Italija Švedska

Preglednica IV: Uspešnost odstranitve v pilotnih čistilnih napravah, ana. Anaerobna razgradnja, anox. Anoksična razgradnja

Spojina Uspešnost odstranitve (%) Vir ibuprofen 90–91

90–100 45–47ana. 17–21anox.

(14) (7) (7) (3)

naproksen 86–94 55–85

85–90ana.

(14) (7) (7)

ketoprofen 89–91 (13) diklofenak 49–59

5–45 0–75ana.

34–38anox.

(14) (7) (7) (3)

karbamazepin < 40 0ana.

(7) (7)

klofibrinska kislina 2–6 26–30anox.

(3) (3)

15

3.1.5 DOLOČANJE OSTANKOV ZDRAVILNIH UČINKOVIN V ODPADNI VODI

Določanje vsebnosti zdravilnih učinkovin in njihovih biotransformacijskih produktov v

okolju zahteva identifikacijo in kvantifikacijo sledov v kompleksnih vodnih medijih (npr.

odpadna voda) ter različnih trdnih vzorcih (npr. blato, usedline). Analizne tehnike morajo

zato biti specifične za določene snovi, da jih lahko ločimo od številnih nečistot in

omogočati zaznavo zelo majhnih količin. Za pravilno določanje zdravilnih učinkovin se

tako po derivatizaciji uporablja različne sklopljene sisteme, npr. LC/MS/MS ali

GC/MS/MS (7). Ker so vzorci pogosto preveč kompleksni, razredčeni ali nezdružljivi s

kromatografskim sistemom, da bi omogočali neposredno injiciranje, je potrebna ustrezna

priprava (15). Priprava vzorcev in analiza poteka v več stopnjah:

- vzorčenje,

- izolacija in koncentriranje,

- derivatizacija,

- ločba in identifikacija.

Vzorčenje

Vzorčenje je pomemben korak v analiznem postopku, pri katerem je pomembno

upoštevati spremenljivost samega vira glede na letni čas (poletje, zima), dan v tednu

(delovnik, vikend), meteorološke in geografske značilnosti ipd. Za določanje splošne

obremenitve je priporočljivo proporcionalno vzorčenje (časovno ali pretočno), za

določanje najvišjih koncentracij pa večkratno trenutno vzorčenje. Pomembna je tudi

mikrolokacija vzorčnega mesta (npr. blizu bolnišnic, industrije), zato je za splošno sliko

potrebno zbiranje na več različnih mestih. Ravno tako pa je zelo pomembno shranjevanje

samih vzorcev pri primernih pogojih (npr. v zamrzovalniku, z dodatkom dezinfekcijskih

sredstev ipd.), da ne pride do razgradnje analitov pred analizo (7).

Izolacija in koncentriranje

Postopki izolacije zdravilnih učinkovin morajo biti enostavni, hitri in poceni, morajo

imeti kvantitativne izkoristke izolacije za izbrano spojino. Za izolacijo organskih spojin iz

vodnih vzorcev najpogosteje uporabljamo ekstrakcijo in adsorpcijo (15).

16

Ekstrakcijo tekoče-tekoče (LLE), kjer se spojine porazdelijo med dve fazi (organsko

topilo – voda) glede na svoje fizikalno-kemijske lastnosti, je povečini zamenjala

ekstrakcija na trdnem nosilcu (SPE). Ta ima pred LLE številne prednosti:

- višji izkoristki,

- večja selektivnost, specifičnost in ponovljivost,

- ni nastanka emulzij,

- zmanjšana poraba velikokrat strupenih organskih topil,

- skrajšan čas priprave vzorca,

- možnost avtomatizacije.

Pri SPE se spojine porazdelijo med tekočo in trdno fazo, do katere naj bi imele večjo

afiniteto. Ključna je izbira primerne stacionarne trdne faze (adsorpcijskega sredstva), saj ta

določa parametre, kot so selektivnost, afiniteta in kapaciteta za vezavo. Večinoma gre za

silikate z vezanimi ogljikovodikovimi verigami (C8 do C18), ki določajo polarnost, ionske

izmenjevalce ali različne polimere, npr. kopolimer divinilbenzena in vinilpirolidona (7,15).

Mikroekstrakcija na trdnem nosilcu (SPME) je največkrat neposredno povezana z

analiznim instrumentom (GC-MS). Pri SPME se uporabljajo kolone iz silikatnih vlaken,

prevlečene s tankim filmom polimerne stacionarne faze, ki se za določen čas pomočijo v

vodni vzorec. Prednosti SPME v primerjavi z SPE so manjši volumen vzorca, enostavna

avtomatizacija in visoko koncentriranje. Slabosti pa sta omejena kapaciteta in pogosto

prenizka občutljivost za okoljske vzorce (7).

Derivatizacija

Plinska kromatografija se uporablja za ločbo termično stabilnih hlapnih organskih

spojin. Veliko spojin, še posebej tistih z visoko molekulsko maso in/ali polarnimi

funkcionalnimi skupinami, ni stabilnih pri visokih temperaturah oz. ne prehajajo v plinsko

fazo. Temu se lahko izognemo z derivatizacijo teh spojin, tj. pretvorbo v nepolarne,

termično stabilne in hlapne oblike (15).

Derivatizacijski reagent je sestavljen iz nepolarnega organskega dela, ki omogoča

hlapnost, vpliva pa tudi na obseg derivatizacije zaradi steričnih in elektronskih efektov, ter

reaktivne skupine (15).

Med najbolj razširjenimi metodami

estrov in etrov, reagenti, ki se za to uporabljajo

trifluoroacetamid (MTBSTFA

N,O-bis(trimetilsilil)-trifluoracetamid

predstavljena na Sliki 9) poteka v brezvodnih pogojih, na uspešnost reakcije pa vplivajo

izbor sililnega reagenta, topila in temperature

Slika 9: Splošna shema reakcije siliranja

Ločba in identifikacija

Za ločbo analitov se najpogosteje uporabljajo razli

na mobilno fazo ločimo:

- plinsko kromatografijo

- superkritično teko

(tekočina) nad kriti

- tekočinsko kromatografijo

(15).

Pri GC in LC se spojine med ponavljajo

porazdelijo med stacionarno in mobilno fazo glede na njihovo afiniteto do ene ali druge.

Ločba je posledica različnega

Plinsko kromatografijo pogosto uporabljamo

Stacionarna faza je lahko teko

razliko od ostalih kromatografskih metod ne interagira z molekulami analita.

plin se uporabljajo helij, argon, dušik ipd

sestavljajo:

- injektor, ki služi

dovolj visoka, da se vzorec takoj uplini. Poznamo dva na

17

Med najbolj razširjenimi metodami derivatizacije je tvorba trimetilsililnih (TMS)

ki se za to uporabljajo, so npr. N-metil-N-(tercbutildimetilsilil)

trifluoroacetamid (MTBSTFA), N-metil-N-(trimetilsilil)trifluoroacetamid (MSTFA)

trifluoracetamid (BSTFA). Reakcija siliranja (splošna shema je

poteka v brezvodnih pogojih, na uspešnost reakcije pa vplivajo

topila in temperature (15).

: Splošna shema reakcije siliranja

analitov se najpogosteje uporabljajo različne kromatografske metode.

plinsko kromatografijo (GC), kjer je mobilna faza inerten plin,

no tekočinsko kromatografijo (SFC), kjer je mobilna faza plin

ina) nad kritičnimi pogoji (temperaturna in tlak),

insko kromatografijo (LC), kjer je mobilna faza tekočina nizke viskoznosti

GC in LC se spojine med ponavljajočim se procesom sorpcije in desorpcije


čnega časa zadrževanja na stacionarni fazi (15).

o pogosto uporabljamo pri analizi vzorcev odpadnih vod.

Stacionarna faza je lahko tekoča ali trdna. Mobilno fazo predstavlja inerten plin, ki za

razliko od ostalih kromatografskih metod ne interagira z molekulami analita.

elij, argon, dušik ipd (15, 16). Aparaturo za plinsko kromatografijo

ki služi vnosu vzorca v kromatografsko kolono. Temperatura

, da se vzorec takoj uplini. Poznamo dva nač

je tvorba trimetilsililnih (TMS)

(tercbutildimetilsilil)

(trimetilsilil)trifluoroacetamid (MSTFA) in

. Reakcija siliranja (splošna shema je

poteka v brezvodnih pogojih, na uspešnost reakcije pa vplivajo

ne kromatografske metode. Glede

, kjer je mobilna faza inerten plin,

, kjer je mobilna faza plin

čina nizke viskoznosti

im se procesom sorpcije in desorpcije


pri analizi vzorcev odpadnih vod.

Mobilno fazo predstavlja inerten plin, ki za

razliko od ostalih kromatografskih metod ne interagira z molekulami analita. Kot nosilni

. Aparaturo za plinsko kromatografijo

. Temperatura mora biti

, da se vzorec takoj uplini. Poznamo dva načina vnosa, »split«,

18

kjer se vzorec razdeli na dva dela in manjši potuje naprej v kolono, ter

»splitless«, kjer vzorec v celoti potuje v kolono,

- kolona, kjer poteka kromatografska ločba spojin. Poznamo polnjene in

kapilarne kolone. Polnjene kolone so navadno dolge 2–3 m in imajo premer 2–4

mm, plast stacionarne faze je debela 0,05–1 µm. Kapilarne kolone so daljše

(tudi do 100 m) in tanjše (premer 0,15–0,53 mm) od polnjenih ter učinkovitejše

(z njimi dosežemo boljšo ločbo),

- detektor, ki služi za zaznavo analitov. Idealni detektor ima primerno

občutljivost, dobro stabilnost in ponovljivost, linearni odziv pri velikem

koncentracijskem razponu, hiter odziv, ki mora biti neodvisen od pretoka,

podoben odziv za vse vrste analitov in mora biti enostaven za uporabo. Med

najpogosteje uporabljanimi detektorji pri GC so plamensko ionizacijski detektor

(FID), detektor na toplotno prevodnost (TCD) in masno spektrometrični

detektor (MSD) (16).

Zadrževalni čas spojin na koloni je pri GC funkcija izbora stacionarne faze in

temperature, zato je pomemben izbor kromatografske kolone in temperaturnega programa

peči, v kateri se nahaja kolona. Temperaturni program sestavlja niz sprememb temperature

v peči, vključuje tako dele, ko je temperatura konstantna, kot dele, ko temperatura

kontrolirano narašča. Na izbor začetne in končne temperature vplivajo temperature, pri

katerih se eluirajo komponente. Hitrost rasti temperature je kompromis med željo po

skrajšanju časa analize in ohranitvijo minimalne sprejemljive ločljivosti. Na to vplivata v

glavnem kompleksnost vzorca in razlike med temperaturami vrelišč posameznih

komponent (15).

Sklopitev plinskega kromatografa z masno spektrometričnim detektorjem (GC-MSD)

omogoča identifikacijo spojin v kompleksnih zmeseh in ločbo med strukturno zelo

podobnimi spojinami. GC-MS omogoča tudi določanje struktur razgradnih produktov

zdravilnih učinkovin. Masni spektrometer loči ione v plinski fazi glede na razmerje

masa/naboj (m/z) (16).

Ionizacijo spojin lahko dosežemo na različne načine, najpogosteje se uporabljata

ionizacija z elektroni (EI) in kemijska ionizacija (CI). EI je najbolj razširjena metoda pri

analizi organskih molekul. Molekuli tu dovedemo energijo s trkom z elektroni, dobimo

radikalski kation oz. molekulski ion (M+. ali M+, Enačba I), z enim prostim elektronom.

19

Običajno uporabljamo energijo elektronov 70 eV. Večina organskih spojin ima sicer

energijo ionizacije med 8 in 15 eV, tako da odvečna kinetična energija vodi v izrazito

fragmentacijo, ki je značilna za posamezno spojino in jo lahko najdemo v različnih

podatkovnih bazah (17).

� + �� → ��. + 2�� Enačba 1

Detekcija ločenih ionov lahko poteka na dva načina, SCAN – snemanje čez celotno

masno območje, za kar so potrebne višje koncentracije, omogoča pa npr. zaznavo novih

razgradnih produktov, ali SIM – selektivno snemanje določenih ionov.

3.2 BIOLOŠKO ČIŠČENJE ODPADNIH VOD

Biološko čiščenje odpadnih vod je posnemanje naravnih procesov samočiščenja s

pomočjo mikroorganizmov in je del izboljšanja kakovosti okolja zaradi onesnaževanja, ki

nastane v gospodinjstvih, industriji, kmetijstvu ipd. Glede na vir nastanka, ki vpliva na

njihove sestave, odpadne vode ločimo na:

- komunalno odpadno vodo, ki nastaja v gospodinjstvih,

- tehnološko odpadno vodo, ki nastaja po uporabi v industriji, kmetijstvu, obrtni

dejavnosti, ter hladilne tekočine, ki odtekajo iz objektov za predelavo, skladiščenje

in odlaganje odpadkov,

- padavinsko odpadno vodo.

S preprečevanjem onesnaževanja okolja začnemo že pri samem viru, tj. s

preprečevanjem, da določene snovi sploh pridejo vanjo, kljub temu pa nekatere snovi

končajo v odpadni vodi in te moramo do določene mere odstraniti. Za to se poslužujemo

vrste fizikalnih, kemijskih in bioloških postopkov, ki se med seboj dopolnjujejo (18). Na

Sliki 10 je predstavljena shema različnih postopkov čiščenja odpadne vode in njihove

funkcije.

Slika 10: Postopki čiščenja odpadne vode in njihova funkcija

Osnovni cilj čiščenja odpadnih vod je zadostiti zakonskim zahtevam, ki upoštevajo

naslednje:

- preprečitev bolezni,

- preprečevanje onesnaženja vodovodov,

- odstranitev vseh onesnaženih izpustov v plovne vode,

- vzdrževanje čistih voda za razmnoževanje in preživetje vodnih organizmov,

- zaščita kopaliških vod,

- zaščita ekosistemov,

- obvarovanje voda (1

Med parametre, s katerimi ovrednotimo odpadne vode,

- temperatura, od katere je odvisna hitrost bioloških procesov,

- barva, ki je odvisna od prisotnih snovi, sveža odpadna voda je siva,

20

enja odpadne vode in njihova funkcija

enja odpadnih vod je zadostiti zakonskim zahtevam, ki upoštevajo

,

evanje onesnaženja vodovodov,

dstranitev vseh onesnaženih izpustov v plovne vode,

istih voda za razmnoževanje in preživetje vodnih organizmov,

ita kopaliških vod,

ita ekosistemov,

obvarovanje voda (18).

