Upload
others
View
3
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Uniwersytet Rolniczy im. H. Kołłątaja w Krakowie
Wydział Technologii Żywności
Katedra Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Technicznej
Tomasz Tarko
Załącznik II
Autoreferat
Kraków 2015
1
Załącznik II Kraków 02.02.2015
Autoreferat
1. Imię i Nazwisko: Tomasz Tarko
Miejsce pracy: Uniwersytet Rolniczy w Krakowie,
Wydział Technologii Żywności,
Katedra Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Technicznej,
ul. Balicka 122, 30-149 Kraków
2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe/ artystyczne - z podaniem nazwy, miejsca i
roku ich uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej.
- Dyplom magistra inżyniera technologii żywności, Akademia Rolnicza im.
Hugona Kołłątaja w Krakowie; 1998.
- Dyplom doktora nauk rolniczych w zakresie technologii żywności
i żywienia, Akademia Rolnicza im. Hugona Kołłątaja w Krakowie; 2004 r.
na podstawie rozprawy „Wpływ wybranych dodatków na stabilność
alkoholowych kremów jajowych”, promotor pracy: prof. dr hab. inż.
Tadeusz Tuszyński.
3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych/
artystycznych.
1998 - 2005 – asystent naukowo-dydaktyczny, Zakład Technologii Fermentacji i
Mikrobiologii Technicznej, Akademia Rolnicza im. Hugona
Kołłątaja w Krakowie.
2005 - obecnie – adiunkt, Zakład Katedra Technologii Fermentacji i Mikrobiologii
Technicznej, Akademia Rolnicza im. Hugona Kołłątaja w Krakowie,
aktualnie Katedra Technologii Fermentacji i Mikrobiologii
Technicznej, Uniwersytet Rolniczy im. Hugona Kołłątaja w
Krakowie.
4. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003
r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki
(Dz. U. rok 2014, poz. 1852):
Osiągnięciem naukowym wynikającym z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003
roku o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki
2
(Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.) i stanowiącym podstawę do ubiegania się o stopień naukowy
doktora habilitowanego jest monografia pt.: „Występowanie i biodostępność związków
polifenolowych oraz możliwości ich wykorzystania w suplementacji żywności”, której
jestem autorem.
Praca opublikowana została w Zeszytach Naukowych Uniwersytetu Rolniczego im.
Hugona Kołłątaja w Krakowie, w serii Rozprawy, zeszyt 401, Wydawnictwo Uniwersytetu
Rolniczego w Krakowie, w grudniu 2014.
Recenzenci rozprawy : prof. dr hab. Jan Oszmiański,
Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu
dr hab. inż. Magdalena Mika
Uniwersytet Rolniczy w Krakowie
Omówienie celu naukowego w/w rozprawy, jak również osiągniętych wyników wraz z
omówieniem ich ewentualnego wykorzystania
Wprowadzenie
Reaktywne formy tlenu (RFT), z których wiele ma charakter rodnikowy, działają
destrukcyjnie na makrocząsteczki wchodzące w skład komórek, tj. białka, lipidy czy DNA.
Ich aktywność może prowadzić do takich chorób, jak miażdżyca, cukrzyca, reumatyzm,
zapalenie trzustki czy chorób autoimmunologicznych. Przyczyniają się także do chorób
nowotworowych, zawału serca, udaru i chorób neurodegeneracyjnych (Alzheimera,
Parkinsona oraz Huntingtona) [Singh i in. 2004, Valko i in. 2007].
Przeciwutleniacze są to związki zdolne do inaktywacji reaktywnych form tlenu.
Hamując powstawanie RTF oraz uczestnicząc w ich przemianie w nieaktywne pochodne,
odgrywają istotną rolę w zapobieganiu wywoływanym przez nie uszkodzeniom. W grupie
przeciwutleniaczy wyróżnić można witaminy C, E i A, karotenoidy oraz bardzo liczną grupę
związków polifenolowych. Podstawowym źródłem polifenoli w diecie ludzi są uprawiane i
dziko rosnące owoce (głównie jagody), warzywa (cebula, brokuły, kabaczki, soja) oraz ich
przetwory. Na uwagę zasługują również owoce o niskiej aktywności antyoksydacyjnej, ale
spożywane w dużych ilościach, np. jabłka. Rodzaj i ilość związków polifenolowych w
owocach i warzywach są zdeterminowane przez czynniki genetyczne i środowiskowe, mogą
jednak ulegać modyfikacji w wyniku przetwarzania i przechowywania [Manach i in. 2004].
3
Sposób metabolizmu związków polifenolowych oraz szybkość ich wchłaniania z
układu pokarmowego mają duży wpływ na stopień i rodzaj oddziaływania tych związków na
organizm ludzki. Przyswajalne są tylko polifenole uwolnione z matrycy żywności w żołądku,
jelicie cienkim i grubym. Na efektywność ich wchłaniania z układu pokarmowego ma wpływ
wiele czynników, m.in. masa cząsteczkowa, hydrofilowość związku, stopień polimeryzacji
oraz rodzaj cukru w cząsteczce, a także wartość pH środowiska. Spożywanie dużych ilości
surowców i produktów zawierających związki polifenolowe i witaminy nie przekłada się
bezpośrednio na wzrost ich stężenia we krwi i w tkankach. Wynika to z faktu, że albo są
słabo absorbowane w przewodzie pokarmowym, albo ulegają szybkim przemianom
metabolicznym lub eliminacji. Ponadto produkty metabolizmu polifenoli, które przedostają
się do krwi i tkanek, często znacznie się różnią od ich postaci natywnych pod względem
aktywności przeciwutleniającej [Olthof i in. 2003, Kroon i in. 2004, Manach i in. 2004].
Występowanie polifenoli w owocach i warzywach nie zawsze świadczy o ich
przydatności dla człowieka. Istotnym elementem jest możliwość ich oddzielenia od innych
składników żywności, z którymi często są związane. Ponieważ związki fenolowe cechują się
labilnością i nierównomiernym rozmieszczeniem w roślinie, ich ekstrakcja z materiału
roślinnego wymaga odpowiedniego przygotowania. Duże znaczenie ma też rodzaj
zastosowanego ekstrahenta [Naczk i Shahidi 2004].
Dostępna w sklepach żywność to coraz częściej tzw. żywność wygodna, czyli wysoko
przetworzone produkty, które w wyniku licznych zabiegów technologicznych zostały
pozbawione wielu cennych składników. Jedną z możliwości uzupełnienia produktów
spożywczych o składniki, które uległy usunięciu lub inaktywacji podczas procesów
produkcyjnych, jest fortyfikacja.
Cel pracy i hipotezy badawcze
Celem badań było:
1. określenie potencjału antyoksydacyjnego, zawartości polifenoli ogółem i ich profilu w
wybranych roślinach uznawanych za prozdrowotne oraz optymalizacja parametrów
ekstrakcji składników o charakterze przeciwutleniającym,
2. ocena biodostępności wybranych związków polifenolowych na każdym etapie
symulowanego trawienia i charakterystyka ich właściwości przeciwutleniających,
3. analiza frakcji powstających na poszczególnych etapach symulowanego trawienia
owoców oraz ekstraktów owocowych pod kątem ich aktywności przeciwutleniającej i
zawartości związków polifenolowych,
4
4. wykorzystanie ekstraktów owocowych do wytwarzania nowych produktów
spożywczych, charakteryzujących się podwyższoną aktywnością przeciwutleniającą.
Sformułowano następujące hipotezy badawcze:
za pomocą doboru rozpuszczalników i zastosowanych metod można zwiększyć
wydajność procesu ekstrakcji związków polifenolowych z surowców roślinnych.
biodostępność związków polifenolowych zależy od matrycy żywności, z którą są
związane.
fortyfikacja produktów spożywczych ekstraktami owocowymi korzystnie wpływa na
ich aktywność przeciwutleniającą i atrakcyjność sensoryczną.
Materiał i metody badawcze
Jako materiał biologiczny wykorzystano kwiaty bzu czarnego (Sambucus nigra L.),
głogu dwuszyjkowego (Crataegus oxyacantha L.) i robinii akacjowej (Robinia pseudoacacia
L.) oraz owoce roślin takich gatunków, jak: aronia czarna (Aronia melanocarpa (Michx.)
Elliott), borówka brusznica (Vaccinium vitis-idaea L.), borówka czarna (Vaccinium myrtillus
L.), bez czarny (Sambucus nigra L.), cytryniec chiński (Schisandra chinensis (Turcz.) Baill.),
dereń jadalny (Cornus mas L.), głóg dwuszyjkowy (Crataegus oxyacantha L.), jabłoń
domowa (Malus domestica Borkh.), kolcowój chiński – goji (Lycium chinense Mill.), morwa
czarna (Morus nigra L.), pigwowiec japoński (Chaenomeles japonica (Thunb.) Lindl. ex
Spach.), pigwa pospolita (Cydonia oblonga Mill.), porzeczka czarna (Ribes nigrum L.),
truskawka (Fragaria ananassa Duchesne ex Rozier), żurawina drobnoowocowa (Oxycoccus
microcarpus (Turcz. ex Rupr.) Schmalh.).
Doświadczenia podzielono na trzy etapy. W pierwszym etapie określano aktywność
przeciwutleniającą oraz zawartość polifenoli i ich profil w wybranych roślinach. Związki
aktywne ekstrahowano metodą maceracji (mieszadło magnetyczne, 6 h) z wykorzystaniem
wodnego roztworu metanolu (80% obj.). Wykonano również doświadczenia związane z
optymalizacją procesu ekstrakcji polifenoli. Określano wpływ zastosowanego
rozpuszczalnika (metanol, gorąca woda, chlorek metylenu, etanol w różnych stężeniach) na
właściwości przeciwutleniające i zawartość polifenoli w ekstraktach, optymalizowano
parametry ekstraktora wysokoobrotowego (modyfikując obroty – 11, 19, 24 tys. obr./min oraz
czas działania urządzenia – 2, 5, 10 min) w kierunku maksymalnego odzysku związków o
charakterze antyoksydacyjnym oraz oceniano możliwość wykorzystania promieniowania
5
mikrofalowego (modyfikując moc 50-600 W i czas 0,5 lub 1 min) podczas wstępnej obróbki
surowców roślinnych do zwiększenia aktywności przeciwutleniającej ekstraktów.
