UNIVERZA V LJUBLJANI - gobe.si delovanje proteinov...Vendar se je s tem pri mnogo katerih izgubila odpornost pred naravnimi plenilci in zajedavci. Prvi znani pesticid je bilo elementarno

UNIVERZA V LJUBLJANIFAKULTETA ZA FARMACIJO

LARA KANDIĆ

INSEKTICIDNO DELOVANJE PROTEINOV IZBRANIH GOB IN RASTLIN NA MODELU VINSKE MUŠICE

INSECTICIDAL ACTIVITY OF PROTEINS FROM SELECTED SPECIES OF FUNGI AND PLANTS ON FRIUT

FLY MODEL INSECT

DIPLOMSKA NALOGA

Ljubljana, 2007

Lara Kandić: diplomska naloga Kazalo

KAZALO VSEBINE

SEZNAM OKRAJŠAV VIII

POVZETEK IX

ABSTRACT X

UVOD................................................................................................................................................................. 1

1 GLIVE .............................................................................................................................................................. 1 Splošne značilnosti gliv..............................................................................................................................2 Vloga gliv v ekosistemih in gospodarstvu..................................................................................................2 Filogenetska razvrstitev gliv......................................................................................................................3

Deblo Zygomycota............................................................................................................................................... 4 Deblo Chytridiomycota........................................................................................................................................ 4 Deblo Glomerulomycota...................................................................................................................................... 5 Deblo Ascomycota............................................................................................................................................... 5 Deblo Basidiomycota........................................................................................................................................... 5

Uporabljene vrste gliv............................................................................................................................... 52 ŽUŽELKE ........................................................................................................................................................ 11

Splošne značilnosti žuželk........................................................................................................................11 Vloga žuželk v ekosistemu........................................................................................................................12 Filogenetska razvrstitev žuželk................................................................................................................ 12 Vinska mušica.......................................................................................................................................... 13

3 INSEKTICIDI .................................................................................................................................................... 16 Biopesticidi.............................................................................................................................................. 17 Biopesticidi proteinske narave.................................................................................................................18 Prebavni encimi in njihovi inhibitorji......................................................................................................18

Inhibitorji glikohidrolaz...................................................................................................................................... 19 Proteaze.............................................................................................................................................................. 19 Inhibitorji proteaz............................................................................................................................................... 21

Lektini...................................................................................................................................................... 23

II. NAČRT ZA DELO ...................................................................................................................................... 30

MATERIALI IN METODE........................................................................................................................... 31

1 MATERIALI, UPORABLJENI PRI PRIPRAVI LIOFILIZATOV IN PROTEINOV ........................................................................ 31 1.1 Kemikalije ........................................................................................................................................... 31 1.2 Pufri in raztopine ................................................................................................................................ 32 1.3 Aparature in pripomočki ..................................................................................................................... 33 1.4 Glivni materiali ................................................................................................................................... 34 1.5 Inhibitorji proteaz ............................................................................................................................... 34 1.6 Lektini ................................................................................................................................................. 34

2 MATERIALI, UPORABLJENI PRI PRIPRAVI GOJIŠČ ..................................................................................................... 35 2.1 Gojišča ................................................................................................................................................ 35 2.2 Aparature in pripomočki ..................................................................................................................... 35 2.3 Kulturi vinske mušice .......................................................................................................................... 35

3 METODE .................................................................................................................................................... 36 Gojišča in optimizacija gojenja vinske mušice........................................................................................ 36

Gojišče 1............................................................................................................................................................ 36 Gojišče 2............................................................................................................................................................ 36 Gojišče 3............................................................................................................................................................ 36 Gojišče 4............................................................................................................................................................ 37 Gojišče 5 ........................................................................................................................................................... 37 Gojišče 6............................................................................................................................................................ 37 Gojišče 7............................................................................................................................................................ 38 Izbira gojišča...................................................................................................................................................... 38


Priprava liofiliziranih ekstraktov izbranih gliv....................................................................................... 39 Priprava ekstrakta iz gob.................................................................................................................................... 39 Dializa................................................................................................................................................................ 39 Centrifugiranje................................................................................................................................................... 40 Liofilizacija........................................................................................................................................................ 40

3.1 Izolacija in čiščenje lektinov ............................................................................................................... 40 Priprava ekstrakta iz meglenke........................................................................................................................... 40 Afinitetna kromatografija................................................................................................................................... 41 Gelska filtracija.................................................................................................................................................. 42 RP-HPLC........................................................................................................................................................... 42 Ultrafiltracija – koncentriranje........................................................................................................................... 44 Določitev koncentracije...................................................................................................................................... 44 SDS PAGE elektroforeza................................................................................................................................... 45

Testiranje ekstraktov in proteinov........................................................................................................... 46 Učinkovitost (insekticidno delovanje)................................................................................................................ 46 Testiranje liofiliziranih ekstraktov...................................................................................................................... 46 Presejalno testiranje inhibitorjev in laktozil specifičnih lektinov........................................................................ 47 Testiranje očiščenih lektinov.............................................................................................................................. 48

III. REZULTATI .............................................................................................................................................. 51

1 OPTIMIZACIJA GOJENJA VINSKE MUŠICE ............................................................................................................... 51 2 PRIPRAVA LIOFILIZIRANIH EKSTRAKTOV IZBRANIH GLIV ......................................................................................... 52 3 IZOLACIJA LEKTINOV ....................................................................................................................................... 54

Izolacija in čiščenje lektinov iz ekstrakta meglenke ............................................................................... 54 Gelska filtracija ...................................................................................................................................... 57 RP-HPLC................................................................................................................................................. 58 Določitev koncentracije izoliranih lektinov.............................................................................................60

Kvantitativno merjenje koncentracije po Bradfordu........................................................................................... 60 Merjenje absorbance med 340 in 240 nm.......................................................................................................... 61

4 TESTIRANJE LIOFILIZIRANIH EKSTRAKTOV ............................................................................................................ 62 5 PRESEJALNO TESTIRANJE INHIBITORJEV IN LAKTOZIL SPECIFIČNIH LEKTINOV ............................................................... 64 6 TESTIRANJE OČIŠČENIH LEKTINOV ....................................................................................................................... 65

RAZPRAVA.....................................................................................................................................................68

7 OPTIMIZACIJA GOJENJA VINSKE MUŠICE ............................................................................................................... 68 8 TESTIRANJE LIOFILIZIRANIH EKSTRAKTOV GOB ...................................................................................................... 70 9 PRESEJALNO TESTIRANJE INSEKTICIDNEGA DELOVANJA INHIBITORJEV PROTEAZ IN LAKTOZIL SPECIFIČNIH LEKTINOV .......... 71 10 TESTIRANJE INSEKTICIDNEGA DELOVANJA RAZLIČNIH LEKTINOV ............................................................................. 72

SKLEPI.............................................................................................................................................................77

LITERATURA.................................................................................................................................................78


KAZALO SLIK

Slika 1 Delitev gliv na debla.………………………………………………….. 4Slika 2 Clitocybe nebularis (foto Slavko Šerod)………………………………. 8Slika 3 Shema žuželke, Piotr Jaworski………………………………………… 9Slika 4 Življenjski ciklus vinske mušice………………………………………. 12Slika 5 GSL IV lektin iz Griffonia simplicifolia……………………………….. 22Slika 6 Eluati laktozil specifičnih lektinov iz laktozil afinitetne kroamtografije. 53Slika 7 Eluati laktozil specifičnih lektinov po afinitetni kromatografiji iz soka,

pridobljenega različnimi ekstrakcijskimi raztopinami………………… 53Slika 8 Vpliv prisotnosti Ca2+ in Mg2+ ionov na afiniteto laktozil specifičnih

lektinov………………………………………………………………… 54Slika 9 Izolirani lektini iz ekstratka……………………………………………. 55Slika 10 Laktozil specifični lektini po gelski filtraciji…………………………… 56Slika 11 Ločba laktozil specifičnih lektinov na RP-HPLC……………………… 58Slika 12 Proteinski inhibitorji proteaz, uporabljeni v presejalnem testiranju……. 62


KAZALO PREGLEDNIC

Preglednica I Uporabljene vrste gliv…………………………………………. 6-7Preglednica II Preglednica najobsežnejših redov žuželk……………………… 11Preglednica III Izbira gojišča…………………………………………………... 36Preglednica IV Izbira posodice in načina zapiranja……………………………. 37Preglednica V Liofilizirani ekstrakti gob, uporabljeni v prvi seriji testiranja… 45Preglednica VI Liofilizirani ekstrakti gob, uporabljeni v drugi serija testiranja.. 45Preglednica VII Liofilizirani ekstrakti gob, uporabljeni v tretji seriji

testiranja……………………………………………………….. 45Preglednica VIII Količine vgrajenih inhibitorjev proteaz in laktozil specefičnih

lektinov………………………………………………………… 46Preglednica IX Teoretične koncentracije lektinov v gojiščih………………… 47Preglednica X Količine raztopin lektinov in zatehte sladkorjev, uporabljene v

testiranju insekticidnega učinka……………………………….. 48Preglednica XI Rezultati izbire gojišča………………………………………. 49Preglednica XII Izračunane povprečne mase bub………………………………. 49Preglednica XIII Rezultati izbire vrste posode in načina zapiranja za izvedbo

testiranj………………………………………………………… 50Preglednica XIV Dobljene mase po liofilizaciji dializiranih ekstraktov gob…….. 51Preglednica XV Primerjava koncentracij lektinov v vzorcih po treh metodah…. 59Preglednica XVI Učinkovitost liofiliziranih ekstraktov v 1. in 2. seriji……..…... 60Preglednica XVII Učinkovitost liofiliziranih ekstraktov v 3. seriji……………….. 61Preglednica XVIII Rezultati presejalnega testiranja proteaznih inhibitorjev in

laktozil specifičnih lektinov…………………………………… 62Preglednica XIX Učinkovitost insekticidnega delovanja lektinov v gojišču 6.….. 63Preglednica XX Učinkovitost insekticidnega delovanja lektinov v gojišču 7.….. 64Preglednica XXI Primerjava LD50 testiranih lektinov v gojiščih 6 in 7…………. 72Preglednica XXII Primerjava vpliva vsebnosti različnih saharidov v gojiščih 6

in 7……………………………………………………………. 73


KAZALO GRAFOV

Graf 1 Elucija laktozil specifičnih lektinov po afinitetni kromatografij.….…..... 52Graf 2 Elucija galaktozil, saharozil in glukozil specifičnih lektinov po afinitetni

kromatografiji……………………………………………………….…… 54Graf 3 Laktozil specifični lektini po gelski filtraciji.….…..…………….…….... 56Graf 4 Preliminarna ločba laktozil specifičnih lektinov na RP-HPLC………….. 57Graf 5 Ločba laktozil specifičnih lektinov na RP-HPLC.……………………..... 57Graf 6 Laktozil specifilčni lektini (A340-A240).…………………….……………. 59Graf 7 Insekticidni učinek v odvisnosti od vsebnosti liofilizata v gojišču……… 61Graf 8 Učinkovitost insekticidnega delovanja lektinov v gojišču 6…………….. 64Graf 9 Učinkovitost insekticidnega delovanja lektinov v gojišču 7…………….. 65

Lara Kandić: diplomska naloga Seznam okrajšav

SEZNAM OKRAJŠAV

A280 absorbanca (negativni logaritem prepustnosti) pri valovni dolžini 280 nmA340-240 absorbanca (negativni logaritem prepustnosti) med valovno dolžino 340 nm

in 240 nmACN acetonitrilBSA goveji serumski albumindH2O destilirana vodaEDTA etilendiamin tetraacetatIJS Inštitut Jožef StefanLMW low molecular weightNaAc natrijev acetatNIB Nacionalni inštitut za biologijoRP-HPLC reverse phase high performance liquid chromatographyRS relativna smrtnostSDS sodium dodecyl sulfateSDS-PAGE sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresisTFA trifluorocetna kislinaTRIS tris (hidroksimetil) amino metanVR variacijski razmik

Lara Kandić: diplomska naloga Povzetek

POVZETEK

Človek z razvojem znanosti skuša zadostiti naraščajočim življenjskim potrebam. Izmed njih

mora zagotoviti boljšo zaščito sebe in vrst, ki jih goji, povečati pridelek in s tem čim manj

škoditi okolju. Rastline in živali so se med evolucijo razvijale hkratiobrambne mehanizma

in rezistenco nanje, medtem pa človek skuša prevzeti kontrolo z uporabo pesticidov in

deugih metod. Med pesticidi zaradi zavedanja krhkosti zdravja nas in narave prihajajo v

ospredje biopesticidi, pri katerih posebno mesto zavzemajo proteini. Še neodkriti vir

biopesticidov predstavlja pozabljeno kraljestvo gliv.

Pri iskanju potencialnih bioinsekticidov smo pri delu uporabili vinsko mušico (Drosophila

melanogaster, Diptera) kot modelni organizem.

Iz kraljestva gliv smo liofilizirali 23 ekstraktov različnih predstavnikov podstavkovnic,

izmed katerih se jih je 6 izkazalo toksičnih za vinsko mušico pri nizki vsebnosti v gojišču.

Nobena izmed izbranih gob ni strupena za človeka, kvečjemu pogojno užitna ali neužitna.

Najbolj toksičen je bil liofilizat ekstrakta meglenke (Clitocybe nebularis).

Vinska mušica ima večino prebavnih proteaz serinskega katalitskega tipa, ustrezno temu so

različni inhibitorji serinskih proteaz dosegli različne insekticidne učinke. Najbolj toksičen

je bil inhibitor PI-2 iz krompirja, sledila sta mu CNSPI iz meglenke in PSPI iz krompirja.

Inhibitorji cisteinskih proteaz za vinsko mušico niso bili toksični.

Ekstrakt meglenke vsebuje tudi več lektinov z različnimi specifikami vezave saharidov,

katerim biološka funkcija ni znana. Izolirali smo jih pótem štirih afinitetnih kromatografij,

gelske filtracije in RP-HPLC.Za vezavo ne potrebujejo dvovalentnih kovinskih kofaktorjev.

Glukozil in saharozil specifična lektina sta čista, galaktozil in laktozil specifični lektini pa

sta mešanici treh proteinov. Izmed njih je bil za vinsko mušico najbolj toksičen laktozil

specifičen lektin z velikostjo 19 kDa, očiščen z RP-HPLC, nato mešanici galaktozil in

laktozil specifičnih lektinov. Glukozil specifični lektini nimajo insekticidnega učinka,

saharozil specifičnim lektinom pa ga je znižala gojišču dodana saharoza in koruzna moka.

