UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Danijela Ž. Petković

Uticaj ibuprofena, acetilsalicilne kiseline i vitamina C na

osmotsku otpornost eritrocita pacova

Master rad

Niš, 2013.

UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Uticaj ibuprofena, acetilsalicilne kiseline i vitamina C na

osmotsku otpornost eritrocita pacova

Master rad

Kandidat: Mentor:

Danijela Ž. Petković dr Perica J.Vasiljević

br.indeksa 11

Niš, maj 2013.

UNIVERSITY OF NIS

FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS

DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY

Effects of ibuprofen, acetylsalicylic acid and vitamin C on the

osmotic resistance of erythrocytes on rats

Master thesis

Candidate: Mentor:

Danijela Ž. Petković dr Perica J. Vasiljević

No. of index 11

Niš, may 2013.

Ovom prilikom želela bih da izrazim posebnu zahvalnost i poštovanje

svom mentoru prof. Perici Vasiljeviću na ukazanoj pomoći, strpljenju

i podršci prilikom izrade ovog master rada.

Takođe, zahvaljujem se laborantu Andrei Žabar na ukazanoj pomoći

prlikom realizacije eksperimentalnog dela master rada.

Najveću zahvalnost dugujem svojim roditeljima na podršci i

razumevanju.

Sažetak

Cilj ovog rada bio je da se utvrdi uticaj ibuprofena, acetilsalicilne kiseline, vitamina C

i kombinacija ibuprofen/vitamina C i acetlsalicilna kiselina/vitamin C na osmotsku otpornost

eritrocita pacova. Koncentracije ispitivanih supstanci su: 25 mg/ml, 50 mg/ml, 75 mg/ml i

100mg/ml. Za svaku koncentraciju određen je procenat hemolize merenjem apsorbance

uzorka, kontrole i standarda na spektrofotometru pri talasnoj dužini od 540 nm.Talog koji je

nastao posle hemolize je korišćen za pravljenje krvnog razmaza na kome je posmatrana

promena oblika eritrocita. Dobijeni rezultati pokazuju da sve ispitivane supstance u ispitivanim koncentracijama

pokazuju hemolitičku aktivnost. Najveću hemolitičku aktivnost od 90,34 ± 7,30 % izaziva

kombinacija brufena i vitamina C koncentracije 100 mg/ml, dok najmanju hemolitičku

aktivnost pokazuje acetilsalicilna kiselina pri koncentraciji 25 mg/ml od 14.32 ± 0.52%.

Procenat hemolize raste kod svih ispitivanih koncentracija kombinacija: askorbinska

kiselina/vitamin C i ibrufen /vitamin C u odnosu na pojedinačne supstance istih ispitivanih

koncentarcija što ukazuje na njihov sinergetski efekat.

Ključne reči: ibuprofen; acetilsalicilna kiselina; vitamin C; eritrociti; hemoliza

Abstract

The aim of this study was to determine the effect of ibuprofen, acetylsalicylic acid

and vitamin C, and combination of ibuprofen/vitamin C and acetylsalicylic acid/vitamin C on

the osmotic resistance of erythrocytes on rats. The concentrations of the tested substances

were: 25 mg/ml, 50 mg/ml, 75 mg/ml and 100mg/ml. For each concentration percentage of

hemolysis was determined by using spectrophotometer at a wavelength of 540 nm measuring

absorbance of the sample, controls and standards. Hemolysis sediment was used for making

blood smears to observe change in shape of red blood cells. The results showed that all the tested substances in the tested concentrations showed

hemolytic activity. Combination of ibuprofen and vitamin C in concentration of 100 mg / ml

was the strongest hemolytic agent in comparations with other substance, percentage of

hemolysis was 90.34 ± 7.30%. The lowest hemolysis of 14.32 ± 0.52% shows acetylsalicylic

acid at a concentration of 25 mg/ml. The percentage of hemolysis increases in all tested

concentrations of the combination (ibuprofen/vitamin C and acetylsalicylic acid/vitamin C)

compared to the same individual tested substances with the same concentration what indicate

their synergistic effect.

Keywords: ibuprofen; acetylsalicylic acid; vitamin C; erythrocytes; hemolysis

Sadržaj

1. UVOD ....................................................................................................................................... 1

1.1 Ibuprofen (Brufen) .............................................................................................................. 1

1.2 Acetilsalicilna kiselina (Anbol) .......................................................................................... 3

1.2.1 Farmakološka dejstva acetilsalicilne kiseline .............................................................. 4

1.3. Vitamin C ........................................................................................................................... 5

1.4. Krvno tkivo ........................................................................................................................ 7

1.4.1. Stvaranje krvnih ćelija ................................................................................................ 8

1.4.2. Sastav krvne plazme ................................................................................................... 9

1.4.3. Uobličeni elementi krvi............................................................................................... 10

1.4.4. Razgradnja eritrocita ................................................................................................... 14

1.4.5. Osmotska otpornost eritrocita ..................................................................................... 14

2. CILJ RADA ............................................................................................................................ 16

3. MATERIJAL I METODE ..................................................................................................... 17

3.1 Materijal .............................................................................................................................. 17

3.2. Metode ............................................................................................................................... 17

3.2.1. Priprema štok rastvora ................................................................................................ 17

3.2.2. Priprema radnih rastvora ............................................................................................. 17

3.2.3. Postupak za dobijanje eritrocita .................................................................................. 18

3.2.4. Cijanmethemoglobinska metoda za određivanje koncentracije hemoglobina ............ 18

3.2.5. Način rada ................................................................................................................... 19

3.2.6. Krvni razmaz ............................................................................................................... 20

4. REZULTATI I DISKUSIJA .................................................................................................. 21

4.1. Uticaj ibuprofena (Brufena) ............................................................................................... 21

4.2. Uticaj acetilsalicilne kiseline (Anbola) .............................................................................. 22

4.3. Uticaj vitamina C ............................................................................................................... 23

4.4. Kombinovani uticaj ............................................................................................................ 24

4.4.1. Efekat kombinacije brufen/vitamin C ......................................................................... 24

4.4.2. Efekat kombinacije anbol/vitamin C .......................................................................... 26

4.4.3. Uporedni prikaz rezultata ............................................................................................ 28

5. ZAKLJUČAK ......................................................................................................................... 30

6. LITERATURA ........................................................................................................................ 31

1

1. UVOD

Eritrociti predstavljaju idealan model za proučavanje biološke membrane. Mogu se

koristiti za ispitivanje uticaja različitih biološki aktivnih supstanci prirodnog ili veštačkog

porekla kao što su: sekundarni metaboliti biljaka, lekovi, prirodni i veštački biomaterijali itd.

(Gopal i sar.,2007).

U ovom radu ispitivan je uticaj ibuprofena, acetilsalicilne kiseline i vitamina C na

osmotsku otpornost eritrocita pacova.

1.1. Ibuprofen (Brufen)

Ibuprofen je derivat propionske kiseline (Slika 1). Njegovo delovanje je

antiinflamatorno, analgetičko i antipiretičko (Varagić, 2005).

Ibuprofen pripada grupi nesteroidnih antiinflamatornih lekova. Osnovni mehanizam

delovanja nesteroidnih antiinflamatornih lekova je inhibicija sinteze prostaglandina. Pored

toga, oni koče proces zapaljenja smanjujući oslobađanje medijatora zapaljenja iz granulocita,

bazofilnih ćelija i mastocita. Proces zapaljenja započinju razni tipovi antigena, u toku tog

procesa se pod dejstvom fosfolipaza oslobađa arahidonska kiselina. Iz arahidonske kiseline se

pod dejstvom ciklooksigenaza (COX) stvaraju tromboksan i prostaglandini. Enzim

ciklooksigenaza je poznat u dva izoenzimska oblik: COX-1 i COX-2. COX-1 je konstitutivni

izo-oblik enzima, nalazi se u većini normalnih ćelija tkiva, uključujući želudac, trombocite i

bubrege. COX-2 je inducibilni oblik enzima i nalazi se u svim tkivima koja su u zapaljenju.

Njegovu indukciju regulišu citokinini i medijatori zapaljenja. Prema mehanizmu delovanja na

ciklooksigenazu ibuprofen pripada grupi neselektivnih COX inhibitora, podjednako inhibiše

COX-1 i COX-2. Zbog istovremene inhibicije COX-1 u želucu moguća je pojava želudačnih

ulceracija kao neželjeni efekat (Varagić, 2005).

2

Slika 1. Hemijska struktura ibuprofena i UV spektar vodenog rastvora,,,bazna sredina

265nm, 273 nm

(www.scribd.com/doc/128825855/Stetan-Uticaj-Aspirina)

Ibuprofen se dobro resorbuje iz gastrointestinalnog trakta. Posle unošenja terapijskih

doza, maksimalne koncentracije u krvi dostižu se već posle 45 minuta. U prisustvu hrane u

želucu resorpcija je znatno sporija (Varagić, 2005). Oko 99% primenjene doze se vezuje za

protein plazme, poluživot eliminacije je 2 sata, izlučuje se urinom u obliku neaktivih

metabolita. Ibuprofen prolazi placentalnu barijeru i u maloj količini se izlučuje mlekom

(Pavlović, 2009). Trajanje njegovog delovanja, u zavisnosti od primenjene doze, iznosi od 4

do 8 sati. Preporučena doza varira u zavisnosti od telesne mase i indikacija

(wikipedia.org/wiki/Ibuprofen). Uobičajena dnevna doza za odrasle je 600–1800mg.