W drugim etapie oszacowano biodostępności związków fenolowych w symulowanym
układzie pokarmowym człowieka. Doświadczenia wykonano na roztworach modelowych
wybranych polifenoli (kwas ferulowy, kwas p-kumarowy, (+)katechina, kwercetyna,
hesperetyna i hesperydyna) oraz na owocach różnych gatunków roślin, uznawanych za bogate
źródło przeciwutleniaczy. Oceniono także różnice w biodostępności polifenoli z owoców i ich
ekstraktów. Zastosowano następujący model trawienia: próbki roztworów polifenoli, owoców
lub ich ekstraktów zakwaszano do pH 2 (HCl), dodawano roztworu pepsyny i inkubowano
(37°C, 2 h). Następnie zobojętniano (NaHCO3), dodawano roztworu pankreatyny i żółci,
inkubowano (37°C, 4 h) i wirowano (1380×g, 10 min). Supernatanty zlewano, pozostałości
przepłukiwano dwa razy wodą redestylowaną, za każdym razem mieszając i wirując, a
supernatanty łączono. Pozostałości po wirowaniu (osad) wykorzystywano później do
symulacji trawienia w jelicie grubym. Supernatanty przenoszono do worków dializacyjnych i
wytrząsano w buforze PBS (37°C, 3 h). Zawartość worków (retentat) łączono z osadem
pozostałym po wirowaniu (z wcześniejszego etapu trawienia), alkalizowano do pH 8 i
zaszczepiano inokulum zawierającym mieszaninę jelitowych bakterii (Bacteroides
galacturonicus, Enterococcus caccae, Bifidobacterium catenulatum, Ruminococcus
gauvreauii, Lactobacillus sp., Escherichia coli), inkubowano (37°C, 16 h) i wirowano. Po
przeprowadzonym procesie trawienia uzyskano następujące frakcje:
supernatant – frakcja rozpuszczalna związków polifenolowych, trawiona w żołądku i
dwunastnicy, powstała po zwirowaniu próbki poddanej trawieniu enzymatycznemu,
osad – frakcja nierozpuszczalna związków polifenolowych poddawanych trawieniu w
żołądku i dwunastnicy, będąca pozostałością po zwirowaniu próbki poddanej
trawieniu enzymatycznemu,
retentat – frakcja rozpuszczalna związków polifenolowych, które nie migrują przez
membranę dializacyjną,
permeat – bufor PBS zawierający składniki, które przeszły przez membranę
dializacyjną,
pozostałość po fermentacji – frakcja związków polifenolowych, która pozostała z
osadu i retentatu po trawieniu bakteryjnym w jelicie grubym.
6
Ostatni etap prac obejmował sprawdzenie przydatności ekstraktów owocowych w
technologii żywności do wytwarzania nowych produktów spożywczych, charakteryzujących
się podwyższoną aktywnością przeciwutleniającą. Do badań wykorzystano napoje jabłkowe,
pomarańczowe i grejpfrutowe (zestawione z zagęszczonych soków owocowych) oraz chipsy
jabłkowe [Opis patentowy 214196], które suplementowano ekstraktami owocowymi,
mającymi zwiększyć ich potencjał antyrodnikowy. Istotnym wyróżnikiem jakościowym była
wysoka ocena sensoryczna uzyskanych produktów.
W ekstraktach, roztworach, napojach oraz wszystkich frakcjach uzyskanych podczas
symulowanego trawienia oznaczano:
aktywność przeciwutleniającą – metoda z ABTS [Tarko i in. 2009b],
zawartość polifenoli ogółem – metoda Folina-Ciocalteu [Tarko i in. 2009b],
profil związków polifenolowych – metoda HPLC [Duda-Chodak i in. 2010].
Ponadto oznaczono właściwości sensoryczne wytworzonych chipsów jabłkowych oraz
napojów [PN-A-04022:1964].
Omówienie wyników
Występowanie i odzysk polifenoli z surowców roślinnych
Do badań wybrano rożne części roślin (kwiaty, owoce) oraz różne rozpuszczalniki
(80% metanol, 80% etanol, gorącą wodę oraz chlorek metylenu). Aktywność
antyoksydacyjna oraz zawartość polifenoli ogółem były najwyższe w przypadku ekstraktów
metanolowych, z wyjątkiem ekstraktów z owoców borówki brusznicy. Ekstrakty metanolowe
owoców bzu czarnego odznaczały się wyjątkowo wysokim potencjałem przeciwutleniającym
(2829 mg troloksu/100 g ś.m.) oraz zawartością polifenoli ogółem (5342 mg (+)katechiny/100
g ś.m.). Dużą zdolnością zmiatania wolnych rodników charakteryzowały się również
ekstrakty z owoców derenia jadalnego i pigwowca japońskiego (odpowiednio 1577 i 1448 mg
troloksu/100 g ś.m.). Potencjał antyoksydacyjny ekstraktów metanolowych z owoców pigwy
pospolitej i morwy czarnej był niski (161 mg troloksu/100 g ś.m.). W grupie analizowanych
kwiatów wysoką aktywność przeciwutleniającą stwierdzono w przypadku głogu
dwuszyjkowego (1443 mg troloksu/100 g ś.m.), który odznaczał się także bardzo dużym
stężeniem polifenoli (4119 mg (+)katechiny/100 g ś.m.). Wyniki aktywności
przeciwutleniającej ekstraktów metanolowych były dodatnio skorelowane z zawartością
polifenoli ogółem (r = 0,84). W grupie owoców, oprócz bzu czarnego, duże stężenie
polifenoli w ekstraktach metanolowych obserwowano w przypadku pigwowca japońskiego,
borówki brusznicy i pigwy pospolitej.
7
Zawartość związków polifenolowych ogółem i aktywność przeciwutleniająca
ekstraktów roślinnych, uzyskanych z użyciem etanolu (80% obj.), były mniejsze niż po
zastosowaniu metanolu. Wyjątek stanowiły ekstrakty z owoców borówki brusznicy – po
ekstrakcji etanolem obserwowano wyższą aktywność antyoksydacyjną (o 41%) i większą
zawartość polifenoli ogółem (o 13%), niż po użyciu metanolu. Wysoki potencjał
przeciwutleniający miały ekstrakty etanolowe z owoców bzu czarnego, derenia jadalnego i
pigwowca japońskiego. Wysoką aktywnością przeciwutleniającą (679 mg troloksu/100 g
ś.m.) charakteryzowały się również ekstrakty z kwiatów głogu dwuszyjkowego. Zawartość
polifenoli ogółem w próbach ekstrahowanych etanolem była o ok. 30% mniejsza niż w
przypadku użycia metanolu. Duże stężenie polifenoli obserwowano w ekstraktach z owoców
bzu czarnego, borówki brusznicy i pigwowca japońskiego oraz z kwiatów głogu
dwuszyjkowego.
Ekstrakty uzyskane za pomocą gorącej wody charakteryzowały się istotnie mniejszą,
niż w przypadku metanolu i etanolu, skutecznością odzysku związków fenolowych i niższą
aktywnością przeciwutleniającą. Wartości potencjału antyoksydacyjnego kształtowały się w
zakresie od 27 do 1688 mg troloksu/100 g ś.m., przy czym najwyższe wyniki stwierdzono dla
ekstraktów z owoców bzu czarnego, borówki brusznicy i pigwowca japońskiego. Zawartość
polifenoli w ekstraktach wodnych z owoców bzu czarnego i kwiatów głogu dwuszyjkowego
(odpowiednio 2430 i 2241 mg (+)katechiny/100 g ś.m.) była wyraźnie większa niż w
wodnych wyciągach z pozostałych badanych surowców roślinnych, jednak znacząco mniejsza
od uzyskanej za pomocą alkoholi.
Ekstrakcja chlorkiem metylenu okazała się zupełnie nieskuteczna w przypadku
przeciwutleniaczy roślinnych. Uzyskano znacząco gorsze wyniki, praktycznie na granicy
wykrywalności metod.
Rodzaj zastosowanego rozpuszczalnika miał bardzo duży wpływ na odzysk związków
polifenolowych, przy czym wpływ ten był różny w zależności od użytego surowca. W
większości przypadków najlepszym ekstrahentem polifenoli był metanol. Etanol wydajniej
niż inne rozpuszczalniki ekstrahował (+)katechinę, procyjanidynę B1 i kwercetynę z kwiatów
bzu. Metanol okazał się lepszy niż inne rozpuszczalniki do odzysku pochodnych
glikozydowych badanych flawonoli i większości kwasów fenolowych. Obserwowano również
zbliżony poziom flawonów w ekstraktach metanolowych i etanolowych. Gorąca woda była
znacznie gorszym ekstrahentem związków polifenolowych z ocenianych kwiatów niż użyte
alkohole. Rezultaty uzyskane dla owoców również potwierdziły wysoką skuteczność alkoholu
8
metylowego i etylowego, jednak różnice nie były już tak wyraźne, jak w przypadku kwiatów.
Metanol okazał się wydajniejszym ekstrahentem flawonoli, antocyjanów, (-)epikatechiny i
kwasu chlorogenowego, etanol natomiast – procyjanidyny B2, a w przypadku owoców bzu i
pigwowca także (+)katechiny.
Dla większości prób najwydajniejszym rozpuszczalnikiem okazał się wodny roztwór
metanolu o stężeniu 80%. Nieznacznie niższą wydajnością ekstrakcji charakteryzował się
roztwór etanolu o stężeniu 80%. Etanol, jako rozpuszczalnik nietoksyczny, dopuszczony do
kontaktu z żywnością, może z powodzeniem zostać zastosowany do odzysku związków
przeciwutleniających dla przemysłu spożywczego [Ustawa 2006]. Dlatego do dalszych
doświadczeń wykorzystywano etanol jako rozpuszczalnik. Wykazano, że wodny roztwór
etanolu o stężeniu 80% obj. jest optymalny do ekstrakcji związków polifenolowych z
owoców.
Zastosowanie homogenizatora wysokoobrotowego do ekstrakcji związków
polifenolowych z owoców przekładało się na większy (od 33 do 40%) ich odzysk, niż w
przypadku maceracji. Natomiast aktywność przeciwutleniająca ekstraktów uzyskanych tą
metodą zwiększała się, w odniesieniu do maceracji, o 40-60%, w zależności od użytego
surowca. Wykazano, że optymalnymi parametrami procesu ekstrakcji związków
przeciwutleniających z analizowanych surowców są: prędkość obrotowa homogenizatora
rzędu 19 000 obr./min i czas 5 minut. Takie warunki umożliwiały odpowiednie rozdrobnienie
surowca, uwolnienie z komórek polifenoli i zwiększenie powierzchni kontaktu z
ekstrahentem. Wydłużanie czasu homogenizacji oraz zwiększanie prędkości homogenizatora
nie poprawiały wydajności ekstrakcji.
Kontynuacją doświadczeń było poddanie owoców przed homogenizacją wstępnej
obróbce mikrofalowej. Działanie promieniowania mikrofalowego zwiększa aktywność
antyoksydacyjną produktów spożywczych oraz zawartość polifenoli ogółem w tych
produktach. Efekt taki przypisuje się inaktywacji oksydaz polifenolowych, które podczas
kontaktu z tlenem utleniają związki fenolowe do składników nieaktywnych lub o niższej
aktywności przeciwutleniającej [Tarko i in. 2009a]. Wstępne traktowanie mikrofalami
owoców przygotowanych do ekstrakcji nie zwiększyło aktywności antyoksydacyjnej
wyciągów etanolowych i zawartości w nich polifenoli. W porównaniu z wynikami samej
homogenizacji rezultaty uzyskane dla próbek traktowanych promieniowaniem mikrofalowym
były znacznie gorsze, co może być spowodowane degradacją związków termolabilnych
zawartych w owocach. Szczególnie wrażliwy na zmiany temperatury jest kwas askorbinowy.
Wraz ze wzrostem temperatury drastycznie maleją jego właściwości przeciwutleniające i
9
dochodzi do rozpadu, w wyniku którego powstaje furfural i dwutlenek węgla [Jabłońska-Ryś
i in. 2009].
Biodostępność polifenoli w symulowanym układzie pokarmowym człowieka
Doświadczenia rozpoczęto od symulacji trawienia roztworów czystych polifenoli.