Lara Kandić: diplomska naloga Abstract

ABSTRACT

Humans are, by developing sciences, trying to satisfy the increasing needs of life. Among

them we must insure better protection of ourselves and species we cultivate, enlarged food

production and cause minimal harm to the environment. Plants and animals have been

developing simultaneously through evolution, adapting to each other; meanwhile we are

trying to take control by the use of pesticides. Among them biopesticides are, due to health

awareness, gaining in importance, where proteins take special place. Yet uncovered source

of biopesticides is the forgotten kingdom of fungi.

We have used fruit fly (Drosophila melanogaster, Diptera) as a model organism in search

of potential bioinsecticides.

From the kingdom of fungi we have lyophilised 23 extracts of different representatives of

Basidiomycestes; among them we found 6 to be toxic to fruit fly present in a low

concentration in rearing medium. None of these 6 are toxic to humans, at the utmost

conditionaly edible or unedible. The most toxic was liophilised extract of a clouded agaric

(Clitocybe nebularis).

The fruit fly has most of its digestion proteases classified as serine type; corresponding to

that, different serine protease inhibitors exert different insecticidal effect. The most toxic

was PI-2 from a potato, followed by CNSPI from a clouded agaric and PSPI from a potato.

Inhibitors of cysteine proteases were not toxic to fruit fly.

Extract of the clouded agaric contains several lectins with different sugar specificities,

which biological function is not known. These proteins have been extracted by means of

affinity chromatography, gel filtration and RP-HPLC. They do not need two-valent metal

ions for sugar binding. Glucosyl and sucrosyl specific lectins were pure, meanwhile

galactosyl and lactosyl specific lectines were mixtures each consisitng of three proteins..

Among these lactosyl specific lectin 19 kDa, purified by RP-HPLC, was the most toxic to

fruit fly, followed by galactosyl and lactosyl specific lectins. Glucosyl specific lectin did

not show any insecticidal effect. Sucrosyl specific lectin has had lowered insecticidal effect

when sucrose or corn meal were added to rearing medium.

IX

Lara Kandić: diplomska naloga I Uvod

UVOD

Človeška civilizacija je vzklila s prvim semenom, ki ga je naš davni prednik načrtno

posadil, negoval in obral njegove plodove. Od prve kultivacije dalje se je po drobnih

korakih razvijalo varstvo rastlin pred škodljivci, pleveli in boleznimi, ki vplivajo na

pridelek kmetijskih rastlin. Naravna odpornost rastlin je zasnovana na različnih obrambnih

mehanizmih fizikalne ali biokemijske narave. Skozi tisočletja smo z izbiro in križanjem

določenih rastlinskih vrst pridobili poljščine, ki večkrat presegajo prinos izhodiščnih vrst.

Vendar se je s tem pri mnogo katerih izgubila odpornost pred naravnimi plenilci in

zajedavci. Prvi znani pesticid je bilo elementarno žveplo, uporabljeno pred 4500 leti pri

Sumercih [1]. Od takrat se je spekter počasi širil, do odkritij organske sintezne kemije in

masovne uporabe pesticida DDT, vendar so kmalu ugotovili kopico njegovih neželenih

posledic za okolje. V zadnjih letih se srečujemo z vse večjim zavedanjem javnosti o

zdravju, varnosti hrane in varovanju okolja. Biopesticidi v širšem smislu pridobivajo

pomen kot alternativa kemičnim pesticidom. V splošnem so manj toksični in se pogosto

hitro razgradijo. V nasprotju s kemičnimi pesticidi širokega spektra, ki lahko vplivajo

direktno in/ali indirektno na zelo različne organizme (žuželke, ptice in sesalce), običajno v

majhnih količinah delujejo le na tarčnega škodljivca. Vir biopesticidov so živali, rastline,

bakterije in nižje glive, medtem ko so produkti višjih gliv ali gob (bazidiomicet), tako

sekundarni metaboliti kot tudi druge sestavine celic, proteini in polisaharidi, v tem pogledu

manj raziskani.

1Glive

V kraljestvu gliv najdemo mnoge pomembne organizme, tako po njihovi ekološki kot

ekonomski vlogi [2]. Od preostalih evkariontov se na edinstven način razlikujejo v načinu

prehranjevanja, strukturni organiziranosti, rasti in razmnoževanju. Opisanih je približno

100.000 vrst gliv, nekateri pa ocenjujejo, da naj bi obstajalo vsaj 1.5 milijona različnih vrst

[3]. So simbiotski organizmi nekaterim rastlinam, vir tako zdravilnih učinkovin kot strupov,

vzrok prenekaterim obolenjem rastlin, živali ter ljudi in hkrati nepogrešljivi del prehranske

industrije in številnih raziskav [2]. Glive so še vedno neizčrpan vir učinkovin, izmed

insekticidnih najdemo insekticidne antibiotike, sekundarne metabolite, proteaze, inhibitorje

proteaz, lektine, druge toksine itd.

1


Splošne značilnosti gliv

Glive so enocelični, koenocitični in večinoma večcelični evkariontski heterotrofni

organizmi. Celice gliv so obdane s celično steno, katere osnovne gradbene enote so, razen

redkih izjem, hitin (β-1,4 homopolimer N-acetilglukozamina v kristaliničnem stanju) in

glukani (α-1,3 in β-1,6 vezi). Nekatere vrste iz debla Ascomycota (Ophiostomataceae)

imajo celulozo v celičnih stenah, določeni člani debla Chytridiomycota pa sten sploh

nimajo (Coelomomycetales).

Z izjemo enoceličnih gliv, kot so na primer kvasovke, vegetativno obliko večine gliv

sestavljajo nitasti nizi celic (hife), ki imajo v premeru 5 do 10 μm. Vedno se delijo samo

končne celice vsake hife, kar omogoča dolžinsko rast glive. Posamezne hife se vzdolžno

povezujejo in tvorijo micelij, ki ima lahko premer tudi po nekaj kilometrov kar pomeni, da

njegovi začetki lahko segajo pred naše štetje [3]. Celice hif so brez plastidov in klorofila,

med njimi pa je celična stena z večjimi porami (septa) kar omogoča pretok ribosomov,

mitohondrijev in celo jeder med celicami. Glive so v glavnem negibljive, nekatere nižje

glive pa tvorijo gibljive spore za razmnoževanje in razširjanje. Razmnoževanje poteka na

spolni ali nespolni način s sporami, ki se ponavadi raznašajo s pomočjo vetra ali vode. Pred

združevanjem pri spolnem razmnoževanju posamezne glive komunicirajo z drugimi preko

feromonov [4].

Vse glive za energijo in sintezo celičnih sestavin potrebujejo organske snovi, ki jih

pridobivajo z absorpcijo hranil iz svojega okolja: enostavnih topnih hranil (sladkorji,

aminokisline) in z izločanjem encimov za razgradnjo polimerov, ki jih niso sposobne

absorbirati, in tako prispevajo svoj delež v ciklusu kroženja snovi v naravi. Energijo

pridobijo po dveh metabolnih poteh, pri dihalni verigi in/ali fermentaciji.

Vloga gliv v ekosistemih in gospodarstvu

Dinamika ekosistemov je v veliki meri odvisna od gliv. Glive so običajno najpomembnejši

razgrajevalni organizmi v svojih naravnih habitatih in s tem v okolje vračajo anorganska

hranila, nujna za rast rastlin in posledično preživetje živali, ki se hranijo z njimi, ter tako

zaključijo cikel kroženja snovi v naravi [3].

Mnoge vrste so prostoživeči saprofiti (uporabniki ogljika, ki ga proizvedejo drugi

organizmi) v lesu, zemlji, odpadlem listju, mrtvih živalih in živalskih eksudatih. Glive so se

predvsem dobro prilagodile na razgrajevanje rastlinskega materiala. Njihove hife vstopijo v

tkiva in celice mrtvega materiala ter z izločanjem zunajceličnih encimov povzročijo

2


hidrolizo polimerov, najpogosteje sta to celuloza in lignin, pri nekaterih vrstah tudi hitin.

Številne druge vrste gliv so biotrofi. Simbionti, kot so lišaji, mikorize, endofiti na listih in

steblih, uspešno sodelujejo z rastlinami (vključno z algami), živalmi (predvsem artropodi)

in prokarionti [5].

Rje, sneti in mnoge askomicete so najpomembnejši rastlinski patogeni. Glive napadejo med

10 in 50 % vsakoletnega pridelka sadja, kar povzroča veliko ekonomsko škodo človeku.

Živali in ljudje so manj občutljivi na parazitne glive, čeprav so lahko infekcije z njimi

precej resne. Ljudje obolevajo za boleznimi kot so blastomikoze, histoplazmoze, alergije,

kriptokokoze in podobnimi. Oportunistični patogeni, kot je kandida (Candida albicans), ki

so normalno prisotni v človeku, postajajo pomembna skupina življenjsko nevarnih

človeških patogenov zaradi povečanja števila bolnikov z zmanjšano imunsko odpornostjo

(npr. oboleli za virusom HIV), ter vedno večjega števila opravljenih transplantacij.

Določene glive izločajo snovi, ki so toksične za človeka (npr. Claviceps purpurea). Toksini

so po drugi strani lahko v majhni količinah uporabni v medicinske namene, kot so na

primer ergot spojine pri zaustavljanju krvavitve pri porodu. Med sekundarnimi metaboliti

so za farmacijo pomembni antibiotiki (penicilini, cefalosporini, grisoefulvin in drugi),

učinkovine za zniževanje holesterola (lovastatin) in imunosupresivne učinkovine

(ciklosporin A) [4].

Glive imajo velik pomen v vsakodnevnem življenju človeka. Z gobami se prehranjuje

večina ljudstev, številne glive pa se izkorišča pri procesiranju hrane in izboljšanju okusa

(kvasovke in njihova sposobnost fermentacije v pekarstvu, pivovarstvu in vinarstvu; vrsta

Penicillium in druge pri izdelavi sira). Sekundarni metaboliti (etanol, organske kisline,

encimi) pa so našli svojo uporabnost v industriji. Z razvojem tehnik genskega inženirstva je

postalo mogoče pridobivati tudi heterologne rekombinantne hormone in proteine iz gliv,

predvsem kvasovk [4].

Filogenetska razvrstitev gliv

Ugotavljanje natančne filogenetske zgodovine gliv je zaradi nizkega števila fosilov težavno

[2]. V preteklosti so obstajale različne intrepretacije, osnovane le na morfoloških lastnostih

obstoječih gliv, predvsem na obliki micelija in načinu spolnega razmnoževanja. Zaradi

razvoja molekularnih tehnik (npr. analize genov male podenote ribosomalne RNA, visoko

ohranjenih proteinov, kot sta tubulin in aktin) so se hipoteze o filogeniji posameznih skupin

gliv radikalno spremenile. Nekateri taksonomski sistemi delijo glive na prave glive

3


(Eumycota) in na glive sluzavke (Myxomycota). Glive sluzavke se pogostje štejejo k

praživalim (Protozoa). Blackwell, Vigalys in Taylor so modificirali razdelitev gliv (Fungi)

po Burnsu in sod. na debla Zygomycota, Chytridiomycota, Glomerulomycota, Ascomycota

in Basidiomycota [4]. Znotraj posameznih debel se razdelitev vrst in poimenovanje nižjih

taksonov razlikujejo med različnimi avtorji.

Slika 1: Delitev gliv na debla

Deblo Zygomycota

Zigomicete so večinoma zemeljski saprofiti mikroskopskih velikosti, nekatere med njimi so

simbionti, druge pa paraziti, patogeni živali, rastlin in drugih gliv. Zaradi njihove

patogenosti za insekte jih proučujejo v namene biokontrole nekaterih škodljivcev (npr.

škržata). Tipično steljko zigomicet predstavlja dobro razvit, razvejan micelij brez predelnih

sten (aseptati), kar jih uvršča med koenocitične glive. Poznane so vrste, ki imajo večcelični

micelij, oziroma obstajajo v dveh vegetativnih oblikah: enocelična oblika oziroma micelij.

Iz tega debla so izločili arbuskularne mikorizne glive (Glomales) in jih uvrstili v ločeno

deblo Glomerulomycota. Red Entomophthorales vsebuje več entomopatogenih vrst gliv [4].

Deblo Chytridiomycota

Kritidiomicete so zemeljske in predvsem vodne saprotrofne ali parazitne glive. Steljka je

pri nekaterih vrstah enocelična, v obliki vrčka (polnega še nesproščenih zoospor) pri drugih

pa koenocitičen micelij, ki ima s septo ločene le reproduktivne strukture. Spolno

razmnoževanje poteka s fuzijo gibljivih gamet; nespolno pa s citoplazemsko delitvijo

sporangija, pri čemer nastanejo gibljive zoospore z enim bičkom. Celična stena je iz hitina,

čeprav najdemo tudi steno iz celuloze [6, 7].

4

EVKARIONTI

GLIVE

zigomicete

kritidiomicete

bazidiomicete

glomerulomicete

askomicete

listarice

nelistarice

trebuharice

RASTLINE

ŽIVALI

podstavkovnice

razdelkovnice


Deblo Glomerulomycota

Članice tega debla so arbuskularne mikorizne glive, obligatorni simbionti. S posebnimi,

arbuskularnimi izrastki na neseptiranih (koenocitičnih) hifah iz simbiontske rastline

absorbirajo ogljikove hidrate. V zameno delujejo kot razširjen koreninski sistem in

simbiontski rastlini povečajo možnost privzema potrebnih mineralov. Do sedaj niso našli

spolne oblike razmnoževanja teh gliv, nespolno pa tvorijo velike večjedrne spore, ki ob

ugodni pogojih vzklijejo in poiščejo novega mikoriznega simbionta [4].

Deblo Ascomycota

Zaprtotrosnice (Ascomycota) so zemeljski saprofiti ali paraziti, za katere je značilen

nastanek askospor v askusu. So tudi simbionti z algami (lišaji) in rastlinami (mikorize,

endofiti). Rastejo v obliki razvejanih hif s predelnimi stenami (septa), znani so tudi nekateri

enocelični organizmi in dimorfne vrste [4].

V tem deblu so odkrili entomotoksičen red Hypocreales. Glivo iz tega reda (Metarhizium

anisopliae) so modificirali tako, da izloča večjo količino toksičnih proteaz in na tak način

hitreje ubije gostiteljske insekte. V tej vrsti so našli nekaj insekticidnih antibiotikov; med

drugimi zaprtotrosnicami jih kar nekaj skriva tudi vsem znan Penicillium [8, 10].