Dugotrajna primena visokih doza može dovesti do ošećenja jetre ili bubrega, povećanja rizika

od nastanka arterijske tromboze (npr. infarkt miokarda ili moždani udar)

(http://www.galenika.rs/downloads/spc-pil/pil/brufen_200mg_oblozena_tableta_pil.pdf).

Ibuprofen, takođe, efikasno redukuje i kontroliše simptome reumatskih i nereumatskih

muskuloskeletnih bolesti i poremećaja, uklanja bolove umerene jačine i snižava telesnu

temperaturu. Kao neželjeni efekti mogući su nadražaji sluznice želuca i alergijske reakcije

(Pavlović, 2009).

3

1.2. Acetilsalicilna kiselina (Anbol)

Acetilsalicilna kiselina je najprodavaniji i najkorišćeniji lek na svetu, sintetisana je

1879. godine i poznata pod nazivom Aspirin (Pavlović, 2009).

Acetilsalicilna kiselina je derivat salicilne kiseline (slika 2). Deluje istim

mehanizmom kao i drugi nesteroidni antiinflamatorni lekovi (ibuprofen), tj.inhibiše

biosintezu prostaglandina.

Salicilati se brzo i potpuno resorbuju iz želuca i tankog creva. Maksimalne

koncentracije u plazmi postižu se već posle 1-2 časa od unošenja leka. Kisela sredina u

želucu održava veliki deo primenjene doze u nejonizovanom obliku, čime se ubrzava

resorpcija. Kada velike koncentracije salicilata uđu u mukozne ćelije, mukozna barijera može

biti oštećena. Ako se podesnim puferom pH želuca povisi do 3.5, nadražajno delovanje

salicilata se znatno smanjuje.

Acetilsalicilna kiselina se resorbuje u nepromenjenom obliku, u krvi i tkivima se brzo

hidrolizuje pod dejstvom esteraza na sirćetnu kiselinu i salicilat. Stvoreni salicilat se vezuje

za proteine plazme, čak do 80 %. Ukoliko se koncentracija salicilata u krvi povećava, utoliko

veća količina ostaje slobodna za dejstvo na tkiva.

Slika 1. Hemijska struktura acetilsalicilne kiseline i UV spektar vodenog rastvora: - kisela

sredina (278 nm),bazna sredina (298 nm)

(www.scribd.com/doc/128825855/Stetan-Uticaj-Aspirina)

Biotransformacija salicilata obuhvata njihovo pretvaranje u konjugate sa

glukuronskom kiselinom ili glicinom, i njihovo pretvaranje u gentizinsku kiselinu. Svi ovi

metaboliti, kao i jedan deo slobodnih salicilata izlučuju se preko bubrega.

Nivo salicilata u plazmi zavisi od pH mokraće. Kisela mokraća favorizuje

reapsorpciju salicilata iz tubula i omogućava održavanje viših nivoa salicilata u plazmi.

Alkalna mokraća favorizuje bržu eliminaciju salicilata u mokraći (Varagić,2005).

4

Kinetika eliminacije salicilne kiseline je dozno zavisna, jer je ograničava kapacitet

enzima jetre. Poluvreme eliminacije antitrombocitnih doza je 2-3 sata, a posle primene

velikih analgetskih doza do 12 sati (Pavlović, 2009).

1.2.1. Farmakološka dejstva acetilsalicilne kiseline

Acetilsalicilna kiselina deluje antiinflamatorno, antipiretički, analgetički, inhibiše

agregaciju trombocita i pojačava izlučivanje mokraćne kiseline.

Antiinflamatorno delovanje – Acetilsalicilna stišava ili potpuno zaustavlja proces

zapaljenja. Ovaj efekat je naročito izražen u akutnoj reumatskoj groznici i reumatoidnom

artritisu. Acetilsalicilna kiselina suzbija proces zapaljenja tako što inhibiše enzim

ciklooksigenazu i tako zaustavlja proces biosinteze prostaglandina, medijatora u procesu

zapaljenja. U poređenju sa drugim nesteroidnim antiinflamatornim lekovima, na ovaj enzim

deluje ireverzibilno.

Antipiretičko delovanje – Acetilsalicilna kiselina snižava povišenu telesnu

temperaturu, a skoro ne deluje na normalnu temperaturu. Snižavanje temperature nastaje

zbog odavanja telesne toplote posredstvom periferne vazodilatacije i intenzivnog znojenja.

Acetilsalicilna kiselina blokira centralne efekte prostaglandina i interleukina-1 i tako

omogućuje da se termoregulacijska kontrola u hipotalamusu podesi na niži nivo.

Analgezija – Acetilsalicilna kiselina je efikasan lek u smanjivanju bola blagog do

umerenog intenziteta (glavobolja, zubobolja, mijalgije, artralgije). Analgezija nastaje zbog

perifernog delovanja acetilsalicilne kiseline na proces zapaljenja, ali delimično i zbog

depresije bolnih nadražaja na supkortikalnom nivou.

Inhibicija agregacije trombocita – Acetilsalicilna kiselina je jedina među

salicilatima koja inhibiše agregaciju trombocita. Ona to čini na taj način što inhibiše

biosintezu tromboksana, jednog člana iz serija prostaglandina za koji se zna da favorizuje

agregaciju trombocita. Za ovaj efekat su dovoljne male doze acetilsalicilne kiseline (100-300

mg dnevno). Opisano delovanje traje 8 dana tj. sve dok se ne formiraju novi trombociti.

Urikozurija – Posle većih doza salicilati povećavaju izlučivanje mokraćne kiseline.

Ovaj efekat nastaje usled sprečavanja tubularne resorpcije mokraćne kiseline. Male doze, one

koje se koriste za analgeziju, mogu imati potpuno suprotan efekat.

5

Neželjeni efekti:

1. Nadražaj sluznice želuca – u kiseloj sredini želuca iz salicilata se oslobađa salicilna

kiselina, koja zatim deluje lokalno nadražajno na sluznicu želuca.

2. Krvarenje iz gastrointestinalnog trakta – posledica ulcerogene aktivnosti

acetilsalicilne kiseline, usled inhibicije enzima COX-1.

3. Napad bronhijalne astme – izuzetno retko, a ovo stanje praćeno je rinorejom i šokom.

4. Trovanje salicilatima (salicilizam) – posle uzimanja većih doza, više od 4 g, dolazi do

zujanja u ušima, vrtoglavice i povremene gluvoće. Trovanje se leči ispiranjem želuca i

održavanjem dobre diureze i infuzijom natrijum-bikarbonata.

5. Rejov sindrom – može se javiti kao neželjeni efekat posle primene kod dece i to kod

one koja boluju ili su pre toga bolovala od neke virusne infekcije.

Kontraindikacije za primenu acetilsalicilne kiseline su peptički ulkus, gastrointestinalna

krvarenja, bronhijalna astma i osetljivost prema acetilsalicilnoj kiselini (Varagić, 2005).

Lek Anbol sadrži aktivne supstance – 1 tableta sadrži 300 mg acetilsalicilne kiseline i

pomoćne supstance (aluminijum-hidroksid u obliku sušenog aluminijum-hidroksid gela;

magnezijum-hidroksid; povidon K-30; krospovidon; magnezijum-stearat)

(http://www.farmaceuti.com/forum/cat.43/).

1.3. Vitamin C

Vitamin C pripada grupi hidrosolubilnih vitamina. Resorbuje se iz digestivnog trakta i

ne postoje njegovi depoi u organizmu. Vitamina C ima u voću i povrću, termička obrada i

prisustvo kiseonika brzo razaraju vitamin C. Smrznuto i konzervirano voće i povrće sadrže

promenljive količine vitamina C (Varagić, 2005).

Hipovitaminoza C (skorbut) se manifestuje poremećajima funkcije kapilara i vezivnih

tkiva (krvarenje desni) (Varagić, 2005).

Vitamin C je neophodan za pretvaranje folne kiseline u folinsku kiselinu, kao i za

biosintezu kortikosteroiida i kolagena, bitan je za konverziju prolina u hidroksiprolin u

jednom proteinskom prekursoru kolagena. Velike doze vitamina C koriste se za

zakiseljavanje mokraće (Varagić, 2005).

Vitamin C deluje na funkcije centralnog nervnog sistema, stimuliše funkciju

endokrinih žlezda, pojačava funkciju jetre, omogućava usvajanje gvožđa u crevu i učestvuje u

6

građenju krvi (obzirom da učestvuje u sintezi prokolagena i kolagena, kao i u normalizaciji

propustljivosti kapilara). Jedna od veoma važnih uloga vitamina C je i njegova

antioksidativna aktivnost. Ovaj vitamin vezuje slobodne radikale i time može da odigra

značajnu ulogu u prevenciji raznih teških oboljenja.