Wykazano spadek stężenia analizowanych związków polifenolowych na kolejnych etapach
trawienia. Po pierwszym etapie trawienia kwasu ferulowego obserwowano w osadzie (frakcja
nierozpuszczalna) stosunkowo dużą jego ilość (35% dawki wejściowej), a supernatant był
znacznie uboższy w ten związek (8,2%). Fakt ten może świadczyć o częściowym rozkładzie
kwasu ferulowego pod wpływem soków i enzymów żołądka i dwunastnicy. Po dializie z
użyciem membran w retentacie pozostało tylko około 1% ilości kwasu ferulowego poddanego
procesowi trawienia, podczas gdy do permeatu przeszło blisko 4%, co pozwala przypuszczać,
że kwas ferulowy może być biernie pobierany z jelita. Kwas ferulowy ulegał znacznemu
rozkładowi pod wpływem mikroflory jelitowej. Po symulacji trawienia kwasu
p-kumarowego stwierdzono, że jego ilość w osadzie stanowiła ok. 50% dawki poddanej
procesowi trawienia, a supernatant zawierał niewiele ponad 2% tego kwasu. Uzyskane wyniki
wskazują na istotne przemiany tego związku w żołądku i dwunastnicy, z wytworzeniem
produktów o istotnie wyższej aktywności antyoksydacyjnej. Zawartość badanego kwasu w
pozostałości po fermentacji była niższa o ok. 64% niż w osadzie po trawieniu, co pozwala
wnioskować, że bakterie jelitowe wykazują aktywność metabolizowania kwasu
p-kumarowego. Pod względem biodostępności flawonoidy istotnie się różniły od
fenolokwasów. Po symulowanym trawieniu (+)katechiny wykazano znaczny spadek jej
zawartości w próbach już po pierwszym etapie trawienia. Ilość pozostająca w osadzie
stanowiła ok. 28% dawki poddanej procesowi trawienia, a w supernatancie obserwowano
jedynie 1,5% ilości wejściowej. Niska zawartość oznaczanego związku polifenolowego w
supernatancie korespondowała z umiarkowanym potencjałem antyoksydacyjnym tej frakcji.
Po fermentacji z bakteriami jelitowymi zawartość (+)katechiny zmniejszyła się 5-krotnie w
stosunku do jej ilości w osadzie. Może to potwierdzać przemiany (+)katechiny do
niskocząsteczkowych kwasów fenolowych o niższym potencjale antyoksydacyjnym. Wśród
analizowanych związków polifenolowych największym potencjałem przeciwutleniającym
cechowała się kwercetyna. Po przeprowadzeniu symulacji trawienia in vitro wykazano, że
ponad 96% tego związku przechodzi do osadu. Frakcje nierozpuszczalne również miały
bardzo wysoki potencjał przeciwutleniający. Supernatant zawierał śladowe ilości kwercetyny,
a pozostałe frakcje uzyskiwane podczas symulacji trawienia nie zawierały tego związku. Brak
10
kwercetyny w pozostałości po fermentacji może świadczyć, że jest ona rozkładana przez
bakterie w jelicie grubym. Hesperetyna i jej 7-O-rutynozyd (hesperydyna) występują
naturalnie w owocach cytrusowych, a ich aktywność antyoksydacyjna, w porównaniu do
innych polifenoli, jest stosunkowo niska. Po trawieniu enzymatycznym in vitro zawartość
hesperetyny w osadzie była niewiele niższa (o ok. 9%) niż przed tym trawieniem, podczas
gdy zawartość hesperydyny po tym etapie zmniejszyła się aż o 98%. Wyniki te sugerują, że
hesperydyna jest rozkładana w żołądku i jelicie cienkim, podczas gdy jej aglikon jest
metabolizowany tylko w niewielkim stopniu. Po dializie nie wykryto hesperetyny w
permeacie, a retentat zawierał śladowe jej ilości. Hesperydyna nie została wykryta w żadnej
próbie na tym etapie symulowanego trawienia. Na uwagę zasługuje bardzo duży spadek
zawartości hesperetyny w próbie po fermentacji z mikroflorą jelitową – o ok. 99% w
porównaniu do frakcji nierozpuszczalnej związków polifenolowych trawionych w żołądku i
dwunastnicy – co świadczy o rozkładzie hesperetyny dopiero przez bakterie bytujące w jelicie
grubym.
Zasadniczą częścią tego etapu doświadczeń była jednak ocena biodostępności
związków polifenolowych z owoców, a nie roztworów modelowych. Do doświadczeń
wybrano zarówno gatunki popularne i spożywane w naszym kraju (aronia czarna, borówka
czarna, jabłoń domowa, porzeczka czarna, truskawka), jak i gatunki dziko rosnące i uznawane
za bogate źródło przeciwutleniaczy (bez czarny, dereń jadalny, głóg dwuszyjkowy, kolcowój
chiński – goji, pigwowiec japoński, żurawina drobnoowocowa).
Jabłka należą do owoców niezbyt bogatych w związki polifenolowe, ale bardzo często
spożywanych w większości krajów europejskich. Po symulowanym trawieniu tych owoców
wykazano, że supernatant charakteryzował się mniejszą zawartością polifenoli ogółem niż
owoce, a jednocześnie umiarkowanie wyższą aktywnością antyoksydacyjną. Przyczyną może
być pojawienie się podczas trawienia polifenoli metabolitów o wysokim potencjale
przeciwutleniającym. W owocach dominowały procyjanidyny oraz (+)katechina, których nie
obserwowano już w supernatancie. Związki polimerowe zostały prawdopodobnie rozłożone
do monomerów, które mają większy potencjał przeciwutleniający. Wykazano, że do osadu po
symulacji trawienia jabłek przechodzi niewielka ilość związków polifenolowych, o niskiej
aktywności antyoksydacyjnej. Fakt ten ma związek z budową owocu jabłoni – wysokim
udziałem miąższu w stosunku do skórki i nasion. Badane jabłka charakteryzowały się
umiarkowanym stopniem migracji związków polifenolowych przez membrany dializacyjne
(29% w odniesieniu do supernatantu). Większość polifenoli (58%) pozostawała w retentacie.
Były to głównie kwasy fenolowe oraz florydzyna. Na uwagę zasługuje wzrost potencjału
11
przeciwutleniającego pozostałości po fermentacji, w odniesieniu do materiału przed
działaniem bakterii jelitowych. We frakcji tej obserwowano przede wszystkim kwasy
fenolowe o przeciętnej aktywności antyoksydacyjnej, jednak prawdopodobnie zawierała ona
także produkty rozkładu procyjanidyn i florydzyny o wysokiej aktywności.
Analiza supernatantów uzyskanych po pierwszym etapie trawienia owoców borówki
czarnej i kolcowoju chińskiego wykazała brak istotnych statystycznie różnic pod względem
aktywności przeciwutleniającej, w porównaniu do owoców, ale zawartość polifenoli ogółem
okazała się istotnie niższa. W przypadku kolcowoju chińskiego zawartość polifenoli
stanowiła 26% ilości obserwowanej w owocach, a borówki zaledwie 7%. Na podstawie
analizy profilu polifenoli na różnych etapach trawienia borówki czarnej można stwierdzić, że
zarówno owoce, jak i supernatant były bogate w antocyjany, głównie glikozydy cyjanidyny,
oraz (-)epikatechinę i kwasy fenolowe. W wyniku symulacji trawienia w żołądku i
dwunastnicy nastąpił znaczny spadek zawartości antocyjanów (o ponad 80%), procyjanidyny
B2 (o 98%) i (-)epikatechiny (o ponad 55%) oraz wzrost stężenia kwasów fenolowych w
stosunku do wartości obserwowanych w owocach. Na uwagę zasługuje również rozkład
glikozydów kwercetyny na tym etapie symulacji trawienia, w wyniku czego w supernatancie
wykryto aglikony w ilościach większych niż w surowcu przed trawieniem. W wyniku
działania na owoce kolcowoju chińskiego kwasu oraz enzymów żołądka i dwunastnicy
rozkładowi ulegały głównie glikozydy. W pozostałości po fermentacji kolcowoju chińskiego
odnotowano ponad 2-krotnie więcej kwercetyny niż w owocach przed trawieniem. Wykazano
również, że aktywność przeciwutleniająca osadu otrzymanego po trawieniu borówki czarnej
była ponad 2-krotnie wyższa od aktywności osadu kolcowoju chińskiego, ale zawartość
polifenoli ogółem w obu frakcjach owoców nie różniła się istotnie. Można zatem
wnioskować, że w nierozpuszczalnej frakcji związków polifenolowych borówki czarnej
znajdują się silne antyoksydanty. Owoce kolcowoju chińskiego miały stosunkowo wysoki
(29%) stopień migracji związków polifenolowych przez membranę dializacyjną. Dla borówki
czarnej wskaźnik ten był niższy i wynosił 19%. Dializaty otrzymane na tym etapie trawienia
cechowały się zbliżoną aktywnością przeciwutleniającą, mimo że stężenie polifenoli w
dializacie borówki czarnej było dwukrotnie niższe. Borówka czarna, jako owoc bogaty w
barwniki antocyjanowe, podczas trawienia uwalnia w dużych ilościach cyjanidynę i jej
glikozydy. Wykazano również, że bakterie jelitowe znacznie wydajniej metabolizowały
związki fenolowe pochodzące z owoców kolcowoju chińskiego niż z owoców borówki.
Jedynie w przypadku derenia jadalnego supernatant uzyskany po trawieniu miał niższą
aktywność antyoksydacyjną niż owoce przed trawieniem. Jednocześnie odznaczał się on
12
największym, spośród analizowanych prób, spadkiem zawartości polifenoli ogółem w
odniesieniu do owoców przed trawieniem. Dereń jadalny zalicza się do produktów bogatych
w związki pektynowe, a pektyna łatwo wiąże polifenole i utrudnia ich uwalnianie w czasie
trawienia [Mazzaracchio i in. 2004]. Wykazano znaczną migrację związków polifenolowych
derenia jadalnego przez membranę dializacyjną, ale komponenty fenolowe permeatu
charakteryzowały się umiarkowaną aktywnością antyoksydacyjną. Aktywność
antyoksydacyjna pozostałości po fermentacji była mniejsza o 65% od aktywności roztworu
przed symulowanym trawieniem w jelicie grubym. Jednoczesne zmniejszenie się stężenia
związków polifenolowych o 20% wskazuje na obecność w pozostałości po fermentacji
metabolitów o niskim potencjale antyoksydacyjnym. We frakcji tej dominowały kwasy
fenolowe, charakteryzujące się stosunkowo niską aktywnością przeciwutleniającą w
porównaniu z innymi polifenolami.
W supernatantach uzyskanych po trawieniu pigwowca japońskiego i żurawiny
drobnoowocowej zaobserwowano podobne stężenie związków polifenolowych, w obu
przypadkach mniejsze niż w odpowiednich owocach. Natomiast aktywność
przeciwutleniająca supernatantu z pigwowca japońskiego była istotnie wyższa od aktywności
owoców. Owoce pigwowca japońskiego były bogatym źródłem procyjanidyn o znacznej
aktywności przeciwrodnikowej, które w niewielkim stopniu ulegały rozkładowi w żołądku i
dwunastnicy. W supernatancie stwierdzono znacznie większe ilości (+)katechiny niż w
surowcu przed trawieniem. Można przypuszczać, że do wzrostu ilości (+)katechiny w tej
frakcji przyczynił się niewielki stopień rozkładu procyjanidyn (spolimeryzowanych tanin). W
owocach żurawiny dominowały glikozydy kwercetyny i kwasy fenolowe, które, przechodząc
do supernatantu, nie wpływały tak istotnie na aktywność tej frakcji. Stężenie związków
polifenolowych ogółem w osadzie otrzymanym po symulacji trawienia pigwowca
japońskiego było znacznie wyższe niż w przypadku żurawiny. Fakt ten wynika z wysokiej
zawartości skórek w stosunku do miąższu w owocach pigwowca japońskiego. Symulacja
transportu biernego związków polifenolowych przez membrany dializacyjne wykazała także
znacznie większy stopień migracji z owoców pigwowca niż z żurawiny. Bakterie jelitowe w
jednakowym stopniu metabolizowały polifenole zawarte w owocach żurawiny i pigwowca
japońskiego, jednak produkty rozkładu polifenoli żurawiny charakteryzowały się wyższym
potencjałem antyoksydacyjnym.