Med parametre, s katerimi ovrednotimo odpadne vode, spadajo:

, od katere je odvisna hitrost bioloških procesov,

, ki je odvisna od prisotnih snovi, sveža odpadna voda je siva,

enja odpadnih vod je zadostiti zakonskim zahtevam, ki upoštevajo

istih voda za razmnoževanje in preživetje vodnih organizmov,

, ki je odvisna od prisotnih snovi, sveža odpadna voda je siva,

21

- vonj, ki je prav tako odvisen od prisotnih snovi, posebno tistih z močnim in

značilnim vonjem,

- motnost, ki jo merimo s turbidimetrom, kaže pa na prisotnost suspendiranih snovi,

- nihanja v pretoku, ki so odvisna od velikosti kanalizacijskega sistema,

življenjskih navad prebivalstva itd.,

- usedljivost, ki nam pove o snoveh, ki se ob mirovanju vode usedejo,

- kot indikator bakterij za patogene organizme se uporabljajo meritve celotnih

fekalnih koliformnih bakterij (E. Coli, enterokoki, streptokoki), ki sicer niso

patogene, so pa številnejše in odpornejše na dezinfekcijo od večine patogenih

bakterij,

- virusi , njihova prisotnost se včasih uporablja za oceno učinkovitosti dezinfekcije,

saj so odpornejši nanjo kot večina bakterij,

- mikroskopski pregled, ki nam posreduje informacijo o bioloških lastnostih in nam

pomaga pri kontroli procesa,

- pH, ki je merilo za kislost ali bazičnost raztopine,

- alkaliteta, ki je merilo sposobnosti vode, da nevtralizira kislino,

- trdne snovi, ki jih določamo z izparevanjem, služijo nam pri kontroli procesa,

- biokemijska potreba po kisiku v 5 dneh (BPK5), s katero določamo množino

kisika, ki je potrebna za stabilizacijo vzorca v 5 dneh; BPK5 je osnova za določanje

obremenitve in projektiranje čistilne naprave,

- kemijska potreba po kisiku (KPK), ki temelji na kemijski oksidaciji, zagotovi

hitro oceno celotne organske snovi v vzorcu,

- celotni organski ogljik (TOC) je alternativni parameter za oceno BPK5, z njim

določimo količino organsko vezanega ogljika v vzorcu,

- dušik, ki se pojavlja v 4 oblikah (organski dušik, amoniak, nitrat, nitrit), prisotne

oblike pa kažejo na nivo stabilizacije organskih snovi,

- fosfor, ki se pojavlja v različnih oblikah (ortofosfat, polifosfat, organsko vezan

fosfor) in je osnovni element za rast in razmnoževanje mikroorganizmov,

- klor , ki se običajno uporablja pri dezinfekciji in se uporablja pri kontroli le-te,

- sulfidi , še posebej vodikov sulfid, ki je povezan z neprijetnimi zdravstvenimi

učinki in povzroča korozijo kanalizacijskih cevi,

- maščobe, olja, masti, specifični polutanti , npr. fenoli, formaldehid,

- toksičnost (18).

3.2.1 POGOJI ČIŠČENJA ODPADNIH VOD

Biološka razgradnja suspendiranih ali raztopljenih organskih snovi lahko poteka pri

različnih oksidacijsko redukcijskih pogojih:

- pri aerobnih pogojih

raztopljenega kisika do CO

- pri anoksičnih pogojih

običajno pa le v vezani obliki (kot nitrat ali nitrit); v anoksi

redukcija nitratnih in nitritnih ionov do elementarnega dušika

- pri anaerobnih pogojih

(kot nitrat ali nitrit), pride najprej do pretvorbe v enostavnejše komponente (nižje

maščobne kisline) ter na koncu do metana

Aerobna razgradnja in nitrifikacija

Pri procesu aerobne razgradnje heterotrofni mikroorganizmi v pri

kisika, ki služi kot akceptor elektronov, pretvorijo organske snovi do ogljikovega dioksida

in vode, nastala energija pa se porabi pri tvorbi

čiščenja mora biti vseskozi

L-1).

Slika 11: Shema presnove aerobnih heterotrofov

22

ENJA ODPADNIH VOD

suspendiranih ali raztopljenih organskih snovi lahko poteka pri

nih oksidacijsko redukcijskih pogojih:

aerobnih pogojih se organsko razgradljive snovi odstranjujejo v prisotnosti

raztopljenega kisika do CO2 in vode,

nih pogojih, kjer je kisik prisoten le v minimalnih koncentracijah,

ajno pa le v vezani obliki (kot nitrat ali nitrit); v anoksičnih pogojih poteka

redukcija nitratnih in nitritnih ionov do elementarnega dušika,

anaerobnih pogojih, kjer kisik ni prisoten ne v elementarni ne v vezani obliki


kisline) ter na koncu do metana (19).

Aerobna razgradnja in nitrifikacija

Pri procesu aerobne razgradnje heterotrofni mikroorganizmi v prisotnosti raztopljenega


in vode, nastala energija pa se porabi pri tvorbi biomase (Slika 11). Za uspešen po

enja mora biti vseskozi prisotna zadostna količina raztopljenega kisika (

aerobnih heterotrofov

suspendiranih ali raztopljenih organskih snovi lahko poteka pri

se organsko razgradljive snovi odstranjujejo v prisotnosti

je kisik prisoten le v minimalnih koncentracijah,

ajno pa le v vezani obliki (kot nitrat ali nitrit); v anoksičnih pogojih poteka

tarni ne v vezani obliki


sotnosti raztopljenega


. Za uspešen potek

raztopljenega kisika (najmanj 0,5 mg

Ob prisotnosti avtotrofnih mikroorganizmov se amonijev dušik oksidira do

oksidacijskega stanja +3 (nitrita) in kasneje do +5 (nitrata),

(Slika 12). Avtotrofni organizmi kot vir ogljika uporabljajo CO

CO32- in HCO3

-), porabljajo pa lahko tudi amoniak in raztopljene nitrate

Slika 12: Shema presnove aerobnih avtotrofov

Nitrifikacija je dvostopenjski proces, kjer pride do oksidacije amoniaka prek nitrita do

nitrata. Pretvorba poteka pod vplivom nitrifi

Nitrosomonas, ki oksidirajo amoniak do nitrita

nitrata. Za pretvorbo ogljikovega dioksida v celi

reakcije proizvedejo sorazmerno malo, je populacija nitrifikatorjev v aktivnem blatu

majhna. So tudi zelo občutljivi na nenad

blata zagotovi večje število nitrifikatorjev. Na Sliki

v odpadni vodi.

23


oksidacijskega stanja +3 (nitrita) in kasneje do +5 (nitrata), tj. poteče proces nitrifikacije

. Avtotrofni organizmi kot vir ogljika uporabljajo CO2 (ter njegovi ionski obliki

), porabljajo pa lahko tudi amoniak in raztopljene nitrate

aerobnih avtotrofov


nitrata. Pretvorba poteka pod vplivom nitrifikacijskih avtotrofnih bakterij iz rodov

, ki oksidirajo amoniak do nitrita, in Nitrobacter, ki oksidirajo nitrit do

nitrata. Za pretvorbo ogljikovega dioksida v celični ogljik je potrebna energija in ker je


čutljivi na nenadna povečanja dotoka odpadnih snovi. Ve

je število nitrifikatorjev. Na Sliki 13 je prikazana shema nitratnega cikla


če proces nitrifikacije

(ter njegovi ionski obliki

), porabljajo pa lahko tudi amoniak in raztopljene nitrate (19).


avtotrofnih bakterij iz rodov

, ki oksidirajo nitrit do

je potrebna energija in ker je te


anja dotoka odpadnih snovi. Večja starost

je prikazana shema nitratnega cikla

Slika 13: Nitratni cikel v odpadni vodi

Zgornjo shemo lahko tudi ponazorimo z naslednjimi ena

2NH�� 3O�

�� 2

2NO�� O�

�� 2NO

Skupna reakcija:

2NH�� 4O� → 2NO�

� � 4

24

: Nitratni cikel v odpadni vodi

ponazorimo z naslednjimi enačbami:

� 2NO�� 4H� � 2H�O Enačba 2

NO�� Enačba 3

4H� � 2H�O Enačba 4

Anoksična razgradnja in denitrifikacija

Proces anoksične razgradnje je podoben aerobnemu, le da tu mikroorganizmi

uporabljajo kisik iz nitratov in nitritov namesto prostega kisika, ki ne sme biti prisoten.

Nastajajo elementarni dušik, ogljikov dioksid in voda, pote

14). Nujno potreben je še zunanji vir lahko razgradljivega ogljika (karbonat)

Slika 14: Anoksična razgradnja (denitrifikacija)

Pri denitrifikaciji gre, v nasprotju z nitrifikacijo, za redukcijo dušikovega atoma iz

oksidacijskih stanj +5 oz.

prisotnega prostega kisika, denitrifikacijski mikroorganizmi za razgradnjo organskih snovi

kot vir kisika uporabijo nitrate in nitrite, reakcije lahko ponazorimo z naslednjima

enačbama:

2NO�� org. snovi → 2NO

2NO�� org. snovi → 2N�

Anaerobna razgradnja

Anaerobna razgradnja poteka,

obliki. V prvi stopnji anaerobni heterotrofni mikroorganizmi pretvor

nižje maščobne kisline, nato pa v vodo, metan in ogljikov dioksid, tvori se tudi

(Slika 15). Kisik mikroorganizmi

(SO42-), ne sme pa biti prisotnega raztopljenega kisika,

mikroorganizmov (19).

25

na razgradnja in denitrifikacija

razgradnje je podoben aerobnemu, le da tu mikroorganizmi


Nastajajo elementarni dušik, ogljikov dioksid in voda, poteče torej denitrifikacija

ben je še zunanji vir lahko razgradljivega ogljika (karbonat)

na razgradnja (denitrifikacija)


oksidacijskih stanj +5 oz. +3 do 0, torej elementarnega dušika. Ker v raztopini ni



NO�� CO� � H�O Enačba 5

� CO� � OH� Enačba 6

Anaerobna razgradnja poteka, če ni prisotnega kisika v prosti ali vezani (nitrat, nitrit)

obliki. V prvi stopnji anaerobni heterotrofni mikroorganizmi pretvorijo organske spojine v

kisline, nato pa v vodo, metan in ogljikov dioksid, tvori se tudi

mikroorganizmi dobivajo bodisi iz organskih spojin bodisi iz sulfatov

), ne sme pa biti prisotnega raztopljenega kisika, saj ta zavira delovanje anaerobnih

razgradnje je podoben aerobnemu, le da tu mikroorganizmi


e torej denitrifikacija (Slika

ben je še zunanji vir lahko razgradljivega ogljika (karbonat) (18).


+3 do 0, torej elementarnega dušika. Ker v raztopini ni



e ni prisotnega kisika v prosti ali vezani (nitrat, nitrit)

ijo organske spojine v

kisline, nato pa v vodo, metan in ogljikov dioksid, tvori se tudi biomasa

dobivajo bodisi iz organskih spojin bodisi iz sulfatov

saj ta zavira delovanje anaerobnih

Slika 15: Shema presnove anaerobnih heterotrofov

Za anaerobno razgradnjo sta pomembna dva tipa bakterij, ki med seboj delujeta

vzajemno, kislinske ter metanogene bakterije.

snovi v nižje maščobne kisline, ki jih metanogene bakterije uporabljajo za svoj razvoj in

jih razgradijo do metana. Za optimalno razgradnjo je torej pomembno vzdrževanje

ravnotežja med kislinskimi in metanogenimi b

obremenitev z blatom, Slika 1

Slika 16: Vzdrževanje ravnotežja med kislinskimi in metanogenimi bakterijami

3.2.2 FIZIKALNO-KEMIJSKI PARAMETRI

Kemijska sestava odpadne

procesih čiščenja, ki jim je bila podvržena. S kemijsko analizo lahko dolo

parametre: pH, kemijsko in biokemijsko potrebo po kisiku (za slednjo je inkubacijski

dni), dušikove in fosforjeve spojine, k

potencial, specifična onesnažila

5.2.4.

26

anaerobnih heterotrofov


vzajemno, kislinske ter metanogene bakterije. Kislinske bakterije pretvarjajo organske

obne kisline, ki jih metanogene bakterije uporabljajo za svoj razvoj in


mi in metanogenimi bakterijami (primerna temperatu

obremenitev z blatom, Slika 16).

: Vzdrževanje ravnotežja med kislinskimi in metanogenimi bakterijami

KEMIJSKI PARAMETRI

odpadne vode nam lahko nudi informacije o njenih

enja, ki jim je bila podvržena. S kemijsko analizo lahko dolo

parametre: pH, kemijsko in biokemijsko potrebo po kisiku (za slednjo je inkubacijski

dni), dušikove in fosforjeve spojine, kloride, sulfide, celoten organski ogljik, redoks

onesnažila itd. Več o samem poteku meritev je opisano v poglavju


Kislinske bakterije pretvarjajo organske

obne kisline, ki jih metanogene bakterije uporabljajo za svoj razvoj in


primerna temperatura, pH in

: Vzdrževanje ravnotežja med kislinskimi in metanogenimi bakterijami

njenih lastnostih in o

enja, ki jim je bila podvržena. S kemijsko analizo lahko določimo naslednje

parametre: pH, kemijsko in biokemijsko potrebo po kisiku (za slednjo je inkubacijski čas 5

loride, sulfide, celoten organski ogljik, redoks

o samem poteku meritev je opisano v poglavju

27

Temperatura in pH

Hitrost bioloških procesov je odvisna od temperature. Pri poviševanju temperature

mikroorganizmi pospešujejo razgradnjo organskih snovi in porabo kisika. Ker pa je pri

višji temperaturi topnost kisika manjša, prav tako pa pri previsokih temperaturah lahko

pride tudi do odmiranja nekaterih bakterijskih vrst, je vzdrževanje primerne temperature

zelo pomembno. Optimalno območje za delovanje mikroorganizmov je med 15 in 25 °C.

Temperatura se spreminja tudi glede na letni čas.

pH je prav tako zelo pomemben parameter pri biološkem čiščenju odpadne vode, saj so

mikroorganizmi dovolj aktivni le v območju pH 6,5–9. Zunaj tega območja je aktivnost

zelo upočasnjena oz. se lahko celo ustavi. Na pH so še posebej občutljive reakcije

nitrifikacije, le-te lahko pH znižajo (Enačba 4) tudi do te mere, da je biološka aktivnost

inhibirana. Surova odpadna voda ima pH približno 8. Velika odstopanja od te vrednosti

lahko kažejo na prisotnost industrijskih ali nekomunalnih izpustov (18).