(http://www.mineravita.com/vit/c/c_bioh.html)

Askorbinska kiselina je sintetički vitamin C (slika 3). Tablete askorbinske kiseline se

koriste u lečenju skorbuta, ne smeju se koristiti ako postoji visok nivo oksalne kiseline u

urinu (hiperoksalurija) ili alergija na neki sastojak leka. Vitamin C može prouzrokovati

hemolitičku anemiju (usled razgradnje crvenih krvnih zrnaca) kod pacijenata sa deficitom

enzima glukozo-6-fosfat dehidrogenaze.

Povećani unos Vitamina C u dužem vremenskom periodu može rezultirati

povećanjem renalnog klirensa askorbinske kiseline (očišcenja plazme od askorbinske

kiseline).

Lek vitamin C sadrži aktivne supstance; 1 tableta sadrži: 500 mg askorbinske kiseline

i pomoćne supstance (mikrokristalna celuloza; kroskarmeloza- natrijum; magnezijum-stearat;

laktoza , bezvodna; kukkuruzni skrob)(http://www.farmaceuti.com/forum/cat.43/).

Slika 3. Hemijska struktura askorbinske kiseline

(http://sr.wikipedia.org/wiki/Askorbinska_kiselina)

Askorbinska kiselina se dobro rastvara u vodi, pri čemu formira blago kisele rastvore.

Askorbinska kiselina se apsorbuje u telu putem aktivnog transporta i difuzije. Pri regularnom

unosu stepen apsorpcije je između 70 i 95%. Stepen apsorpcije se smanjuje sa povećanjem

unosa. Pri visokom unosu (1,25 g), frakciona humana apsorpcija askorbinske kiseline može

da padne na 33%; pri niskom unosu (<20 mg) stepen apsorpcije može da dostigne 98%. Kad

koncentracija askorbata pređe renalnu granicu reapsorpcije on slobodno prelazi u urin. Na

visokim dijetarnim dozama (koje su kod ljudi nekoliko stotina mg/dan) askorbat se akumulira

u telu dok nivoi u plazmi ne dostignu granicu renalne resorpcije, koja je oko 1,5 mg/dL kod

muškaraca i 1,3 mg/dL kod žena. Koncentracije u plazmi veće od tih vrednosti (za koje se

7

smatra da predstavljaju telesno zasićenje) se brzo izlučuju u urin sa poluživotom od oko 30

minuta. Poluživot vitamina C u telu se produžava smanjenjem telesnih zaliha. Njegov

poluživot se može povećati do 83 dana, nakon čega se pojavljuju prvi simptomi skrobuta

(http://sr.wikipedia.org/sr/Vitamin%20C).

1.4.Krvno tkivo Krv je specijalizovano vezivno tkivo čija je međućelijska supstanca u tečnom stanju, a

ćelije nemaju stalan položaj. Krv neprekidno kruži kardiovaskularnim sistemom (Anđelković

i sar., 2009).

Uloge krvi su:

prenošenje različitih molekula (O2, CO2, hranljivih materija, metabolita, vitamina,

elektrolita);

regulacija telesne temperature;

transmisija signala (hormona);

puferizacija;

imunološka odbrana.

Krv se sastoji od tečnog dela (plazme) i uobličenih elemenata krvi (eritrocita, leukocita i

trombocita) (slika 4). Volumen krvi odraslih osoba zavisi od telesne mase i iznosi kod žena 4-

4.5 litara, kod muškaraca 4.5-5 litara telesne mase 70 kg (Despopulus i Silbernagal, 2011).

Slika 4. Uzorak krvi nakon centrifugiranja (http://www.softchalk.com/lessonchallenge09/lesson/ImmuneSystems/BloodLymphaticandImmuneSystems_pri

nt.html)

8

1.4.1. Stvaranje krvnih ćelija

Krvne ćelije nastaju u procesu hematopoeze (Slika 5), od zajedničke pluripotentne

matične (stem) ćelije u koštanoj srži njihovom proliferacijom i diferencijacijom.

Hematopoeza obuhvata eritrocitopoezu, granulocitopoezu, monocitopoezu i

megakariocitopoezu (Anđelkovići sar., 2009).

Slika 5. Hematopoeza (http://www.d.umn.edu/~jfitzake/Lectures/DMED/CytAnt/Cytokines/HematopoieticAgents.html)

Pluripotentne matične ćelije imaju sposobnost samoobnavljanja, njihovom deobom

nastaju multipotentne matične ćelije od kojih se odvajaju mijeloidna (eritrociti, granulociti,

megakariociti i monociti) i limfoidna loza. Umnožavanjem i sazrevanjem ovih ćelija nastaju

progenitorne ćelije, a zatim od njih pekursorske ćelije koje su prve morfološki prepoznatiljive

hematopoezne ćelije. Njihovom diferencijacijom nastaju zrele ćelije krvi (Anđelković i

sar.,2009).

9

Na samoobnavljanje i sazrevanje matičnih ćelija krvi utiću brojni faktori rasta i

specifična mikrosredina u kojoj se odvija hematopoeza. Hematopoezni faktori rasta su:

interleukini (IL-1, IL-3, IL-5, IL-6), koloni-stimulišući faktori (CSF), eritropoetin i

trombopoetin (Anđelković i sar.,2009).

Proces hematopoeze počinje u embrionalnom periodu i traje do smrti jedinke, deli se

na prenatalnu i postnatalnu hematopoezu. Prenatalna hematopoeza počinje u žumančanoj

kesi, zatim počinje u jetri i slezini, pa u koštanoj srži i limfnim žlezdama. Hematopoeza se

posle rođenja odvija u aktivnoj koštanoj srži, timusu, limfnim žlezdama i slezini. U koštanoj

srži se stvaraju sve loze krvnih ćelija. Aktivna koštana srž se nakon rođenja nalazi u svim

kostima. Kasnije, tokom puberteta, količina masnog tkiva u cevastim kostima raste i žuta

koštana srž postepeno zamenjuje aktivnu crvenu koštanu srž. Kod odraslih osoba

hematopoeza se odvija u koštanoj srži grudne kosti, rebara, karlice, kičmenih pršljenova,

lobanje i u proksimalnim delovima humerusa i femura. Formiranje uobličenih elemenata krvi

van koštane srži naziva se ekstramedularna hematopoeza (Petrović, 2009).

1.4.2. Sastav krvne plazme

Krvna plazma je prozračna, žućkasta tečnost, sadrži 90-92 % vode u kojoj su

rastvorene ili suspendovane brojne supstance: elektroliti, hranljive materije, metaboliti,

vitamini, hormoni, gasovi i proteini. Dobija se centrifugiranjem krvi uz prethodno dodavanje

antikoagulanasa, u vidu supernatanta., dok su ćelije krvi nataložene na dnu epruvete

(Anđelković i sar., 2009).

Proteini velike molekulske mase, joni i neke nenaelektrisane materije male

molekulske mase su rastvoreni u plazmi. Zbir koncentracija ovih materija daje osmolarnost

plazme od 290 mOsm/kg H2O. Najzastupljeniji katjon u plazmi je Na+, dok su od anjona

najzastupljeniji Cl- i HCO3- (Despopulus i Silbernagal, 2011).

U plazmi je najviše proteina, 60% svih proteina plazme čine albumini (slika 6) čija je

osnovna uloga u transportu materija. Pored transportne uloge, albumini određuju koloidno-

osmotski pritisak koji pomaže da se volumen krvi održi konstantnim i obezbeđuju proteinsku

rezervu u nedostatku ostalih proteina. Globulini α1, α2 i β služe za transport lipida

(apolipoproteini), hemoglobina (haptoglobin), gvožđa (apotransferin), kortizola (transkortin),

kobalamina (transkobalamin). Većina faktora koagulacije, fibrinolize i imunoglobulina su

proteini plazme (Despopulus, Silbernagal, 2011).

10

Jedna od osnovnih uloga proteina plazme je održavanje acidobazne ravnoteže, zbog

svog amfoternog karaktera mogu disosovati kao kiseline ili baze i tako zajedno sa

karbonatnim i fosfatnim sistemom učestvuju u održavanju stalnog pH krvi (Štajn, 1990).

Slika 6. Struktura albumina

(http://www.vidi.hr/Zdravlje/Znanstvenici-uzgajaju-protein-krvi-u-rizi)

1.4.3. Uobličeni elementi krvi

Leukociti Leukociti su bele ćelije krvi uključene u humuralnu i celularnu odbranu organizma.

Odbranbena uloga zasniva se na njihovoj sposobnosti fagocitoze i ameboidnog kretanja.

Leukociti poseduju jedro, ćelijske organele i granule, se dele na granulocite (neutrofilne,

bazofilne i eozinofilne) i agranulocite (monociti i leukociti)(slika 7). Broj leukocita je varijabilan i kreće se od 5.000 do 9.000 u mm3 krvi, zavisi od

uzrasta, pola i fiziološkog stanja (Anđelković i sar., 2009).