Supernatanty otrzymane po symulacji trawienia głogu dwuszyjkowego i truskawki
zawierały podobne, mniejsze (ok. 11-krotnie) ilości polifenoli ogółem niż owoce.
Jednocześnie wzrost aktywności antyoksydacyjnej supernatantów otrzymanych z owoców
13
truskawki był ponad dwukrotnie wyższy niż w przypadku głogu. Może to sugerować, że na
tym etapie trawienia związki polifenolowe metabolizowane są najszybciej, co skutkuje
wytworzeniem silnych przeciwutleniaczy. Związki polifenolowe zawarte w owocach głogu
migrowały przez membrany dializacyjne jedynie w 12%, zachowując jednocześnie 45%
aktywności przeciwutleniającej wyjściowego supernatantu. Na wysoką aktywność
przeciwutleniającą dializatów z głogu wpływały metabolity obecnych w nim polifenoli,
głównie pochodnych kwercetyny. Większość polifenoli głogu była metabolizowana z
udziałem bakterii fermentacyjnych, co może się wiązać ze zwartą strukturą pektynową
owoców.
Supernatanty uzyskane po symulacji trawienia bogatych w barwniki antocyjanowe
owoców aronii czarnej, porzeczki czarnej oraz bzu czarnego charakteryzowały się znacznie
mniejszym (16–18-krotnie) stężeniem związków polifenolowych ogółem niż owoce.
Aktywność antyoksydacyjna tych supernatantów była wyższa niż w przypadku owoców,
szczególnie porzeczki czarnej. Wśród wszystkich badanych owoców aronia wyróżniała się
największą ilością związków polifenolowych ogółem w permeacie uzyskanym po dializie
(174 mg (+)katechiny/100 g ś.m.) oraz najwyższą aktywnością przeciwutleniającą tej frakcji
(3609 mg troloksu/100 g ś.m.). Bakterie przewodu pokarmowego w znacznym stopniu
przyczyniały się do rozkładu związków polifenolowych zawartych w owocach aronii, istotnie
redukując aktywność antyoksydacyjną pozostałości po fermentacji. Rozkładowi ulegały
przede wszystkim antocyjany pozostałe po wcześniejszych etapach trawienia. Supernatant z
pierwszego etapu trawienia owoców bzu czarnego, w porównaniu z innymi badanymi
owocami, odznaczał się największą zdolnością zmiatania wolnych rodników (7519 mg
troloksu/100 g ś.m). Za wysoki potencjał antyrodnikowy odpowiadały przede wszystkim
antocyjany – cyjanidyno-3-O-sambubiozyd i kwercetyno-3-O-rutynozyd. Po
przeprowadzonej dializie supernatantu bzu czarnego stwierdzono 3-krotne zmniejszenie
stężenia polifenoli ogółem, podczas gdy permeat wykazywał o 30% mniejszą aktywność
przeciwutleniającą niż supernatant. W przypadku porzeczki czarnej stopień migracji
związków polifenolowych przez membranę dializacyjną wynosił 23%, przy czym permeat w
porównaniu do supernatantu miał o 20% niższy potencjał antyoksydacyjny. Bakterie jelitowe
w nieznacznym stopniu przyczyniły się do rozkładu związków polifenolowych pochodzących
z owoców bzu czarnego i porzeczki czarnej, metabolizując głównie glikozydy cyjanidyny i
kwercetyny.
Bardzo duży wpływ na biodostępność związków polifenolowych ma ich powiązanie z
matrycą żywności oraz innymi składnikami występującymi w rzeczywistych racjach
14
żywieniowych. Tylko polifenole uwolnione z matrycy żywności w jelicie cienkim i grubym
mogą być przyswajane przez organizm. Zauważono bardzo duże różnice w trawieniu
pomiędzy czystymi związkami polifenolowymi, a związkami występującymi w różnych
owocach. Wykazano, że po trawieniu in vitro czystych związków polifenolowych do osadu
przechodziła przeważająca część tych komponentów, a dominującą rolę odgrywała
fermentacja z udziałem bakterii jelitowych. W przypadku owoców to supernatant był
najbogatszą w polifenole frakcją, co sugeruje, że największy wpływ na polifenole zawarte w
tkankach owoców miało działanie kwasu i enzymów żołądkowych oraz warunki panujące w
jelicie cienkim.
Wiele produktów spożywczych, suplementów diet oraz preparatów farmaceutycznych o
właściwościach przeciwutleniających zawiera ekstrakty z roślin. Ekstrakty te, najczęściej
wyciągi etanolowe, są bogate w polifenole. Dlatego też, w kolejnej części doświadczeń
porównano biodostępność związków polifenolowych z owoców oraz odpowiednich
ekstraktów etanolowych. Do doświadczeń wybrano owoce aronii czarnej, bzu czarnego,
derenia jadalnego, głogu dwuszyjkowego, jabłoni domowej i pigwowca japońskiego.
Do supernatantów uzyskanych w wyniku trawienia ekstraktów etanolowych
przechodziło znacznie więcej polifenoli, niż miało to miejsce w przypadku trawienia owoców,
a stopień migracji związków polifenolowych przez membranę dializacyjną był od 2 do 8 razy
wyższy. W osadach otrzymanych po procesie trawienia in vitro ekstraktów owocowych
związki polifenolowe występowały w śladowych ilościach (0,2–0,6 mg (+)katechiny/100 ml).
Wyniki te korespondowały z aktywnością antyoksydacyjną poszczególnych frakcji.
Supernatanty uzyskane po trawieniu ekstraktów odznaczały się relatywnie wyższą (o 13-40%)
aktywnością antyoksydacyjną niż ich odpowiedniki po trawieniu owoców. Potencjał
przeciwutleniający osadów był bardzo niski i stanowił od 0,03 do 2,6% aktywności
ekstraktów poddanych symulacji trawienia, podczas gdy w przypadku owoców potencjał ten
wynosił od 12 do 46%. Różnice te można tłumaczyć odmiennym składem próbek poddanych
procesowi symulowanego trawienia. Związki polifenolowe owoców – bogatych w takie
składniki, jak np. pektyny, włókna pokarmowe, polisacharydy, mogące wiązać polifenole – w
większej ilości przechodziły do osadów, natomiast polifenole w ekstraktach etanolowych nie
były związane z matrycą pokarmową.
15
Wykorzystanie ekstraktów owocowych w technologii żywności
Soki, nektary, a przede wszystkim napoje należą do produktów bardzo często
wybieranych przez konsumentów i z racji bogatego asortymentu smakowego oraz dużego
spożycia, stanowią dobry materiał do suplementacji. Do doświadczeń wykorzystano napoje
jabłkowe, pomarańczowe i grejpfrutowe. Wśród ocenianych prób napoje jabłkowe
charakteryzowały się najniższą aktywnością przeciwutleniającą i najmniejszą zawartością
polifenoli ogółem. Z tego względu fortyfikacja podnosiła ich zdolność antyrodnikową
znacznie bardziej niż w przypadku pozostałych napojów. Wykazano, że dodatki ekstraktów
owocowych wpłynęły na wzrost ilości związków polifenolowych w napojach jabłkowych (od
48 do 138%, w stosunku do napoju bez dodatków). Zwiększył się również, chociaż w
mniejszym stopniu (od 10 do 32%), potencjał antyoksydacyjny prób. Największe różnice
obserwowano po wprowadzeniu 5% dodatku ekstraktu z pigwowca japońskiego. Wykazano,
że jedynie ten dodatek wpływał pozytywnie na wyniki oceny sensorycznej. Fortyfikacja
ekstraktami borówki brusznicy i derenia jadalnego została negatywnie odebrana przez panel
sensoryczny. Wprowadzenie do napoju pomarańczowego ekstraktów z pigwowca
japońskiego oraz borówki brusznicy przyczyniało się do wzrostu zarówno ich potencjału
antyoksydacyjnego, jak i zawartości polifenoli ogółem. Zastosowane dodatki w podobny
sposób zwiększały wartości analizowanych parametrów jakościowych napoju
pomarańczowego. Dodatek do napoju pomarańczowego ekstraktu z pigwowca w ilości 5%
powodował wzrost jego aktywności przeciwutleniającej oraz zawartości polifenoli ogółem
(odpowiednio o 24 i 56%). Na uwagę zasługuje fakt, że suplementacja napojów
pomarańczowych ekstraktami z pigwowca japońskiego przyczyniła się do wyższych ocen
panelu sensorycznego. Suplementacja napojów grejpfrutowych ekstraktami owocowymi w
niewielkim stopniu przyczyniała się do wzrostu potencjału antyoksydacyjnego i zawartości
polifenoli ogółem. Wartości ocenianych wyróżników, szczególnie ilości polifenoli, uzyskane
dla napojów z poszczególnymi dodatkami nie różniły się istotnie statystycznie. Jedynie
dodatek 10% ekstraktu z derenia jadalnego w znacznej mierze podnosił wartości
analizowanych parametrów. Tak duży udział ekstraktu w napoju został jednak negatywnie
odebrany przez panel sensoryczny, a noty okazały się istotnie niższe niż dla napoju bez
dodatków.
Tempo, styl życia oraz przyzwyczajenia żywieniowe często skłaniają kupujących do
wyboru przekąsek. Z tego względu coraz większą popularność zyskują przekąski owocowe i
warzywne, będące wyrobami beztłuszczowymi, niskokalorycznymi, o małej zawartości soli,
nadające się do fortyfikacji w związki polifenolowe. Do suplementacji chipsów jabłkowych
16
wykorzystano ekstrakty etanolowe uzyskane z owoców żurawiny drobnoowocowej, derenia
jadalnego, aronii czarnej, głogu dwuszyjkowego, cytryńca chińskiego, pigwowca japońskiego
i kolcowoju chińskiego (goji). Największym potencjałem antyoksydacyjnym odznaczały się
próby z dodatkiem ekstraktu z cytryńca, żurawiny i goji. Wartości te były wyższe o
odpowiednio 77, 68 i 67% w porównaniu z kontrolą. Najniższą aktywnością,
charakteryzowały się próbki suplementowane ekstraktem z aronii. Fortyfikacja przyczyniła
się do wzrostu stężenia związków polifenolowych w badanych chipsach. Największą
zawartością polifenoli cechowały się chipsy z dodatkiem ekstraktu z aronii (o 30% większą
od wartości kontrolnej) oraz derenia (o 28% większą). Najmniejszy wpływ natomiast miał
dodatek ekstraktu z goji i cytryńca (wzrost o 5%). W wyniku oceny sensorycznej chipsów
wzbogacanych różnymi ekstraktami owocowymi prawie wszystkie wyroby otrzymały
zbliżoną liczbę punktów (3,98–4,18). Jedynie chipsy suplementowane ekstraktem z cytryńca
dostały istotnie niższe noty (3,54 pkt), ze względu na cierpko-gorzki smak. Wszystkie próby z
dodatkami ekstraktów owocowych dawały słabsze odczucie słodkości i cechowały się wyższą
kwasowością niż próbka kontrolna. Ze względu na oceniane wyróżniki najlepszymi
dodatkami wzbogacającymi chipsy jabłkowe były ekstrakty z owoców pigwowca, goji i
głogu.