Kemijska potreba po kisiku (KPK)

Določanje KPK temelji na kemijski oksidaciji in nam lahko zagotovi hitro oceno

celotne organske snovi v vzorcu (razgradljive in nerazgradljive). Postopek nam da rezultat

v nekaj urah (običajno 3–4), namesto v 5 dneh kot pri BPK5.

Rezultati KPK so običajno višji kot pri BPK5, razmerje med njima pa je med čistilnimi

napravami različno, zato obe meritvi opravljamo vzporedno. Razmerje se spreminja tudi

od vtoka do iztoka. Razmerje KPK/BPK5 je za surovo vodo običajno 2 : 1, v dobro

stabiliziranem sekundarnem odtoku pa to narase tudi do 10 : 1 (18).

Biokemijska potreba po kisiku v petih dneh (BPK5)

Z merjenjem BPK5 določamo množino kisika, ki je potrebna za biološko razgradnjo

(stabilizacijo) vzorca v petih dneh, posredno pa množino organske snovi, ki je v vzorcu na

voljo za razgradnjo, s tem pa tudi prihodnji vpliv iztoka na vodotok. Biološka aktivnost je

odvisna od temperature, dokončna razgradnja pa zahteva okoli 20 dni, zato je poskus

standardiziran na 5 dni pri temperaturi 20 °C. Množina, potrebna za oksidacijo ogljikovih

organskih spojin (ne dušika), imenujemo ogljikov BPK (CBPK). V nadaljevanju poteče še

druga faza oksidacije, nitrifikacija, kjer amonij prehaja v nitrit in nitrat. BPK5 je osnova za

določanje obremenitve in projektiranje čistilne naprave (18).

28

Dušikove spojine

Dušik se v odpadni vodi pojavlja v štirih oblikah: organski dušik, amonij (v prosti ali

ionizirani obliki), nitrit in nitrat. Oblike dušika, prisotne v vzorcu, kažejo na nivo

stabilizacije (surova odpadna voda ima navadno višji nivo organskega in amonijevega

dušika ter nižji nivo nitrata in nitrita) (18). Spremembe in porazdelitev dušika nam lahko

dajo informacijo o pogojih, v katerih poteka proces v posameznem delu čistilne naprave

(poglavje 3.2.1).

Običajno koncentracijsko območje dušika v surovi odpadni vodi je 20–85 mg L-1 za

celotni dušik, 8–35 mg L-1 za organski ter 12–50 mg L-1za amonijev dušik. Nitrit in nitrat

sta običajno prisotna v neznatnih koncentracijah. Za določanje organskega in amonijevega

dušika uporabljamo Kjeldahlovo metodo:

1. razgradnja proteinov s H2SO4, običajno pod vplivom katalizatorjev, tvorba

(NH4)2SO4,

2. dodatek NaOH, sproščanje amoniaka,

3. »zajetje« amoniaka z dodatkom prebitka H3BO3, tvorba amonija,

4. povratna titracija presežka H3BO3 z Na2CO3.

Fosforjeve spojine

Fosfor se v odpadni vodi pojavlja v različnih oblikah, kot ortofosfat, polifosfat ali

organsko vezan fosfor in je osnovni element za biološko rast in razmnoževanje. Za to je

najprimernejši ortofosfat. Previsoke količine fosforja v površinskih vodah vodijo do

čezmerne rasti alg in evtrofikacije.

V komunalni odpadni vodi so običajne koncentracije celotnega fosforja med 2 in 20

mg L-1, od tega je 1–5 mg L-1 organskega ter 1–15 mg L-1 neorganskega fosforja (18).

29

3.2.3 MEJNE VREDNOSTI PARAMETROV ODPADNE VODE

Preglednica V prikazuje zakonsko določene mejne vrednosti nekaterih parametrov

odpadne vode v Republiki Sloveniji (20, 21).

Preglednica V: Mejne vrednosti za nekatere parametre v RS

Parameter Mejna vrednost za iztok v vode

Mejna vrednost za iztok v kanalizacijo

Enota Količina izpuščene

nevarne snovi temperatura 30 40 °C

pH 6,5–9 6,5–9,5 amonijev

dušik 10 100–200 mg L-1

nitritni dušik 1,0 10 mg L-1 1000 g/leto nitratni dušik * - mg L-1 celotni fosfor 1,0–2,0 - mg L-1

TOC 30 - mg L-1 KPK 120 - mg L-1 BPK5 25 - mg L-1

Za izračun mejnih vrednosti nitratnega dušika in sulfata v iztoku v vode (*)

uporabljamo naslednjo enačbo:

MVK =,,�×/01(34)×6(0)

6 Enačba 7

kjer je:

- MVK: mejna vrednost koncentracije nitratnega dušika za odvajanje odpadne vode

neposredno v vode na vodovarstvenem območju, izražena v mg L-1,

- MVK(1r): mejna vrednost koncentracije nitratnega dušika ali sulfatov za

površinsko vodo prvega kakovostnega razreda, ki je za nitratni dušik 5 mg L-1

oziroma za sulfate 150 mg L-1,

- Q(V): srednji nizki pretok vodotoka, izražen v s-1 in

- Q: največji 6-urni povprečni pretok odpadne vode, ki se odvaja v vodotok pri polni

obremenitvi vira onesnaževanja, izražen v s-1.

Pri neposrednem odvajanju odpadne vode v vodotok ne glede na izračunano vrednost

koncentracija nitratnega dušika ne sme presegati vrednosti 30 mg L-1, koncentracija

sulfatov pa vrednosti 1000 mg L-1.

30

4 NAMEN DELA

Odpadna voda vsebuje številne okolju potencialno nevarne snovi, ki lahko porušijo

ravnotežje v naravi, zato jih je treba odstraniti oz. čim bolj zmanjšati njihovo vsebnost.

Med te sodijo tudi ostanki zdravilnih učinkovin, ki imajo v okolju lahko zelo dolgo

razpolovno dobo in se posledično akumulirajo. V odpadnih in okoljskih vodah se navadno

nahajajo v koncentracijskem območju od ng L-1 do µg L-1.

Cilj diplomskega dela je določiti in primerjati odstranjevanje posameznih zdravilnih

učinkovin v aerobnih in anoksičnih pogojih v pilotni čistilni napravi ter v sklopljenem

sistemu anoksični-aerobni reaktor. Kot modelne spojine bomo uporabili nesteroidne

protivnetne učinkovine ibuprofen, naproksen, ketoprofen in diklofenak, antiepileptik

karbamazepin, klofibrinsko kislino, ki je metabolit antihiperlipidemika klofbirata,

metabolita karbamazepina akridin in akridon ter metabolit diklofenaka 1-(2,6-

diklorofenil)indolin-2-on. Njihovo odstranjevanje bomo spremljali v pilotnih čistilnih

napravah. Za izolacijo bomo uporabili ekstrakcijo na trdnem nosilcu (SPE), čemur bo

sledila derivatizacija, tj. pretvorba v za kromatografsko ločbo primernejšo obliko. Ločbi s

plinsko kromatografijo bo sledila detekcija z masnim spektrometrom, s čimer bomo

potrjevali istovetnost spojin. Za kvantitativno določanje spojin bomo pred začetkom

ekstrakcije v vzorce dodali znano količino internega standarda. V sklopljenih sistemih

bomo določali tudi količino hranil (amonij, nitrit, nitrat, fosfat, kemijska in biokemijska

potreba po kisiku) v posameznih reaktorjih in spreminjanje njihove vsebnosti glede na

pogoje čiščenja.

S primerjavo rezultatov odstranjevanja učinkovin v posameznih in sklopljenih

reaktorjih bomo skušali ugotoviti, ali je odstranjevanje v sklopljenem sistemu statistično

značilno učinkovitejše kot v posameznih reaktorjih. Dobljene rezultate pa bomo primerjali

tudi z literaturnimi podatki.

31

5 MATERIALI IN METODE

5.1 MATERIALI

Spojine, ki smo jih uporabljali pri delu:

- ibuprofen, čistosti 98 % (CAS 15687-27-1), proizvajalca Sigma-Aldrich Chemie

GmbH, Steinheim, Nemčija,

- klofibrinska kislina, čistosti 97 % (CAS 882-09-7), Sigma-Aldrich,

- naproksen, čistosti 98 % (CAS 22204-53-1), Sigma-Aldrich,

- ketoprofen, čistosti ≥ 98 % (CAS 22071-15-4), Sigma-Aldrich,

- diklofenak, natrijeva sol (CAS 15307-79-6), Sigma-Aldrich,

- karbamazepin, čistosti 99 % (CAS 298-46-4), Acros Organics, New Jersey, ZDA,

- akridin, čistosti > 97 % (CAS 260-94-6), Sigma-Aldrich,

- akridon, čistosti > 98 % (CAS 578-95-0), Sigma-Aldrich,

- 1-(2,6-diklorofenil)indolin-2-on (serijska št. 060518-1), Chemosyntha MV,

Meulebeke, Belgija,

- devteriran ibuprofen, 99,4 % devteriran (št. K379P25), C/D/N Isotopes, Quebec,

Kanada (interni standard pri določanju zdravilnih učinkovin),

- 9-kloroakridin, čistosti 97 % (CAS 1207-69-8), Sigma-Aldrich (interni standard pri

določanju metabolitov),

- N-metil-N-(tercbutildimetilsilil) trifluoroacetamid (MTBSTFA, CAS 77377-52-7),

Acros Organics (derivatizacijsko sredstvo).

Topila, ki smo jih uporabljali pri delu:

- metanol Baker Ultraresi-Analyzed®, čistosti min. 99,8 % (CAS 67-56-1),

proizvajalca Mallinckrodt Baker B.V., Deventer, Nizozemska,

- etilacetat Baker Ultraresi-Analyzed®, čistosti min. 99,6 % (CAS 141-78-6),

Mallinckrodt Baker B.V.,

- destilirana voda.

Nakisanje vodnih raztopin preučevanih spojin smo izvedli s 37-odstotno raztopino

klorovodikove kisline (CAS 7647-01-0), proizvajalca Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

Steinheim, Nemčija.

32

Za filtriranje smo uporabljali steklene filtrirne papirje MN-GF-2, premera 55 mm,

proizvajalca Macherey-Nagel GmbH & Co., Düren, Nemčija, ter membranske filtrirne

papirje Nylon 66 Mebranes, premera 47 mm in velikosti por 0,45 µm, proizvajalca

Supelco, Bellefonte, Pensilvanija, ZDA.

Pri ekstrakciji smo uporabljali nosilce OASIS® HLB 3 cm3 proizvajalca Waters

Corporation, Milford, Massachussetts, ZDA, s specifično površino 768 m2/g, povprečnim

premerom por 84 Å, celotnim volumnom por 1,26 cm3/g ter povprečno velikostjo delcev

29,2 µm.

Za določanje parametrov v pilotni čistilni napravi smo uporabili naslednje teste in

reagente:

- Nitra Ver 5 Nitrate Powder Pillow®, proizvajalca Hach, Düsseldorf, Nemčija,

- Nitri Ver 3 Nitrite Powder Pillow®, Hach,

- reagent Rochelle Salt – PVA Reagent®, Hach,

- reagent Nessler Reagent for Food and Waste Analysis®, Hach,

- reagenta amino kislina in molibdat, Hach,

- zmes H2SO4/Ag2SO4, Hach,

- natrijev hidroksid, Hach.

Za pripravo hranilnega medija za pilotno čistilno napravo smo uporabili naslednje snovi:

- kvasni ekstrakt, Sigma-Aldrich,

- kazein pepton, Sigma-Aldrich,

- mesni ekstrakt, Sigma-Aldrich,

- amonijev acetat, Honeywell Riedel-de Haën, Hannover, Nemčija,

- amonijev klorid, Merck, Darmstadt, Nemčija,

- kalijev hidrogenfosfat, Merck,

- kalijev dihidrogenfosfat, Merck,

- kalcijev karbonat, Merck,

- magnezijev karbonat, Merck,

- natrijev klorid, Scharlau Chemie, S.A., Barcelona, Španija,

- železov (II) sulfat heptahidrat, Merck.

33

5.2 METODE

5.2.1 PRIPRAVA RAZTOPIN STANDARDOV

Raztopine standardov preučevanih spojin smo pripravili tako, da smo v 100 mL

merilno bučko natehtali 10 mg vsake posamezne spojine ter jo dopolnili do oznake z

metanolom. Raztopino metabolitov smo nato zaradi manjše hitrosti raztapljanja akridona

še dodatno tri ure stresali na stresalniku pri sobni temperaturi. Tako pripravljene raztopine

so nam služile tako za izdelavo umeritvenih krivulj standardov kot za določanje

izkoristkov ekstrakcije ter za dodatek v reaktorje, v katerih smo določali eliminacijo

preučevanih spojin.

Pri delu smo uporabljali dva interna standarda, devteriran ibuprofen, ki smo ga

uporabljali pri določanju zdravilnih učinkovin ter 9-kloroakridin, ki smo ga uporabljali pri

določanju metabolitov. Raztopino devteriranega ibuprofena smo pripravili tako, da smo 2,5

mg spojine natehtali v 50 mL merilno bučko in jo z metanolom dopolnili do oznake. Tako

pripravljeno raztopino smo označili z IS0. Raztopino IS0 smo nato razredčili v razmerju

1/50, in sicer tako, da smo 1 mL odpipetirali v 50 mL bučko, ki smo jo z metanolom

dopolnili do oznake. Novo raztopino smo označili z IS in to smo tudi uporabljali pri analizi

vsebnosti zdravilnih učinkovin v vzorcih ter pri izdelavi umeritvenih krivulj in določanju

izkoristkov ekstrakcije. V posamezni vzorec smo dali 0,5 mL raztopine IS, kar znaša 0,5

µg devteriranega ibuprofena. Raztopino 9-kloroakridina smo pripravili tako, da smo 3,0

mg spojine natehtali v 50 mL bučko in jo z metanolom dopolnili do oznake. Tako

pripravljeno raztopino smo uporabljali pri določanju vsebnosti metabolitov v vzorcih, za

izdelavo umeritvenih krivulj ter določanju izkoristkov ekstrakcije, in sicer po 0,5 mL

raztopine, kar znaša 30 µg 9-kloroakridina.