11

Slika7. Leukociti (http://classes.midlandstech.edu/carterp/Courses/bio225/chap16/sld006.htm)

Tombociti Trombociti (krvne pločice) nastaju prskanjem megakariocita u koštanoj srži. To su

bezjedarne ćelije (170-400 x 103 po µl krvi) čiji je poluživot približno 10 dana. Zajedno sa

faktorima koagulacije u plazmi i krvnim sudovima učestvuju u procesu hemostaze

(Despopulus, Silbernagal, 2011).

Slika 8. Krvne ćelije (http://normalplateletcount.org/high-platelet-count-vs-normal-platelet-count)

Eritrociti Eritrociti (crvena krvna zrnca) nastaju u procesu eritrocitopoeze koji je kontrolisan

brojnim faktorima među kojim se posebno ističe eritropoetin, koji se sintetiše u uslovima

hipoksije. Pod uticajem eritropoetina matične ćelije opredeljene za eritrocitopoezu pretvaraju

se u proeritroblaste, sazrevanjem proeritroblasta nastaju bazofilni eritroblasti, zatim nastaju

polihromatofilni eritroblasti, acidofilni eritroblasti i retikulociti koji daju zrele eritrocite. U

normalnim uslovima eritrociti ne napuštaju kardiovaskularni sistem (Anđelković i sar., 2009)

12

Eritrociti su bikonkavne ćelije diskoidnog oblika (slika 9), bez jedra, prečnika 7-8 µm,

njihova debljina na ivicama kreće se od 2-2.4 µm, a u centru oko 1 µm. Ovakav oblik

eritrocita je najpogodniji za razmenu gasova kroz njegovu opnu, jer je najveća površina za

razmenu gasova i molekuli hemoglobina su znatno bliži opni. Pored toga, ovakav oblik

omogućava veliku savitljivost tako da eritrociti mogu da se prilagode uslovima koji postoje u

krvnim sudovima i u sinusima slezine (Stefanović, 1989).

Slika 9. Promene veličine i oblika eritrocita

(http://www.medfak.ni.ac.rs/PREDAVANJA/2.%20STOMATOLOGIJA/HISTOLOGIJA/11.%20predavanje%20I%20deo%20Rancic.pdf)

Normalni eritrocit sadrži 71% vode, 28% hemoglobina, 7% lipida (holesterol, lecitin)

i 3% mešavine belančevina, glutationa i elektrolita Jedina uloga eritrocita je prenošenje i

zaštita od denaturisanja njihovog pigmenta hemoglobina, koji je prenosilac O2 i CO2 između

tkiva i pluća(Stefanović, 1989).

Ćelijska membrana eritrocita (slika 10) sadrži 50% proteina, 40% lipida i 10%

ugljenih hidrata. Lipidni deo membrane se sastoji od fosfolipida, holesterola i glikolipida.

Fosfolipidi i glikolipidi kao strukturni delovi membrane imaju naelektrisane grupe na

spoljašnjoj i unutrašnjoj strani membrane. Ugljeni hidrati se nalaze isključivo na spoljašnjoj

strani membrane i određuju antigenost eritrocita. Jedan deo ugljenih hidrata se nalazi na

membranskim proteinima (glikoforini). Sa unutrašnje strane membrane nalaze se 4 proteina

(spektrin, aktin, protein 4.1 i ankirin) koji formiraju proteinsku mrežu koja eritrocitima daje

bikonkavni oblik. Spektrina ima najviše, sastoji se iz dva lanca, α i β koji su međusobno

isprepletani u heterodimer, koji se u proksimalnom delu vezuje za aktin formirajući tetramer,

a on je istovremeno pričvršćen za protein 4.1. Distalni deo β spektrinskog lanca povezan je sa

ankirinom koji je povezan sa transmembranskim proteinom, tzv. protein-3, koji deluje kao

anjonski kanal (Labar, 2007).

13

Slika 10. Membrana eritrocita (http://bmb.pharma.hr/predavanja/krv/sld025.htm)

Na površini spoljašnje proteinske opne nalazi se sijalna kiselina koja daje

elektronegativnost opni eritrocita i sprečava spontanu aglutinaciju eritrocita.

Na spoljašnjem sloju membrane eritrocita postoje pore koje služe za transport vode, glikoze,

elektrolita i drugih jedinjenja između eritrocita i plazme (Stefanović, 1989).

Hemoglobin (Slika11) je složena belančevina (hromoprotein), eritrocitima daje

crvenu boju, sastoji se iz četiri polipeptidna globinska lanca (2 αi 2β) i četiri molekula hema

(prostetična grupa koja se sastoji od 4 pirolska prstena i dvovalentnog gvožđa koje može da

se veže reverzibilno za kiseonik, da se tom prilikom ne oksidiše u trovalentni feri oblik).

Pored prenošenja O2 ,hemoglobin učestvuje i u prenošenju CO2 (Stefanović, 1989).

Slika 11. Građa hemoglobina (http://www.baileybio.com/plogger/?level=picture&id=490)

14

1.4.4. Razgradnja eritrocita

Normalni eritrociti žive prosečno 120 dana, nakon toga se razgrađuju. Razgradnja

normalnih eritrocita je posledica starenja koje se odlikuje smanjenjem sposobnosti eritrocita

da održava svoju morfologiju i sposobnosti hemoglobina za prenošenje gasova (Stefanović,

1989).

Najveći broj eritrocita se razgradi u ćelijama retikuloendotelnog sistema, uglavnom

slezine. Pri razgrađivanju eritrocita oslobađaju se: gvožđe, globin i porfirinski prsten. Gvožđe

i globin se koriste za novu sintezu hemoglobina, dok se iz porfirinskog prstena stvara

bilirubin (Petrović, 2009).

Gubljenjem delova opne eritrocita (fragmentacijom) smanjuje se površina i eritrociti

dobijaju izgled sferocita, postaju rigidni i manje savitljivi.

In vitro se fragmentacija eritrocita postiže izlaganjem eritrocita visokoj temperaturi ili

propuštanjem krvi kroz fibrinska vlakna.

Povećanje zapremine eritrocita zbog povećanog ulaženja Na+ u eritrocite postoji kod

naslednih hemoliznih anemija koje su izazvane sferocitozom. In vitro se hemoliza zbog

povećanja zapremine eritrocita može izazvati stavljanjem eritrocita u hipotonićne rastvore

NaCl (Stefanović, 1989).

1.4.5.Osmotska otpornost eritrocita

Osmolalnost se odnosi na broj rastvorenih čestica po kilogramu vode, dok se termin

osmolarnost odnosi na broj registrovanih čestica po litru rastvora. Osmolalnost telesnih

tečnosti se kreće normalno između 280 i 300 mOsm/kg vode i povoljna je sredina za

ćelijsku aktivnost. Osmolalnost intracelularne tečnosti mora biti u ravnoteži sa odeljkom

ekstracelularne tečnosti, u cilju održavanja korektne distribucije tečnosti između ćelije i njene

okoline. (http://wwwold.med.bg.ac.rs/dloads/nastavni_fiziologija/2010/Sadrzaj%20III%20vezbe.pdf)

Termin toničnost se koristi za ispitivanje osmolarnosti određenog rastvora u odnosu

na plazmu. Rastvori koji imaju istu osmolarnost kao i plazma su izotonični; rastvori sa

povećanom osmolarnošću u odnosu na plazmu su hipertonični, dok sa smanjenom

hipotonični. Eritrociti održavaju svoj oblik u 0.9% rastvoru NaCl, koji je izotoničan sa

plazmom (Štajn,1990).

15

Izlaganje svake ćelije, pa i eritrocita hipertoničanim rastvorima (slika 12) izaziva

izlazak tečnosi iz ćelija (smanjenje volumena ćelije-smežuravanje), dok hipotoničan rastvor

dovodi do većeg ulaženja vode u ćeliju što izaziva povećanje njenog volumena (krajnja

posledica je prskanje ćelijske membrane – liza). Zahvaljujući transportima jona, ćelije imaju

izvesnu sposobnost da se suprotstave preteranom ulasku vode. Eritrociti u hipertoničnom

rastvoru su smežurani, a u prisustvu destilovane vode gotovo svi hemolizirani.

Slika12. Izgled eritrocita u razlicitim rastvorima (http://www.fmhs.uaeu.ac.ae/wlammersteach/Introduction%20to%20PathoPhysiology/Lect%201/A203Osmosis.html)

Sposobnost eritrocita da se suprotstave hemolitičkom dejstvu hipotoničnih rastvora je

osmotska otpornost. Osmotska otpornost nije podjednaka za sve eritrocite, jer eritrociti

nemaju mitohondrije, ni mogućnosti da stvaraju ATP, oni poseduju različite količine ATP

koje su nastale još u toku njihovog razvoja u koštanoj srži. Zbog toga mlađi eritrociti

pokazuju veću osmotsku rezistenciju od starijih.