Deblo Basidiomycota

Odprtotrosnice (Basidiomycota) so tipični zemeljski saprofiti ali paraziti, ki tvorijo

bazidiospore na bazidiju. Delijo se na dva razreda: podstavkovnice (Basidiomycetes) in

razdelkovnice (Heterobasidiomycetes). Med njih sodijo gobe, rje in sneti. Redke

bazidiomicete so vodni organizmi. Steljko predstavlja dobro razvit micelij iz hif s

predelnimi stenami. Nekatere odprtotrosnice lahko obstajajo v enocelični fazi, številne vrste

oprtotrosnic pa razvijejo plodišča, ki so sestavljena iz beta in klobuka (gobe) [3]. V

nekaterih družinah bazidiomicet so našli tripsinske [11] in cisteinske inhibitorje [12].

Vse gobe, uporabljene v diplomskem delu, so iz debla odprtotrosnic.

Uporabljene vrste gliv

Pri delu smo uporabili gobe, ki se lahko najdejo na različnih področjih Slovenije. Med

njimi so nekatere užitne, druge strupene, v kolikor se znajdejo na našem jedilniku. Iz debla

odprtotrosnic smo pokrili vse podrazrede podstavkovnic: listarice (Agaricomycetideae),

nelistarice (Aphyllophoromycetideae) in trebuharice (Gasteromycetideae). Glavne lastnosti,

navedene v preglednici I, so povzete po dveh virih [13, 14].

5


Preglednica I: Uporabljene vrste gliv

podrazred: AGARICOMYCETIDEAE (Listarice)rod glavne lastnosti in zanimivosti

red

družina

Agaricales(listarji)Agaricaceae(kukmarke)

Agaricus(kukmaki)

Agaricus campestris, travniški kukmak

◦ užiten, vonj mil, okus prijeten◦ raste pozno pomladi in konec poletja◦ prvi hemaglutinin odkrit leta 1966 [15]◦ hipoglikemično delovanje [16]

Macrolepiota (dežniki)

Macrolepiota procera, orjaški dežnik

◦ užiten paniran◦ raste v gozdovih in na gozdnih

travnikih, od sredine poletja do pozne jeseni

◦ znan po visoki vsebnosti kovinred

družina

Boletales(cevarji)Boletaceae(cevarke)

Boletus (gobani)

Boletus calopus, leponogi goban

◦ neužiten, zelo grenak, vonj kiselkast ◦ pogosto ga najdemo v gozdovih◦ vsebuje δ-laktone, lovilce prostih

radikalov [17]Suillus(lupljivke)

Suillus granulatus, ovčarska lupljivka

◦ užitna, vonj mil, okus prijeten ◦ raste pod bori, mikorizna goba◦ vsebuje antioksidantne fenole [18]◦ vsebuje protitumorne substance [19]

red družina

Cortinariales(koprenarji)Cortinariaceae(koprenarke)

Cortinarius(koprenke)

Cortinarius caerulescens, višnjeva koprenka

◦ užitna, vonj neznaten, okus prijeten ◦ raste v senčnatem bukovem gozdu◦ koprenke so najobsežnejši rod gob

Cortinarius glaucopus, kolobarniška koprenka

◦ užitna, vonj neizrazit, včasih nekoliko neprijeten, okus mil

◦ raste pod iglavci, zlasti v gorskem svetu

Hebeloma(medlenke)

Hebeloma radicosum, korenasta medlenka

◦ pogojno užitna, vonj po mandljih, mil vendar grenkoben okus

◦ raste v listnatih gozdovih od poletja do pozne jeseni

Hebeloma sinapizans, redkvičasta medlenka

◦ strupena, vonj po repi, okus grenak◦ raste pod različnim drevjem, od poletja

do pozne jeseni◦ vsebuje citotoksične spojine [20]

red

družina

Russulales(golobičarji)Russulaceae(golobičarke)

Lactarius(mlečnice)

Lactarius deliciosus, užitnasirovka

◦ užitna, vonj kiselkast, okus oster◦ raste pod bori (mikorizna goba), tudi

brini◦ okarakteriziran lektin LDL (O-eritrociti),

domnevno sodeluje pri razvoju mikoriz [21]

Lactarius cilicioides, kocasta mlečnica

◦ neužitna, ostrega okusa ◦ raste v listnatih gozdovih na

apnenčastih tleh

Lactarius piperatus, poprova mlečnica

◦ pogojno užitna, vonj po kruhu, okus pekoč

◦ raste v senčnih in vlažnih gozdovih◦ vsebuje cis-poliizoprene [23]

Lactarius scrobiculatus, jamičasta mlečnica

◦ pogojno užitna, vonj po sadju, okus pekoč

◦ raste pod iglavci, poleti in jeseni◦ vsebuje norlaktaranske in laktaranske

6

http://www.gobe.si/Mikologija/Macrolepiota

http://www.gobe.si/Mikologija/Macrolepiota


seskviterpene [24]Russula (golobice)

Russula albonigra, črnjava golobica

◦ neužitna, vonj rahel, okus grenak in pekoč

◦ raste predvsem v bukovih gozdovih

7


Nadaljevanje preglednice I: Uporabljene vrste gliv

podrazred: AGARICOMYCETIDEAE (Listarice)rod vrsta glavne lastnosti in zanimivosti

red

družina

Tricholomatales(kolobarničarji)Hygrophoraceae(polžarke)

Hygrophorus(polževke)

Hygrophorus pudorinus, hojeva polževka

◦ užitna, vonj in okus po smoli◦ raste pod smrekami in jelkami◦ rod vsebuje higroforone, fungicidne

ciklopentanone [25]red

družina

Tricholomatales(kolobarničarji)Tricholomataceae(kolobarničarke)

Armillaria(mraznice)

Armillaria mellea, sivorumena mraznica

◦ pogojno užitna,vonj neprijeten,okus kisel ◦ raste na štorih kot gniloživka/zajedavka◦ znana tudi pod imenom prava štorovka ◦ vsebuje fibrinolitični proteazo AMMP

[26]Clitocybe (Livke)

Clitocybe geotropa poznalivka

◦ užitna, močen vonj po sivki ali grenkih mandeljnih, okus mil

◦ raste jeseni na gozdnih jasah v obročih◦ v Franciji našli obroč s premerom

600 mClitocybe nebularis, poprhnjena livka

◦ znana pod imenom meglenka; gobo smo podrobneje raziskali v diplomskem delu, zato ji je posvečenih več besed v poglavju 1.4.1.1

Lepista (kolesnice)

Lepista nuda vijoličasta kolesnica

◦ pogojno užitna, vonj aromatičen in okus◦ raste jeseni v iglastih gozdovih◦ MeOH ekstrakt deluje protimikrobno

[27]◦ sveža dobre antioksidantne lastnosti [28]◦ našli so lektin,ki ga inhibira galaktoza

[29]Tricholoma(kolobarnice)

Tricholoma bufonium, krastačja kolobarnica

◦ strupena, vonj po acetilenu, okus mil◦ raste jeseni v listnatih gozdovih◦ definirajo jo kot infraspecifično

varianto T. sulphureum [30]

podrazred : APHYLLOPHOROMYCETIDEAE (Nelistarice)rod vrsta glavne lastnosti in zanimivosti

red

družina

Cantharellales(lisičkarji)Clavariaceae(kijarke)

Ramaria(grive)

Ramaria formosa,Lepagriva

◦ strupena, vonj nezaznaven, okus kiselkast in grenkoben

◦ raste pod listavci poleti in jeseni◦ toksine uvrščajo med gastroiritante

red

družina

Telephorales(bodičarji)Bankeraceae(bodičarke)

Sarcodon (ježevci)

Sarcodon imbricatus, rjaviježevec

◦ užitna, okus kiselkast in grenkoben◦ raste v iglastih in mešanih gozdovih◦ vsebuje antioksidante (fenolne spojine)

[31]

podrazred: GASTEROMYCETIDEAE (Trebuharice)rod vrsta glavne lastnosti in zanimivosti

red

družina

Lycoperdales(trebuharji)Geastraceae(zvezdarke)

Geastrum(zvezdice)

Geastrum sessile, resasta zvezdica

◦ neužitna, ◦ raste jeseni v gozdu◦ imenujejo jo tudi Geastrum

fimbriatum [32]red

družina

Lycoperdales(trebuharji)Lycoperdaceae

Lycoperdon(prašnice)

Lycoperdon perlatum, betičasta

◦ mlada užitna, prijetnega okusa in vonja ◦ raste v gozdovih od pomladi do pozne

jeseni

8

http://www.gobe.si/Mikologija/Tricholomataceae

http://www.gobe.si/Mikologija/Hygrophoraceae


(prašničarke) prašnica

9


Gobe, uporabljene v poskusih, so iz osmih od dvanajst redov podstavkovnic. Iz nekaterih so

izolirali spojine, katerim učinke še odkrivajo, pri drugih so učinek opazili in še iščejo

učinkovine. Največ je takšnih, katere še čakajo, da jih sploh opazijo.

Meglenka

Clitocybe nebularis, meglenka ali poprhnjena livka, spada v rod lisičark oziroma livk

(Agaricales), družino kolobarnic (Tricholomataceae). Ima mesnat klobuk, pokrit s polsteno

kožico, ki jo zlahka olupimo. Klobuk je pogosto ugreznjen v obliki lija z gladkim,

spodvihanim robom, pepelnato ali sajasto sivkast in belkasto poprhnjen. Pod klobukom so

tanki lističi, kjer so tudi bazidiji. Nima ovojnice niti obročka. Vonj je močan in aromatičen,

malce neprijeten, po okusu pa je kiselkasta. Je užitna, vendar lahko povzroča prebavne

motnje. Najdemo jo od poznega poletja do začetka zime na apnenčastih tleh, pri nas

predvsem na Krasu in Istri, na preperelem listju v listnatih in mešanih gozdovih [13, 14].

Leta 1977 so iz nje izolirali lektin, specifičen za N-acetil-α-D-galaktozamin (BI), že leta

1953 pa so že poročali o anti-A1 fitoaglutininu [34]. Slabih 50 let pozneje so iz nje izolirali

nov inhibitor serinskih proteaz CnSPI (Clitocybe nebularis serine protease inhibitor),

odkrili pa so tudi člana nove družine inhibitorjev cisteinskih proteaz, klitocipin [12, 35].

Slika 2: Clitocybe nebularis (foto Slavko Šerod [13])

10


2Žuželke

Izmed 1,2 milijona znanih vrst nevretenčarjev je 950,000 žuželk [37]. Vsako leto popišejo

7000 novih vrst, napovedujejo pa do 50 milijonov vrst vseh žuželk, za zdaj razvrščenih v

30-35 redov, odvisno od avtorjev. Prevladujejo na kopnem, tudi v sladkih vodah (hrošči,

stenice in larve nekaterih vrst). So izjemno prilagodljive: našli so primerke na gorskih

vrhovih, v naftnih mlakah in slanih jezerih.

Splošne značilnosti žuželk

Telo žuželk je sestavljeno iz glave, oprsja in zadka, z zunanje strani utrjeno z hitinskim

ogrodjem. Obustne okončine so iz treh delov (mandibula, maksila in labium) in sestavljajo

grizalo, sesalo (npr. Lepidoptera), lizalo-sesalo ali bodalo-sesalo (npr. Diptera). Za vse

redove so značilni trije pari nog na, po en par vsakem izmed treh delov oprsja. V zadku je

večji del respiratornega sistema (pri večini trahealni - dihalnice), ekskretorni sistem

(Malpighijeve cevke), prebavila in reproduktivni organi. Uporabljajo skoraj vse vire hrane,

večinoma so herbivori, veliko je karnivor, poznamo tako simbiozo kot parazitizem.

Krvožilje je odprt sistem, srce (perforirana mišična cev) prečrpava hemolimfo, zadolženo

za transport hranil; za izmenjavo plinov zadostuje trahealni sistem, ki je po drugi strani

eden omejitvenih dejavnikov velikosti žuželk . Živčni sistem sestavljajo trebušna nevralna

vrvica in centralni gangliji v glavi. Oči so glavno

čutilo in so direktno povezane z optičnim centrom.

S tipalnimi organi zaznavajo premikanja zraka in

vibracije (zvok), preko katerih medsebojno

komunicirajo (fonoreceptorji). Zvok ustvarjajo z

vibriranjem ali potrkavanjem zadka ob podlago ali s

specializiranimi organi (red Orthoptera, kobilice):

z drgnjenjem kril, mandibul ali zadnjega para nog.

Premikajo se z letenjem, hojo, nekatere še s plavanjem. 90% vseh žuželk je krilatih, kar je

bila bistvena prednost pri osvajanju kopna pred 350 milijoni let (konec devona) in

razširjanju na velike razdalje [37]. Večina jih ima dva para kril, pri nekaterih (npr. pri

muhah (Brachycera)) je drugi zakrnel v organa imenovana utripači. Njuna naloga je pomoč

pri krmiljenju in omogoča lebdenje na mestu, neverjetno hitre obrate in boje v zraku [38].

Žuželke se razmnožujejo spolno. Iz oplojenih jajčec se izležejo larve (ovivoparno, redko

vivoparno), ki se hranijo in prestanejo več levitev, katere uravnavajo juvenilni hormoni,

11

Slika 3: Shema žuželke, Piotr Jaworski [CB]


nato se zabubijo. Nimfe so larve, podobne odraslim pripadnikom vrste z manjkajočimi krili,

larve, ki pa so po obliki drugačne od odraslih, pa skozi razvojne faze prestanejo popolno

metamorfozo [3, 37].