34

5.2.2 IZKORISTEK EKSTRAKCIJE IN KALIBRACIJA

Pri ugotavljanju izkoristka ekstrakcije na trdnem nosilcu ter izdelavi umeritvenih

krivulj smo uporabili raztopine, izdelane po postopku, opisanem pod 5.2.1, ter iztok iz

reaktorja R0 (5.2.3). Izkoristek ekstrakcije smo določili tako, da smo najprej v 6 čaš dali po

200 mL iztoka R0, od tega smo v 3 dali po 1 mL metanolne raztopine zdravilnih učinkovin

in njihovih izbranih metabolitov ter nato izvedli ekstrakcijo vseh šestih. Po končani

ekstrakciji smo v preostale (prazne) tri paralelke dodali po 1 mL raztopine preučevanih

spojin. Interni standard smo prav tako dodali po ekstrakciji. Nato smo vse analizirali po

postopku, opisanem v poglavju 5.2.5. Izkoristek ekstrakcije (Enačba 8) smo določili kot

razmerje med povprečnim odzivom (površino pod krivuljo) paralelk, v katere smo analite

dodali po ekstrakciji (Āpo ekstrakciji), s povprečnim odzivom paralelk, v katere smo analite

dodali pred ekstrakcijo (Āpred ekstrakcijo):

% ekstrakcije = 3,,?@ AB CDEFGHIJKJ

?@ AGCL CDEFGHIJKB Enačba 8

Umeritvene krivulje smo izdelali tako, da smo za zdravilne učinkovine in za metabolite

pripravili raztopine v iztoku R0 s koncentracijskim območjem 0,5 µg L-1- 60 µg L-1. Interni

standard smo dodali pred ekstrakcijo, pripravljene raztopine pa smo ekstrahirali in

analizirali po postopku, opisanem v poglavju 5.2.5.

35

5.2.3 PILOTNA ČISTILNA NAPRAVA IN VZORČENJE

Delovanje biološke čistilne naprave smo posnemali v pilotnih bioreaktorjih. Shema

aerobnega reaktorja je prikazana na Sliki 17.

Slika 17: Shema aerobnega reaktorja

Skupna prostornina posameznega reaktorja je 4,7 L, od tega je 4 L mokrega volumna.

Vsak reaktor vsebuje standardno centrifugalno mešalno črpalko, ki omogoča reciklažo

blata. V aerobne reaktorje smo namestili tudi standardne akvarijske prezračevalnike

(porozne kamne), ki omogočajo dovajanje kisika, medtem ko jih anoksični reaktorji ne

vsebujejo. Anoksične reaktorje smo tudi zaščitili pred svetlobo z aluminijasto folijo.

Vtočno cev smo namestili v vsebnik, v katerega smo polnili hranilno raztopino, sestava le-

te je prikazana v Preglednici VI. Črpanje hranilne raztopine je potekalo s hitrostjo 2 L/dan.

36

Preglednica VI: Sestava hranilne raztopine

Snov Masa / 20 L (g) Koncentracija (mg L-1) kvasni ekstrakt 2,6 130 kazein pepton 2,6 130 mesni ekstrakt 2,6 130 CH3COONH4 6,34 317

NH4Cl 0,8 40 K2HPO4 0,48 24 KH2PO4 0,16 8 CaCO3 2,0 100 MgCO3 2,0 100 NaCl 0,8 40

FeSO4·7H2O 0,1 5

V reaktorje smo poleg hranilne raztopine dodajali tudi po 1 mL metanolne raztopine

zdravilnih učinkovin oz. metabolitov (pripravljenih po postopku, opisanem v poglavju

5.2.1) s koncentracijo 10 mg/100 mL, kot je prikazano v Preglednici VII, tako da je bila

končna koncentracija spojin 50 µg L-1. Reaktorja R0 in A0 sta služila kot kontroli in zato

vanju nismo dodajali preučevanih spojin.

Preglednica VII: Osnovne značilnosti reaktorjev

Reaktor Vrsta presnove Analiti Koncentracija v 2 L ( µg L-1) R0 aerobna kontrola 0 R1 aerobna zdravilne učinkovine 50 R2 aerobna zdravilne učinkovine 50 R3 aerobna metaboliti 50 R4 aerobna metaboliti 50 A0 anoksična kontrola 0 A1 anoksična zdravilne učinkovine 50 A2 anoksična metaboliti 50

V prvem delu raziskave smo preu

reaktorjih, tj. ločeno aerobno in anoksi

vzorčenja dodajali hranilno raztopino in v njej raztopljene analite, da

adaptirala na preiskovane spojine

zamenjali hranilno raztopino, saj so nekatere hranilne snovi slabše topne in smo se s tem v

dobršni meri izognili morebitne

razgradnji na vtoku.

Vzorčenje smo izvedli tako, da smo 1

metabolitov dali v merilno bu

L). Del tako pripravljene raztopine smo uporabili kot vzorec vtoka, preostanek pa polnili

reaktorje. Vzorce z volumnom

por 0,45 µm, 200 mL filtrata pa nato ekstrahirali in analizirali po postopku

poglavju 5.2.5.

V drugem delu smo preu

sistemih, kjer smo uporabili sklopitev anoksi

Sklopitev smo izvedli tako, da smo iztok anoksi

aerobni reaktor, preiskovane spojine pa smo dajali le v

Sklopitev je prikazana na Slik

analite brez vzorčenja, da se je koncentracija v vmesnem vsebniku stabilizirala

izvajali vzorčenje po enakem postopku, kot je opisano zgor

Slika 18: Shema sklopitve anoksi

37

V prvem delu raziskave smo preučevali odstranjevanje analitov

eno aerobno in anoksično razgradnjo. Sprva smo v reaktorje tri tedne

ajali hranilno raztopino in v njej raztopljene analite, da

adaptirala na preiskovane spojine. Tri dni pred vzorčenjem smo v reaktorjih

hranilno raztopino, saj so nekatere hranilne snovi slabše topne in smo se s tem v

dobršni meri izognili morebitnemu vplivu neraztopljenih snovi, izognili pa

nje smo izvedli tako, da smo 1 mL metanolnih raztopin zdravilnih u

metabolitov dali v merilno bučko ter s hranilnim medijem dopolnili do oznake (skupaj 2

). Del tako pripravljene raztopine smo uporabili kot vzorec vtoka, preostanek pa polnili

z volumnom 400–500 mL smo filtrirali s filtrirnim papirjem z velikostjo

filtrata pa nato ekstrahirali in analizirali po postopku

smo preučevali odstranjevanje preiskovanih spojin tudi v sklopljenih

sistemih, kjer smo uporabili sklopitev anoksičen-aeroben reaktor (A1

Sklopitev smo izvedli tako, da smo iztok anoksičnega reaktorja uvajali v vsebnik za

aerobni reaktor, preiskovane spojine pa smo dajali le v vtok anoksi

Sklopitev je prikazana na Slikah 18 in 19. Dva tedna smo uvajali hranilno raztopino in

enja, da se je koncentracija v vmesnem vsebniku stabilizirala

enje po enakem postopku, kot je opisano zgoraj.

: Shema sklopitve anoksičnega in aerobnega reaktorja

evali odstranjevanje analitov v posameznih

. Sprva smo v reaktorje tri tedne brez

ajali hranilno raztopino in v njej raztopljene analite, da bi se biomasa

v reaktorjih dnevno

hranilno raztopino, saj so nekatere hranilne snovi slabše topne in smo se s tem v

mu vplivu neraztopljenih snovi, izognili pa smo se tudi

metanolnih raztopin zdravilnih učinkovin oz.

dopolnili do oznake (skupaj 2

). Del tako pripravljene raztopine smo uporabili kot vzorec vtoka, preostanek pa polnili v

s filtrirnim papirjem z velikostjo

filtrata pa nato ekstrahirali in analizirali po postopku, opisanem v

spojin tudi v sklopljenih

aeroben reaktor (A1-R2 in A2-R3).

nega reaktorja uvajali v vsebnik za

oksičnega reaktorja.

. Dva tedna smo uvajali hranilno raztopino in

enja, da se je koncentracija v vmesnem vsebniku stabilizirala, ter nato

38

Slika 19: Sklopitev anoksičnega in aerobnega reaktorja

5.2.4 DOLOČANJE KEMIJSKIH PARAMETROV ODPADNE VODE

Pri sklopljenih reaktorjih smo določili tudi koncentracije nekaterih kemijskih

parametrov na vtoku, v vmesnem vsebniku ter na iztoku. Vzorce smo pred meritvami

najprej razredčili v razmerju 1/20 (5 mL smo dali v 100 mL merilno bučko in jo dopolnili z

deionizirano vodo do oznake). Dobljene rezultate za amonijev, nitratni in nitritni dušik ter

za fosfate smo tako morali pomnožiti z 20.

Določanje amonijevega dušika (NH3, NH4+)

Amonij smo določali tako, da smo v vzorce (v 25 mL kivetah) najprej dodali 1 mL

reagenta Rochelle Salt – PVA Reagent® ter nato še 1 mL reagenta Nessler Reagent for

Food and Waste Analysis®. Ob prisotnosti amonija je prišlo do tvorbe intenzivnega

rumeno oranžnega obarvanja. Koncentracijo amonija smo določili spektrofotometrično pri

valovni dolžini 425 nm, kot slepi vzorec smo uporabili deionizirano vodo, ki smo ji dodali

oba reagenta. Kemijsko je Nesslerjev reagent kalijev tetrajodomerkurat(II) (K2[HgI4]) v

raztopini KOH. Ob prisotnosti amonija pride do naslednje reakcije (Enačba 9):

NH�� + 2[HgI�]�� + 4OH� → HgO · Hg(NH�)I + 7I� + 3H�O Enačba 9

vsebnik za anoksični reaktor

vmesni vsebnik za aerobni reaktor

anoksični reaktor

aerobni reaktor

črpalka za anoksični reaktor

črpalka za aerobni reaktor

39

Določanje nitratnega dušika (NO3-)

Nitrate smo določali s hitrim testom z uporabo blazinic Nitra Ver 5 Nitrate Powder

Pillow®, ki vsebujejo kadmijeve granule, obdelane v raztopini bakrovega sulfata, ter

sulfanilamid in reagent za diazotiranje N-(1-naftil)etilendiamin. Celotno vsebino le-te

damo v vzorec in 1 minuto stresamo. Pride do redukcije nitratov in tvorbe modrega azo

barvila. Po 5 minutah izmerimo absorbanco pri 400 nm. Kot slepi vzorec nam služi

deionizirana voda z dodanim reagentom.

Določanje nitritnega dušika (NO2-)

Nitrite smo določali podobno kot nitrate s hitrim testom z uporabo blazinic Nitri Ver 3

Nitrite Powder Pillow®, ki vsebujejo sulfanilamid in reagent za diazotiranje N-(1-naftil)-

etilendiamin dihidroklorid. Po dodatku vsebine blazinice vzorce pretresemo. Pride do

tvorbe rožnatega azo barvila. Po 20 minutah izmerimo absorbanco pri 507 nm. Kot slepi

vzorec nam služi deionizirana voda z dodanim reagentom.

Določanje ortofosfata (PO43-)

Ortofosfat je le ena izmed oblik fosforja, ki se nahajajo v odpadnih vodah. Določali

smo ga tako, da smo v vzorec dodali najprej 1 mL amino kisline, nato 1 mL molibdatnega

reagenta ter vse skupaj pretresli. Pride do tvorbe rumeno obarvanega kompleksa

amonijevega fosfomolibdata (Enačba 10). Po 10 minutah smo izmerili absorbanco pri 530

nm, kot slepi vzorec nam je služila deionizirana voda z dodanima reagentoma.

PO�� + 12(NH�)�MoO� + 24H� → (NH�)�PO� · 12MoO� + 21NH�

� + 21H�O

Enačba 10

Kemijska potreba po kisiku (KPK)

KPK smo določili tako, da smo 2 mL nerazredčenih vzorcev dali v viale, ki so

vsebovale zmes H2SO4 in Ag2SO4. Po dvournem segrevanju in nato ohladitvi na sobno

temperaturo smo izmerili absorbanco pri 620 nm. Kot slepi vzorec nam je služila

deionizirana voda, ki smo jo dali v viale in prav tako 2 uri segrevali.

40

Biokemijska potreba po kisiku v petih dneh (BPK5)

Za vsak vzorec smo opravili dve vzporedni meritvi. Pri prvi smo uporabili 250 mL

nerazredčenega vzorca, končni rezultat pa smo pomnožili s faktorjem 5, pri drugi pa 164

mL vzorca s faktorjem 10. Vzorec smo skupaj z magnetnim mešalom dali v zatemnjeno

steklenico in vanjo namestili gumijast tulec, v katerega smo dali dve tabletki natrijevega

hidroksida. Ta je reagiral z nastajajočim CO2, ki bi brez dodatka NaOH nakisal vzorec, kar

bi lahko privedlo do propada mikroorganizmov. Steklenico smo nato zaprli z zamaškom z

manometrom ter pustili na mešalu. Po petih dneh smo odčitali vrednost BPK5.

Slika 20: Določanje BPK5 z manometrično metodo

5.2.5 ANALIZNI POSTOPEK DOLOČANJA ANALITOV V VZORCIH

Učinkovitost odstranjevanja zdravilnih učinkovin in njihovih metabolitov v aerobnih in

anoksičnih pogojih smo preučevali s pomočjo sistema aerobnih in anoksičnih

bioreaktorjev, ki so simulirali delovanje komunalne čistilne naprave. Učinkovitost

njegovega delovanja smo določili z razliko v vsebnosti analitov na vtoku in iztoku. Shema

uporabljenih analiznih postopkov je prikazana na Sliki 21 in zajema pripravo vzorca

(dodatek internega standarda, nakisanje), nanašanje vzorca na SPE kolono, eluiranje,

koncentriranje eluata, derivatizacijo in analizo s plinskim kromatografom z masno

spektrometričnim detektorjem.

Slika 21: Shema analiznega postopka za dolo

Izolacija

Preiskovane spojine smo iz vodnih vzorcev izolirali z ekstrakcijo na trdnem nosilcu

(SPE). Pri tem smo uporabili napravo

Technologies, Santa Clara,

41

: Shema analiznega postopka za določanje analitov


(SPE). Pri tem smo uporabili napravo Vacuum Manifold Processing Station (Agilent

Kalifornija, ZDA), ki je prikazana na Sliki 2


m Manifold Processing Station (Agilent

2.

42

Slika 22: Sistem za ekstrakcijo na trdnem nosilcu

Sprva smo izvedli kondicioniranje kolon, in sicer smo jih najprej omočili s 3 mL

etilacetata, nato dodali 3 mL metanola (ker se meša tako z etilacetatom kot z vodo) in na

koncu še 3 mL matričnega topila – vodovodne vode (nakisane s 37% HCl do pH 2–3 pri

izolaciji zdravilnih učinkovin). Da se izognemo dekondicioniranju, smo poskrbeli, da je

kolona ves čas ostala omočena. Pri kondicioniranju smo aktivirali funkcionalne skupine

ekstrakcijskega nosilca.