Kod zdravih osoba, nezavisno od pola, hemoliza eritrocita počinje u hipotoničnom

rastvoru NaCl koncentracije 0,44–0,46%, što predstavlja vrednost minimalne osmotske

rezistencije, a potpuna je u rastvoru koncentracije 0,32–0,34%, što predstavlja vrednost

maksimalne osmotske rezistencije. (http://wwwold.med.bg.ac.rs/dloads/nastavni_fiziologija/2010/Sadrzaj%20III%20vezbe.pdf)

Test osmotske rezistencije eritrocita je rutinska laboratorijska analiza koja se koristi u

cilju dijagnostikovanja poremećaja metabolizma eritrocita praćenih ubrzanom hemolizom

eritrocita. Ovi poremećaji posledica su poremećene structure ćelijske membrane eritrocita

(slučaj kod sferocitoze) ili povećane propustljivosti i lakše fragilnosti kao posledica

izmenjenog metabolizma unutar samih eritrocita (http://publisher.medfak.ni.ac.rs/2005-html/3-

broj/Znacaj%20izvodenja%20testa%20osmotske%20).

16

2. CILJ RADA

Ispitivanje uticaja različitih koncentracija ibuprofena, acetilsalicilne kiseline i vitamina C na osmotsku otpornost eritrocita pacova.

Ispitivanje uticaja različitih koncentracija kombinacija ibuprofen/vitamina C i acetlsalicilna kiselina/vitamina C na osmotsku otpornost eritrocita pacova.

17

3. MATERIJAL I METODE

3.1. Materijal

U eksperimentalnom radu su korišćeni sledeći materijali:

Eksperimentalne životinje, pacovi soja Wistar, mase oko 250g;

Ibuprofen (Brufen – Proizvođač: GALENIKA, Srbija);

Acetilsalicilna kiselina (Anbol – Proizvođač: GALENIKA, Srbija);

Vitamin C ( Proizvođač: GALENIKA, Srbija).

3.2. Metode

3.2.1. Priprema štok rastvora

Štok rastvori su pripremljeni tako što je najpre usitnjen odgovarajući broj tableta

brufena, anbola i vitamina C u avanu uz pomoć tučka, zatim je pojedinačno na analitičkoj

vagi odmerena masa usitnjenih tableta. Odmerene mase tableta su prelivene odgovarajućom

zapreminom 0,9% rastvora NaCl (fiziološki rastvor). Dobijeni rastvori su koncentracije 100

mg/ml i to su štok rastvori za pravljenje potrebnih rastvora.

3.2.2. Priprema radnih rastvora

Za ispitivanje osmotske otpornosti eritrocita pacova su korišćeni rastvori brufena,

anbola, vitamina C, kombinacije brufen/vitamin C i anbol/vitamin C sledećih koncentracija:

25 mg/ml, 50 mg/ml, 75 mg/ml, 100mg/ml. Ove koncentracije su dobijene tako što je

odgovarajuća količina štok rastvora razblažena odgovarajućom količinom 0,9 % NaCl.

Koncentracija od 75 mg/ml dobijena je tako što je od štok rastvora koncentracije 100 mg/ml

uzeto 3 ml i razliveno u epruvetu i dodato jos 1 ml 0,9 % rastvora NaCl. Koncentracija od 50

mg/ml dobijena je tako što je u epruvetu razliveno 2 ml štok rastvora koncentracije 100

mg/ml i dodato 2 ml fiziološkog rastvora. Koncentracija od 25 mg/ml napravljena je tako što

je u epruvetu razliven1 ml štok rastvora i dotato 3 ml fiziološkog rastvora. Ovakav postupak

18

je ponovljen za sve ispitivane supstance, pri čemu je kod kombihnacije brufen/vitamin C i

anbol/vitamin C finalna koncentracija dobijena tako što je od svakg rastvora uzeta

odgovarajuća zapremina određene koncentracije i njihovim mešanjem su dobijene

koncentracije 25mg/ml, 50mg/ml, 75 mg/ml, 100mg/ml.

Pored ovih rastvora u eksperimentu je korišćena destilovana voda kao standard

(pozitivna kontrola-100% hemolize) i fiziološki rastvor (negativna kontrola-nepostojanje

hemolize).

3.2.3. Postupak za dobijanje eritrocita

Eritrociti za ispitivanje osmotske otpornosti su dobijeni iz krvi pacova, koji je najpre

tretiran etrom a zatim anesteziran sa 0,4 ml 10 % ketamidorom. Za eksperiment su potrebni

eritrociti pune krvi, koji su dobijeni punkcijom leve komore srca špricem sa sterilnom iglom.

Špric i igla su prethodno heparinizovani kako bi se onemogućila koagulacija krvi. Zatim je

izvučena što veća količina krvi sa povremenim zaustavljanjem kako bi se srce napunilo. Po

završetku postupka, igla se baca, a nakon zabeležavanja zapremine pune krvi, krv iz šprica je

prebacena u epruvetu laganim ispustanjem niz zid epruvete, kako se ne bi oštetile ćelije.

Zatim je puna krv razblažena 0.9% rastvorom NaCl u odnosu 1:2, tako razblažena krv je

korišćena u eksperimentu.

3.2.4. Cijanmethemoglobinska metoda za određivanje koncentracije

hemoglobina

Medoda se zasniva na tome da se hemoglobin krvi, tretirane kalijum cijanidom i

kalijum fericijanidom, pretvori u stabilni kompleks cijanmethemoglobin (HbCN).

Koncentracija hemoglobina se određuje spektrofotometrijski na talasnoj dužini od 540 nm

(Rusov, 1984).

Drapkinov reagens je dobijen mesanjem 1000 mg natrijum bikarbonata, 50 mg

kalijum-cijanida, 200 mg kalijum fericijanida i vode do 1000 ml (Rusov, 1984).

19

3.2.5. Način rada

Za izvođenje eksperimenta neophodno je sledeće:

1. Fiziološki rastvor (0,9 % rastvor NaCl);

2. Radni rastvori odgovarajućih koncentracija;

3. Destilovana voda;

4. Drabkinov reagens;

5. Epruvete;

6. Centrifuga;

7. Graduisane pipete (0,1 ml; 10 ml);

8. Mikropipete (0,1 ml);

9. Poluautomatske pipete (200-1000µl);

10. Spektrofotometar.

Za svaku ispitivanu supstancu (brufen, anbol ,vitamin C, brufen/vitamin C,

anbol/vitamin C) izdvojene su epruvete na osnovu različitih koncentracija u 4 test grupe po 3

epruvete. U svakoj grupi epruveta je naliveno po 1 ml odgovarajuće koncentracije rastvora, a

zatim je dodato po 1 ml razblažene krvi.

Kao negativna kontrola u eksperimentu je korišćen set epruveta koje sadrže po 1 ml

0,9% NaCl uz dodavanje 1 ml razblažene krvi, a kao pozitivna kontrola (standard) set

epruveta koje sadrže 1 ml destilovane vode uz dodavanje 1ml razblažene krvi.

Nakon dodavanja krvi, uzorci su inkubirani na sobnoj temperaturi 4h. Nakon

inkubacije, epruvete sa uzorcima su centrifugirane 8 minuta na 2500rpm na 4ºC. Za svaku

epruvetu naliveno je po 3ml Drapkinovog reagensa i nakon centrifugiranja dodato je po 200

µl supernatanta uzorka svake koncentracije uz blago mućkanje. Tako pripremljeni uzorci su

odlivani u kivete spektrofotometra i merene su apsorbance na talasnoj dužini od 540 nm, kao

nula korišćen je Drapkinov reagens.

Na kraju eksperimenta, određivanjem koncentracije hemoglobina

spektrofotometrijski, utvrđen je procent hemolize merenjem apsorbance uzorka, kontrole i

standarda na spektrofotometru.

Prethodno je za sve ispitivane supstance, za svaki radni rastvor, uz pomoć

Drapkinovog reagensa određena apsorbanca, ali bez dodavanja krvi.

20

Nakon dobijenih vrednosti apsorbanci za sve uzorke, procenat hemolize je računat po

formuli:

Procenat hemolize = ((Ab uzorka-Ab ispitivane supstance)- Ab negativne

kontrole)/Ab pozitivne kontrole x 100 %

3.2.6. Krvni razmaz

Za svaki uzorak, nakon centrifugiranja i odlivanja supernatanta, talog koji je nastao

posle hemolize je korišćen za pravljenje krvnog razmaza na kome je posmatrana promena

oblika eritrocita.

Na jedan kraj predmetnog stakla stvljena je kap resuspendovanih ćelija iz određenog

taloga, određene koncentracije. Drugim predmetnim staklom je povučena kap krvi duž prvog

pod uglom od 45º(slika 13). Dobijen je tanak sloj krvi koji je ostavljen da se suši na vazduhu

(Štajn, 1990).

Nakon sušenja krvnog razmaza vršeno je bojenje po Pappenhim-u, najpe prelivanjem

May-Grünvald-ovim rastvorom koji sadrži metil alkohol koji fiksira razmaz. Nakon 3 minuta

preko razmaza je dolivena ista količina destilovane vode, tako razblažena boja je ostavljena

1 minut, a nakon toga je sve odliveno. Zatim je razmaz prelivan razblaženim Giemsa

rastvorom (3 kapi boje u 2 cm2 destilovane vode) i ostavljen da stoji 10 minuta, nakon toga

je detaljno ispran destilovanom vodom. Preparat je ostavljen da se suši pod oštrim uglom

(Štajn, 1990).