Vloga žuželk v ekosistemu

Mnoge žuželke uvrščajo med škodljivce, saj so zajedavci (komarji, uši), uničujejo strukture

(termiti), ter uničujejo kmetijske pridelke (kobilice) [37]. So prenašalke številnih bolezni:

Siphonaptera (kuga, tifus, salmoneloza); Phthiraptera (tifus, mrzlica); Diptera (malarija,

griža, kolera, spalna bolezen, denga virus, mrzlice). Samo diareja vzame dnevno osem tisoč

življenj, SARS pa jih je v celem letu petsto. Malarija je leta 1998 odnesla dober milijon

človeških življenj, več kot rak prostate in dojk, melanom in levkemija skupaj [39]. Mnoge

žuželke imajo takšne reprodukcijske sposobnosti, da bi v eni sezoni lahko dobesedno

prekrile vso Zemljo, vendar jim to preprečujejo njihovi naravni plenilci (druge žuželke -

insektivori, ptiči). Entomofagija, prehranjevanje z žuželkami, rešuje lakoto v nemalo

državah, saj so skoraj neomejen vir beljakovin. Posušene in pomešane z različnim

rastlinjem, so za domorodce Avstralije in Amerike pomenile zdravo in uravnoteženo

prehrano v najneprijaznejših obdobjih. V koevoluciji z rastlinami so herbivorne žuželke ali

širile nabor prehranskih rastlin ali pa so specializirale prehrano le na nekatere vrste; ta

specializacija je vključevala tudi razvoj rezistence na obrambne mehanizme rastlin. Le-te

pa so v nekaterih drugih žuželkah našle obligatorne partnerje: žuželke ob nabiranju nektarja

prenašajo pelod žužkocvetk. 80 % kmetijskih rastlin je žužkocvetk, kar nas dodatno

opozarja na pomembnost selektivne toksičnosti insekticidov [3, 37].

Filogenetska razvrstitev žuželk

Žuželke so razred v poddeblu šesteronožnih členonožcev (Hexapoda). Nadalje jih delijo v

podrazrede, infrarazrede in nadrede. Apterigota so primarno nekrilate žuželke (pražuželke),

ki združuje štiri rede: skakače, proture, dvorepke in ščetinorepke. V zadnji red spadajo t.i.

srebrne ribice (Lepismatide). Pterigota, primarno krilate žuželke, lahko zaradi načina

življenja izgubijo krila (mravlje, uši, bolhe). Le-te delijo najprej na hemimetabolne in

holometabolne in dalje na več redov. V preglednici II so našteti so le najštevilnejši redovi

glede na število vrst in predstavniki, znani večini iz vsakdanjega življenja. Ocenjujejo, da

letno izumre 1000 vrst žuželk iz različnih razlogov (npr. pomanjkanje hrane zaradi

podnebnih sprememb in posegov človeka v okolje); izumrli so tudi že številni redovi [37].

12


Preglednica II: Preglednica najobsežnejših redov žuželk [37]

red slovensko ime ocenjeno št. vrst predstavnikiAnoplura uši 2.400 naglavna ušColeoptera hrošči 500.000 koloradski hrošč, pikapolonicaDiptera dvokrilci 120.000 vinska mušica, navadna muhaHemiptera stenice 55.000 veliki škržat, šuštarji, trtna ušHymenoptera kožokrilci 100.000 čebele, ose, čmrljiIsoptera termiti 2.000 mravlje, faraonke, termitiLepidoptera metulji 180.000 metulji, moljiOdonata kačji pastirji 5.000 prodni modračOrthoptera ravnokrilci 30.000 kobilice; primorska plenilkaSiphonaptera bolhe 2.000 pasja bolha, človeška bolha

Vinska mušica

Drosophila melanogaster je žuželka iz reda dvokrilcev (Diptera) oziroma pravih muh.

Zanje so značilni trije pari nog, en par kril, sesajoči, prebadajoči ali ovijajoči ustni deli ter

popolna metamorfoza. Vrsta izhaja iz vlažnih tropskih predelov, s človekom pa se je

razširila in prilagodila na številna druga okolja. Naseljuje skoraj vso Zemljo, z izjemo

Antarktike, puščav, visokih hribov in gora. Hrani se prvenstveno s sadjem, lahko pa tudi z

lesom, gobami, cvetjem ipd. Pri nas je srečamo največ jeseni, posebno v sadovnjakih in

vinogradih. Sama po sebi je neškodljiva, vendar lahko v velikih količinah nanese kar nekaj

škode v agronomiji [40, 41].

Vstopnica v raziskovalne laboratorije

Za mnoge je neprecenljiv modelni organizem za raziskave na področju biologije, predvsem

genetike in razvojne biologije. V laboratorijih je že skoraj celo stoletje, odkar je T. H.

Morgan razširil veljavnost Mendelejeve teorije kromosomskega dedovanja na živalski svet

[40]. Njene bistvene prednosti so kratek življenjski ciklus (povprečno v dveh tednih je nova

generacija spolno zrela), veliko število potomcev (ena samica odloži do 500 jajčec) in

relativna enostavnost in nezahtevnost gojenja v laboratorijskih pogojih [3]. Njeni 4 pari

kromosomov, sestavljenih iz približno 132 milijonov baznih parov, so bili sekvencionirani

že leta 2000. Genetsko smo ljudje kar v 44% podobni vinski mušici, 61% naših genskih

bolezni se razpoznavno ujema v njenem genskem zapisu. Uporablja se jo kot raziskovalni

model za nekatera človeška obolenja, npr. Parkinsonovo, Alzheimerjevo in Huntingtonovo

bolezen. Vpeljana je tudi v študije diabetesa, raka in mehanizmov imunskega odziva [40].

13


Opis prve mutacije, ki je vplivala na obnašanje živali, je bila mutacija v genu t.i. biološke

ure, ki nadzoruje dnevne aktivnosti vinske mušice. Čeprav je gen prisoten v mnogih

celicah, so nosilne nevronske celice v centralnem živčnem sistemu. Od takrat so našli gene,

ki so vpleteni v vid, voh, sluh, učenje/spomin, bolečino, dvorjenje idr. Na področju

nevrologije, embriologije in razvojne fiziologije so na vinski mušici poglobili marsi katera

spoznanja [40].

Življenjski ciklus vinske mušice

Zrela samička (8-12 ur po prvem vzletu) se pari z večimi samčki in semenčeca hrani v sebi.

Po oploditvi oocita poteče 13 jedrnih delitev (nastane 5000-6000 uporabnih jeder),

citoplazma se deli šele pri zadnji. Samička odloži jajčeca na ugodno gojišče, ki je za večino

pripadnikov te vrste rahlo gnilo ali

načeto sadje. Odložena jajčeca (velika

do 0,5 mm) se v 12-15 urah oblikujejo

v larve. V tej fazi je pomembna izbira

in obdelava jajčec za uporabo v

genetskih raziskavah. Larva se pri

optimalnih pogojih (primerna hrana,

25°C) 4 dni neprestano hrani ter trikrat

levi. Naslednja razvojna stopnja

mušice je nastanek bube, ki se

praviloma nahajajo na bolj suhih

predelih. V laboratoriju je to stena

posode nad gojiščem, v naravi pa bodisi na zunanja stran sadne lupine ali okolica sadeža

(listje, prst), odvisno od vlažnosti okolja. Po 4-5 dneh se iz bube izleže muha, ki aktivno

preživi do 30 dni z izjemami v diapavzi. Na življenjski ciklus vinske mušice ima poleg

dostopnosti hranil še večji vpliv temperatura. Omenjena parametra vplivata tako na velikost

kot na preživetje larv. Najkrajši čas razvoja iz jajčeca do muhe so opazili pri 28°C (7 dni),

ki se pa podaljšuje z dvigom ali spustom temperature (30°C - 11dni, 18°C - 19 dni, 12°C

čez 50 dni). Če je gojišče (sadež) prenaseljeno, se razvojni čas podaljša, prav tako tudi če je

hranil v gojišču malo; izležene mušice so manjše [40, 43]. Prilagoditev je šla tako daleč, da

so na istem kontinentu našli razlike med prehranjevalnimi navadami in celo izraženimi

encimi glede na zemljepisno širino [44]. Pričakovano obstajajo razlike med encimi glede na

14

Slika 4: Življenjski ciklus vinske mušice, [42]


naravno dostopno hrano. V poskusih, kjer so gojili več generacij mušic na gojiščih, ki so se

razlikovala v vsebovanem viru ogljikovih hidratov (škrob in maltoza), so opazili razlike pri

izbiri partnerjev in frekvenci parjenja glede na izhodiščno gojišče. Samičke s škrobovih

gojišč so trikrat pogosteje parile s samčki s škrobovih gojišč, podobno je veljalo za mušice

z gojišč z maltozo. Medtem pa v kontrolnih skupinah ni bilo razlik med frekvenco v

parjenju med mušicami z istega gojišča, kljub temu, da so izhajale iz različnih matičnih

populacij, kar dokazuje zmožnost hitrega prilagajanja in nastajanja razlik med mušicami

glede na nova okolja [3] Vinska mušica živi, kjer jé. Spremembe se odražajo tako v

genotipu kot v fenotipu. Mušice, ki so naselile višje zemljepisne širine, so se prilagodile na

nižje temperature in celo prezimijo v vseh razvojnih oblikah z vstopom v diapavzo (fizična

in metabolna znižanost). Najbolj enostavna rešitev je preživetje zime v kleteh ali drugih

prostorih, kjer ljudje hranijo sadje in drugo zanje primerno hrano [41].

Gojenje vinske mušice

Naravno okolje za razvoj in prehrano vinske mušice predstavlja sadje, ki vsebuje od 10 do

20% ogljikovih hidratov, od 0,2 do 0,4 % maščob in od 0,3 do 1,7% proteinov [45].

Za gojenja vinske mušice se uporabljajo različna gojišča, v katerih najpogosteje najdemo

agar, kvas in/ali ekstrakte kvasa, moko (koruzno, sojino), saharide in konzervanse [46].

Nipagin (10% raztopina para-metilhidroksibenzojske kisline v 96% etanolu) in ponekod še

propanojska kislina sta standardno dodajana gojišču za zaščito pred razvojem plesni in

bakterij, ki so normalno prisotne v okolju. Za dosego ponovljivosti se poskusi izvajajo v

inkubatorju (znana temperatura, vlažnost), nekateri celo simulirajo izmenjavo dan/noč, če

enak poskus traja več mesecev. V večini raziskav z vinsko mušico ni pomembna količina in

konsistenca gojišča, saj je znano, da so jajčeca zmožna preživeti obdelavo in se nato izvaliti

v larve tudi v izjemno neugodnih pogojih (natrijev hipoklorit - varikina, organska topila) in

se nato v ustreznem hranilnem gojišču razviti v odrasle mušice. V genetskih raziskavah se

ne šteje številčno preživetje vseh odloženih jajčec, kajti le-te se pred vnosom spremembe

(povzročitev mutacije, genski material) izbere in obdela. Opazujejo razvojne stopnje, vpliv

mutacij, analizirajo izolati ipd. Sicer pa je viabilnost v različnih stadijih gotovo pomemben

podatek pri novih mutacijah. Kljub impresivnemu spektru odkritij, je malo znanega o

pristnih potrebah, družabnih navadah in ekoloških kontekstih življenja vinske mušice;

mogoče bi s tem lažje razumeli tudi naše skozi evolucijo razvite nevrološke poti [44].

15


3Insekticidi

Insekticidi spadajo med pesticide, fitofarmacevtska sredstva, bodisi spojine bodisi

kombinacijo spojin, ki na različne načine preprečijo uničujoče delovanje ali ubijejo

škodljivce, v našem primeru žuželke. Približno 10.000 vrst žuželk od skoraj milijona se

prehranjuje z rastlinami, ki jih človek goji za prehrano. Insekticidi delujejo proti vsem

razvojnim oblikam, proti jajčecem (ovaricidi) in predvsem proti larvam (larvicidi).

Uporabljajo se v medicini za zatiranje nadležnih oz. zdravju škodljivih žuželk, industriji,

gospodinjstvih, za varstvo kmetijskih in okrasnih rastlin, pridelkov in hrane. Uporaba v

agrikulturi je poleg mehanizacije eden poglavitnih razlogov za povečano produktivnost in

pridelavo v 20. stoletju. Skoraj vsi insekticidi vplivajo na ekosisteme, težave pa nastanejo

pri tem, da mnogi insekticidi na trgu škodujejo ne le škodljivim insektom ampak tudi

koristnim insektom in drugim živalskim vrstam [1, 47].

Njihova strupenost se izraža z LD50, določi pa se jo s poskusi na laboratorijskih živalih

(modelni insekti ter ribe, sesalci).

Delimo jih lahko po [39, 48]:

▫ mehanizmu delovanja:

regulatorji rasti interferenca pri sintezi hitina in juvenilnega hormona, pri levitvicelični nivo alkilirajoče snovi, inhibitorji glikolize, mitohondrijski strupiživčni aktivatorji Na- oz. blokatorji Cl- kanalčkov; inhibitorji acetilholinske

estereaze; mimetiki acetilholinadrugi fizikalne metode; mišični strupi; narkotiki; citolitiki

▫ načinu aplikacije

sistemski se nahajajo v rastlini: njeni lastni ali biotehnološko vgrajeni; ali pa se

po aplikaciji absorbirajo v rastlino in se razporedijo po celi rastlinikontaktni delujejo od stiku z insektom, najpogosteje aplicirani v obliki aerosola

▫ kemijsko

anorganski SiO2, H3BO3Pb3(AsO4)2, CaSx, Na2B4O5(OH)4×8 H2O, Zn3P2, HCN,

Hg2Cl2, C10H6F17NO2S,…organski sintezne kemijske spojine, predstavljajo večino dostopnih pesticidov:

klorirani ogljikovodiki, organofosfati, karbamati, piretrinoidni

insekticidi, antibiotiki, derivati rastlinskih in drugih toksinov

▫ izvoru

sintezni vse kemijsko modificirane spojine

16


naravni najdemo jih v živih bitjih (piretrini, nikotin, rotenon, limonen,

toksini, mnogi inhibitorji amilaz, inhibitorji proteaz, lektini,…)

Iz mehanizma delovanja lahko sklepamo na možnosti nadaljnje toksičnosti za ostale

organizme, v kolikor pridejo v posredni ali neposredni stik. Poleg neškodljivosti za druge

organizme, torej tarčnega delovanja, je pomembna hitra in visoka učinkovitost,

biorazgradljivost v netoksične produkte, minimalna akumulacija v pridelku in v ekosistemu

ter čim manjši razvoj rezistence. Anorganski pesticidi so obsoletni, nizkomolekularnim

sinteznim pa postopoma tržni delež prevzemajo pesticidi naravnega izvora, ki so strogo

gledano tudi organski.

Malokatera kemijska industrija izpušča toliko potencialno škodljivih snovi v okolje kot

proizvodnja pesticidov. So eden največjih onesnaževalcev biosfere. Enkrat vneseni v okolje

vstopajo v hranilno verigo, katere pogost člen smo tudi mi. Iz teh razlogov je njihova

uporaba strogo regulirana, prav tako tudi analize ostankov pesticidov in njihovih razgradnih

produktov v izdelkih in okolju.