V nadaljevanju smo izvedli nanos 200 mL vzorcev. Z rahlim podtlakom (cca. 2 mm

Hg), ki smo ga ustvarili z vodno črpalko, smo prek cevke črpali vzorce. Hitrost pretoka

skozi kolono smo nastavili na 2–3 mL/min.

Po končanem nanosu smo kolone sprali z matričnim topilom in jih nato 60 min sušili

pri podtlaku cca. 15 mm Hg. Končna točka sušenja je bila, ko je nosilec ponovno postal

sipek.

Po sušenju smo izvedli še elucijo s štirikrat po 0,5 mL etilacetata. Pri tem nismo

uporabljali vodne črpalke, saj smo želeli počasen pretok prek kolone. Dobljena 2 mL smo

najprej z dušikom skoncentrirali na približno 1 mL, ki smo ga nato kvantitativno prenesli v

2 mL viale. Temu je sledilo su

0,5 mL etilacetata.

Derivatizacija

Končni raztopini v 0,5

MTBSTFA (Slika 22). Viale smo zaprli s teflonskimi zamaški in jih v pe

pri 60 °C (zdravilne učinkovine) oz. 80

vzorce analizirali z GC-MSD.

Slika 23: Derivatizacijski reagent MTBSTFA

GC-MSD analiza

Sililne estre preiskovanih spojin smo kvalitativno

Ločbo smo izvedli s plinskim kromatografom HP 6890 (Hewlett

Nemčija), s kapilarno kolono HP

µm debeline filma stacionarne faze.

Ločba na plinskem kromatografu je potekala pod naslednjimi pogoji:

- nosilni plin: helij,

- hitrost nosilnega plina: 37

- pretok nosilnega plina: 1,0

- tlak nosilnega plina: 8,5

- temperatura injektorja: 250

- način injiciranja: splitless,

- tlak v injektorju: 8,5

- pretok v injektorju: 53,5

- volumen injiciranega vzorca: 1

43

viale. Temu je sledilo sušenje v toku dušika do suhega. Suhi ostanek smo raztopili v

ni raztopini v 0,5 mL etilacetata smo dodali 30 µL reagenta za si

). Viale smo zaprli s teflonskimi zamaški in jih v pe

činkovine) oz. 80 °C (metaboliti). Po končani derivatizaciji smo

MSD.

: Derivatizacijski reagent MTBSTFA

Sililne estre preiskovanih spojin smo kvalitativno in kvantitativno dolo

bo smo izvedli s plinskim kromatografom HP 6890 (Hewlett-Packard, Waldbronn,

ija), s kapilarno kolono HP-5 MS dolžine 30 m, notranjega premera 0,25

stacionarne faze.

kromatografu je potekala pod naslednjimi pogoji:

hitrost nosilnega plina: 37 cm/s pri 100 °C, konstantna,

pretok nosilnega plina: 1,0 mL/min,

tlak nosilnega plina: 8,5 psi (58,6 kPa),

temperatura injektorja: 250 °C,

splitless,

tlak v injektorju: 8,5 psi,

pretok v injektorju: 53,5 mL/min,

volumen injiciranega vzorca: 1 µL.

do suhega. Suhi ostanek smo raztopili v

L reagenta za siliranje

). Viale smo zaprli s teflonskimi zamaški in jih v peči segrevali 15 ur

čani derivatizaciji smo

in kvantitativno določali z GC-MSD.

Packard, Waldbronn,

m, notranjega premera 0,25 mm in 0,25

44

Temperaturna programa segrevanja peči plinskega kromatografa, ki smo ju uporabljali

pri ločbi, sta navedena v Preglednici VIII in Preglednici IX.

Preglednica VIII: Temperaturni program ločbe zdravilnih učinkovin

Začetna temperatura

(°C)

Hitrost naraščanja temperature

(°C/min)

Končna temperatura

(°C)

Trajanje (min)

65 - 65 2 65 30 180 3,83 180 5 300 24 300 - 300 5

Preglednica IX: Temperaturni program ločbe metabolitov

Začetna temperatura

(°C)

Hitrost naraščanja temperature

(°C/min)

Končna temperatura

(°C)

Trajanje (min)

65 - 65 2 65 30 180 3,83 180 10 210 3 210 20 240 1,5 240 - 240 1 240 30 300 2 300 - 300 5

Snemanje čez celotno masno območje (SCAN) smo izvajali pri 50–550 m/z. V

Preglednici X pa so navedeni izbrani fragmentni ioni, ki smo jih selektivno snemali (SIM).

Preglednica X: Izbrani fragmentni ioni za SIM analizo

Spojina Izbrani fragmentni ion (m/z) ibuprofen 263 klofibrinska kislina 271 naproksen 287 ketoprofen 311 diklofenak 352 karbamazepin 193 devteriran ibuprofen 266 akridin 179 akridon 252 1-(2,6-diklorofenil)indolin-2-on 300 9-kloroakridin 213

45

6 REZULTATI IN RAZPRAVA

6.1 IZKORISTKI EKSTRAKCIJE IN LINEARNOST ANALIZNE

METODE

Izkoristke ekstrakcije smo določili po postopku, ki je opisan v poglavju 5.2.2,

predstavljeni pa so v Preglednici XI:

Preglednica XI: Povprečni izkoristki ekstrakcije (IE), relativne standardne deviacije (RSD), št. meritev z dodatkom analitov pred (npred) in po (npo) ekstrakciji

Spojina Povprečni IE v % RSD v % npred npo ibuprofen 97,0 2,1 3 3 klofibrinska kislina 102,4 2,3 3 3 naproksen 92,3 1,0 3 3 ketoprofen 91,7 3,0 3 3 diklofenak 78,7 3,5 3 3 karbamazepin 76,8 6,5 3 3 akridin 87,8 4,6 3 3 akridon 87,0 4,5 3 3 1-(2,6-diklorofenil)indolin-2-on 87,1 4,2 3 3

Iz Preglednice XI je razvidno, da so izračunani izkoristki ekstrakcije preučevanih

spojin med 76 in 102 %, najvišji je pri klofibrinski kislini, najnižji pa pri karbamazepinu in

diklofenaku. Ocenili smo, da so dovolj visoki, da ekstrakcija ne botruje prevelikim

izgubam in ni potrebna nadaljnja optimizacija.

Pri karbamazepinu smo opazili, da se pri vzorcih, derivatiziranih 12 ur, med čakanjem

na analizo pri sobni temperaturi površina pod krivuljo za karbamazepin povečuje s časom,

ki ga vzorec preživi na sobni temperaturi. Sklepamo lahko torej, da derivatizacija še ni bila

popolna in je deloma še potekala, česar nismo opazili pri drugih spojinah. Tudi s tem lahko

razložimo nižji izkoristek ekstrakcije ter tudi večjo relativno standardno deviacijo (6,5 %)

kot pri drugih spojinah (1,0–4,6 %).

Ravno zaradi tega pojava smo v nadaljevanju podaljšali čas derivatizacije na 15 ur. Da

bi preverili utemeljenost spremembe, smo pripravili 2 vzorca, enega smo derivatizirali 12

ur, enega pa 15 ur ter vsak vzorec izmerili trikrat zapored. Glede na trajanje

temperaturnega programa (poglavje 5.2.6) to pomeni, da je vzorec do tretjega injiciranja

46

bil na sobni temperaturi približno 90 minut. Dobljene relativne standardne deviacije

(19,3 % in 4,0 %) so nas prepričale v pravilnost odločitve, da čas derivatizacije

podaljšamo. Kljub temu pa smo se skušali v največji meri izogibati daljšemu izpostavljanju

vzorcev sobni temperaturi.

Preverili smo tudi druge mogoče vire izgub, npr. adsorpcija na stene čaš, zato smo po

SPE stene čaše, iz katere smo črpali vzorec, sprali z metanolom in dobljeno raztopino

analizirali. Poskusili smo tudi z lovljenjem prečrpane vode v posebno čašo namesto odpada

in to ponovno ekstrahirali (če smo morda presegli kapaciteto sorbenta v koloni). Izvedli

smo tudi elucijo z dvakratno količino etilacetata, osemkrat po 0,5 mL, ter analizirali druga

2 mL. V nobenem od naštetih poskusov nismo zaznali analitov, torej lahko trdimo, da ni

prišlo do dodatnih izgub. Nazadnje smo poskusili tudi z elucijo z metanolom namesto z

etilacetatom. Dobili smo višje odzive kot pri eluciji z etilacetatom, vendar ker smo izvedli

le en poskus, ne moremo z gotovostjo trditi, da je elucija z metanolom optimalnejša.

V Preglednici XII so navedeni izračunani Pearsonovi koeficienti korelacije (r) ter

koeficienti determinacije (R2) za posamezne spojine, ki smo jih določali po postopku,

opisanem v poglavju 5.2.2. S tem smo preverjali linearnost analizne metode.

Preglednica XII: Koeficienti korelacije (r), koeficienti determinacije (R2) ter koncentracijsko območje, znotraj katerega smo ju določali za posamezne spojine

Spojina r R2 Koncentracijsko območje (µg L-1)

ibuprofen 0,9973 0,9946 0,5–60 klofibrinska kislina 0,9986 0,9971 2–60 naproksen 0,9989 0,9979 0,5–60 ketoprofen 0,9993 0,9986 0,5–60 diklofenak 0,9993 0,9986 0,5–60 karbamazepin 0,9967 0,9935 2–60 akridin 0,9992 0,9985 2–60 akridon 0,9912 0,9825 2–60 1-(2,6-diklorofenil)indolin-2-on 0,9928 0,9857 0,5–60

47

Pri vseh spojinah smo opravili meritve v koncentracijskem območju 0,5–60 µg L-1,

vendar pri nekaterih spojinah pri najnižjih koncentracijah nismo dobili odziva, zato teh

koncentracij nismo upoštevali. Tako pri koncentraciji 0,5 µg L-1 nismo dobili odziva pri

klofibrinski kislini, karbamazepinu, akridinu in akridonu. Na Sliki 24 je primer umeritvene

krivulje za ketoprofen.

Slika 24: Umeritvena krivulja za ketoprofen, razmerje med površino pod krivuljo sililnih estrov ketoprofena in internega standarda – devteriranega ibuprofena (Aket/A is) v odvisnosti od razmerja koncentracij sililnih estrov ketoprofena in internega standarda (cket/cis)

y = 0,4726x + 0,6564R² = 0,9986

0

2

4

6

8

10

12

14

0 5 10 15 20 25

Aket/A is

cket/cis

48

6.2 MEJA ZAZNAVNOSTI ANALIZNE METODE

Mejo zaznavnosti analizne metode (LOD), ki je definirana kot najmanjša koncentracija

analita, ki ga še lahko kvantitativno določimo z uporabljeno analizno metodo, smo določili

tako, da smo tri slepe paralelke (iztokov R0 brez dodanih analitov) ekstrahirali in

analizirali po postopku iz poglavja 5.2.5. Izračunali smo jo kot koncentracijo analita, pri

kateri je kromatografski vrh enak trikratni vrednosti standardne deviacije sipanja signala.

Za izračun smo uporabili enačbe umeritvenih premic za posamezne spojine, predpostavili

pa smo 100-odstotni izkoristek ekstrakcije. V Preglednici XIII so podane izračunane

vrednosti mej zaznavnosti za posamezne spojine.

Preglednica XIII: Izračunane meje zaznavnosti za posamezne spojine

Spojina Meja zaznavnosti v ng L-1 ibuprofen 43,0 klofibrinska kislina 432,9 naproksen 81,3 ketoprofen 84,8 diklofenak 46,5 karbamazepin 72,1 akridin 289,5 akridon 93,2 1-(2,6-diklorofenil)indolin-2-on 73,9

Opazimo lahko predvsem izstopajoči vrednosti za klofibrinsko kislino in akridin. Pri

akridinu smo tekom analiz že opazili, da je imel med metaboliti najnižji odziv, temu je

lahko vzrok dejstvo, da se kot edina spojina ne derivatizira. Klofibrinska kislina je bila

med zdravilnimi učinkovinami tudi med slabše odzivnimi (pri vtokih, saj so vse spojine

takrat bile prisotne v približno enakih koncentracijah).

Za naše potrebe (visoke koncentracije v reaktorjih) dobljene vrednosti zadostujejo,

vendar bi jih bilo za okoljske vzorce potrebno znižati, npr. z izbiro primernejšega topila za

elucijo (metanol namesto etilacetata, poglavje 6.1), večjim volumnom vzorca ali manjšim

dodatkom derivatizacijskega sredstva.

49

6.3 DOLOČANJE KEMIJSKIH PARAMETROV ODPADNE VODE

V Preglednici XIV so prikazani rezultati meritev kemijskih parametrov. Določali smo

jih po postopku iz poglavja 5.2.4.

Preglednica XIV: Rezultati meritev kemijskih parametrov za sklopljen sistem reaktorjev za zdravilne učinkovine (ZU) in metabolite (M); vm. = vmesni vsebnik

NH4+

(mg L-1) NO3

- (mg L-1)

NO2-

(mg L-1) PO4

3-

( mg L-1) KPK

(mg L-1) ZU vtok 64,40 24,0 0,440 38,80 1043 ZU vm. 77,80 18,0 0,100 43,60 327 ZU iztok 10,00 110,0 0,180 46,40 213 MET vtok 54,80 22,0 0,380 37,80 1015 MET vm. 73,20 18,0 0,120 34,00 248 MET iztok 5,60 116,0 0,560 41,60 204

Rezultati za amonijev, nitratni in nitritni dušik so v okviru pričakovanj, saj kot smo

opisali v poglavju 3.2.1, amonij med anoksično presnovo nastaja in se med aerobno

presnovo porablja, medtem ko se nitrat in nitrit med anoksično presnovo porabljata

(denitrifikacija) in nastajata med aerobno presnovo (nitrifikacija).

Pri ortofosfatu ne moremo opaziti enotnega trenda, saj se njegova koncentracija v

reaktorjih z zdravilnimi učinkovinami vseskozi povečuje, medtem ko se pri reaktorjih z

metaboliti med anoksično presnovo najprej zmanjša in nato poveča med aerobno presnovo.

To lahko pripišemo dejstvu, da ortofosfati niso edina oblika fosfata v odpadnih vodah in je

mogoče nihanje koncentracij razložiti tudi z različnim razpadom polifosfatov. Tako bi

morali za popolnejšo sliko izmeriti tudi celoten fosfat, potrebno pa bi bilo opraviti še več

meritev.