Wnioski
1. Kwiaty bzu czarnego i głogu dwuszyjkowego oraz owoce bzu czarnego, pigwowca
japońskiego i derenia jadalnego odznaczały się wysoką aktywnością antyoksydacyjną
i wysokim stężeniem polifenoli. Profil związków fenolowych zależał od gatunku
owoców, a ich potencjał antyoksydacyjny był w dużej mierze związany z obecnością
polifenoli. Każdy z analizowanych surowców roślinnych może zostać wykorzystany
jako bogate źródło związków o charakterze przeciwutleniającym.
2. Wodny roztwór metanolu (80% obj.) okazał się najwydajniejszym rozpuszczalnikiem
do odzysku związków polifenolowych, ale wydajność ekstrakcji prowadzonej przy
użyciu wodnego roztworu etanolu (80% obj.) była tylko nieznacznie niższa. Etanol,
jako rozpuszczalnik nietoksyczny, dopuszczony do kontaktu z żywnością, może z
powodzeniem zostać zastosowany w odzysku związków przeciwutleniających dla
przemysłu spożywczego.
3. Homogenizacja wysokoobrotowa okazała się znacznie lepszym sposobem ekstrakcji
niż maceracja i pozwoliła na uzyskanie wyciągów o wyższej zawartości polifenoli
oraz wyższej aktywności antyoksydacyjnej. Prędkość obrotowa 19 000 obr./min i czas
17
5 minut stanowiły optymalne parametry homogenizatora wysokoobrotowego do
ekstrakcji związków fenolowych z większości analizowanych surowców roślinnych.
Wstępna obróbka mikrofalami nie poprawiała właściwości antyoksydacyjnych
wyciągów z owoców.
4. Większość analizowanych związków fenolowych (z wyjątkiem kwercetyny i
hesperetyny) ulega częściowemu rozkładowi podczas symulowanego trawienia w
żołądku i dwunastnicy, a powstałe metabolity wykazują zwykle wyższy potencjał
przeciwutleniający niż związki wyjściowe. Badane polifenole w różnym stopniu
przenikały przez membrany dializacyjne. Najłatwiej wchłanianiu, w symulacji in vitro
procesu trawienia, ulegały kwasy fenolowe, ze względu na małe rozmiary cząsteczek,
a większe flawonoidy słabiej przenikały przez pory w membranach.
5. Mikroflora jelitowa odgrywała istotną rolę w trawieniu związków polifenolowych.
Część polifenoli, która nie uległa rozkładowi i wchłanianiu w żołądku i jelicie
cienkim, trafiła do okrężnicy, gdzie związki te zostały zmetabolizowane przez bakterie
jelitowe. Mikroflora jelita grubego w największym stopniu wpływała na trawienie
flawonoidów, głównie kwercetyny i hesperetyny, a w znacznie mniejszym – na
metabolizm kwasów fenolowych.
6. Biodostępność czystych polifenoli oraz polifenoli związanych z matrycą pokarmową
owoców była różna. Po trawieniu in vitro czystych polifenoli przeważająca część tych
komponentów przechodziła do osadu, a dominującą rolę odgrywała tu fermentacja z
udziałem bakterii jelitowych. W przypadku owoców, najbogatszą w polifenole frakcją
był supernatant, co sugeruje, że na polifenole owocowe największy wpływ ma
działanie kwasów i enzymów żołądkowych oraz warunki panujące w jelicie cienkim.
7. Polifenole występujące w ekstraktach były bardziej podatne na działanie enzymów
przewodu pokarmowego i kwasów żołądkowych niż ich odpowiedniki w owocach,
dając frakcje o odpowiednio wyższej zdolności zmiatania wolnych rodników. Szybsza
hydroliza polifenoli pochodzących z ekstraktów umożliwiała intensywniejszą
migrację tych związków przez membranę dializacyjną, co odpowiadało większej ich
biodostępności. Intensywniejszy rozkład polifenoli zawartych w ekstraktach
owocowych, na początkowych odcinkach przewodu pokarmowego, ograniczał
znaczenie mikroflory jelitowej i metabolizmu tych związków w okrężnicy.
8. Fortyfikacja napojów owocowych i chipsów jabłkowych za pomocą ekstraktów
owocowych korzystnie wpływało na ich potencjał antyoksydacyjny oraz zawartość
polifenoli ogółem. Najlepszym dodatkiem do napojów okazał się ekstrakt z owoców
18
pigwowca japońskiego (w przypadku napojów jabłkowych i pomarańczowych) oraz
borówki brusznicy (napój grejpfrutowy). Chipsy jabłkowe najlepiej wzbogacać
ekstraktami z owoców pigwowca japońskiego, goji i głogu dwuszyjkowego.
Otrzymane wyniki potwierdziły hipotezę, że za pomocą doboru odpowiednich
rozpuszczalników oraz zastosowanych metod można zwiększyć wydajność procesu ekstrakcji
związków polifenolowych z surowców roślinnych. Wysoką wydajność odzysku związków
polifenolowych z materiału roślinnego pozwala osiągnąć zastosowanie roztworu metanolu i
etanolu o stężeniu 80% i homogenizacji wysokoobrotowej. Wstępna obróbka mikrofalami nie
poprawia właściwości antyoksydacyjnych wyciągów z owoców.
Potwierdzenie znalazła również hipoteza, że biodostępność związków polifenolowych
zależy od matrycy żywności, z którą są związane. W wyniku symulowanego trawienia
czystych związków polifenolowych znaczna ich część przechodzi do osadu i jest
metabolizowana głównie przez bakterie jelitowe. Po trawieniu in vitro owoców najbogatszą w
polifenole frakcją jest supernatant. Enzymy przewodu pokarmowego i kwasy żołądkowe
szybciej metabolizują polifenole występujące w ekstraktach niż ich odpowiedniki w owocach,
dając frakcje o wyższej aktywności antyoksydacyjnej i ograniczając znaczenie mikroflory
jelitowej przy ich trawieniu. Wydajniejszy rozkład polifenoli pochodzących z ekstraktów
owocowych przekłada się na intensywniejszą migrację tych związków przez membrany
dializacyjne, co odzwierciedla większą ich biodostępność.
Wyniki pracy potwierdziły także hipotezę, że wzbogacanie produktów spożywczych
ekstraktami owocowymi korzystnie wpływa na ich aktywność przeciwutleniającą i
atrakcyjność sensoryczną. Zastosowanie ekstraktów z owoców pigwowca japońskiego, goji i
głogu dwuszyjkowego, jako dodatku do chipsów jabłkowych podnosi ich potencjał
antyrodnikowy. Fortyfikacja napojów jabłkowych i pomarańczowych ekstraktami z
pigwowca japońskiego, a napojów grejpfrutowych wyciągami z owoców borówki brusznicy
najkorzystniej wpływa na jakość nowych produktów: aktywność antyoksydacyjną, zawartość
polifenoli oraz ocenę sensoryczną.
Literatura
Duda-Chodak A., Tarko T., Satora P., Sroka P., Tuszyński T. 2010. The profile of
polyphenols and antioxidant properties of selected apples cultivars grown in Poland, J.
Fruit Ornament. Plant Res., 18(2), 39-50.
19
Jabłońska-Ryś E., Zalewska-Korona M., Kalbarczyk J. 2009. Antioxidant capacity, ascorbic
acid and phenolics content in wild edible fruit. J. Fruit Ornament. Plant Res., 17, 115-
120.
Kroon P., Clifford M., Crozier A., Day A., Donovan J., Manach C., Williamson G. 2004.
How should we assess the effects of exposure to dietary polyphenols in vitro? Am. J.
Clin. Nutr., 80, 15-21.
Manach C., Scalbert A., Morand C., Remesy C., Jimenez L. 2004. Polyphenols: Food sources
and bioavailability. Am. J. Clin. Nutr., 79, 727-747.
Mazzaracchio P., Pifferi P., Kindt M., Munyaneza A., Barbiroli G. 2004. Interactions
beetween antocyanins and organic food molecules in food model systems. Int. J. Food
Sci. Technol., 39, 53-59.
Naczk M., Shahidi F. 2004. Extraction and analysis of phenolics in food. J. Chromatogr. A,
1054, 95-111.
Olthof M., Hollman P., Buijsman M., Amelsvoort J., Katan M. 2003. Chlorogenic acid,
quercetin-3-rutinoside and black tea phenols are extensively metabolized in humans. J.
Nutr., 133, 1806-1814.
Opis patentowy, 214196, PL. Zgłosz. 383488. z 05.10.07. Opubl. 28.06.2013. Sposob
wytwarzania chipsow jabłkowych. Uniwersytet Rolniczy im. Hugona Kołłątaja w
Krakowie, Krakow (PL). Tworcy: Tomasz Tarko, Aleksandra Duda-Chodak, Tadeusz
Tuszyński.
PN-A-04022:1964 Metody analizy sensorycznej. Analiza jakości cząstkowej i całkowitej
metoda punktową. Wytyczne sporządzania szczegołowych wzorow oceny.
Singh R.P., Sharad S., Kapur S. 2004. Free radicals and oxidative stress in neurodegenerative
diseases: Relevance of dietary antioxidants. J. Indian Acad. Clin. Med., 5, 218-225.
Tarko T., Duda-Chodak A., Ignacok M. 2009a. Odzysk związkow przeciwutleniających z
roślinnych surowcow odpadowych. Przem. Ferm. Owoc.-Warz., 10, 18-22.
Tarko T., Duda-Chodak A., Sroka P., Satora P., Michalik J. 2009b. Transformations of
phenolic compounds in an in vitro model simulating the human alimentary tract. Food
Technol. Biotechnol., 47, 456-463.
Valko M., Leibfritz D., Moncol J., Cronin M.T., Mazur M., Telser J. 2007. Free radicals and
antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int. J. Biochem. Cell
Biol., 39, 44-84.
5. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo - badawczych
Egzamin maturalny zdałem 1993 r. i w tym samym roku rozpocząłem studia na
Wydziale Technologii Żywności Akademii Rolniczej im. Hugona Kołłątaja w Krakowie. W
1998 r. obroniłem pracę magisterską, uzyskując tytuł magistra inżyniera technologii
żywności. Po ukończeniu studiów zostałem zatrudniony (od 01.09.1998) na stanowisku
asystenta naukowo-dydaktycznego w Zakładzie Technologii Fermentacji i Mikrobiologii
Technicznej (obecnie Katedra Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Technicznej)
Akademii Rolniczej (obecnie Uniwersytet Rolniczy) w Krakowie, gdzie dołączyłem do
zespołu kierowanego przez prof. dr hab. inż. Tadeusza Tuszyńskiego.
Stopień doktora nauk rolniczych w zakresie żywności i żywienia uzyskałem 14 lipca
2004 r. na Wydziale Technologii Żywności Akademii Rolniczej w Krakowie. Promotorem
20
pracy pt. „Wpływ wybranych dodatków na stabilność alkoholowych kremów emulsyjnych”
był prof. dr hab. inż. Tadeusz Tuszyński. Na realizację swoich badań otrzymałem grant
promotorski (KBN 3 P06T 059 23).
Z dniem 01.06.2005 r. zostałem zatrudniony na stanowisku adiunkta na Wydziale
Technologii Żywności, w Katedrze Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Technicznej
Akademii Rolniczej w Krakowie (obecnie Uniwersytet Rolniczy w Krakowie).