Biološki nadzor škodljivcev lahko izvajamo na več načinov:

1. klasična biokontrola - uporaba naravnih sovražnikov oz plenilcev škodljivca, v kolikor

je škodljivec eksotičnega tipa ali pa je naravni plenilec prešibek. Obstaja nevarnost

prekomernega razširjanja naravnega sovražnika in s tem ogrožanje drugih vrst.

2. konzervativna biokontrola - manipulacija okolja in s tem spodbujanje naravne obrambe.

3. uporaba biopesticidov - poleg transgenih rastlin so po načinih aplikacije podobni kot

kemični pesticidi, prednost je tračno delovanje.

Veliko naravnih substanc, ki nastajajo v različnih organizmih, kaže pesticidno aktivnost in

bi lahko bile potencialno uporabljene kot biopesticidi. Rastline same v ta namen proizvajajo

antibiotike, alkaloide, terpene, cianogene glikozide in nekatere proteine. Človek je začel

razširjati nabor insekticidov: molekulam z nizko molekularno maso (npr. nikotin, piretroidi)

in njihovim derivatom se pridružujejo proteini.

Biopesticidi

Pesticidi se v 75% uporabljajo v kmetijstvu, preostalih 25% se porazdeli med industrijo,

zdravstvo in gospodinjstva. Zavedanje javnosti o krhkosti zdravja nas in našega okolja je

naložilo težke naloge pridelovalcem, predelovalcem in nenazadnje tudi službam za

varovanje zdravja. Znano je, da so se škodljivci prilagajali obrambnim mehanizmom

17


rastlin, se z njimi razvijali. Ravno iz tega razloga je smotrno poiskati nove iz drugih vrst.

Med biopesticide uvrščamo v naravi pojavljajoče se substance, mikroorganizme (bakterije,

viruse, nižje glive in bakteriofage) in substance, ki jih proizvedejo transgene rastline zaradi

dodatnega genskega materiala. Le-te ali same delujejo kot pesticidi ali pa spodbudijo

rastlino k njenemu lastnemu imunskemu odzivu [49]. Med njimi posebno mesto zavzemajo

proteini.

Biopesticidi proteinske narave

Biopesticidi proteinske narave pišejo novo poglavje o varni zaščiti rastlin. Njihovo

delovanje je bistveno bolj specifično in hkrati netoksično za organizme, ki niso njihova

tarča. Hitro se razgradijo in ne puščajo toksičnih razgradnih produktov. Proteine ali njihove

gene lahko z biotehnološkimi metodami vgradimo v rastlino, bakterijo ali bakteriofag.

Mejni kamen je postal zadnji široko uporaben komercialni bioinsekticid Bt toksin (Bacillus

thuringiensis je gram pozitivna bakterija živeča v prsti). Protein - protoksin se lahko izrazi

znotraj kmetijskih rastlin, pridobljenih z genetskim inženirstvom (npr. v koruzi) ali pa ga

očistijo iz bakterijskih izolatov. Deluje preko vezave t.i. δ-toksinov na specifične proteine

in glikolipidne receptorje v epitelu prebavila tarčnega škodljivca, ki so razviti le pri insektih

in nematodih, ne najdemo jih pa pri vretenčarjih. Našli so že več kot 90 vrst bakterij, ki so

vsaj entomospecifične v kolikor ne entomotoksične, vendar jih še večina ni natančneje

preučena (Photorhabdus luminescens, Xenorhabdus nematophilus; Photorhabdus

luminescens) [50, 51]

Med ostalimi proteini z insekticidnim delovanjem so najbolj perspektivni:

◦ inhibitorji prebavnih encimov (inhibitorji glikohidrolaz in inhibitorji proteaz)

◦ lektini (monovalentni lektini, mulivalentni lektini, inhibitorji ribosomov,…)

◦ drugi (inhibitorji hitinaze, arcelini, kanatoksin,…)

Prebavni encimi in njihovi inhibitorji

Insekti spadajo med heterotrofne organizme, ki za svoje energetske in razvojne potrebe

razgrajujejo organske molekule. Le-to omogočajo prebavni encimi kot so glikohidrolaze,

proteaze in lipaze. Nanje lahko delujemo v vseh prehranjujočih se stadijih insekta.

Specifičnost inhibicije za enega ali skupino zajedavcev je pomembna tudi za proizvajalski

(varovani) organizem, da ne prihaja do avtoinhibicije.

18


Inhibitorji glikohidrolaz

Med najpomembnejšimi glikohidrolazami je α-amilaza, ki razgrajuje α-1,4 povezane

polisaharide, kot sta škrob in glikogen, v oligosaharide. Potrebujejo jo vsi organizmi.

Naravno prisotne inhibitorje najdemo predvsem v žitaricah in stročnicah. Med neproteinske

inhibitorje spadajo akarboza, hibiskusna kislina, ciklodekstrini, proteinske pa delijo v šest

razredov [52, 53]:

◦ lektinski tip αAI-1, -2, -3 (α-amilazni inhibitor) iz fižola (Phaseolus vulgaris)◦ knotinski tip AAI iz amaranta (Amaranthus hypocondriacus)◦ taumatinski tip zeamatin iz koruze, proteini R in S iz ječmena (Hordeum vulgare)◦ žitarični tip α-amilazni inhibitor 0.19 iz indijske prosenke (Eleusine coracana),

RBI bifunkcionalni α-amilazno-tripsinski inhibitor iz ječmena◦ Kuniztove α-amilazno-subtilisinski inhibitor BASI iz ječmena, WASI iz

pšenice (Tricitum vulgare) in RASI iz riža (Oryza sativa)◦ γ-purotioninski

tip

SIα-1, 2 in 3 iz sirka (Sorghum bicolor)

Rastlina transgenega graha (Pisum sativu) je bila popolnoma odporna na tri različne

zajedavce (Acantoscelides obtectus, Bruchus pisorum, Callosobruchus chinensis) z 0,8-1 %

vsebnostjo αAI-1. Žitarični tip inhibitorjev pogosto povzroča alergije.

Proteaze

Proteoliza je encimska razgradnja beljakovin, pri kateri pride do hidrolize ene ali več

peptidnih vezi. Encime, ki katalizrajo hidrolizo peptidne vezi imenujemo peptidaze (tudi

proteinaze, proteaze ali proteolitični encimi). Proteaze v splošnem sodelujejo predvsem pri

presnovi proteinov in zagotavljajo vir aminokislin [54]. Uravnavajo življenje celice in

organizma od oploditve, diferenciacije tkiva, odziva celic na zunanje signale in potrebe

vzdrževanja notranjega ravnovesja, opravljanja celičnih funkcij do celične smrti.

Proteaze lahko delimo glede na :

◦ izvor (mikrobne, glivne, živalske, rastlinske)

◦ mesto delovanja (ekstra- in intracelularne)

◦ mesto cepitve vezi - endopeptidaze (cepijo peptidno vez v notranjosti peptidne verige)

in eksopeptidaze (cepijo končno peptidno vez na N- ali C- koncu)

◦ načinu delovanja (različen katalitski tip)

Najsodobnejša razdelitev proteaz je MEROPS klasifikacija (po Barettu in Rawlingsu [54]).

Le-ta razvršča proteaze na osnovi njihove evolucijske sorodnosti. Najprej jih deli glede na

19


katalitski tip, nato po terciarni strukturi, ki je evolucijsko starejša od primarne, v klane, le-ti

pa so sestavljeni iz ene ali večih družin (ujemanje v aminokislinskem zaporedju - primarni

strukturi). Tu se upošteva predvsem ujemanje v segmentih, ki sodelujejo pri tvorbi

aktivnega mesta.

Delitev na katalitske tipe

Katalitski tip določa aminokislina v aktivnem mestu, ki s kisikom kot nukleofilom napade

peptidno vez (S - serinski, T - treoninski, C - cisteinski in P - klan mešanih (C-, S-, T-)

proteaz), oziroma aminokislina ali kovinski ion, ki za nukleofilni napad aktivira molekulo

vode (A - aspartatni, G - glutamatni, M - metaloproteaze). Ostale proteaze z neznanim

mehanizmom delovanja uvršča v neznan katalitski tip U. Do danes je identificiranih več kot

2.300 družin [54].

Obstajajo drugi sistemi za delitev proteaz v različne skupine. NC-IUBMB (Nomenclature

Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology) jih uvršča

med hidrolaze, ki delujejo na peptidno vez (EC.3.4), in jih razdeli na 26 podrazredov in

družin. Delitev temelji na delitvi po Rawlingsu in Barettu, predhodno pa jih razdeli na

ekso- in endopeptidaze [55]. Medtem jih ExPASy (Expert Protein Analysis System) razdeli

v 13 skupin [56]. V obeh sistemih se pojavljajo zgoraj našteti katalitski tip z manjšimi

modifikacijami (dodatni podrazredi glede mesta, mehanizma in specifičnosti delovanja).

Žuželčje proteaze

Iz žuželk je izoliranih le nekaj proteaz, za mnoge ni znana njihova fiziološka vloga. Za

uporabo bioinsekticidov so najzanimivejše proteaze prebavnega trakta. Glede teh je bila

večina raziskav izvedena na izvlečkih prebavil ali deloma očiščenih encimih, bodisi z

uporabo specifičnih inhibitorjev različnega tipa bodisi z identifikacijo cepitvenih mest

specifičnih umetnih substratov ali s primerjalno analizo genoma [57]. Ocenjujejo, da ima

vsaka vrsta žuželk v prebavilih v povprečju 1000 proteolitičnih encimov (skupaj z

izooblikami) z različnimi specifičnostmi [58]. Prisotnost inhibitorjev proteaz spodbudi

sintezo in izločanje neobčutljivih alternativnih prebavnih encimov, ki spadajo v enega ali

več katalitskih tipov [52].

Redovi Lepidoptera, Hymenoptera, Orthoptera in Diptera imajo v prebavilih prevladujoče

serinske proteaze; v redu Coleoptera najdemo poleg cisteinskih še serinske, v redu

Hemiptera pa cisteinske in aspartatne [58]. Vinska mušica je priljubljen modelni insekt in

njen genom je znan že več let. Identificirane ima aspartatne, cisteinske, serinske in

20


metaloproteaze, ter proteaze kombiniranega tipa, v prebavilih pa bi naj bile pretežno

serinske in v manjši meri cisteinske [57, 59, 46]. Vsaki tip proteaz ima svoj pH optimum:

serinske in metaloproteaze pH 9-11, cisteinske pH 5-7 in aspartatne pH 3-5 [58].

Celična razgradnja poteka v večih organelih, v največjem obsegu pa se vrši v lizosomih in

citosolu. Aktivnost proteaz je strogo nadzorovana glede na celične potrebe s hitrostjo

sinteze proteaz, posttranslacijskimi modifikacijami, dostopnimi kofaktorji in alosteričnimi

spremembami. Pomembna je tudi lokalizacija proteaz in njihovih substratov, spremembe

pH in nenazadnje proteazni inhibitorji [54].

Inhibitorji proteaz

Do pred kratkim so inhibitorje proteaz delili glede na katalitski tip proteaze, katero so

inhibirali. Zapleti so nastali pri razvrščanju inhibitorjev, ki so inhibirali več različnih

katalitskih tipov proteaz. Danes jih po MEROPS-u delijo na klane in družine glede na

evolucijsko sorodnost, po enakem principu kot proteaze. Nekatere inhibitorje še niso

uvrstili v klane, saj se po svojem aminokislinskem zaporedju in strukturi ne morejo uvrstiti

v nobeno izmed obstoječih družin; eden izmed teh je tudi klitocipin [54, 12]. Kljub temu,

da imajo proteaze istega tipa podobno aminokislinsko zaporedje v aktivnem mestu, niso vsi

inhibitorji enako učinkoviti.

Katerokoli proteazo lahko inhibirajo majhne kemijske substance in proteinski inhibitorji.

Vsi organizmi jih izdelujejo za kontrolo lastnih proteaz, z evolucijo pa so se razvili tudi v

obrambne namene. Sočasno z razvojem novih obrambnih inhibitorjev se je razvijala tudi

rezistenca nanje [52]. Vmes je posegel človek z raziskovanjem zajedavcev in tarčnih

organizmov in jih s pomočjo sodobnih biotehnoloških postopkov razvija v novo učinkovito

orodje. Pri tem je potrebno preveriti ali bi novonastala transgena rastlina nove inhibitorje

sama razgradila, ali bi bila sinteza pravilno inducirana in lokalizirana v želenih delih

rastline ter neobremenjujoča za rastlino, ali bi se dosegel sinergistični ali celo

kontraproduktivni učinek z endogenimi obrambnimi inhibitorji [46, 54, 58].

Predpostavljena sta dva mehanizma toksičnosti [58]:

◦ znižanje količine dostopnih aminokislin

◦ hiperprodukcija prebavnih encimov, zaradi katerih insekt troši aminokisline, zlasti tiste,

ki vsebujejo žveplo (metionin, cistein).

21


Rastlinski in glivni inhibitorji proteaz proteinske narave

Največ proteinskih inhibitorjev proteaz so iz omenjenih kraljestev izolirali iz semen

stročnic, žitaric, bučk in krompirjevih gomoljev, pri glivah pa so zastopane tako nižje glive

kot gobe [52]. Na primeru napada koloradskega hrošča na krompir so opazili, da se v

rastlini lokalno zviša količina inhibitorjev že nekaj ur po prvi poškodbi in se znatno poveča

ob drugem napadu. Hkrati se signal prenese po celotni rastlini in tudi drugje stimulira

sintezo inhibitorjev. Sistemski učinek pada s starostjo rastline, saj takrat zanjo en napad ne

bi bil tako poguben kot pri mladi rastlini [46].

Če razdelimo rastlinske proteaze glede na katalitski tip, dobimo štiri razrede: serinski,

cisteinski, aspartatni in metaloproteaze [58].

Za inhibitorje serinskih proteaz, ki so najštevilčnejši, so potrdili vlogo obrambnih snovi. Ti

proteini so prisotni v majhnih količinah, ustreznih za zaščito pred plenilci. Vsi rastlinski

inhibitorji serinskih proteaz so kompetetivni inhibitorji in delujejo po podobnem

mehanizmu. Po Laskowskem [60] jih delimo v 13 družin.

Inhibitorje cisteinskih proteaz so izolirali pa so jih iz riža, avokada, papaje, limskega fižola,

ambrozije in krompirja. Največkrat so jih testirali na predstavnikih reda Coleoptera, saj

imajo ti v prebavilih pretežno cisteinske proteaze.