Kemijska potreba po kisiku (KPK) pada tako med anoksično kot med aerobno

presnovo, vendar smo pričakovali večji padec med aerobno presnovo in ne med anoksično.

Vzrok temu bi lahko bila prisotnost mikroorganizmov v vmesnem vsebniku, kar poveča

razgradnjo. Glede na to, da v vmesnem vsebniku nismo menjavali raztopine, saj smo želeli

vzpostaviti konstantno koncentracijo zdravilnih učinkovin, je verjetno, da je prišlo do rasti

mikroorganizmov, posebej zato, ker je medij ugoden za njihov razvoj.

Določili smo tudi biokemijsko potrebo po kisiku v petih dneh (BPK5). V Preglednici

XV so predstavljeni rezultati meritev po posameznih dnevih kot povprečje paralelk

(poglavje 5.2.4).

Preglednica XV: Rezultati meritev BPK

1. dan (mg L-1)

2. dan (mg L

ZU vtok 287,5 > 500ZU vm. 12,5 27,5ZU iztok 15 32,5M vtok 282,5 > 500M vm. 40 50M iztok 0 12,5

BPK5 je enak rezultatom po 5. dnevu meritev. Pri vtokih je rezultat že po 2. dnevu

presegel merilno območje in je tako višji od 500

za metabolite je ostala znotraj merilnega obmo

morali poleg večjega števila meritev vzorce razred

Sicer pa je viden padec BPK med vtokom, vmesnim vsebnikom in iztokom, vendar bi

za popolnejšo sliko potrebovali

primerjamo rezultate meritev KPK in BPK

anoksičnim in vmesnim kot med vmesnim in aerobnim reaktorjem. Ker se vrednosti BPK

med vmesnim reaktorjem in iztokom (še posebej pri zdravilnih u

razlikujeta, lahko sklepamo, da bi bilo smiselno dodajanje hranilnih snovi tudi v vmesne

reaktorje. Na Sliki 25 je prikazan potek BPK za iztok reaktorjev z metaboliti.

Slika 25: Potek BPK po dnevih za iztok reaktorjev z metaboliti

0

5

10

15

20

25

0 1

BPK (mg/l)

50

: Rezultati meritev BPK po dnevih

2. dan mg L-1)

3. dan (mg L-1)

4. dan (mg L-1)

5. dan (mg L-1)

500 > 500 > 500 > 500 27,5 30 30 40 32,5 35 27,5 30 500 > 500 > 500 > 500 50 52,5 52,5 52,5

12,5 20 22,5 22,5

je enak rezultatom po 5. dnevu meritev. Pri vtokih je rezultat že po 2. dnevu

čje in je tako višji od 500 mg L-1, le ena paralelka

za metabolite je ostala znotraj merilnega območja. Za izboljšanje teh rezultatov bi torej

jega števila meritev vzorce razredčiti.


o sliko potrebovali večje število opravljenih meritev skozi daljši

primerjamo rezultate meritev KPK in BPK5, vidimo, da je padec obeh vrednosti ve

nim in vmesnim kot med vmesnim in aerobnim reaktorjem. Ker se vrednosti BPK

med vmesnim reaktorjem in iztokom (še posebej pri zdravilnih učinkovinah) le malo


je prikazan potek BPK za iztok reaktorjev z metaboliti.

: Potek BPK po dnevih za iztok reaktorjev z metaboliti

2 3 4 5

Čas (dni)

je enak rezultatom po 5. dnevu meritev. Pri vtokih je rezultat že po 2. dnevu

le ena paralelka vtoka reaktorjev

Za izboljšanje teh rezultatov bi torej


je število opravljenih meritev skozi daljši čas. Če

vidimo, da je padec obeh vrednosti večji med

nim in vmesnim kot med vmesnim in aerobnim reaktorjem. Ker se vrednosti BPK5

činkovinah) le malo


je prikazan potek BPK za iztok reaktorjev z metaboliti.

6

Čas (dni)

51

6.4 MASNI SPEKTRI PREUČEVANIH SPOJIN

V Preglednici XVI so navedene preučevane spojine, njihovi retencijski časi in značilni

fragmentni ioni, s pomočjo katerih smo lahko identificirali spojine.

Preglednica XVI: Preučevane spojine, njihova relativna molekulska masa (Mr), retencijski čas (tr), najznačilnejši fragmentni ioni in referenčni ion, po katerem smo spojino kvantificirali (Mq)

Spojina tr M r Mq fragmentni ioni (m/z) ibuprofen 11,06 206,3 263 75, 205, 263 klofibrinska kislina 10,59 214,6 271 75, 143, 185, 243, 271, 328 naproksen 17,75 230,3 287 75, 141, 185, 287, 344 ketoprofen 19,85 254,2 311 73, 105, 295, 311 diklofenak 21,31 296,1 352 73, 179, 214, 277, 352, 409 karbamazepin 20,69 236,3 193 73, 193, 250, 293, 335 devteriran ibuprofen 10,99 209,3 266 73, 205, 266 akridin 9,87 179,2 179 75, 179 akridon 13,39 195,2 252 73, 252, 309 1-(2,6-diklorofenil)indolin-2-on 13,52 278,1 300 73, 179, 214, 242, 277, 300 9-kloroakridin 11,01 213,7 213 75, 177, 213

Fragmentacija je bila najbolj izrazita pri klofibrinski kislini, kjer je število dobro

izraženih vrhov (kar je razvidno tudi iz samega spektra, Slika 29) precej višje kot pri

ostalih spojinah. Pri večini spojin smo za opazovani ion (Mq) izbrali dimetilsililni (DMS)

derivat osnovne spojine, ki nastane po odcepitvi butilne skupine in čigar vrh je bil povečini

tudi najvišji. Pri akridinu in 9-kloroakridinu smo opazovali osnovno spojino, saj se ta ne

derivatizira, pri karbamazepinu pa smo opazovali tričlenski obročni sistem z m/z = 193, ki

je najbolj stabilen fragmentni ion. Za siliranje značilna fragmenta z m/z = 73 in m/z = 75

nastaneta po odcepu sililne skupine, ponekod se pojavi tudi fragment z m/z = 57, ki

predstavlja terc-butilno skupino (Slika 26).

Slika 26: fragmenti z m/z = 57 (levo), m/z = 73 in m/z = 75 (desno)

52

Na Slikah 27 in 28 sta prikazana kromatograma za enega od vzorcev odpadne vode z

zdravilnimi učinkovinami in metaboliti.

Slika 27: Kromatogram vseh ionov vzorca zdravilnih učinkovin v SCAN načinu (x-os predstavlja čas v minutah, y-os pa odziv)

Slika 28: Kromatogram vseh ionov vzorca metabolitov v SCAN načinu (x-os predstavlja čas v minutah, y-os pa odziv)

53

Iz masnega spektra ibuprofena (Slika 29) lahko vidimo, da je najvišji odziv pri DMS

ionskem fragmentu ibuprofena (m/z = 263), ki nastane po odcepu dobro izstopajoče terc-

butilne skupine iz terc-butildimetilsililnega (TBDMS) derivata (m/z = 320). Pri m/z = 247

lahko vidimo sicer nizek odziv za fragment, ki nastane po dodatni odcepitvi metilne

skupine. Dobljeni odziv pri m/z = 205 predstavlja molekulo ibuprofena z odcepljenim

vodikovim atomom, ta nastane po odcepu DMS skupine iz fragmenta m/z = 263. Značilen

je še fragment pri m/z = 161, ki nastane po odcepu fragmenta –COOSiR3, lahko pa vidimo

tudi tipična fragmenta pri m/z = 57 in m/z=75 (Slika 26).

Slika 29: Masni spekter ibuprofena v SCAN načinu, na x-osi je razmerje med maso in nabojem (m/z), na y-osi pa odziv

54

Na Sliki 30 je prikazan masni spekter klofibrinske kisline. Vidimo lahko, da je

fragmentacija zelo raznolika, najvišji odziv je v tem primeru pri fragmentu 1-kloro-4-

metoksibenzenu (m/z = 143). Izbrani fragment, ki smo ga opazovali pri analizi, je DMS

ester (m/z = 271), ki nastane po odcepu terc-butilne skupine (iz molekule z m/z=328) in

ima drugi najvišji odziv. Običajno sicer spremljamo najvišji odziv, vendar ima fragment

m/z = 143 premajhno maso in bi dal prevelik šum. Preostali fragmentni ioni, ki so imeli še

visok odziv, so ion pri m/z = 243 in 1-terc-butoksi-4-klorobenzil (m/z = 185). Visok odziv

imata tudi fragmenta pri m/z = 75 in m/z = 57.

Slika 30: Masni spekter klofibrinske kisline v SCAN načinu, na x-osi je razmerje med maso in nabojem (m/z), na y-osi pa odziv

55

Slika 31 predstavlja masni spekter naproksena. Najvišji odziv ima DMS derivat (m/z =

287), ki smo ga tudi uporabljali pri analizi. Pri m/z = 344 lahko opazimo molekulski ion

TBDMS derivata naproksena. Včasih je viden tudi fragment pri m/z = 272, ki nastane z

odcepom metilne skupine. Visok odziv imata še fragmentna iona 2-metilnaftil pri m/z =

141 in 2-etil-6-metoksinaftil pri m/z = 185. Fragment m/z = 185 nastane z odcepitvijo

COOSiR3 skupine, po nadaljnji odcepitvi metilne in metoksi skupine pa dobimo fragment

m/z = 141. Opazimo pa lahko tudi tipičen odziv pri m/z = 75.

Slika 31: Masni spekter naproksena v SCAN načinu, na x-osi je razmerje med maso in nabojem (m/z), na y-osi pa odziv

56

Iz masnega spektra ketoprofena na Sliki 32 lahko opazimo, da je najvišji odziv pri

fragmentu z m/z = 311, DMS estru ketoprofena. Fragmenta pri m/z = 294 in m/z = 282

nastaneta z odcepom ene oz. dveh metilnih skupin iz DMS fragmentnega iona. Tipičen je

še odziv pri m/z=75.

Slika 32: Masni spekter ketoprofena v SCAN načinu, na x-osi je razmerje med maso in nabojem (m/z), na y-osi pa odziv

57

Slika 33 predstavlja masni spekter diklofenaka. Tako kot pri klofibrinski kislini, lahko

tudi pri diklofenaku opazimo, da ion, ki smo ga uporabljali pri analizi (DMS ester, m/z =

352) ni imel najvišjega odziva, v tem primeru je to ion pri m/z = 214. Visok odziv imajo še

fragmenti pri m/z = 179, m/z = 242 ter molekulski ion pri m/z = 409 (TBDMS ester

diklofenaka). Z odcepom terc-butilne skupine iz molekulskega iona m/z = 409 dobimo

fragment z m/z = 352. Z nadaljnjim odcepom Cl atoma in OSiMe2 skupine dobimo

fragment z m/z = 242. Z odcepom karbonilne skupine iz m/z = 242 dobimo fragment z

m/z = 214 in od tod z odcepom še drugega klorovega atoma fragment z m/z = 179.

Opazimo lahko še odziva pri m/z = 57 ter pri m/z = 75.

Slika 33: Masni spekter diklofenaka v SCAN načinu, na x-osi je razmerje med maso in nabojem (m/z), na y-osi pa odziv

58

Na Sliki 34 je masni spekter karbamazepina. Pri analizi smo opazovali fragment z

m/z = 193, tričlenski obročni sistem 5H-dibenzo[b,f]azepin, ki nastane po odcepu

karboksamidne stranske skupine iz molekule karbamazepina. Ta ima tudi najvišji odziv.

Opazimo lahko prisotnost fragmenta akridinila (m/z = 179). Pri m/z = 293 in m/z = 335

lahko opazimo odziva za DMS oz. TBMS derivat karbamazepina. Fragment m/z = 293

nastane z odcepom terc-butilne skupine, fragment m/z = 335 pa z odcepom metilne

skupine iz TBDMS derivata. Pri m/z = 250 pa opazimo metilni derivat karbamazepina.

Reakcije nastanka fragmentov m/z = 250, m/z = 293 in m/z = 335 so možne zaradi keto-

enol tavtomerije. Opazimo tudi fragmenta pri m/z = 57 ter pri m/z = 73.

Slika 34: Masni spekter karbamazepina v SCAN načinu, na x-osi je razmerje med maso in nabojem (m/z), na y-osi pa odziv

59

Na masnem spektru devteriranega ibuprofena (Slika 35), internega standarda pri

določanju zdravilnih učinkovin, dobimo najvišji odziv pri m/z = 266, DMS estru osnovne

spojine. Opazimo lahko tudi sicer nizek odziv za ibuprofen (m/z = 205), ki najverjetneje

nastane z zamenjavo devterijevih atomov z vodikovimi po odcepu DMS skupine. Vidimo

lahko tudi odziva pri m/z = 73 ter pri m/z = 57.

Slika 35: Masni spekter devteriranega ibuprofena v SCAN načinu, na x-osi je razmerje med maso in nabojem (m/z), na y-osi pa odziv

60

Na masnem spektru akridina na Sliki 36 je najvišji odziv pri m/z = 179, ki predstavlja

samo molekulo akridina. Ta se ne derivatizira, zato lahko ostale odzive smatramo bodisi za

preostale spojine, prisotne v matriksu, bodisi za ostanke derivatizacijskega sredstva

(m/z = 75).

Slika 36: Masni spekter akridina v SCAN načinu, na x-osi je razmerje med maso in nabojem (m/z), na y-osi pa odziv

61

Na Sliki 37 je masni spekter akridona. Najvišji odziv dobimo pri DMS derivatu

akridona (m/z = 252), ki nastane po značilnem odcepu terc-butilne skupine iz

molekulskega iona pri m/z = 309 (TBDMS derivat). Derivatizacija na OH skupini je

mogoča zaradi keto-enol tavtomerije. Opazimo tudi značilni odziv pri m/z = 73.

Slika 37: Masni spekter akridona v SCAN načinu, na x-osi je razmerje med maso in nabojem (m/z), na y-osi pa odziv

62

Slika 38 predstavlja masni spekter 1-(2,6-diklorofenil)indolin-2-ona. Med analizo smo

opazovali fragment pri m/z = 300, ki ima tudi najvišji odziv. Gre za DMS fragmentni ion

osnovne spojine, iz katere se je odcepil klorov atom. Visoke odzive smo dobili še pri

m/z = 391 (TBDMS eter osnovne spojine), pri m/z = 276 (osnovna spojina), m/z = 241

(odcep klorovega atoma iz osnovne spojine) in m/z = 213 (razpad indolnega obroča pri

m/z = 241 z odcepom karbonilne skupine). Tudi pri DKFI je derivatizacija mogoča zaradi

keto-enol tavtomerije. Opazimo lahko še odziv pri m/z = 73.