Profil moich zainteresowań badawczych dotyczył wielu obszarów związanych z
szeroko pojętą technologią żywności. Realizowana przeze mnie tematyka naukowo-badawcza
obejmuje następujące zagadnienia:
5.1. wytwarzanie napojów alkoholowych i ich charakterystyka jakościowa,
5.2. analiza związków polifenolowych i właściwości przeciwutleniających roślin
i produktów spożywczych,
5.3. biodostępność związków polifenolowych w symulowanym układzie
pokarmowym człowieka,
5.4. ocena możliwości wykorzystania drobnoustrojów na potrzeby człowieka.
Ad. 5.1. Wytwarzanie napojów alkoholowych i ich charakterystyka jakościowa
Na początku swojej działalności badawczej włączyłem się w tematykę realizowaną w
Katedrze Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Technicznej, związaną ze związkami
lotnymi w napojach alkoholowych. Związki sześciowęglowe, głównie alkohol heksylowy i
jego pochodne, charakteryzują się stosunkowo niskimi progami wyczuwalności, wpływają
niekorzystnie na smak i zapach napojów, przyczyniając się między innymi do ostrego,
piekącego i trawiastego ich posmaku. Efektem prowadzonych badań były publikacje
(Załącznik IV, pkt. A1, D2, Załącznik V, pkt. B1), w których wykazano, że w celu
zmniejszenia zawartości heksanolu i komponentów pochodnych w napojach alkoholowych,
należy eliminować z przerobu surowce niedojrzałe oraz ich zanieczyszczenia, głównie zielone
części roślin. Podczas procesów technologicznych powinno się maksymalnie ograniczyć
napowietrzanie surowców w trakcie ich rozdrabniania. Dodatek SO2, kwasu askorbinowego,
CO2 i innych inhibitorów enzymów wpływa hamująco na powstawanie heksanolu w czasie
przygotowania i obróbki owoców, maceracji miazgi oraz fermentacji moszczów. W napojach
destylowanych można dodatkowo ograniczyć zawartość heksanolu poprzez odpowiednią
destylację korekcyjną z odbiorem frakcji pogonowych lub rektyfikację.
21
Jednym z kierunków badań były również doświadczenia związane z wykorzystaniem
propolisu, jako składnika napojów alkoholowych (Załącznik IV, pkt. D1; Załącznik V., pkt.
B2), których efektem było zgłoszenie patentowe (Załącznik IV, pkt. B1). Propolis
charakteryzuje się gorzkim, lekko piekącym smakiem, który uwydatnia się zwłaszcza w
roztworach etanolowych. Ekstrakty propolisowe otrzymane przy udziale 40 i 50% etanolu są
stabilne i charakteryzują się stosunkowo niskim progiem wyczuwalności smaku (45 ppm)
oraz zapachu (75 ppm). Wódki (czyste i gatunkowe) zestawione z niewielkim dodatkiem
przygotowanych wyciągów odznaczały się oryginalnym zapachem i specyficznym smakiem,
tzw. nutą propolisową.
Ważną częścią moich zainteresowań była stabilność alkoholowych kremów
emulsyjnych, a zwieńczeniem badań związanych z tą tematyką było opracowanie rozprawy
naukowej i uzyskanie na jej podstawie stopnia naukowego doktora. Doświadczenia
prowadziłem w ramach projektu badawczego „Optymalizacja procesów otrzymywania
alkoholowych kremów emulsyjnych w celu poprawy ich stabilności” (grant KBN 3 P06T 059
23). Najważniejsze wyniki tych badań zostały przestawione w publikacjach (Załącznik IV,
pkt. D3, D6, D7. D9) i doniesieniach na konferencjach naukowych (Załącznik V, pkt. B3, B4,
B5, B6, B7). Wykazano, że niskie stężenie lecytyny w emulsjach alkoholowych, przy
stosunkowo wysokim udziale kwasów tłuszczowych, prowadzi najczęściej do szybkiego
rozwarstwiania kremu. Wzbogacenie kremów lecytyną (0,3%) oraz kazeinianem sodu (0,2%)
warunkowało pełną trwałość przechowalniczą, w czasie pięciomiesięcznego składowania.
Wykazano także synergistyczny efekt oddziaływania lecytyny i kazeinianu sodu na trwałość
przechowalniczą alkoholowych kremów emulsyjnych. Frakcje lipidowe emulsji ulegały
silniejszemu, w odniesieniu do kontroli, zdyspergowaniu oraz wolniejszej koalescencji. Ich
dyspersja do rozmiarów poniżej 20 μm wydłużała w zasadniczy sposób trwałość badanych
emulsji. Wprowadzanie do kremów składników przeciwutleniających (szczególnie
tokoferolu) przyczyniało się do ograniczenia rozkładu karotenoidów, ale nie spowalniało
brunatnienia. Opracowano także metodę prognozowania stabilności alkoholowych kremów
emulsyjnych.
Od 2005 roku Polska zaliczana jest do najchłodniejszej strefy uprawy winorośli w
Europie, dlatego kolejny etap moich badań dotyczył win wytwarzanych w Polsce (Załącznik
IV, pkt. A8, A16, D11, D31, D32, D36). Wina gronowe, produkowane w rejonie chłodnego
klimatu, z wykorzystaniem nowych odmian (mieszańców złożonych) mogą stanowić
konkurencję dla win uzyskiwanych w tradycyjnych krajach winiarskich. Do szczepów tych
zostały zaliczone m.in. Marechal Foch, Leon Millot, Aurora, Rondo, Regent, Bianca, Perła
22
Zali. Odmiany te charakteryzowały się zawartością ekstraktu w zakresie 12,85-21,85 g/100 g
oraz zbliżoną kwasowością ogólną. Wina pochodzące z regionów chłodnego klimatu
spełniały wymagania normatywne EU. Charakteryzowały się niewielką zawartością ekstraktu
ogółem (poniżej 4%), stężeniem alkoholu w zakresie od 9,9 do 14,5% obj. oraz kwasowością
od 4,0 do 8,7 g/l. Dominującymi związkami lotnymi tych win były alkohole wyższe, głównie
alkohole izoamylowe oraz izobutanol. Polskie wina gronowe, ze względu na wysoką
kwasowość, były również bogate w octan etylu. Nie można jednak zapominać o winach
owocowych, których tradycja wytwarzania sięga XIII w. Jednym z kierunków moich badań
było wytwarzanie i ocena jakościowa win owocowych (Załącznik IV, pkt. A2, A5, A17;
Załącznik V. pkt. B18, B24, B29, B31, B42, B49). Umiarkowany klimat w Polsce sprzyja
wysokiej produkcji jabłek. Rocznie zbiera się około 1,5 mln ton tych owoców, a przemysł
przetwarza około 700 tysięcy ton. Jabłka stanowią bardzo dobry surowiec do produkcji wina.
Wykazano, że wytworzone z nich moszcze charakteryzowały się stosunkowo niską
kwasowością (1,5-4,7 g/l) i zawartością ekstraktu na poziomie 11°Blg. W wyniku fermentacji
otrzymano wina o niskim stężeniu cukru resztkowego, zawierające bardzo bogaty profil
związków lotnych, w którym dominowały alkohole fuzlowe, aldehyd octowy, octan etylu,
butanol i kwas octowy. Wina jabłkowe były również wysoko oceniane przez panel
sensoryczny.
Fermentacja wysokostężonych brzeczek, m.in. podczas wytwarzania miodów pitnych,
stanowiła także jeden z obszarów moich zainteresowań i badań (Załącznik IV, pkt. D21, D43;
Załącznik V, pkt. B10, B39, B44, B50), których efektem było zgłoszenie patentowe
(Załącznik IV, pkt. B3). Wysokie stężenie cukru może hamować wzrost drożdży z powodu
ciśnienia osmotycznego. W wyniku przeprowadzonych badań wykazano, że brzeczki
wysokostężone należy fermentować z wykorzystaniem szczepów drożdży osmofilnych, mniej
wrażliwych na wysokie ciśnienie osmotyczne roztworu. Obecne w brzeczkach inhibitory
fermentacji (krótko- i średniołańcuchowe kwasy tłuszczowe) istotnie spowalniały lub
zatrzymały fermentację. Wykazano, że dodatek kwasu benzoesowego (5-50 mg/l) lub
sorbowego (25-50 mg/l) zwiększał wydajność fermentacji. Suplementacja brzeczek
miodowych hydrokoloidami (0,01-0,5%) i jonami magnezu chroniła komórki przed
niekorzystnymi czynnikami zawartymi w roztworze, przyczyniając się do zwiększenia stopnia
odfermentowania. Bardzo dobre efekty ochronne osiągnięto się również po immobilizacji
komórek, np. z wykorzystaniem gumy arabskiej, przyspieszając równocześnie klarowanie
miodów pitnych.
23
Zainteresowanie procesami fermentacji i doświadczenie zdobyte podczas omówionych
powyżej badań nad parametrami wpływającymi na technologię pozwoliło na wydanie skryptu
dla studentów Wydziałów Technologii Żywności, pt. „Procesy Fermentacyjne. Przewodnik
do ćwiczeń” (Załącznik IV, pkt. D28), którego jestem współredaktorem i współautorem.
Ad. 5.2 Analiza związków polifenolowych i właściwości przeciwutleniających roślin
i produktów spożywczych
Tematyką związaną ze związkami polifenolowymi zainteresowałem się w 2003 roku,
uczestnicząc w projekcie zamawianym (094/P06/2003/28) (Załącznik IV, pkt. I2)
„Weryfikacja zasad technologii wytwarzania i wykorzystania żywności bogatej w naturalne
antyoksydanty pod względem jej działania prozdrowotnego: Właściwości antyoksydacyjne
wybranych odmian jabłek i innych przetworów z tych owoców w aspekcie oddziaływania
prozdrowotnego”. W ramach projektu brałem udział w doświadczeniach związanych z
pomiarem aktywności antyoksydacyjnej oraz zawartości polifenoli w różnych odmianach
jabłek i ich przetworach (chipsach, suszach, cydrach i winach) (Załącznik IV, pkt. A2, A4,
A5, A9, D4, D5, D10, D33, D38; Załącznik V, pkt. B8, B9, B12, B22, B23, B30). Wykazano,
że największą aktywnością antyoksydacyjną charakteryzowały się jabłka odmiany
Antonówka: 4059,2 mg troloksu/100 g s.s., Boskoop (3315,0), Złota Reneta (3109,6) oraz
Kronselska (3023,7), a najmniejszą Koksa pomarańczowa (1691,3). Najbogatsze w polifenole
były odmiany: Antonówka (524,7 mg (+)katechiny/100 g s.s.), Ligol (445,74), Red Boskoop
(408,38) oraz Złota Reneta (368,11). Profil związków polifenolowych różnił się w
poszczególnych odmianach, jednak cechą wspólną wszystkich badanych owoców była
znacząca przewaga ilościowa 3 substancji: (-)epikatechiny, procyjanidyny B2 oraz kwasu
chlorogenowego. Wysoka zawartość związków polifenolowych i znaczące właściwości
przeciwutleniające zależały w głównej mierze od kwasu chlorogenowego. Zdolności
przeciwutleniające jabłek malały w trakcie ich dojrzewania, natomiast podczas
przechowywania owoców w chłodni rosły. W czasie dojrzewania owoców znacząco zmalała
zawartość kwasu chlorogenowego, (-)epikatechiny i florydzyny. Natomiast podczas
przechowywania owoców w chłodni wykazano wzrost udziału procyjanidyny B1, C1 i
(+)katechiny. W skórach jabłek dominowały: glikozydy kwercetyny (-)epikatechiny i
procyjanidyny B2, a w miąższu: kwas chlorogenowy, (-)epikatechiny i procyjanidyna B2.