Iz krompirja so izolirali tudi inhibitorje aspartatnih proteaz. Rastline so razvile vsaj dve

družini metaloproteaz, ki so jih izolirali iz paradižnika in krompirja.

Pri glivah so inhibitorje razvrstili v 8 družin, največ je serinskih nato še cisteinskih

inhibitorjev [54]. Samo za primer: iz meglenke (Clitocybe nebularis) so izolirali inhibitor

serinskih proteaz CnSPI [61], še nedefiniran tip inhibitorja, in inhibitor cisteinskih proteaz

klitocipin [12], ki je prvi predstavnik svoje družine, kar priča o še neodkritem bogastvu

kraljestva gliv.

22


Lektini

Splošne lastnosti

Prvi lektin so izolirali že v 19. stoletju iz semen navadnega kloščevca (Ricinus communis

L.; hladno stiskano ricinusovo olje se še danes uporablja kot močno odvajalo). Ta

proteinski toksin, ricin, aglutinira rdeče krvničke. Danes lektine definiramo kot razred

proteinov neimunskega izvora, ki imajo vsaj eno nekatalitično domeno, s katero

reverzibilno vežejo specifične ogljikove hidrate, ne da bi jih pri tem modificirali [62].

Nadalje jih delimo lahko v razrede, skupine ali družine. Poimenovani so glede na izvor z

začetnicama latinskega ali angleškega imena, končnica A pa izvira iz besede aglutinin oz. L

iz besede lektin.

V družine delimo lektine glede na njihov izvor in evolucijsko sorodnost ali pa specifičnosti

za ogljikove hidrate in njihove derivate. Ta specifičnost je primerljiva s specifičnostjo

vezave encima in substrata oz. antigen-protitelo. Lektini se razlikujejo še po

posttranslacijskih modifikacijah (glikoproteini), potrebi po kofaktorjih (kovinski ioni) in

številu podenot. Ravno oligomernost lektinom omogoča multivalenco (vezavo večih in

različnih saharidov z visoko afiniteto), s čem razlagajo zmožnost aglutinacije in

precipitacije.

Med lektine uvrščajo tudi t.i. ribosom-inaktvirajoče proteine (RIP). Sestavljeni so iz dveh

podenot, povečini povezanih z disulfidno vezjo. Lektinska podenota prepozna in se veže na

glikokonjugat na celici, nato protein vstopi v celico z endocitozo, druga podenota pa deluje

kot encim, ki inaktivira ribosome in proizvodnjo celičnih proteinov. Sem spadajo ricin,

lektin kanavanina (ConA) in bele omele (ML-I) ter abrin; slednji lahko inaktivira 1500

ribosomov na sekundo [63]. Najdemo jih v vseh živih bitjih, njihova vloga pa še zdaleč ni

razjasnjena [63, 64].

Mnogi so tesno zviti globularni proteini in zato zelo odporni tudi na toplotno denaturacijo.

Za vse lektine je značilna tudi visoka razistenca na proteolizo in stabilnost preko širokega

območja pH, tudi ko so izolirani iz svojega naravnega okolja.

Mehanizmi vezave in delovanja

Lektini z oligosaharidi ne tvorijo kovalentnih vezi, ampak le tesne reverzibilne asociate.

Aminokislinsko zaporedje v zankah vezavnega mesta je oblikovano za prepoznavo

23


specifičnih oligosaharidov in se na njih veže

s pomočjo vodikovih vezi, Van der

Waalsovih vezi in hidrofobnih interakcij.

Na sliki je rastlinski lektin GSL IV (iz

družine metuljnic) [65], prikazan pa je le del

oligosaharida (sive barve) in nakazane

vodikove vezi.

Lektine se zaradi njihove specifične vezave saharidov uporablja za določevanje krvnih

skupin, tipiziranje bakterij, separacijo in analizo celic, izolacijo glikokonjugatov z

imobiliziranimi lektini, testiranje encimov (glikozidaz in glikoziltransferaz) in mapiranje

nevronskih poti. Pri celicah, kjer se spremeni glikozilacija celične stene, jih lahko uporabijo

za identifikacijo in selekcijo mutiranih celic ter za uničevaje tumorskih celic s toksičnimi

konjugati [64].

V farmaciji imajo veliko vlogo tudi pri načrtovanju novih dostavnih sistemov, ki

omogočajo ciljano dostavo in podaljšano sproščanje učinkovine. Te so lahko proteinske

učinkovine, cepiva, terapevtski geni, citotoksične spojine itd. Uporabni so tako endogeni

lektini (izraženi na tarčnih celicah), ki prepoznajo vnesen (oligo)saharid, kot eksogeni

lektini, ki prepoznavajo saharide na površini tarčnih celic. Nekateri lektini se lahko

internalizirajo v celice z endocitozo in bi nanje lahko vezali učinkovine, za katere želimo,

da se sprostijo v celicah. Takšne lektinizirane učinkovine pa so potencialni imunogeni in/ali

toksini; možne so tudi interakcije o ostalimi saharidi [66]. Velik potencial kažejo tudi za

zdravljenje tumorjev: povzročajo kontaktno inhibicijo s premreženjem rakastih celic,

nekateri spremenijo citoskelet in sprožijo kaskado reakcij, lahko tudi celično apoptozo.

Raziskovali so jih že na nekaterih celičnih linijah [67], kot orodje za klinično spremljanje

raka prostate [68] in raka kolona [69], kot inhibitorje in stimulatorje rasti rakastih tvorb [70,

71, 72]. Lektin CVL iz morskega črva (Chaetopterus variopedatus) inhibira citopatični

učinek, induciran z HIV-1; kaže aktivnost proti HIV-1, in sicer v koncentraciji 0,33 μM

(oz. 0,07μM) zmanjša pripenjanje virusa na celico za 86 % (oz. 21%) [73]. Lektini

24

Slika 5: GSL IV lektin iz Griffonia simplicifolia, [65]


usmerjeni na glikane v bakterijski celični steni tudi lahko delujejo kot zelo specifični

baktericidi.

Pri žuželkah so polisaharidi strukturne komponente hitinskih zunanjih skeletov in

povrhnjice ter mucinov prebavnega trakta, kar v vseh primerih predstavljajo je dobre

potencialne tarče za lektine.

Živalski lektini

Učinek živalskih lektinov so raziskovalci prvič opazili pri reagregaciji disociiranih celic

morske spužve, kjer je potrebna specifična prepoznava celic med seboj, vendar takrat še

niso vpeljali pojma lektini [64]. Naslednji korak je bilo odkritje hemaglutininov v telesnih

tekočinah nekaterih pajkov in rakov. V šestdesetih letih so odkrili, da so se podganji

levkociti, tretirani z bakterijskimi glikozidazami, različno razporedili po organizmu. Prve

lektine (galektine) so izolirali s pomočjo afinitetne kromatografije z asialoglikoproteini in

se dotaknili vrha ledene gore. Začeli so se vrstiti novi saharidi in nove družine ter razredi

lektinov [64, 74].

Tudi za živalske lektine velja, da so večinoma globularni proteini, sestavljeni pretežno iz

beta strukturnih ploskev. Od kovinskih kofaktorjev je kalcij precej pogostejši kot mangan.

Sodelujejo v adheziji in premreženju celic, celičnemu signaliziranju, prepoznavanju

patogenov in naravni imunosti, pretvorbi glikoproteinskih hormonov, oploditvi in

embriogenezi [64]. Preizkusi z njimi (npr. galektini) prav tako kažejo na antiproliferativni

efekt in stimulacijo adhezije celic s povezovanjem ekstracelularnega matriksa z

glikoziliranimi proteini celične površine [63].

Rastlinski lektini

Rastlinski lektini so najbolj raziskani, saj jih dnevno zauživamo v hrani. Najdemo jih npr. v

paradižniku, krompirju, fižolu, arašidih, grahu, soji, korenju, češnjah, borovnicah, bezgu,

koruzi, pšenici, rižu, česnu, peteršilju, oreščkih, čaju in v različnih okrasnih rastlinah. V

večini naštetih rastlin je najvišja koncentracija lektinov v semenih, iz česa sklepajo na

njihovo varovalno vlogo pred nezaželenimi plenilci in patogeni, saj večina lektinov lahko

prednostno veže tudi tuje glikokonjugate [62]. Poleg tega lahko v semenih predstavljajo

tudi obliko skladiščnih proteinov ali pomagajo pri vzdrževanju dormance semen. Pred tem

verjetno nekateri poskrbijo za prepoznavanje peloda oziroma celic med seboj, drugi pa za

mitogensko stimulacijo embrijskih rastlinskih celic [75, 52]. Ena izmed možnih vlog je tudi

komunikacija s simbiotskimi organizmi, mikoriznimi glivami, ali pa sodelujejo pri

25


nodulaciji in vezavi dušika pri stročnicah. Najdemo jih tudi v listju, lubju, deblu ali steblu.

Pri poškodbi ali okužbi rastline s patogenom so opazili povečanje koncentracije lektinov v

prizadetem tkivu, kar je sprožilo raziskave v zvezi s potencialno zaščitno vlogo [64].

Parenteralna toksičnost je znana že iz časov ricina in abrina, vendar so študije na podganah

in miših pokazale tudi na peroralno toksičnost nedenaturiranih lektinov. Eden izmed

mehanizmov delovanja je vezava na receptorje v epitelu prebavil, spremembe v morfološki

sestavi in metabolizmu celic. Hkrati povzročijo razbitje in disorganizacijo najvažnejših

absorbcijskih celic prebavnega trakta; s posledično zmanjšano absorpcijo hranil sprožijo

kaskado signalov, ki spremeni intermediarni metabolizem. Namreč, lektini, ki se ne vežejo

na mukozo, redko povzročajo prehranske motnje. Dodatno se lahko vežejo na topne in

membranske encime, kar negativno vpliva na prebavo proteinov in ogljikovih hidratov in

prispeva k zmanjšanju dostopnih hranil [62].

Sistemski učinki so posledica prehoda lektinov v krvni obtok z endocitozo preko

enterocitov. Pšenični lektin (WGA) so našli v stenah krvnih in limfatičnih žil, PHA je

sprožil močan in selektiven humoralni odziv in produkcijo IgG ter IgA. Po izvedbi

afinitetne kromatografije so v serumu zdravih ljudi našli protitelesa proti lektinom, ki jih

vsakodnevno vnašamo v telo s prehrano. Prav tako lahko lektni sprožijo sproščanje

histamina iz bazofilcev, nekateri celo izločanje interlevkinov (IL-4 in IL-13), ključnih

promotorjev odgovora limfocitov Th2 in tvorbo IgE. Posledice so lahko alergije tipa 1 na

številna hranila. Pri dojemljivejših posameznikih lahko interakcije lektinov z entereociti in

limfociti pripomorejo k nastanku trajne periferne antigenske stimulacije, kar lahko privede

do nastanka npr. revmatiodneg artritisa [62].

V študijah s podganami so odkrili še spremembe povečanje jeter in pljuč, atrofijo priželjca,

hipertrofijo trebušne slinavke in porušeno ravnovesje med sintezo in izločanjem insulina.

Kljub nižjim koncentracijam insulina v krvi je koncentracija glukoze ostala normalna.

Vplivajo tudi na povečan metabolizem maščob (verjetno preko znižane koncentracije

insulina v krvi) in znižajo sintezo mišičnih proteinov (PHA). Po drugi strani pa lektin iz

arašidov (PNA) kaže afiniteto do glikoproteinov v gladkih mišicah arterij, stimulira njihovo

rast in prispeva k nastanku ateromov [62].

Možnost uporabe rastlinskih lektinov kot bioinsekticidov je bila pokazana v večih študijah.

Peroralna toksičnost, testirana na različnih insektih, variira med 5-1500 μg/ml oziroma med

1-50 mg/ml hrane odvisno od načina aplikacije. Opazovali so različne parametre: smrtnost,

velikost, težo, barvo, plodnost, podaljšanje časa razvoja insektov in podobno. Uporabljeni

26


so bili modelni insekti iz družin Homoptrea, Diptera, Colepotera in Lepidoptera.

Mehanizem delovanja ni razjasnjen, sklepajo pa na vmešavanje v prebavno, zaščitno in

sekretorno delovanje preko vezave lektinov na prebavila insektov, pri čemer je pomembna

njihova odpornost na proteolizo. Pomembno vezavno domeno predstavlja hitin, poleg tega

lahko lektini interagirajo tudi z encimi v prebavilih. Še več, lektine niso našli le v

prebavilih, ampak tudi v maščobnih telescih, jajčnikih, v Malpighijevih tubulih in po

celotni hemolimfi [62].

Prve transgene rastline so vsebovale lektine iz graha (Pisum sativum – PSA),

spomladanskega zvončka (Galanthus nivalis - GNA), pšenice (Tricitum aestivum oz. Wheat

Germ - WGA), kanavanina (Concavalia ensiformis - ConA) in fižola (Phaseolus vulgaris -

PHA). Če se že sama proizvodnja lektinov v transgenih rastlinah ne pokaže za popolnoma

učinkovito zaščito, lahko z izraženimi lektini dosežemo sinergistični učinek z drugimi

insekticidi in tako zmanjšamo uporabo le-teh. Do sedaj niso odkrili negativnega učinka na

ostale udeležence v ekosistemu, ki bi zaužili lektini direktno iz rastline ali indirektno preko

uživanja tarčnih insektov. Kljub temu je potrebno v načrtovanju nove transgene rastline

posvetiti pozornost tudi možnim vplivom na okolje [62].

Glivni lektini

Navzočnost lektinov v glivah je pogostejša kot v višjih rastlinah. Nekatere vrste gob

vsebujejo po več lektinov npr.: gobani, mavrahovci, golobice, mlečnice, polžarke. Vsebnost

lektinov se povezuje s fiziologijo in z ekološko vlogo posameznih vrst. Nekateri lektini se

lahko razlikujejo v specifičnosti kljub strukturni podobnosti, še bolj pogosto pa so lahko

strukturno zelo različni lektini specifični za isti saharid [76].

V sporomu so opazili drugačno količino lektinov v betu kot v klobuku, prav tako pa so

našli razlike glede na starost, letni čas, razvojno stopnjo in lokacijo (mikrookolje: teren,

prst, klimatski pogoji, drevesa). Fiziološke vloge v gobah segajo od metabolizma,

simbiotskih (mikorize) in parazitskih odnosov (gliste, insekti), združevanja hif v času rasti

bazidioma (gobe), dormance gob in nenazadnje služijo za obrambo pred paraziti. Tudi

zanje veljajo splošne lastnosti lektinov (stabilnost, kofaktorji, specifične reverzibilna

vezava na saharide). Malo glivnih lektinov povzroča zastrupitve s hrano; do sedaj so to

dokazali le za bolesatin (Boletus satanas, vražji goban) [76].