Slika 38: Masni spekter 1-(2,6-diklorofenil)indolin-2-ona v SCAN načinu, na x-osi je razmerje med maso in nabojem (m/z), na y-osi pa odziv

63

Slika 39 predstavlja masni spekter 9-kloroakridina, ki smo ga uporabljali kot interni

standard pri določanju metabolitov. Molekula se ni derivatizirala, odziv za osnovno

molekulo lahko vidimo pri m/z = 213. Opazimo lahko tudi odziv za fragmentni ion

akridinil, ki nastane po odcepu klorovega atoma in se prav tako ne derivatizira.

Slika 39: Masni spekter 9-kloroakridina v SCAN načinu, na x-osi je razmerje med maso in nabojem (m/z), na y-osi pa odziv

64

6.5 ODSTRANJEVANJE ZDRAVILNIH U ČINKOVIN

Odstranjevanje zdravilnih učinkovin v posameznih reaktorjih

V Preglednici XVII so predstavljene eliminacije preiskovanih zdravilnih učinkovin v

posameznih reaktorjih. V nadaljnji diskusiji bomo predvsem skušali interpretirati dobljene

rezultate in hkrati razložiti anomalije, do katerih je prišlo, in sicer smo ponekod dobili na

videz negativne eliminacije, tj. izmerjene koncentracije spojin na iztokih so bile višje kot

na vtokih.

Preglednica XVII: Rezultati meritev odstranjevanja zdravilnih učinkovin v % v posameznih reaktorjih; nR1, nR2 in nA1 predstavljajo število meritev v posameznem reaktorju, SD pa standardno deviacijo

Spojina R1 (%) SD nR1 R2 (%) SD nR2 A1 (%) SD nA1 ibuprofen 91,3 5,3 8 94,8 3,3 5 5,9 4,3 5 klofibr. kisl. –14,4 11,8 8 –14,1 5,1 5 –5,6 3,6 5 naproksen 92,8 2,8 8 92,3 4,8 5 86,5 5,0 5 ketoprofen 96,4 2,0 8 94,6 3,2 5 12,6 4,7 5 diklofenak 21,0 18,0 8 50,4 7,2 5 –8,7 9,4 5 karbamazepin –7,9 18,7 8 8,0 5,8 5 0,9 7,5 5

Eliminacije ibuprofena, naproksena in ketoprofena v aerobnih reaktorjih so

pričakovano visoke in presegajo 90 % (5, 13, 15). Med izbranimi spojinami so ibuprofen,

ketoprofen in naproksen strukturno najbolj podobni internemu standardu devteriranemu

ibuprofenu, kar je eden od razlogov za nižje standardne odklone od preostalih spojin. Nižji

standardni odkloni pa nakazujejo, da je izbrana analizna metoda najprimernejša ravno za

ibuprofen, naproksen in ketoprofen. V anoksičnih pogojih se naproksen prav tako zelo

dobro (86,5 %), medtem ko se ibuprofen in ketoprofen slabše odstranjujeta.

Klofibrinska kislina, diklofenak in karbamazepin so težje razgradljive spojine. Vse tri

tudi vsebujejo klorov atom, ki je v organskih spojinah manj pogost, in morda je to eden od

razlogov, zakaj se te spojine slabše eliminirajo. Rezultati so bili konstantno negativni zgolj

pri klofibrinski kislini (razen pri enem vzorcu), pri diklofenaku in karbamazepinu pa smo

pri nekaterih vzorcih dobili pozitivno, pri nekaterih pa negativno eliminacijo. Pri vseh treh

smo tudi opazili, da je bila eliminacija proti koncu večinoma višja kot na začetku (najbolj

izrazito v R1, ki smo ga tudi najdlje opazovali), kar poleg izmenjujočih se pozitivnih in

negativnih rezultatov botruje tudi višji standardni deviaciji pri teh spojinah. Na osnovi tega

65

lahko sklepamo, da se je biomasa dalj časa prilagajala na te spojine kot na druge, bolj

razgradljive spojine. Negativno eliminacijo, predvsem pri diklofenaku in karbamazepinu,

je mogoče razložiti s tem, da je njihova eliminacija okoli 0-odstotna, vendar zaradi

variabilnosti pri bioloških sistemih ta lahko variira in zapade tudi pod 0 %. Zaradi

zahtevnega analiznega postopka določanja sledov spojin v tako kompleksni matrici, kot je

odpadna voda, lahko določena odstopanja pripišemo tudi vplivu merilne napake.

Slika 40 ponazarja odstranjevanje diklofenaka v reaktorju R1. Opazno je, da se je pri

diklofenaku, z izjemo 5. serije, eliminacija v glavnem povečevala. Nižji rezultat v 5. seriji

lahko pripišemo bodisi spremembam v biomasi bodisi napaki pri vzorčenju, previsoki

temperaturi ipd. Kljub anomaliji v 5. seriji lahko sklepamo, da je prišlo vsaj do delne

adaptacije biomase na vnos diklofenaka, za boljšo sliko pa bi bil potreben daljši čas

opazovanja. Naslednja, manj verjetna možnost je, da je prihajalo do nalaganja omenjenih

učinkovin in kasnejšega spiranja med vzorčenjem. Prav tako je lahko tudi prišlo do

sistemske napake, ki je pri vseh vzorcih botrovala nižjim rezultatom za vtoke.

Slika 40: Odstranjevanje diklofenaka v R1

Vtoki se razlikujejo od iztokov predvsem po veliko višjih koncentracijah celokupnih

topljencev in se zato težje filtrirajo, počasneje črpajo skozi kolone pri SPE ter lahko zaradi

velikega števila raztopljenih spojin tudi pride do posebnega pojava t. i. »ionske

interference« (ang. »ion interference«), kjer velika količina ionov lahko moti pri detekciji

-30

-20

-10

0

10

20

30

40

50

60

0 2 4 6 8 10

diklofenak

Serija

Odstranjevanje (%)

66

iskanih spojin na masnem spektrometru. Ta pojav je sicer pogostejši pri realnih vzorcih s

čistilnih naprav, kjer so koncentracije različnih topljencev veliko višje kot v našem

primeru.

Da bi preverili, ali sestava hranilne raztopine vpliva na dobljene rezultate v vtokih, smo

primerjali površine pod krivuljo za vtok, iztok ter pripravljeno raztopino zdravilnih

učinkovin v vodovodni vodi (topilom za pripravo hranilne raztopine). Rezultati za spojine

v vodovodni vodi so bili res višji kot pri vtokih, vendar še vedno ne v dovolj veliki meri,

da bi dosegli pozitivno vrednost eliminacije klofibrinske kisline.

Tekom analiz vzorcev smo opazili, da so bili rezultati prvih dveh serij nižji kot v

naslednjih, ko se je eliminacija vseh preiskovanih spojin povečala (oz. v primeru

klofibrinske kisline, karbamazepina in diklofenaka bližja 0 %), takrat smo namreč imeli

težave pri filtraciji vzorcev, zaradi katerih nismo izvedli ekstrakcije še istega oz. najkasneje

naslednjega dne, kot je bil to slučaj kasneje, ampak šele po več dneh. Ker so vtoki ugoden

medij za razvoj mikroorganizmov, bi lahko prišlo do delne razgradnje spojin, poleg tega pa

se lahko nekatere hranilne snovi v manjši meri oborijo, kar otežuje ekstrakcijo.

Alternativna možnost bi bila, da se je biomasa v tem času bolje adaptirala na vnesene

spojine in bi pri daljšem času opazovanja (npr. leto ali več) rezultati bili drugačni.

Pri klofibrinski kislini smo tudi opazili, da je fragmentacija zelo raznolika (Preglednica

XV), saj je opaziti več izrazitih vrhov kot pri drugih spojinah in razmerja med temi niso

vedno konstantna. Prav tako je v nekaterih slučajih prišlo do zamika kromatografskega

vrha (v nekaterih vzorcih pri cca. 10,5 min, v nekaterih pa pri cca. 11,5 min) oz. do pojava

dveh vrhov. To lahko nakazuje bodisi na to, da se spojina težje loči na koloni, bodisi da je

derivatizacijski produkt po 15 urah delno razpadel ali da gre za neko drugo spojino, ki ima

enako razmerje m/z. Morda bi tukaj veljalo poskusiti tudi s krajšim časom derivatizacije

(npr. 1 uro) in primerjati tako dobljene rezultate, bi pa to pomenilo, da ne bi mogli hkrati

analizirati še karbamazepina, ki nujno potrebuje daljši čas derivatizacije.

Eliminaciji diklofenaka v reaktorjih R1 in R2 sta se občutno razlikovali (15,2 % in

50,4 %). To bi lahko razložili z različno sestavo in vsebnostjo biomase med reaktorjema,

tako da je v reaktorju R2 večja količina mikroorganizmov, ki so sposobni uspešno

razgraditi diklofenak (oz. ga uporabiti). Podobno bi lahko razložili razliko med

reaktorjema pri karbamazepinu.

67

Odstranjevanje zdravilnih učinkovin v sklopljenem sistemu

V Preglednici XVIII so predstavljeni rezultati odstranjevanja zdravilnih učinkovin v

sklopljenih sistemih anoksičnen-aeroben reaktor (R2-A1).

Preglednica XVIII: Odstranjevanje zdravilnih učinkovin v sklopljenem sistemu anoksičen-aeroben reaktor (R20-A1); SD predstavlja standardno deviacijo, %teor. predstavlja teoretično izračunano eliminacijo, n pa število meritev

Spojina R2-A1 (%) SD % teor. n ibuprofen 98,6 0,6 95,1 3 klofibrinska kislina –21,4 2,2 –20,5 3 naproksen 99,8 0,1 99,0 3 ketoprofen 98,2 0,8 95,3 3 diklofenak 45,0 18,9 46,1 3 karbamazepin 10,0 3,5 8,8 3

Teoretične izkoristke smo izračunali iz rezultatov odstranjevanja v posameznih

reaktorjih, in sicer po Enačbi 17, ki smo jo izpeljali na naslednji način (eaer predstavlja

eliminacijo, izraženo kot delež v aerobnem reaktorju, eanox eliminacijo v anoksičnem

reaktorju, c0 je začetna koncentracija, cvm koncentracija v vmesnem vsebniku, ci pa

koncentracija na iztoku):

TUVWXTYZ�V (YV[W\TZ�]) = �^��_

�^= 1 −

�_

�^ Enačba 11

��a =�^��bc

�^ Enačba 12

�� =�bc��_

�bc Enačba 13

Iz Enačb 12 in 13 dobimo:

d, =�bc

3��efgh Enačba 14

d� = di� ∙ (1 − ��) Enačba 15

Enačbi 14 in 15 vstavimo v Enačbo 11:

TUVWXTYZ�V (YV[W\TZ�]) = 1 −�bc∙(3��ekl)∙(3��efgh)

�bc Enačba 16

68

Enačbo 16 poenostavimo do končne Enačbe 17:

TUVWXTYZ�V (YV[W\TZ�]) = �� a − �� × ��a Enačba 17

Vidimo lahko, da so dobljeni izkoristki v glavnem blizu teoretično izračunanih

vrednosti. Pri večini spojin so sicer nekoliko višji (izjemi sta le klofibrinska kislina in

diklofenak), kar lahko razložimo s tem, da bi izkoristki v posameznih reaktorjih morali biti

višji, kar smo skušali utemeljiti v podpoglavju Odstranjevanje zdravilnih učinkovin v

posameznih reaktorjih. Pri računanju smo ponekod uporabili negativne izkoristke, kar je

rezultate še dodatno znižalo, saj je sicer logično sklepati, da bi morala biti eliminacija po

sklopitvi višja ali kvečjemu enaka eliminaciji v enem od reaktorjev (saj le-ta teoretično ne

bi smela biti manjša od 0).

Izkoristki za ibuprofen, ketoprofen in naproksen so pričakovano visoki, diklofenak,

karbamazepin in klofibrinska kislina pa se odstranjujejo v manjši meri, kar smo opazili že

v posameznih reaktorjih.

69

6.6 ODSTRANJEVANJE METABOLITOV

Odstranjevanje metabolitov v posameznih reaktorjih

V Preglednici XIX so predstavljene eliminacije metabolitov v posameznih reaktorjih, v

nadaljevanju pa smo dobljene rezultate skušali tudi interpretirati.

Preglednica XIX: Rezultati meritev odstranjevanja metabolitov v % v posameznih reaktorjih; nR3, nR4 in nA2 predstavljajo število meritev v posameznem reaktorju, SD pa standardno deviacijo

Spojina R3 (%) SD nR3 R4 (%) SD nR4 A200 (%) SD nA2 akridin 99,7 0 4 99,7 0 7 63,6 16,4 4 akridon 68,6 18,8 4 74,7 32,8 7 –10,6 18,0 4 DKFI 45,2 12,8 4 38,8 21,0 7 11,4 17,1 4

V primerjavi z zdravilnimi učinkovinami smo pri metabolitih imeli eno serijo meritev

manj, saj smo začeli s kasnejšim dodajanjem spojin v reaktorje. Tudi tukaj smo dobili

nekatere negativne eliminacije, ki bi jih lahko razložili podobno kot pri zdravilnih

učinkovinah (poglavje 6.5).

Eliminacija akridina v aerobnih reaktorjih je praktično popolna, saj ga v iztokih nikoli

nismo detektirali (zato tudi standardna deviacija 0). Ker pa smo omejeni z mejo

zaznavnosti metode, smo 99,7 % dobili tako, da smo od teoretičnih 100 % odšteli ½ LOD

(22). V anoksičnem reaktorju je eliminacija nekaj nižja, kljub vsemu pa precej višja od

vseh preučevanih spojin z izjemo naproksena.

Akridon se je v aerobnih pogojih odstranjuje slabše od akridina, in sicer 68–75 %.

Opazili smo tudi znatno naraščanje deleža eliminacije tekom raziskave, kar botruje tudi

večji standardni deviaciji (od začetnih 9 % do blizu 90 % v kasnejših serijah pri R4).