Nasiona jabłek odznaczały się większą aktywnością przeciwutleniającą oraz zawartością
polifenoli w porównaniu do skórek i miąższu. W nasionach dominowała florydzyna,
stanowiąca od 72 do 84% wszystkich oznaczanych antyutleniaczy oraz kwas chlorogenowy.
24
Nie stwierdzono obecności glikozydów kwercetyny, które stanowiły istotną frakcję polifenoli
skórek. Chipsy jabłkowe i susz jabłkowy odznaczały się mniejszą (1500-2500 mg
troloksu/100 g s.m.) zdolnością do zmiatania wolnych rodników niż jabłka (2829 - 4140 mg
troloksu/100 mg s.m.). Uzyskane produkty odznaczały się tym samym składem jakościowym
związków polifenolowych jak surowce – głównymi związkami były kwas chlorogenowy,
(-)epikatechina i procyjanidyny B2 i C1. Dodatkowo stwierdzono obecność
5-hydroksymetylofurfuralu (HMF). Zróżnicowanie odmianowe miało istotny wpływ na
smakowitość końcowego produktu. Ostatecznie stwierdzono, że spośród ocenianych odmian,
najbardziej przydatną do produkcji chipsów są jabłka Golden Delicious. Wykazano również,
że grubość plastrów jabłek w zakresie od 3 do 3,5 mm oraz temperatura suszenia na poziomie
90°C była optymalna do zapewnienia wysokiej zawartości polifenoli, aktywności
przeciwutleniającej oraz odpowiednich, korzystnych cech sensorycznych produktu.
Zastosowanie wstępnej obróbki mikrofalowej (300 W, 5 min) wiązało się ze znacznym
skróceniem czasu suszenia i nie wpływało negatywnie na ocenę organoleptyczną chipsów, a
jednocześnie przyczyniało się do znacznego wzrostu zawartości polifenoli (o około 60%) i
aktywności przeciwutleniającej (80%). Konsekwencją prowadzonych badań było otrzymanie
patentu „Sposób wytwarzania chipsów jabłkowych” (patent nr 214196) (Załącznik IV, pkt.
B2). Oceniano również wpływ warunków fermentacji na zawartość związków
polifenolowych i potencjał antyoksydacyjny win. Najlepszymi właściwościami
antyoksydacyjnymi wśród badanych napojów, odznaczały się wina z jabłek Šampion
(466,1 mg troloksu/100 ml), natomiast w przypadku odmiany Gloster aktywność ta była
ponad 7-krotnie niższa. Aktywność antyoksydacyjna była bezpośrednio związana z ilością
polifenoli oraz ich profilem. Dominującym związkiem we wszystkich próbach był kwas
chlorogenowy, którego zawartość mieściła się w zakresie od 12,7 (Gloster) do 25,8 mg/l
(Šampion). Udział pozostałych związków był silnie zróżnicowany i uzależniony od odmiany
jabłek użytej do fermentacji. Cechą wspólną tych prób była zbliżona zawartość pochodnych
kwasu cynamonowego i (-)epikatechiny oraz mała ilość pochodnych glikozydowych
kwercetyny. Pasteryzacja moszczu przeznaczanego do fermentacji istotnie wpłynęła na
wzrost stężenia procyjanidyn, w odniesieniu do prób bez obróbki termicznej. Fermentacja w
miazdze zwiększała aktywność przeciwutleniającą otrzymywanych win jabłkowych, co było
bezpośrednio związane z ilością polifenoli. Obecność tlenu wpłynęła niekorzystnie na
charakterystykę chemiczną win – stwierdzono zmniejszenie aktywności przeciwutleniającej i
ogólnej ilości polifenoli o ponad 60%. Immobilizacja komórek drożdży z wykorzystaniem
alginianu wapnia poprawiała aktywność przeciwutleniającą win jabłkowych, powodując
25
znaczący wzrost stężenia kwasu chlorogenowego, a przede wszystkim (+)katechiny i
(-)epikatechiny. Zwieńczeniem grantu zamawianego nr 094/P06/2003/28 było
współautorstwo monografii pt. „Przeciwutleniacze w żywności. Aspekty zdrowotne,
technologiczne, molekularne i analityczne”, pod redakcją prof. Włodzimierza Grajka
(Załącznik IV, pkt. D8).
Po zakończeniu prac związanych z omawianym projektem badawczym
kontynuowałem moje badania dotyczące analizy związków polifenolowych i właściwości
przeciwutleniających roślin i produktów spożywczych (Załącznik IV, pkt. A10, A13, A15,
D12, D14-D17, D19, D22-D27, D34, D39, Załącznik V, pkt. B11, B16, B17, B19-B22, B25,
B26, B33, B34, B38). Na część doświadczeń otrzymałem finansowanie z Ministerstwa Nauki
i Szkolnictwa Wyższego (projekt N N310 079636) (Załącznik IV, pkt. I3). W ramach
przeprowadzonych badań wykazano, że owoce niewykorzystywane powszechnie w
przetwórstwie, np. pigwowca japońskiego, derenia jadalnego czy morwy czarnej odznaczały
się silnymi właściwościami prozdrowotnymi, związanymi głównie z zawartością polifenoli.
Owoce pigwowca japońskiego i derenia jadalnego miały wysoką aktywność antyoksydacyjną
(odpowiednio 2631 i 1782 mg troloksu/100 g), w porównaniu z innymi owocami krajowymi
(jabłka – około 500 mg troloksu/100 g, gruszki – 324, śliwki – 448, melony – 38). Ich
potencjał antyrodnikowy wynikał głównie z dużego stężenia związków polifenolowych.
Owoce pigwowca japońskiego i derenia jadalnego charakteryzowały się także interesującym
smakiem i aromatem. Ze względu na skład chemiczny oraz możliwości uprawy w krajach o
klimacie umiarkowanym mogą stanowić ciekawą alternatywę dla innych owoców
stosowanych w przetwórstwie. Owoce pigwowca japońskiego i derenia jadalnego, z powodu
wysokiej kwasowości i niekorzystnego stosunku cukrów do kwasów nadają się tylko do
przetwórstwa. W tym celu w recepturze muszą być uwzględnione działania powodujące
zmianę profilu cukrowo-kwasowego, lub też owoce mogą występować jako składnik
przetworów wieloowocowych. Zalecane kierunki przetwórstwa to przede wszystkim
produkcja nalewek, win do kupażu oraz przetworów dżemowych. Cennym źródłem związków
polifenolowych o wysokiej aktywności przeciwutleniającej są zioła i herbaty. Zbadano
potencjał antyoksydacyjny i zawartość polifenoli ogółem w piętnastu ziołach
wykorzystywanych w ziołolecznictwie. Największą aktywność antyoksydacyjną
(1753 mg troloksu/g s.m.) i najwyższy poziom polifenoli wykazano dla borówki brusznicy
(200 mg (+)katechiny/g s.m.). Kora dębu, dziurawiec oraz kwiaty głogu i bzu czarnego były
również bardzo cennym źródłem związków przeciwutleniających. Niskim potencjałem
antyrodnikowym odznaczały się liście pokrzywy, ziele skrzypu, jemioły i fiołka. Potencjał
26
przeciwutleniający herbat okazał się ponad 5-krotnie silniejszy niż wysokoaktywnych ziół.
Wykazano, że herbaty zielone zawierają więcej związków aktywnych niż czerwone i czarne,
a ich aktywność istotnie maleje podczas przechowywania (do 35% na miesiąc). Jednym z
kierunków zainteresowań o charakterze naukowym i utylitarnym było wykorzystanie
odpadów z przemysłu owocowo-warzywnego. Właściwe ich zagospodarowanie stanowi duży
problem, a wtórne wykorzystanie odpadów pozwala uniknąć kosztów magazynowania lub
utylizacji. Złożony skład chemiczny daje wiele możliwości, a najpopularniejsze dotąd
przeznaczanie ich na paszę lub nawóz nie rozwiązuje problemu. Atrakcyjną alternatywą jest
odzysk substancji, które mogą być wykorzystane w różnych gałęziach przemysłu, głównie w
przemyśle spożywczym. Preparaty uzyskane w ten sposób mają niską cenę i stanowią
doskonały zamiennik popularnych obecnie związków wytwarzanych na drodze reakcji
chemicznych. Dodatkową zaletą jest obecność związków towarzyszących, które
niejednokrotnie pozytywnie wpływają na organizm człowieka. Wykazano, że wytłoki z
winogron i jabłek charakteryzowały się względnie wysoką aktywnością przeciwutleniającą
(odpowiednio 1452 i 415 mg troloksu/100 g ś.m.) i zawartością związków polifenolowych
(130 i 142 mg (+)katechiny/100 g ś.m.) i stanowiły dobre źródło błonnika pokarmowego.
Wytłoki marchwiowe, mimo małej zawartości suchej masy, były również cennym źródłem
β-karotenu. Oceniano także wpływ różnych rozpuszczalników na odzysk związków
aktywnych z wytłoków owocowo-warzywnych i wykazano, że rozpuszczalniki organiczne
stanowiły najlepsze ekstrahenty, jednak niektóre z nich są toksyczne dla człowieka. Dlatego,
ze względu na niską toksyczność, zaleca się wykorzystywać do tego procesu 60-80% roztwór
etanolu.
Ad. 5.3. Biodostępność związków polifenolowych w symulowanym układzie
pokarmowym człowieka
Badania nad związkami polifenolowymi, zapoczątkowane w czasie wykonywania
projektu badawczego nr 094/P06/2003/28 (Załącznik IV, pkt. I2), oraz doświadczenia
omawiane w punkcie 5.2, skierowały moje zainteresowania na biodostępność i
bioprzyswajalność polifenoli w układzie pokarmowym człowieka. Wysokie ilości polifenoli
w owocach i warzywach nie zawsze są dostępne dla człowieka. Istotny jest sposób
metabolizmu i wchłaniania do ustroju tych składników oraz ich uwolnienie z matrycy
żywności. Dlatego rozpocząłem badania związane z tą tematyką, a w 2011 roku uzyskałem
grant pt. „Biodostępność i bioprzyswajalność związków polifenolowych w symulowanym
układzie pokarmowym człowieka” (nr 2011/01/B/NZ9/00218), finansowany przez Narodowe
27
Centrum Nauki (Załącznik IV, pkt. I4). Rezultaty przeprowadzonych doświadczeń stanowią
istotną część monografii „Występowanie i biodostępność związków polifenolowych oraz
możliwości ich wykorzystania w suplementacji żywności”, która stanowi osiągnięcie
naukowe będące podstawą do ubiegania się o stopień naukowy doktora habilitowanego. W
tym samym czasie uczestniczyłem również w grancie (nr 2011/01/B/NZ9/00226) związanym
z tematyką interakcji związków polifenolowych z mikroflorą przewodu pokarmowego
człowieka, jako główny wykonawca (Załącznik IV, pkt. I5). Część wyników z obu projektów
została już opublikowana w czasopismach naukowych i zaprezentowana na konferencjach
krajowych i zagranicznych (Załącznik IV, pkt. A3, A6, D13, D42; Załącznik V, pkt. B15,
B27, B37, B40, B41, B43, B45, B46, B48, B51). Istnieje wiele metod in vivo oraz in vitro
oceniających stopień i szybkość trawienia oraz przyswajanie związków polifenolowych.