V splošnem so večini gobjih lektinov določevali le aglitunacijske sposobnosti in

specifičnost na saharide [77]. Zadnji večji pregled so naredili Konska in sod. leta 1997 [77],

27


tekoče se pa posodoblja baza identificiranih lektinov z znano terciarno strukturo [78], s

katero pa se lahko pohvalijo le redki lektini pridobljeni iz gob. Na osnovi 3D strukture so

jih v zadnjih par letih razvrstili v sedem strukturnih tipov. Nekateri od teh so homologni

živalskim in rastlinskim proteinskim družinam, kot so galektini (Agrocybe cylindracea

[79], Coprinus cinerea [80]), fibronektini (Flammulina velutipes [81]), podenote integrinov

(Psathyrella velutina lektin [82]) in ricini (Laetiporus sulphureus [84]), s tem da vsi našteti

homologni proteini nimajo nujno lektinskih lastnosti. XCL (Xerocomus Chrysenteron) in

par podobnih lektinov iz drugih gob spadajo v lektinsko družino, za katero je doslej edini

homolog aktinoporin z zmožnostjo perforacije celičnih membran iz morske veternice [84].

Nedavno odkrit lektin in Aleurie amantie pa po drugi strani kaže originalno terciarno

strukturo (6-listni β-propeler) [85].

Paquereau in sod. (2003) [86] so na modelu vinske mušice dokazali, da je LD50 za XCL

0,40 ± 0,10 mg/ml, LD50 za lektin zvončka GNA 0,87 ± 0,17 mg/ml, za lektin grahora LOL

LD50 8,5 ± 0,6 mg/ml, torej se je XCL izkazal kot najbolj toksičen. Pokazali so tudi, da je

rekombinantni XCL toksičen še v nižji koncentraciji LD50=0,068 ± 0,02 mg/ml, ravno

obratno pa je veljalo za drugi modelni insekt, Acyrthosiphon pisum. Predpostavljen

mehanizem delovanja je vezava na peritrofični matriks insektov.

3.5 Inhibitorji hitinaze, arcelini, kanatoksini

Inhibitorji hitinaze

Že samo ime encima (EC 3.2.1.14) je dovolj zgovorno, saj omogoča hidrolitično razgradnjo

hitina. Hitin najdemo le pri žuželkah in glivah. Je njihov strukturni oziroma zaščitni

polimer, vendar je za rast potrebna razgradnja obstoječega hitina in nato sinteza novega. V

primeru insektov se inhibitor aplicira v zgodnjih stadijih rasti larv, da se ne morejo preleviti

v bube in odrasti. Na trgu so dostopne le manjše kemijske molekule (npr.: heksaflumuron,

teflubenzuron), med proteinske pa spadata ciklopentapeptida argifin in argadin (IC50 sta

100 nM in 1 nM za hitinazno družino 18), izolirana iz kultur Gliocladium in Clonostachys

[87, 52].

Arcelini

So insekticidni proteini iz divje vrste fižola, za katere so se geni v kultiviranih vrstah

izgubili verjetno kot posledica kromosomske rekombinacije in izbire pri križanju vrst.

Spadajo v lektinom-podobno družino, ki vključuje dva tipa fitohemaglutininov in α-

28


amilaznih inhibitorjev. Našli so 7 alelnih različic arcelinov, od katerih Arc 5 in Arc 1

omogočata najboljšo zaščito proti škodljivcu. Ker so sestavljeni iz polipeptidov, ostaja

vprašanje, če so vse izooblike najučinkovitejšega Arc5 enako učinkovite. Predpostavljeni

mehanizmi toksičnega delovanja temeljijo na interakcijah z glikoproteini (hrana, površina

celic prebavil ter z glikoziliranimi prebavnimi encimi). Našli so jih tudi v hemolimfi [52].

Kanatoksin

Iz kanavalina so izolirali prvo naravno ureazo in lektin ConA, odkrili pa so še kantoksin, ki

je nevrotoksični protein. Obnaša se kot hemilektin - pri poskusnih živalih povzroča

aglutinacijo eritrocitov šele ob prisotnosti protiteles proti kanatoksinu, povzroča pa tudi

konvulzije in smrt, apliciran intravensko. Interagira s kompleksnimi glikokonjugati kot so

gangliozidi, še posebej polisializiranimi. Toksičen je za insekte, ki so odvisni od uporabe

katepsina B in D kot glavnih prebavnih encimov (Hemiptera, Coleoptera), ne pa na tiste z

tripsinskimi encimi (Diptera). Pri C. maculatus (Coleoptera) je primerljivo toksičen z α-

amilaznimi inhibitorji, lektini in določenimi proteaznimi inhibitorji. Kanatoksinski proteini

delujejo komplementarno BT endotoksinu [52].

29

Lara Kandić: diplomska naloga II Načrt za delo

II.Načrt za deloCilj našega dela je poiskati nove potencialne bioinsekticide, ter jih razvrstiti po

učinkovitosti. Merilo za učinkovitost je relativna smrtnost (RS) modelnega insekta glede na

potrebno koncentracijo potencialnega bioinsekticida v gojišču (LD50) v primerjavi s

kontrolo.

V ta namen bomo

1.) optimizirali gojišče za gojenje našega modelnega insekta, vinske mušice.

2.) testirali liofilizirane ekstrakte 23 izbranih gliv iz debla odprtotrosnic (Basidomycota),

razred: podstavkovnice (Basidiomycetes)

3.) izmed liofiliziranih ekstraktov gob izbirali tiste, ki bodo toksične za vinsko mušico ter

nižali vsebnost liofilizata v gojišču in tako izbrali gobo za natančnejšo obdelavo

4.) hkrati preizkušali tudi insekticidno delovanje nekaterih proteinskih inhibitorjev proteaz,

tako iz izbrane gobe, kot iz drugih izbranih rastlin, ki so komercialno dostopni.

5.) iz izbrane gobe izolirali lektine, ki so specifični za različne sladkorje (monosaharide in

disaharide) ter skušali poiskati njihovo minimalno potrebno koncentracijo za dosego

50% smrtnosti (RS=0,5), torej LD50 .

Zaradi omejene količine dosegljivih gob bomo morali poiskati takšno gojišče, ki bo

omogočalo vgraditev vzorca v gojišče v raziskovani koncentraciji, a hkrati dovolj majhni

količini ter v pogojih, ki bodo čim manj destruktivni za potencialne bioinsekticide (npr.

temperatura priprave gojišča). Seveda so pomembne tudi sama topnost vzorca (predvsem

liofilizata) in enakomerna razporeditev vzorca po gojišču. Upoštevati bomo morali tudi, da

različne razvojne stopnje vinske mušice zahtevajo različne pogoje za razvoj (npr. vlaga,

količina in sestava hrane).

30

Lara Kandić: diplomska naloga III Materiali in metode

Materiali in metode

1Materiali, uporabljeni pri pripravi liofilizatov in proteinov

1.1Kemikalije

kemikalija kakovost kratica proizvajalec

acetonitril p.a. ACN Sigma-Aldrich

destilirana voda dH2O

pridobljena z Mr Slim Mitsubishi

Electronics Reverse Osmosis

LC010M Nobel

dinatrijev etilendiamin tetraacetat p.a. EDTA Serva

divinilsulfon 98,0% / Fluka

etanol 99,8% / Carlo Erba

galaktoza ≥99% / Fluka

glukoza ≥99% / Fluka

goveji serumski albumin BSA Serva

kalcijev klorid dihidrat ≥99,5% / Serva

klorovodikova kislina 37% / Merck

laktoza ≥99% / Fluka

magnezijev klorid p.a. / Sigma

natrijev acetat p.a. NaAc Merck

natrijev bisulfit p.a. / Parchem

natrijev hidroksid ≥99% / Sigma-Aldrich

natrijev karbonat ≥99,9% / Fluka

natrijev klorid ≥99,9% / Merck

ocetna kislina 100% / Merck

saharoza ≥99% / Fluka

Sepharose 4B / Pharmacia Fine Chemicals

Sephacryl S-200 / Pharmacia Fine Chemicals

tekoči dušik / Tehnični plini Jesenice

trifluorocetna kislina ≥99,5% TFA Pierce Chemical Company

tris-(trihidroksimetil)aminometan) p.a. TRIS Serva

31


1.2Pufri in raztopinepufer ali raztopina sestava proizvajalecratopina za ekstrakcijo 1 0,003 M Na2S2O3

0,3 M NaCl

raztopina za ekstrakcijo 2 0,003 M Na2S2O3

0,3 M NaCl0,2 M TRIS

raztopini za spiranje sefaroze 0,5 M Na2CO3,0,02 M NaOH

pufer za afinitetno 1 0,3 M NaCl, 0,05 M EDTA, 0,05 M TRIS/HClpH 7

pufer za afinitetno 2 0,3 M NaCl0,005 M CaCl2

0,005 M MgCl2

0,05 M TRIS/HClpH 7

raztopina za elucijo 0,02 M NaOH pufer za nevtralizacijo 2 M TRIS/HCl

pH 6,5pufer za gelsko 0,1 M NaAc

0,3 M NaCl0,001 M EDTApH 5,5

BioRad fosforna kislinametanolCoomassie Brilliant Blue 250

BioRad Laboratories

Phast SDS PAGEgradientni poliakrilamidni gel PhastGel™ Gradient 8-25 GE Healthcare Bio Science AB2x nanašalni pufer 0,02% bromfenolmmodro

0,002 M EDTA5 % SDS0,02 M TRIS/HCl pH 8

pufer za elektroforezo PhastGel™ SDS Buffe Strips Amersham Bioscienceraztopina za barvanje gela C45H44N3NaO7S2

(Coomassie Brilliant Blue)Sigma-Aldrich

raztopini za razbarvanje gela 30 % etanol10 % ocetna kislina10 % etanol5 % ocetna kislina

32


Standardi za Phast SDS-PAGE:fosforilaza B 94 kDa karboksianhidraza 30 kDagoveji serumski albumin 67 kDa tripsinski inhibitor 20,1 kDajajčni albumin 43 kDa α-laktalbumin 14,4 kDa

1.3Aparature in pripomočkiaparatura oz. pripomoček proizvajalec

centrifuga Sorvall RC 5C PLUS, Kendocentrifuga za epice Eppendorf Centrifuga 5410črpalka za gelsko elektroforezo Technica AutoAnalyser Proportioning Pumpčrpalka za ustvarjanje podtlaka AEG, tip: AMEB08FY4R3N1dializno črevo Servapor, Servasistem za elektroforezo Phast System Separation and Control Unit, LKBaparatura za slikanje gela intiskalnik

UVI tec,Mitsubishi P90

HPLC Helwett Packard Sunic 1100HPLC kolona Chromsep C8 HPLC column 100 × 3,0 mmliofilizator Hetosicc, Heto Lab equipmentmagnetna mešala Rotamix 560 MM,

Rotamix 606 MMMikrovalovna pečica Daewoo KOR 618TpH meter Mettler Toledo Seven Easypipete BioHit (0,5-10; 10-100; 100-1000),

Eppendorf Researchrotor za centrifugo Sorvall GSAstresalnik za barvanje gela Grant Boekel BFR25tehtnica Mettler Toledo PC 200,

Mettler Toledo AG 245ultrafiltri (in membrane) Amicon 8400 oz. 8200 (Amicon 3,5 kDa)UV/VIS spektrofotometer (A280) Perkin Elmer UV/VIS Spectrometer Lambda 11UV/VIS spektrofotometer (A340-240) Perkin Elmer UV/VIS Spectrometer Lambda 18UV/VIS spektrofotometer (Biorad) Tecon, Safire (V 2.20 08/02)vakuumski sušilnik Savant SpeedVac Plus SC110Avorteks MS1 Minishaker, IKAzamrzovalnik Gorenje

33


1.4Glivni materialiAgaricus campestris travniški kukmakArmillaria mellea sivorumena mraznica; prava štorovkaBoletus calopus leponogi goban; rdečebetni gobanClitocybe geotropa pozna livkaClitocybe nebularis meglenka; poprhnjena livkaCortinarius caerulescens višnjeva koprenkaCortinarius glaucopus kolobarniška koprenkaGeastrum sessile resasta zvezdicaHebeloma radicosum korenasta medlenkaHebeloma sinapizans redkvičasta medlenkaHygrophorus pudorinus hojeva polževkaLactarius cilicioides kocasta mlečnicaLactarius deliciosus užitna sirovkaLactarius piperatus poprova mlečnicaLactarius scrobiculatus jamičasta mlečnicaLepista nuda vijoličasta kolesnicaLycoperdon perlatum betičasta prašnicaMacrolepiota procera orjaški dežnikRamaria formosa lepa grivaRussula albonigra črnjava golobicaSarcodon imbricatus rjavi ježevecSuillus granulatus ovčarska lupljivkaTricholoma bufonium krastačja kolobarnica

1.5Inhibitorji proteaz

vir inhibitorja ime inhibitorjabučka Curcubita maxima Trypsin Inhibitorkrompir Potato Serine Protease Inhibitorkrompir Protease Inhibitor 2krompir Potato Cysteine Protease Inhibitormeglenka Clitocybe nebularis Serine Protease Inhibitormeglenka klitocipin

1.6Lektini

Lektine smo izolirali iz vodnega ekstrakta meglenke (Clitocybe nebularis), nabrane na

Krasu leta 2005. Ločili in poimenovali smo jih glede na specifičnost za saharide in velikost

oziroma navidezno maso, določeno z Phast elektroforezo.