Podobno kot pri prvih dveh serijah zdravilnih učinkovin smo v prvi seriji metabolitov imeli

še težave s počasno filtracijo, kar je verjetno delno doprineslo k znižanju rezultatov v

vtokih in posledično nižji dobljeni eliminaciji. Povečanje bi lahko pripisali tudi adaptaciji

biomase na dodajane spojine (podobno kot pri diklofenaku, Slika 39). Pri akridinu se to

sicer ni poznalo, predvsem pri akridonu in delno tudi DKFI pa smo opazili povečanje od

druge serije naprej, tako da bi brez le-te elimiacija pri akridonu bila med 80 in 90-odstotna

v aerobnih reaktorjih. Pri anoksičnem reaktorju je dobljeno negativno eliminacijo prav tako

moč pripisati predvsem prvi seriji, pri nadaljnjih se je rezultat gibal med –10 in 10 %, kar

je v okviru merilne napake.

70

1-(2,6-diklorofenil)indolin-2-on se je med metaboliti najslabše odstranjeval v aerobnih

reaktorjih, med 38 in 45 %. Tudi tukaj smo od druge serije naprej opazili povečanje

odstranjevanja, vendar ne v taki meri kot pri akridonu, je pa tudi tukaj to razlog za visoko

standardno deviacijo. Tudi v anoksičnem reaktorju se je slabše odstranjeval (11 %).

Odstranjevanje metabolitov v sklopljenem sistemu

V Preglednici XX so predstavljeni rezultati odstranjevanja zdravilnih učinkovin v

sklopljenih sistemih anoksičnen-aeroben reaktor (R3-A2).

Preglednica XX: Odstranjevanje zdravilnih učinkovin v sklopljenem sistemu anoksičen-aeroben reaktor (R3-A2); SD predstavlja standardno deviacijo, %teor. predstavlja teoretično izračunano eliminacijo, n pa število meritev

Spojina R3-A2 (%) SD % teor. n akridin 99,7 0 99,7 3 akridon 87,1 1,5 65,3 3 1-(2,6-diklorofenil)indolin-2-on 40,0 5,7 51,4 3

Teoretične izkoristke smo izračunali po Enačbi 17. Akridina tako kot pri posameznih

aerobnih reaktorjih na iztoku sklopljenih reaktorjev nismo zaznali, tako da smo tudi tukaj

od 100 % odšteli ½ LOD. Pri akridonu opazimo, da je odstranjevanje bistveno višje kot

teoretično izračunana vrednost, kar lahko pripišemo nižjima izkoristkoma v obeh

posameznih reaktorjih, ki sta v veliki meri bila posledica prve serije in povečevanja

odstranjevanja s časom (opisano v podpoglavju Odstranjevanje metabolitov v posameznih

reaktorjih). Pri DKFI pa je dobljen izkoristek nižji od teoretično izračunanega, čeprav smo

pričakovali, da bo ta, podobno kot pri akridonu, višji. Spremenljivost rezultatov pri DKFI

je moč razložiti s tem, da smo spojino prvič poskusno preučevali, in verjetno je, da analizni

postopek, ki je primernejši za karbamazepin in njegove metabolite (akridin, akridon), za

določanje DKFI, ki je podoben diklofenaku in se strukturno bistveno razlikuje od internega

standarda 9-kloroakridina, ni optimalen.

71

6.7 PRIMERJAVA ODSTRANJEVANJA V SKLOPLJENIH IN

AEROBNIH REAKTORJIH

S pomočjo enostranskega t-testa smo primerjali odstranjevanje preučevanih spojin v

sklopljenih sistemih anoksičen-aeroben reaktor z odstranjevanjem spojin v uporabljenem

aerobnem reaktorju, kjer so bili rezultati za večino spojin višji kot v anoksičnem. V

Preglednici XXI so navedeni rezultati za aerobni reaktor in sklopljen sistem:

Preglednica XXI: Primerjani rezultati odstranjevanja preučevanih spojin v sklopljenih sistemih in posameznih reaktorjih (za zdravilne učinkovine R2, za metabolite R3) ter ali je razlika statistično značilna

Spojina aerobni reaktor (%)

SD sklopljen sistem (%)

SD statistično značilna razlika

ibuprofen 94,8 3,3 98,6 0,6 da klofibrinska kislina –14,1 5,1 –21,4 2,2 da naproksen 92,3 4,8 99,8 0,1 da ketoprofen 94,6 3,2 98,2 0,8 da diklofenak 50,4 7,2 45,0 18,9 ne karbamazepin 8,0 5,8 10,0 3,5 ne akridin 99,7 0 99,7 0 ne akridon 68,6 18,8 87,1 1,5 ne DKFI 45,2 12,8 40,0 5,7 ne

Na osnovi rezultatov smo poskusili ugotoviti, ali se za posamezne spojine dobljeni

eliminaciji statistično značilno razlikujeta pri stopnji zaupanja α = 0,05. Za ibuprofen,

naproksen in ketoprofen smo ugotovili, da je eliminacija v sklopljenem sistemu statistično

značilno višja kot v aerobnem reaktorju. Za navedene spojine iz podatkov torej lahko

trdimo, da se bolje odstranjujejo v sklopljenih sistemih aerobni-anoksični reaktor. Pri

klofibrinski kislini pa je eliminacija statistično značilno manjša (bolj negativna).

Pri vseh ostalih spojinah, večinoma gre za slabo razgradljive snovi, razlike nismo

ugotovili, kar lahko pripišemo majhnemu številu vzorcev ter naraščanju odstranjevanja s

časom (adaptacijo biomase na vnesene snovi), kar je povečalo standardne deviacije. Pri

nekaterih spojinah sama metoda analize ni bila optimalna.

Opazili smo tudi, da so standardne deviacije pri vseh spojinah, razen pri diklofenaku,

nižje v sklopljenih sistemih, kar je lahko dokaz v prid adaptaciji biomase na spojine, saj

smo sklopitev izvedli šele po nekajtedenskem vnašanju spojin v posamezne reaktorje.

72

7 SKLEP

V diplomskem delu smo opazovali odstranjevanje zdravilnih učinkovin in nekaterih

njihovih presnovkov v pilotni čistilni napravi v aerobnih in anoksičnih pogojih ter v

sklopljenem sistemu anoksični-aerobni reaktor. Kot modelne spojine smo izbrali

predstavnike nesteroidnih protirevmatičnih učinkovin ibuprofen, naproksen, ketoprofen in

diklofenak, antiepileptik karbamazepin, humani presnovek lipidnega regulatorja klofibrata

klofibrinsko kislino, presnovka karbamazepina akridin in akridon ter presnovek

diklofenaka 1-(2,6-diklorofenil)indolin-2-on. Izbrane zdravilne učinkovine so bile v letu

2008 med najpogosteje predpisanimi v Sloveniji glede na indikacije, le klofibrat v

Sloveniji ni registriran. Klofibrinska kislina pa je zaradi svoje obstojnosti v okolju in ker

gre za aktivno obliko predzdravila klofibrata med najpogosteje preučevanimi presnovki

(10).

Izbrane spojine smo sprva vnašali ločeno v aerobne in anoksične reaktorje ter

opazovali njihovo odstranjevanje pod omenjenimi pogoji. Sledila je sklopitev anoksičnega

in aerobnega reaktorja. Procese, ki so potekali v sklopljenem sistemu, smo ovrednotili tudi

z meritvami kemijskih parametrov (amonij, nitrat, nitrit, ortofosfat, kemijska in

biokemijska potreba po kisiku) in potrdili, da v anoksičnih pogojih poteka denitrifikacija

(redukcija nitritov in nitratov) ter da v aerobnih pogojih poteče nitrifikacija (oksidacija

amonija do nitrita in nitrata).

Izolacijo preučevanih spojin smo izvedli z ekstrakcijo na trdnem nosilcu, izkoristki so

bili za vse spojine nad 76 %. Zaradi večje vsebnosti celokupnih topljencev je bila

ekstrakcija bolj problematična pri vzorcih iz vtokov. Sledila je derivatizacija z reagentom

MTBSTFA, kjer smo termolabilne in slabo hlapne spojine prevedli v bolj stabilne in

hlapne sililne derivate. Zaradi daljšega časa derivatizacije, ki ga zahteva karbamazepin,

smo čas derivatizacije poskušali optimizirati in ga določili kot 15 ur. Derivatizaciji je

sledila ločba in analiza s plinskim kromatografom z masno spektrometričnim detektorjem.

Vsebnost analitov v vzorcih smo določili relativno glede na odziv znane količine dodanih

internih standardov devteriranega ibuprofena za zdravilne učinkovine in 9-kloroakridina za

presnovke. Z analizo z masnim spektrometrom smo potrdili strukture sililnih derivatov

izbranih spojin.

73

V aerobnih pogojih so se najbolje odstranjevali ibuprofen, naproksen, ketoprofen in

akridin (vsi nad 90 %), medtem ko so se ostale spojine odstranjevale v manjši meri

(klofibrinska kislina –14 %, karbamazepin –8 do 8 %, diklofenak 20–50 %, DKFI 39–

45 %, akridon 68–75 %). V anoksičnih pogojih sta se najbolje odstranjevala naproksen (87

%) in akridin (64 %), vse ostale spojine so se odstranjevale v manj kot 13 %. V sklopljenih

sistemih anoksični-aerobni reaktor smo primerjali odstranjevanje izbranih spojin glede na

teoretično izračunane izkoristke odstranjevanja v posameznih reaktorjih. Potrdili smo, da

se ibuprofen, ketoprofen in naproksen statistično značilno bolje odstranjujejo kot v

posameznih reaktorjih, medtem ko za ostale spojine zaradi večjih standardnih odklonov

tega nismo mogli trditi (pri klofibrinski kislini pa je odstranjevanje bilo statistično značilno

nižje).

V bodoče predlagamo nadaljevanje preučevanja sklopljenih sistemov tudi z metodami,

kot so ozoniranje in drugi napredni oksidacijski procesi (advanced oxidation processes,

AOP, ki temeljijo na tvorbi visoko reaktivnih kisikovih zvrsti), ter UV razgradnja. V

študijah je že bilo pokazano, da se težje biorazgradljive spojine, kot so karbamazepin,

klofibrinska kislina in diklofenak v veliki meri (tudi nad 90 %) odstranijo z ozoniranjem

(23) in drugimi oksidacijskimi procesi (24).

74

8 LITERATURA

1. Zakon o zdravilih (ZZdr-1), Uradni list Republike Slovenije, 31, 2006: 3217

2. Williams, D.A., Lemke, T.L.: Principles of Medicinal Chemistry, 5th Ed., Lippincott

Williams & Wilkins, Philadelphia 2002: 12–23, 751–793

3. Kümmerer, K.: Pharmaceuticals in the Environment; Sources, Fate, Effects and Risks,

2nd Ed., Springer Verlag Berlin Heidelberg, 2004: 3–12, 121–132

4. Rang, H.P., Dale, M.M., Ritter, J.M., Flower, R.J.: Rang and Dale's Pharmacology, 6th

Ed., Elsevier Limited, 2007: 113–127, 226–247, 321–330, 575–587

5. Kosjek, T., Andersen, H.R., Kompare, B., Ledin, A., Heath, E.: Fate of Carbamazepine

during Water Treatment, Environ. Sci. Technol., 43, 2009, 6256-6261

6. Pečar-Čad, S., Kasesnik, K., Hribovšek, T., Košir, P.: Ambulantno predpisovanje zdravil

v Sloveniji po ATC klasifikaciji v letu 2006, Inštitut za varovanje zdravja Republike

Slovenije, Ljubljana 2007

7. Ternes, T.: Human pharmaceuticals, Hormones and Fragrances; The challenge of

micropollutants in urban water management, IWA Publishing, Cornwall 2006: 15–54, 55–

105, 243–292

8. Jørgensen, S.E., Halling-Sørensen, B.: Drugs in the Environment, Chemosphere 40,

2000: 691–699

9. Kosjek, T., Heath, E., Petrović, M., Barceló, D.: Mass Spectrometry for identifying

pharmaceutical biotransformation products in the environment, Trends in Analytical

Chemistry, Vol.26, 11, 2007: 1076–1085

10. Mompelat, S., LeBot, B., Thomas, O.: Occurrence and fate of pharmaceutical products

and by-products, from resource to drinking water, Environment International, 2009

11. Kosjek, T., Heath, E., Krbavčič, A.: Determination of non-steroidal anti-inflammatory

drug (NSAIDs) residues in water samples, Environment International 31, 2005: 679–685

12. Zorita, S., Mårtensson, L., Mathiasson, L.: Occurrence and removal of pharmaceuticals

in a municipal sewage treatment system in the south of Sweden, Science of the Total

Environment 2009

13. Togola, A., Budzinski, H.: Multi-residue analysis of pharmaceutical compounds in

aqueous samples, Journal of Chromatography, 1177, 2008: 150–158

75

14. Kosjek, T., Heath, E., Kompare, B.: Removal of pharmaceutical residues in a pilot

wastewater treatment plant, Anal Bioanal Chem, 387, 2007: 1379–1387

15. Poole, C.F., Poole, S.K.: Chromatography Today, Elsevier Science Publishers,

Amsterdam 1991: 1–95, 231–302, 736–922

16. Skoog, D.A., West, D.M., Holler, F.J.: Fundamentals of Analytical Chemistry, 7th Ed.,

Saunders College Publishing, 1996: 686–699

17. Pavia, D.L., Lampman, G.M., Kriz, G.S.: Introduction to Spectroscopy, 4th Ed.,

Brooks/Cole 2008: 418–440

18. Roš, M.: Biološko čiščenje odpadne vode, GV Založba, Ljubljana 2001: 11–14, 43–56,

143–160, 201–228

19. Roš, M.: Sistemi čiščenja s problematiko odpadnega blata, Zbornik referatov, Vodni

dnevi 2005, Portorož, 12.–13. oktober 2005, Slovensko društvo za zaščito voda, Ljubljana

2005: 18–26.

20. Uredba o emisiji snovi in toplote pri odvajanju odpadnih voda iz virov onesnaževanja,

Uradni list Republike Slovenije, 35, 1996: 2953

21. Uredba o spremembah uredbe o emisiji snovi in toplote pri odvajanju odpadnih voda iz

virov onesnaževanja, Uradni list Republike Slovenije, 21, 2003: 2580

22. Sacher, F., Ehmann, M., Gabriel, S., Graf, C., Brauch, H.J.: Pharmaceutical residues in

the river Rhine - results of a one-decade monitoring programme, Journal of Environmental

Monitoring, 10, 2008, 664–670

23. Sui, Q., Huang, J., Deng, S., Yu, G., Fan, Q.: Occurrence and removal of

pharmaceuticals, caffeine and DEET in wastewater treatment plants of Beijing, China,

Water Research 2009

24. Klavarioti, M., Mantzavinos, D., Kassinos, D.: Removal of residual pharmaceuticals

from aqueous systems by advanced oxidation processes, Environment International, 35,

2009: 402–417

Documents

UROŠ STANI Č - uni-lj.si