Slika 13.Izrada krvnog razmaza (http://www.greatscopes.com/act001.htm)

21

4. REZULTATI I DISKUSIJA

Nakon 4h inkubacije sa ispitivanim supstancama različitih koncentracija,

određivanjem koncentracije hemoglobina spektrofotometrijski, utvrđen je procent hemolize

za sve ispitivane supstance.

4.1. Uticaj ibuprofena (Brufena)

Na grafiku 1. prikazan je uticaj ispitivanih koncentracija brufena na hemolizu

eritrocita pacova. Na grafiku se jasno vidi da procenat hemolize raste sa povećanjem

koncentracije brufena. Pri koncentraciji od 25 mg/ml procenat hemolize je 69,15 ± 2,78%, pri

koncentraciji od 50 mg/ml hemoliza je 74,77 ± 8,91%, koncentracija 75 mg/ml ima procenat

hemolize 75,20 ± 0,92%, dok najveća koncentracija od 100 mg/ml izaziva najveći procenat

hemolize i to 77,00 ± 5,39%. Hemolitički efekat brufena uočen je i morfološkom analizom

pripremljenih krvnih razmaza.

Ranija istraživanja su pokazala da nesteroidni antiinfamatorni lekovi u in vitro

uslovima deluju na eritrocite (Manrique-Moreno i sar., 2010). Manrique-Moreno i saradnici,

2011.godine, su pokazali da ibuprofen pri koncentraciji od 10 µM–2 mM izaziva morfološke

25 50 75 100Brufen (mg/ml)

0

20

40

60

80

100

% h

emol

ize

Grafik 1. Procenat hemolize eritrocita sa različitim koncentracijama rastvora brufena

22

promene eritrocita, dovodeći do sve većeg narušavanja njihovog bikonkavnog oblika sa povećanjem

koncentracije (Manrique-Moreno i sar., 2011).

4.2. Uticaj acetilsalicilne kiseline (Anbola)

Efekat anbola ispitivanih koncentracija na hemolizu eritrocita prikazan je na grafiku

2. Pri koncentraciji od 25 mg/ml procenat hemolize je 14,32 ± 0,52 %, pri koncentraciji od 50

mg/ml hemoliza je 38,61 ± 0,93%, procenat hemolize pri koncentraciji od 75 mg/ml je 53,31 ±

0,68%, dok je pri najvećoj koncentraciji od 100 mg/ml procenat hemolize70,13 ± 0,79 %.

Dobijeni rezultati pokazuju da postoji linearna zavisnost između koncentacije aktivne

supstance tj. Acetilsalicilne kiseline i procenta hemolize.

Na razmazu eritrocita (slika 14.) uočavaju se eritrociti nepravilnog oblika što takođe

potvrđuje postojanje hemolize.

Dobijeni rezulati potvrđuju i rezulati Elblbesy i saradnici, 2012. koji su pokazali da

acetilsalicilna kiselina pored agregacije trombocita utiče i na eritrocite, i to povećanjem

koncentracije acetilsalicilne kiseline dolazi do povećanja procenta hemolize eritrocita

(Elblbesy i sar, 2012). Brojne studije su, takođe, pokazale efekat acetilsalicilne kiseline na

membranu eritrocita. Kod akutno i hronično testiranih životinja primećeno je da dolazi do

25 50 75 100Anbol (mg/ml)

0

20

40

60

80

100

% h

emol

ize

Slika 14.Eritrociti u krvnom razmazu u rastvoru anbola koncentracije 25 mg/ml. Bojenje po Pappenheim-u, UV 40 x

Grafik 2. Uticaj različitih koncentracija anbola na hemolizu eritrocita pacova

23

morfoloških promenena i do povećanja volumena eritrocita što dovodi do pojave sferocita

(Merchant i sar., 2004). In vitro acetilsalicilna kiselina menja ćelijsku membranu eritrocita

tako što inhibiše jon zavisnu ATP-aznu aktivnost, menjajući na taj način jonsku

propustljivost ćelijskog zida, izazivajući povećanje volumena eritrocita i pojavu lize ćelija

(Modi i sar., 2003).

4.3. Uticaj vitamina C

Na grafiku 3. prikazan je efekat različitih koncentracija rastvora vitamina C na

osmotsku otpornost eritrocita pacova. Na grafiku se jasno vidi da procenat hemolize raste sa

povećanjem koncentracije vitamina C. Rastvori vitamina C sledećih koncentracija 25mg/ml,

50mg/ml, 75 mg/ml i 100mg/ml imaju redom, sledeće vrednosti hemolize: 73,33 ± 16,52%,

74,03 ± 11,24%, 83,26 ± 3,66%, 87,07 ± 1,37%.

Morfološke promene eritrocita su prikazanena slici 15. gde se eritrociti praktično i ne

uočavaju već izliven ćelijkski sadržaj, kao posledica pucanja membrane.

Ibrahim i saradnici, 2006.godine, su pokazali da stepen hemolize eritrocita zavisi od

koncentracije vitamina C. Smatra se da hemoliza nastaje zbog interakcije askorbinske

kiseline sa eritrocitima, uzrokujući peroksidaciju lipida membrane i oksidaciju hemoglobina

25 50 75 100Vitamin C (mg/ml)

0

20

40

60

80

100

% h

emol

ize

Slika 15. Eritrociti u krvnom razmazu u rastvoru vitamina C koncentracije 50 mg/ml. Bojenje po Pappenheim-u, UV 40 x

Grafik 3. Uticaj različitih koncentracija vitamina C na hemolizu eritrocita pacova

24

(Fe+2 u Fe+3 ). Ovaj proces dovodi do hemolize eritrocita ako je koncentracija vitamina C

visoka, dok je u malim koncentracijama vitamin C antioksidativno sredstvo (Ibrahim i sar.,

2006).

4.4. Kombinovani uticaj

Kako bi utvradili da li postoji interakcija izmedju ispitivanih supstanci, ispitivan je

efekat kombinacije brufen/vitamin C i anbol/vitamion C na osmotsku otpornost eritrocita

pacova.

Dobijene vrednosti za hemolizu eritrocita pod uticajem kombinacije brufen/vitamin C

i anbol/vitamin C bile su podvrgnute Studentovom t-testu. Ovim testom vršeno je poređenje

između dobijenih vrednosti za hemolizu pod uticajem kombinacije ispitivanih supstanci i sa

druge strane dobijenih vrednosti za procenat hemolize pojedinačno ispitivanih supstanci.

Vrednosti p<0,05 smatraju se statistički značajnim (Tabela 1 i Tabela 2).

4.4.1. Efekat kombinacije brufen/vitamin C

Analizom dobijenih rezultata za hemolizu eritrocita pacova pod uticajem rastvora

brufena, vitamina C i kombinacije brufen/vitamin C dobijen je sledeći uporedni graficki

prikaz (Grafik 4).

Efekat ispitivanih koncentracija kombinacije brufen/vitamin C na hemolizu eritrocita

pacova, kao što se na Grafiku 4. može videti je sledeći: koncentracija od 25 mg/ml

kombinacije brufena i vitamina C izaziva 62,29 ± 6,76% hemolize, koncentracija 50 mg/ml

pokazuje 53,40 ± 4,84% hemolize, 75 mg/ml izaziva 84,03 ± 20,32% hemolize, dok najveća

koncentracija od 100 mg/ml brufena i vitamina C izaziva najveći procenat hemolize i to

90,34 ± 7,30%.

25

Morfološkom analizom razmaza eritrocita pod uticajem rastvotra kombinacije

brufen/vitamin C potvrđeno je hemolitičko dejstvo. Pri koncentraci od 25 mg/ml većina

eritrocita je hemoliziralo, dok su ostali izmenjenog oblika (slika 16). Pri koncentraciji od 100

mg/ml na slici 17. prikazan je krvni razmaz na kome uočavamo ostatke eritrocita usled lize

ćelija.

Grafik 4. Procenat hemolize eritrocita sa različitim koncentracijama rastvora brufena, vitamina C i kombinacije brufen/vitamin C.

Slika 16. Eritrociti u krvnom razmazu u rastvoru brufen/vitamin C koncentracije 25mg/ml. Bojenje po Pappenheim-u,UV 40 x

Slika 17.Eritrociti u krvnom razmazu u rastvoru brufen/vitamin C koncentracije 100 mg/ml. Bojenje po Pappenheim-u, UV 40 x

26

Na osnovu dobijenih rezultata (Tabela1) možemo zaključiti da kombinacija

brufen/vitamin C u poređenju sa pojedinačno ispitivanim supstancama izaziva veći procenat

hemolize pri koncentraciji od 75 mg/ml i 100 mg/ml. Pri koncentraciji od 50 mg/ml i

25mg/ml procenat hemolize za kombinovani rastvor je manji u poređenju sa procentom

hemolize koju izazivaju pojedinačno ispitivane supstance. Poređenjem dobijenih vrednosti za hemolizu pod uticajem kombinacije ispitivanih

supstanci i sa druge strane pojedinačno ispitivanih supstanci, jedino je za koncentraciju od 50

mg/ml u poređenju sa procentom hemolize za brufen dobijena vrednost p<0,05, dok je za sva

ostala poređenja dobijena vrednost p > 0,05.