Metodami zapewniającymi uzyskanie najbardziej pewnych wyników są metody in vivo,
jednak mają one wiele ograniczeń. Dlatego też powstało wiele modeli in vitro symulujących
pracę układu pokarmowego człowieka i starających się odtworzyć warunki w nim panujące.
Jednym z pierwszych etapów tej części doświadczeń było opracowanie modelu in vitro
uwzględniającego wszystkie etapy symulacji trawienia, który umożliwiał badanie
biodostępności polifenoli z owoców i przetworów owocowych. W modelu uwzględniono etap
żołądka i jelita cienkiego, z odpowiednią regulacją pH i symulacją wydzielania enzymów
trawiennych, etap wchłaniania z użyciem membran dializacyjnych oraz jelita grubego z
mikroflorą rezydującą. Wykazano, że w wyniku działania enzymów trawiennych aktywność
antyoksydacyjna jabłek i śliwek wzrastała, co było związane ze zwiększeniem ilości
polifenoli i z lepszą ich przyswajalnością, wywołaną głównie przemianami do związków
prostszych (monomery, aglikony). Udowodniono także dobrą przyswajalność katechiny,
zarówno naturalnie obecnej w badanych owocach, jak i tej pochodzącej z trawienia
procyjanidyn. Po symulacji trawienia owoców aronii, gruszek i bananów aktywność
antyoksydacyjna malała, odwrotnie niż w przypadku jabłek i śliwek. Wszystkie dializaty
uzyskane po symulowanym trawieniu charakteryzowały się mniejszą zawartością polifenoli
ogółem w porównaniu do surowca wyjściowego. Podczas symulowanego trawienia
rozkładowi ulegały głównie glikozydy kwercetyny i cyjanidyny. Fenolokwasy oraz
procyjanidyny odznaczały się mniejszym stopniem wchłaniania. Mikroflora jelitowa, użyta w
doświadczeniu, oddziaływała na związki polifenolowe obecne w badanych owocach w
zróżnicowany sposób. Można było zauważyć istotny wpływ metabolizmu bakteryjnego na
trawienie polifenoli obecnych w jabłkach oraz truskawkach. Prawidłowe funkcjonowanie
mikroflory jelitowej jest kluczowe dla metabolizmu licznych substancji chemicznych
28
dostarczanych wraz z pożywieniem. Równowaga pomiędzy układem immunologicznym
gospodarza a komensalnymi gatunkami mikroflory jest także niezbędna dla zachowania
zdrowia, a jej zaburzenia powodują rozwój licznych chorób. Dlatego w badaniach, w których
uczestniczyłem oceniano wpływ wybranych polifenoli oraz ekstraktów owocowych na
mikroflorę jelitową. Wykazano, że kemferol silnie hamował wzrost wszystkich badanych
bakterii, działając najmocniej wobec Ruminococcus gauvreauii (minimalne stężenie hamujące
– MIC 20 µg/ml) oraz Eubacterium cylindroides (MIC 50 µg/ml). Słabszymi inhibitorami
były rezweratrol i florydzyna. Rezweratrol silnie hamował wzrost Lactobacillus sp. i
Ruminococcus gauvreauii (MIC 100 µg/ml) oraz Enterococcus caccae (MIC 250), a
florydzyna słabo hamowała Enterococcus caccae i Ruminococcus gauvreauii (MIC>250). W
wyniku oceny wpływu ekstraktów z 13 różnych roślin na bakterie jelitowe wykazano, że
Lactobacillus sp. był wrażliwy tylko na ekstrakt z borówki brusznicy. Najsilniejszy wpływ na
bakterie E. coli miał ekstrakt z nasion grejpfruta, podczas gdy ekstrakty z owoców kolcowoju
chińskiego i bzu czarnego działały hamująco na wzrost Enterococcus caccae. Wiele z
badanych ekstraktów roślinnych miało negatywny wpływ na mikroflorę jelitową człowieka,
w tym gatunków pożądanych i korzystnych. Uzyskane wyniki wskazują na konieczność
przemyślanego doboru suplementów diety, gdyż stosowane bez kontroli i w nadmiarze
składniki przeciwutleniające mogą negatywnie wpłynąć na funkcjonowanie fizjologicznej
mikroflory jelitowej. Wykazano także, że związki polifenolowe chronią komórki nabłonkowe
jelita przed stresem oksydacyjnym i proliferacją. Udowodniono, że kwas chlorogenowy i
kwercetyna wykazują silniejsze działanie ochronne niż epigalokatechina.
Ad. 5.4. Ocena możliwości wykorzystania drobnoustrojów na potrzeby człowieka
Ostatnim, pobocznym obszarem moich zainteresowań jest wykorzystanie
drobnoustrojów dla szeroko rozumianych potrzeb człowieka. Jednym z nich były
cyjanobakterie (sinice) rodzaju Arthrospira (dawniej Spirulina) (Załącznik IV, pkt. A7, A12,
A14). Cyjanobakterie z rodzaju Arthrospira, znane komercyjnie jako Spirulina, zawierają ok.
60-70% białka wysokiej jakości, w którego skład wchodzi 9 aminokwasów egzogennych.
Sinice należące do tego rodzaju są również bogatym źródłem wielu witamin, głównie z grupy
B (m.in. B12), a także witamin D, A, E i mikroelementów. Dodatkowo cyjanobakterie
zawierają znaczne ilości nienasyconych kwasów tłuszczowych, w tym ω-3 i ω-6. Bardzo
ważnym składnikiem sinic są barwniki (fikocyjaniny; chlorofile; karotenoidy, głównie
β-karoten). Suplementy diety oparte na liofilizowanych bakteriach Arthrospira aktywują
układ odpornościowy, głównie przez modulowanie poziomu cytokin. Fikocyjaniny są
29
silnymi, selektywnymi inhibitorami cyklooksygenazy-2, zaangażowanymi w syntezę
prostaglandyn i hamowanie uwalniania histaminy z komórek tucznych. Część
przeprowadzonych doświadczeń dotyczyła oceny wpływu podłoża hodowlanego na syntezę
związków bioaktywnych (β-karotenu, fikobiliprotein) oraz właściwości antyoksydacyjnych u
sześciu wybranych gatunków cyjanobakterii z rodzaju Arthrospira. Wykazano, że rodzaj
zastosowanego podłoża wzrostowego (Zarrouk’a, RM6) wpływa na ilość związków
syntetyzowanych w komórkach badanych cyjanobakterii. Skład ilościowy i jakościowy
podłoża Zarrouk’a wpływał korzystniej na syntezę β-karotenu w biomasie sinic wszystkich
badanych szczepów, natomiast w biomasie wzrastającej na podłożu RM6 zanotowano
większą zawartość fikobiliprotein (z wyjątkiem A. platensis 85.79). Również w przypadku
oznaczenia całkowitej zdolności antyoksydacyjnej bardziej korzystnym okazał się być skład
medium Zarrouk’a (z wyjątkiem A. platensis 86. 79 i A. platensis 257.80). W zespole
badawczym oceniano także możliwości wykorzystania immobilizowanych bakterii
Arthrospira platensis (w alginianie sodu, żelu krzemionkowym i agarozowym) do biosorpcji
ołowiu. Maksymalne możliwości sorpcyjne dla komórek unieruchomionych w alginianie,
żelu agarozowym i krzemionkowym wynosiły odpowiednio 425, 273 i 2 mg Pb/g suchej
masy biosorbenta. Największą wydajność biosorpcji ołowiu przez bakterie immobilizowane
w żelu alginianowym i agarozowym obserwowano w pH = 5,0 i przy początkowym stężeniu
ołowiu około 500 mg/l. Dla żelu krzemionkowego korzystniejsze wyniki osiągano przy
pH = 4,0 i stężeniu ołowiu na poziomie 100 mg/l.
Innymi badaniami związanymi z usuwaniem ołowiu z wody były doświadczenia nad
wykorzystaniem biomasy odpadowej różnych szczepów drożdży (Załącznik IV, pkt. A11).
Testowane drożdże usuwały z roztworu ponad 90% ołowiu w ciągu 20 min procesu, przy
czym jedynie zastosowanie drożdży piekarskich umożliwiało obniżenie poziomu Pb poniżej
1 mg/l z roztworów o wyjściowym stężeniu 200 i 500 mg Pb/l. Największą wydajność
usuwania Pb wykazano stosując drożdże piekarskie, gdy wyjściowe stężenie ołowiu wynosiło
500 mg/l.
Biomasa drożdży może też znaleźć zastosowanie w technologii żywności. W ramach
badań nad wykorzystaniem drożdży jako zamiennika mięsa w produktach spożywczych
(Załącznik IV, pkt. B29 i B30), wykazano, że drożdże piekarnicze i ich hydrolizaty mogą
stanowić ciekawą alternatywę dla wegetarian. Hydrolizaty drożdży nadawały wytworzonym
pasztetom „mięsny” posmak, zastępując całkowicie użycie mięsa i wątroby wieprzowej do
wyrobu. Stanowiły także dobre źródło białek i mikroelementów w tych produktach.
30
Mój dotychczasowy dorobek publikacyjny obejmuje:
L.p. Nazwa czasopisma Liczba
publikacji IF
a IF
b Punkty wg
MNiSWa
Punkty wg
MNiSWb
1. Food Chemistry 1 2,696 3,259 24 40
2. Food Science and Technology
International 1 0,467 0,981 15 20
3. Journal of Food Processing and
Preservation 2 0,944 1,876 26 30
4. Journal of Agricultural and Food
Chemistry 1 2,469 3,107 24 40
5. Food Technology and Biotechnology 1 0,976 0,977 20 25
6. Journal of Food Composition and
Analysis 1 1,948 2,259 32 35
7. Journal of Elementology 1 0,381 0,643 15 15
8. Czech Journal of Food Science 1 0,685 0,741 20 20
9.
Journal of Environmental Science and
Health Part A-Toxic/Hazardous
Substances & Environmental
Engineering
1 1,135 1,135 20 20
10. Journal of Food Science and
Technology 1 2,024 2,024 20 20
11. Fruits 1 0,800 0,800 25 25
12. FEMS Yeast Research 1 2,436 2,436 25 25
13. Postępy Mikrobiologii 1 0,140 0,271 13 15
14. Żywność, Nauka, Technologia, Jakość 3 0,190 0,311 26 45
15. Przemysł Fermentacyjny i Owocowo-
Warzywny 7 — — 29 35
16. Acta Scientiarum Polonorum
Technologia Alimentaria 10 — — 51 100
17. Polish Journal of Food and Nutrition
Science 1 — — 6 10
18. Electronic Journal of Polish Agricultural
Universities 2 — — 8 14
19. Herba Polonica 2 — — 15 16
20. Journal of International Scientific
Publication 2 — — 4 4
21. Journal of Fruit and Ornamental Plant
Research 1 — — 6 —
22. Przemysł Spożywczy 1 — — 6 5
23. Żywienie Człowieka i Metabolizm 1 — — 1 4
24. Roczniki Państwowego Zakładu Higieny 1 — — 6 6
25. Rozdział w monografii 15 — — — —
26. Udzielone patenty 3 — — — —
27. Doniesienia opublikowane w
materiałach konferencyjnych 51 — — — —
OGÓŁEM 111 17,291 20,820 437 569 a – obowiązujące w roku opublikowania
b – zgodne z aktualną ministerialną listą czasopism punktowanych