Tabela 1. Procenat hemolize i Studentov t-test za rastvor koji sadrži brufen/vitamin C

Koncentracija Procenat hemolize

p Procenat hemolize

p Brufen Brufen/vitamin C Vitamin C Brufen/vitamin

C 25 mg/ml 69,15 ± 2,78 62,29 ± 6,76 0,070 73,33 ± 16,52 62,29 ± 6,76 0,240 50 mg/ml 74,77 ± 8,90 53,40 ± 4,84 0,007 74,03 ± 11,24 53,40 ± 4,84 0,046 75 mg/ml 75,20 ± 0,92 84,03 ± 20,32 0,264 83,26 ± 3,66 84,03 ± 20,32 0,472 100 mg/ml 77,00 ± 5,39 90,34 ± 7,30 0,104 87,07 ± 1,37 90,34 ± 7,30 0,254

4.4.2. Efekat kombinacije anbol/vitamin C

Slika 18. Eritrociti u krvnom razmazu u rastvoru anbol/vitamin C koncentracije 25mg/ml. Bojenje po Pappenheim-u, UV 40 x

Grafik 5. Procenat hemolize eritrocita sa različitim koncentracijama rastvora anbola, vitamina C i kombinacije anbol/vitamin C

27

Efekat ispitivani koncentracija rastvora koji sadrže kombinaciju anbol/vitamin C u

poređenju sa procentom hemolize koju izazivaju pojedinačni rastvori prikazan je na grafiku

5. Kao što se na grafiku može videti, procenat hemolize pod uticajem kombinacije

anbol/vitamin C povećava se povećanjem koncentracije anbola i vitamina C. Najmanji

procenat hemolize 55,69 ± 5,75% je pri koncentraciji od 25 mg/ml, koncentracija od 50

mg/ml izaziva 77,21 ± 18,09% hemolize, koncentracija od 75 mg/ml izaziva 85,54 ± 16,70%

hemolize, a najveći procenat hemolize 86,49 ± 8,37% je pri kontraciji od 100 mg/ml.

Morfološkom analizom razmaza eritrocita pokazan je efekat različitih koncentracija

rastvora kombinacije anbol/vitamin C na hemolizu eritrocita. Na slici 18. prikazan je efekat

kombinacije anbola i vitamina C koncentracije 25mg/ml na eritrocite, uočavamo pojavu

nepravilnih oblika eritrocita usled povećanja volumena ćelije i izlivanje ćelijskog sadržaja.

Na osnovu ovog grafika zaključujemo da različite koncentracije rastvora vitamina C i

rastvora koji sadrži anbol/vitamin C izazivaju visok procenat hemolize u poređenju sa

procentom hemolize koju izazivaju rastvori anbola istih koncentracija.

Tabela 2. Procenat hemolize i Studentov t-test za rastvor koji sadržianbol/vitamin C

Koncentracija Procenat hemolize

p Procenat hemolize

p Andol Andol/vitamin

C Vitamin C Andol/vitamin C

25 mg/ml 14,32 ± 0,52 55,69 ± 5,75 0,004 73,33 ± 16,52 55,69 ± 5,75 0,148 50 mg/ml 38,61 ± 0,93 77,21 ± 18,09 0,030 74,03 ± 11,24 77,21 ± 18,09 0,399 75 mg/ml 53,31 ± 0,68 85,54 ± 16,70 0,037 83,26 ± 3,66 85,54 ± 16,70 0,397 100 mg/ml 70,13 ± 0,79 86.49 ± 8.37 0,032 87,07 ± 1,37 86.49 ± 8.37 0,463

Na osnovu dobijenih vrednosti za procenat hemolize (Tabela 2 ), može se zaključiti

da, kombinacija anbol/vitamin C u poređenju sa pojedinačno ispitivanim uticajem anbola

izaziva veći procenat hemolize pri svim koncentracijama. Procenat hemolize se povećava, u

jednom i drugom slučaju, povećanjem koncentracije. Studentovim t-testom je određeno za

sve koncentracije p<0,05.

Poređenjem dobijenih vrednosti za hemolizu pod uticajem kombinacije anbol/vitamin

C i vrednosti hemolize koju izaziva rastvor vitamina C zaključujemo da je za koncentracije

od 50 mg/ml, 75 mg/mli100 mg/ml karakteristično povećanje procenta hemolize za

kombinovani rastvor, dok je pri koncentraciji od 25 mg/ml i 100 mg/ml veći procenat

hemolize kada je ispitivan samostalni efekat vitamina C. Studentovim t-testom za sve

koncentracije utvrđeno je p > 0,05.

28

4.5. Uporedni prikaz rezultata

Na grafiku 6. prikazan je efekat svih ispitivanih supstanci na osmotsku otpornost

eritrocita pacova. Upoređujući prikazane rezultate može se zaključiti da sve ispitivane

supstance u svim ispitivanim koncentracijama pokazuju hemolitičku aktivnost, pri čemu

najmanju hemolizu pokazuje anbol i to pri koncentraciji od 25 mg/ml 14,32 ± 0,52 %, dok

najveću hemolitičku aktivnost pokazuje kombinacija brufen/vitamin C koncentracije 100

mg/ml i to 90,34 ± 7,30 %.

Najveći procenat hemolize izazivaju rastvori koncentracije 100 mg/ml za sve

ispitivane supstance, najveći porocenat hemolize izaziva rastvor koji sadrzi brufen/vitamin C

i to 90,34 ± 7,30 %, nešto niži procenat hemolize 87,07 ± 1,37 % izaziva rastvor vitamina C,

zatim sledi rastvor koji sadrži anbol/vitamin C koji izaziva 86,49 ± 8,37 % hemolize, zatim

rastvor brufena 77 ± 5,39 %, dok najmanji procenat hemolize izaziva rastvor anbola i to

70,13 ± 0,79%.

Procenat hemolize za sve ispitivane supstance prikazan je u tabeli 3.

Grafik 6. Procenat hemolize eritrocita pacova sa različitim koncentracijama ispitivanih supstanci.

29

Tabela 3. Procenat hemolize eritrocita pacova sa različitim koncentracijama ispitivanih

rastvora

Koncentracija Procenat hemolize

Anbol Brufen Vitamin C Anbol/vitamin C

Brufen/vitamin C

25 mg/ml 14,32 ± 0,52 69,15 ± 2,78 73,33 ± 16,52 55,69 ± 5,75 62,29 ± 6,76 50 mg/ml 38,61 ± 0,93 74,77 ± 8,91 74,03 ± 11,24 77,21 ± 18,09 53,40 ± 4,84 75 mg/ml 53,31 ± 0,68 75,20 ± 0,92 83,26 ± 3,66 85,54 ± 16,70 84,03 ± 20,32 100 mg/ml 70,13 ± 0,79 77,00 ± 5,39 87,07 ± 1,37 86,49 ± 8,37 90,34 ± 7,30

Morfološkom analizom krvnih razmaza pokazano je da dolazi do promene oblika

eritrocita u zavisnosti od koncentracije rastvora. U normalnim uslovima (fiziološki rastvor)

eritrociti su bikonkavnog oblika (slika 19). Povećanjem koncentracije ispitivanih supstanci

dolazi do veće deformacije eritrocita, eritrociti postaju nepravilnog oblika i na kraju dolazi do

pucanja membrane i do njihove potpune lize.

Slika19. Eritrociti i limfociti u krvnom razmazu u fiziološkom rastvoru. Bojenje po Pappenheim-u, UV 40 x

30

5. ZAKLJUČAK

Najveću hemolitičku aktivnost pokazuje koncentacija od 100 mg/ml vitamin C, a

najniži procenat hemolize izaziva acetilsalicilna kiselina pri koncentaciji od 25

mg/ml;

Procenat hemolize raste kod svih ispitivanih koncentracija kombinacija: askorbinska

kiselina/vitamin C i ibrufen /vitamin C u odnosu na pojedinačne supstance istih

ispitivanih koncentarcija što ukazuje na njihov sinergetski efekat.

31

6. LITERATURA

1. Anđelkovic Z. i sar. (2009). Histologija. Niš: Impressum.

2. Despopoulos A., Silbernagl S. (2011). Fiziološki atlas u boji. Niš: Medicinski fakultet.

3. Elblbesy A. M.i sar. (2012) Effects of Aspirin on Rheological Properties of Erythrocytes

In Vitro. Int J Biomed Sci. 8 (3): 188-193.

4. Gopal V.S., A. Ranjith Kumar, A.N. Usha, A. Karthik, N. (2007). Effective drug

targeting by Erythrocytes as Carrier Systems. Current Trends in Biotechnology and

Pharmacy. Vol.1 (1): 18-33.

5. http://bmb.pharma.hr/predavanja/krv/sld025.htm

6. http://classes.midlandstech.edu/carterp/Courses/bio225/chap16/sld006.htm

7. http://normalplateletcount.org/high-platelet-count-vs-normal-platelet-count

8. http://publisher.medfak.ni.ac.rs/2005-html/3-

broj/Znacaj%20izvodenja%20testa%20osmotske%20)%20

9. http://sr.wikipedia.org/sr/Vitamin%20C

10. http://sr.wikipedia.org/wiki/Askorbinska_kiselina

11. http://www.baileybio.com/plogger/?level=picture&id=490

12. http://www.d.umn.edu/~jfitzake/Lectures/DMED/CytAnt/Cytokines/HematopoieticAgen

ts.html

13. http://www.farmaceuti.com/forum/cat.43/

14. http://www.fmhs.uaeu.ac.ae/wlammersteach/Introduction%20to%20PathoPhysiology/Le

ct%201/A203Osmosis.html

15. http://www.galenika.rs/downloads/spc-pil/pil/brufen_200mg_oblozena_tableta_pil.pdf

16. http://www.greatscopes.com/act001.htm

17. http://www.medfak.ni.ac.rs/PREDAVANJA/2.%20STOMATOLOGIJA/HISTOLOGIJA

/11.%20predavanje%20I%20deo%20Rancic.pdf

18. http://www.mineravita.com/vit/c/c_bioh.html

19. http://www.softchalk.com/lessonchallenge09/lesson/ImmuneSystems/BloodLymphatica

ndImmuneSystems_print.html

20. http://www.vidi.hr/Zdravlje/Znanstvenici-uzgajaju-protein-krvi-u-rizi

21. http://www.wikipedia.org/wiki/Ibuprofen

22. http://wwwold.med.bg.ac.rs/dloads/nastavni_fiziologija/2010/Sadrzaj%20III%20vezbe.p

df

32

23. Ibrahim I. H. i sar. (2006). Oxidative Hemolysis of Erythrocytes Induced by Various

Vitamins. InternatIonal journalof BIomedIcal science. vol. 2 (3): 295-298.

24. Labar B., Hauptmann E. (2007). Hematologija. Zagreb: Školska knjiga.

25. Manrique-Moreno M. i sar. (2010). Effects of the nonsteroidal anti-inflammatory drug

naproxen on human erythrocytesand on cell membrane molecular models. Biophysical

Chemistry. 147: 53–58.

26. Manrique-Moreno M. i sar. (2011). Human cells and cell membrane molecular models

are affected in vitro by the nonsteroidal anti-inflammatory drug ibuprofen. Biochimica et

Biophysica Acta. 1808: 2656–2664.

27. Merchant M. A., Modi D. N. (2004). Acute and chronic effects of aspirin on

hematological parameters and hepatic ferritin expression in miceparameters and hepatic

ferritin expression in mice.Indian J Pharmacol. Vol 36(4): 226-230.

28. Modi D. N., Merchant M. A. (2003). In vitro effects of aspirin and salicylate on

erythrocytes: size and Na+/ K+ atapase activity. Indian Journal of Pharmacology. 35: 27-

31.

29. Pavlović A.N. (2009). Kinetičko određivanje nekih analgetika i sedativa. Doktorska

disertacija. Niš: Univerzitet u Nišu, Prirodno-matematički fakultet.

30. Petrović M. (2009). Laboratorijska hematologija. Beograd: Farmaceutski fakultet.

31. Rusov Č. (1984). Osnovi hematologje životinja. Beograd: Naučna knjiga.

32. Stefanović S. (1989). Hematologija. Beograd-Zagreb: Medicinska knjiga.

33. Štajn A., Žikić R. (1990). Vežbe iz fiziologije životinja. Kragujevac: Prirodfno-

matematićki fakultet.

34. Varagić V., Milošević M. (2005). Farmakologija. Beograd: Elit-Medica.

33

Biografija kandidata

Danijela Petković rođena je 08. 09. 1988. godine u Leskovcu. Završila je osnovnu

školu „Bora Stankovic“ u Bunuškom Čifluku (matična škola u Vučju), nakon toga 2003.

godine upisuje gimnaziju u Lekovcu na prirodno-matematičkom smeru.

Godine 2007. započinje osnovne akademske studije na Prirodno–matematičkom

fakultetu, Univerziteta u Nišu, na Departmanu za biologiju i ekologiju, koje završava 2010.

godine sa zvanjem „biolog“. Iste godine upisuje master akademske studije na Departmanu za

biologiju i ekologiju, odsek Biologija, koje završava 2013. godine.

Прилог 5/2

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

Accession number, ANO: Identification number, INO: Document type, DT: monograph Type of record, TR: textual / graphic Contents code, CC: master thesis

Author, AU: Danijela Petković Mentor, MN: Perica Vasiljević Title, TI: EFFECTS OF IBUPROFEN, ACETYLSALICYLIC ACID AND

VITAMIN C ON THE OSMOTIC RESISTANCE OF ERYTHROCYTES

ON RATS

Language of text, LT: Serbian Language of abstract, LA: English Country of publication, CP: Republic of Serbia Locality of publication, LP: Serbia Publication year, PY: 2013 Publisher, PB: author’s reprint Publication place, PP: Niš, Višegradska 33. Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes) 33 p. ; 19 figures; 3 tables; 6 graphic

Scientific field, SF: Biology Scientific discipline, SD: Cell biology Subject/Key words, S/KW: Ibuprofen, acetylsalicylic acid, vitamin C, erythrocytes

hemolysis UC 615.276:599.324.1+591.044+612.111

547.587.1:599.324.1 +591.044+612.111 577.164.2:599.324.1+591.044+612.111

Holding data, HD: library Note, N: Abstract, AB: The aim of this study was to determine the effect of ibuprofen, acetylsalicylic acid and

vitamin C, and combination of ibuprofen/vitamin C and acetylsalicylic acid/vitamin C on the osmotic resistance of erythrocytes on rats. The concentrations of the tested substances were: 25 mg/ml, 50 mg/ml, 75 mg/ml and 100mg/ml. For each concentration percentage of hemolysis was determined by using spectrophotometer at a wavelength of 540 nm measuring absorbance of the sample, controls and standards. Hemolysis sediment was used for making blood smears to observe change in shape of red blood cells.The results showed that all the tested substances in the tested concentrations showed hemolytic activity. Combination of ibuprofen and vitamin C in concentration of 100 mg / ml was the strongest hemolytic agent in comparations with other substance, percentage of hemolysis was 90.34 ± 7.30%. The lowest hemolysis of 14.32 ± 0.52% shows acetylsalicylic acid at a concentration of 25 mg/ml.

Accepted by the Scientific Board on, ASB: Defended on, DE: Defended Board, DB: President: Member: Member, Mentor:

Образац Q4.09.13 - Издање 1

Прилог 5/1

ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Редни број, РБР: Идентификациони број, ИБР: Тип документације, ТД: монографска Тип записа, ТЗ: текстуални / графички Врста рада, ВР: мастер рад Аутор, АУ: Данијела Петковић Ментор, МН: Перица Васиљевић Наслов рада, НР:

УТИЦАЈ ИБУПРОФЕНА, АЦЕТИЛСАЛИЦИЛНЕ КИСЕЛИНЕ И ВИТАМИНА Ц НА ОСМОТСКУ ОТПОРНОСТ ЕРИТРОЦИТА ПАЦОВА

Језик публикације, ЈП: српски Језик извода, ЈИ: енглески Земља публиковања, ЗП: Р. Србија Уже географско подручје, УГП: Р. Србија Година, ГО: 2013. Издавач, ИЗ: ауторски репринт Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33. Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога) 33 стр. 19 слика; 3 табеле; 6 графика Научна област, НО: Биологија Научна дисциплина, НД: Биологија ћелије Предметна одредница/Кључне речи, ПО: ибупрофен, ацетилсалицилна киселина, витамин Ц,

еритроцити, хемолиза УДК 615.276:599.324.1+591.044+612.111

547.587.1:599.324.1 +591.044+612.111 577.164.2:599.324.1+591.044+612.111

Чува се, ЧУ: библиотека Важна напомена, ВН: Извод, ИЗ: Циљ овог рада био је да се утврди утицај ибупрофена, ацетилсалицилне

киселине и витамина Ц и комбинација ибупрофен/витамин Ц и ацетилсалицилна киселина/витамин Ц на осмотску отпорност еритроцита пацова. Концентрације испитиваних супстанци су: 25 mg/ml, 50 mg/ml, 75 mg/ml i 100mg/ml. За сваку концентрацију одређен је проценат хемолизе меренјем апсорбанце узорка, контроле и стандарда на спектрофотометру при таласној дужини од 540 nm. Талог настао после хемолизе је коришћен за прављење крвних размаза на коме је посматрана промена облика еритроцита. Резултати показују да све испитиване супстанце у испитиваним концентрацијама показују хемолитичку активност. Највећу хемолитичку активност од 90,34 ± 7,30 % изазива комбинација бруфена и витамина Ц концентрације 100mg/ml, док најмањју хемолитичку активност показује ацетилсалицилна киселина при концентрацији од 25 mg/ml од 14.32 ± 0.52%.

Датум прихватања теме, ДП: Датум одбране, ДО:

Чланови комисије, КО: Председник: Члан: Члан, ментор:

Образац Q4.09.13 - Издање 1