34


2Materiali, uporabljeni pri pripravi gojišč

2.1Gojišča

sestavina proizvajalecdestilirana voda pridobljena z MiliQ plus 185, Milliporeagar Agar Technical Biolife Italianasladkor Kandit, kuhinjski sladkor (saharoza)sadni sok Fructal, 100% sok jabolko kvas Alltech Fermin a.d.Nipagin (para-metilhidroksibenzojska kislina),

10%

Clariant

Propionska (propanojska) kislina Sigma-Aldrichkoruzna moka Mlinotest saharoza, p.a. Flukalaktoza, p.a. Flukagalaktoza, p.a. Flukaglukoza, p.a. Fluka

2.2Aparature in pripomočki

aparatura proizvajalectehtnica Mettler Toledo AB304-S/FACTgrelna električna plošča Corona EKA 10 KSvodna kopel brez oznake, grelno območje 35-80°Chladilnik Gorenjelupa Leica MZ 95

vir svetlobe za lupo Leica CLS 100xinkubator Kambič I-190 EK

2.3Kulturi vinske mušice

Kultura 1 divji tip, Univerza v Queenslandu, AvstralijaKultura 2 divji tip - Canton S, Univerza v Indiani, ZDA

35


3METODE

Gojišča in optimizacija gojenja vinske mušice

Testna gojišča smo pripravili na NIB največ en dan pred prenosom jajčec in jih hranili v

hladilniku (5-8°C). Na zalogi smo imeli pripravljena gojišča za vzdrževanje kulture vinske

mušice ter gojišča za odlaganje jajčec.

Nipagin je 10% raztopina para-metilhidroksibenzojske kisline v 96% etanolu.

Gojišče 1

3,5 g agarja

3,4 g sladkorja

65 ml dH2O

35 ml sadnega soka

Vodo in agar smo zmešali v čaši in zavreli na električni

plošči. Dodali smo sladkor in sadni sok ter ponovno zavreli.

Odstranili smo z ognja in z enakomernim mešanjem

zmanjšali količino mehurčkov. Gojišče smo ulili v petrijevke

oziroma izbrano posodo. Količina zadostuje za 20 petrijevk.Uporabili smo ga predvsem za podlago, na katero so mušice odlagale jajčeca. Preizkusili

smo ga tudi kot gojišče za preživetje larv in dozorevanje v odrasle mušice (preglednica III).

Gojišče 2

1,2 g agarja

3,2 g sladkorja

8,5 g kvasa

5 g koruzne moke

100 ml dH2O

1,1 ml Nipagina

0,5 ml propanojske kisline

Agar, sladkor, kvas in moko smo suspendirali v vodi in

zavreli. Počakali smo, da se shladi na približno 60°C, nato

dodali še Nipagin in propanojsko kislino. Preden se je gel

strdil, smo ga ulili v izbrane posode.

Opisano gojišče se uporablja za gojenje in vzdrževanje

kulture vinske mušice na NIB-u. Uporabili smo ga v več

poskusih (preglednica III, IV,…).

Gojišče 3

2 g agarja

10 g kvasa

0,5 ml Nipagina

100 ml dH2O

Sestavine smo zmešali v vodi in zavreli. Ko so se shladile na

60°C, smo dodali Nipagin. Preden se je gel strdil, smo ga

ulili v izbrane posode (preglednica III, IV).

Gojišče smo zasledili v znanstvenem članku [77], kjer so

prav tako gojili vinsko mušico in merili insekticidni učinek.

36


Gojišče 4

Osnovno gojišče, ki smo ga izbrali po optimizaciji, smo priredili tako, da smo sestavine

zavreli v 75% predpisane vode in s tem pridobili topilo (preostalih 25% vode) za liofiliziran

ekstrakt. Tako pripravljeno gojišče smo ohladili na 50°C in ga vzdrževali na tej temperaturi

v vodni kopeli.

V manjšo čašo smo odpipetirali 75% končnega volumna gojišča (4,5 ml) in dodali

raztopljen vzorec (1,5 ml) in tako dobili 6 ml končnega gojišča za 5 paralel (5x1 ml). 1 ml

rezerve smo imeli zaradi morebitnih izgub (npr. oprijemanje gojišča na stene čaše).

Količine vgrajenih liofiliziranih ekstraktov so navedene v preglednicah V, VI, VII v

podpoglavju III.3.4.2.

Gojišče 5

Gojišče, izbrano po optimizaciji, smo pripravili po postopku opisanem v (III. 2. 1. 4), le da

smo ga pripravili v 50% predpisane dH2O. Ostalih 50 % tekoče faze so bili raztopljeni

proteini: inhibitorji proteaz, laktozil specifični lektini, BSA. Natančnejši podatki o

vgrajenih proteinih so navedeni v preglednici VIII v podpoglavju III.3.4.3.

Gojišče 6

dve mešanici izoliranih lektinov (laktozil in galaktozil specifični lektini) ter trije čisti lektini

(glukozil, saharozil in en očiščen laktozil specifičen lektin 19 kDa) (slika 9, IV.3.1).

V dveh koncentracijah vseh petih vzorcev (C2, C4) smo preizkusili tudi insekticidni učinek

raztopine lektinov v prisotnosti sladkorja (C2+, C4+), komplementarnega vzorčnemu lektinu

(preglednica IX, X; III.3.4.4).

Opazovali smo vpliv samih sladkorjev na razvoj vinske mušice. Pripravili smo 5 kontrolnih

gojišč: v prvo kontrolno gojišče smo dodali le dH2O. Za preostala 4 kontrolna gojišča smo v

dH2O raztopili ustrezno količino laktoze, galaktoze, saharoze ali glukoze (preglednica IX,

X; III.3.4.4) in vmešali v pripravljeno gojišče 6.

37

1 g agarja

10 g kvasa

100 ml dH2O

1,1 ml Nipagina

0,5 ml propanojske kisline

Kvas in agar smo suspendirali v 75% predpisane dH2O,

ohladili na približno 60°C, dodali Nipagin ter propanojsko

kislino in tako pripravljeno gojišče vzdrževali na 50°C na

vodni kopeli. Preostalo dH2O smo uporabili kot topilo za

lektine (in sladkorje). V preglednici IX (III.3.4.4.) so

navedene koncentracije vmešanih lektinov v gojišče 6:


Gojišče 7

Sestavine gojišča 7 so ustrezale sestavinam gojišča 2 (III.3.1.2) brez sladkorja (saharoze),

postopek priprave pa je že opisan pri gojišču 6 (III.3.1.6). Prav tako smo pripravili tudi 5

kontrolnih gojišč, brez sladkorja in s saharozo, laktozo, galaktozo in glukozo (preglednica

IX, X; III.3.4.4).

Izbira gojišča

Pri vseh poskusih smo na testno gojišče prenesli po 10 jajčec, ki so jih samice vinske

mušice odložile na gojišče 1. Da bi se izognili prevelikemu vplivu drugih dejavnikov (npr.

genetska kakovost jajčec), napakam pri prenosu jajčec na gojišča in ostalim napakam pri

delu, smo vse teste izvedli vsaj v 5 paralelah.

Za odlaganje jajčec, ki smo jih uporabili v raziskovalne namene, smo uporabili gojišče 1 v

petrijevkah, na katerega smo kanili kapljico kvasa in tako stimulirali samice k odlaganju.

Jajčeca vinske mušice smo gojili v inkubatorju (Kambič I-190 EK) pri stalni temperaturi

25°C in po prvem poskusu še ob največji možni vlažnosti. Zagotovili smo jo s stalnim

dodajanjem vode v petrijevko na dnu inkubatorja do nastanka bub. Občasno smo gojišča z

razvijajočimi mušicami prezračili in ob tem zapisali skladnosti in odstopanja od

pričakovanj. Preživele muhe smo prešteli 14. dan.

Uporabili smo dve kulturi vinske mušice: prva je bila kultura divjega tipa vinske mušice,

prinesena iz raziskovalnih laboratorijev Univerze v Queenslandu, Avstralija, druga je bila

kultura divjega tipa Canton S, pridobljenja iz zaloge iz Bloomingtona, Univerza v Indiani,

ZDA. Slednjo smo uporabili pri testiranju insekticidnega delovanja očiščenih lektinov

(III.3.4.4)

Za izvedbo testiranja insekticidnega delovanja liofilizatov in proteinov smo izbirali med

tremi gojišči različne sestave (III.3.1.1 - III.3.1.3). Zanimalo nas je, na katerem gojišču se iz

odloženih jajčec razvije največ odraslih mušic z najmanjšim variacijskim razmikom.

Uporabili smo posodice s 2r=2,5 cm in h=3,5 cm, zaprli smo jih s plastičnim zamaškom, na

katerem smo naredili 10 luknjic z iglo. Poskus smo izvedli v 10 paralelah.

Preglednica III: Izbira gojišča za testiranja na modelu vinske mušice; sestava podana v III.3.1.1 - III.3.1.3

vrsta gojišča gojišče 1 gojišče 2 gojišče 3 gojišče 3 gojišče 3volumen uporabljenega gojišča 1 ml 1 ml 1 ml 1,5 ml 2 ml

38


Vzporedno smo naredili še 5 paralel gojišča 2. Stehtali smo posodice z gojiščem in bubami

(m1), nato iz njih prenesli bube in stehtali posodice brez bub (m2) in bube (m3). Izračunali

smo povprečno maso ene bube iz razlike mas (m1-m2) oziroma iz mase samih bub (m3).

Pri optimizaciji pogojev gojenja smo izbirali še med različnima načinoma zapiranja posode

in med dvema vrstama posod za gojenje. Posodice 1 so imele dimenzije 2r=2,5 cm in

h=3,5 cm, zaprli smo jih bodisi s plastičnim zamaškom, bodisi s kosmom vate, ki smo ga

navlažili. Na zamaških smo naredili 10 luknjic z iglo. Posodice 2 so imele dimenzije

2r=1 cm in h=3,5 cm, zapirali smo jih s kosmi navlažene vate. Poskus smo izvedli v 10

paralelah. Uporabili smo gojišče 2.

Preglednica IV: Izbira posode in načina zapiranja, razloženo v besedilu

volumen uporabljenega gojišča 2 1 ml 1 ml 2 ml 2 ml 1 mlvrsta posode,

način zapiranja

posoda 1,

zamašek

posoda 1,

vata

posoda 1,

zamašek

posoda 1,

vata

posoda 2,

vata

Priprava liofiliziranih ekstraktov izbranih gliv

Nabor naših gliv je obsegal 23 pravih gob iz razreda podstavkovnice (Basidiomycetes), in

sicer iz vseh treh podrazredov: listarice, nelistarice in trebuharice. Vse so bile nabrane v

Sloveniji med leti 2002 in 2005. Gobe je determiniral g. Andrej Piltaver. Testirali smo

liofilizirane ekstrakte gob, katerim smo odstranili molekule, manjše od 3,5 kDa.

Priprava ekstrakta iz gob

Gobe so bile po nabiranju strokovno determinirane, označene in hranjene na -70°C. Za

pripravo vodnega ekstrakta smo gobe odtalili v mikrovalovni pečici, dobro premešali,

pregnetli in iztisnili sok. Ekstrakt smo precedili skozi plenično podlago in odstranili večje

koščke gobjega tkiva. Tako pripravljene ekstrakte smo uporabili za pripravo suhega

(liofiliziranega) ekstrakta.

Dializa

Dializno cev, celofansko črevo z velikostjo por, ki zadržijo molekule z relativno molsko

maso večjo od 3,5kDa, smo sprali z dH2O. Odmerili smo do 100 ml našega ekstrakta v

dializno cev, zamašili s stiščki in potopili v 5 l dH2O. Pripravljeno smo postavili na

magnetno mešalo in mešali v hladni sobi (t=16 ur, T=4°C).

39


Centrifugiranje

Dializirane vzorce smo prelili v ustrezne posode za centrifugiranje, jih uravnotežili,

namestili v rotor in centrifugirali 15 minut pri obratih 9,000 min-1 pri 4°C. Po

centrifugiranju smo za liofilizacijo uporabili supernatant, oborino pa smo zavrgli.

Liofilizacija

Liofilizacija je postopek sušenja z dehidracijo pri nizki temperaturi (ponavadi med -30°C

do -50°C, tudi do -70°C) pod znižanim pritiskom (do 200 Pa). Ti pogoji omogočajo

sublimacijo vode in s tem sušenje. Tako posušen material se lažje ponovno rehidrira, kajti

led, ki sublimira, pušča mikroskopske pore. Ustrezno shranjen posušen vzorec je

obstojnejši, saj je preprečeno delovanje tako mikroorganizmov kot encimov.

Vzorec, 50 - 150 ml supernatanta izbrane gobe, smo prelili v bučko z obrusom in vanjo

namestili nastavek, ki nam je omogočal, da smo lahko bučko trdno držali na ustrezni

oddaljenosti (25 - 30 cm) in vrteli okrog vertikalne osi. Med vrtenjem smo bučko pomočili

v tekoči dušik v Dewarjevi posodi in vzorec zamrznili. Vrtenje omogoči, da se vzorec

porazdeli po čim večji površini stene bučke v enakomerni tanki plasti, kar je pomembno za

enakomernost sublimacije. Bučko z zamrznjenim vzorcem smo pritrdili na liofilizator

(Hetosicc). Po določenem času (3-6 ur, odvisno od količine vzorca in higroskopnosti suhe

snovi v vzorcu) smo liofiliziran ekstrakt označili in shranili na -70°C.

V kolikor se je vzorec med liofilizacijo odtalil, smo postopek ponovili.

3.1Izolacija in čiščenje lektinov

Specifičnost lektinov na monosaharide in disaharide je bila osnova, glede na katero smo

lektine izolirali (ločili) in poimenovali.

Priprava ekstrakta iz meglenke

Za izolacijo lektinov smo pripravili več litrov ekstrakta iz meglenke (Clitocybe nebularis).

Gobe smo odtalili v mikrovalovni pečici. Dodali smo 5 g Na2S2O3 in 17,5 g NaCl na 1 kg

gob, dobro premešali, pregnetli in iztisnili tekočino. Gobje tkivo smo nato macerirali

raztopini za ekstrakcijo 1 oz. 2 v količini, ustrezni 30% začetne teže gob, približno

30 minut, in iztisnili nastali sok. Postopek smo še enkrat ponovili. Skupni ekstrakt smo

precedili skozi plenično podlago in odstranili večje koščke gobjega tkiva.

Uporabili smo dve različni raztopini za ekstrakcijo:

40


1. 0,003 M Na2S2O3, 0,3 M NaCl v dH2O

2. raztopina za ekstrakcijo 1 z 0,2 M TRIS, pH 11. Tako pripravljen ekstrakt smo pred

nanosom na kolono za afinitetno kromatografijo nevtralizirali z 1 M HCl.

Ekstrakt smo pred nanosom na sefarozo centrifugirali in uporabili supernatant.

Afinitetna kromatografija

Afinitetna kromatografija je metoda ločevanje biokemičnih mešanic na osnovi visoko

specifične reverzibilne biološke interakcije (npr. antigen-protitelo, encim-substrat,

receptor-ligand). Uporablja se za čiščenje in koncentriranje molekul iz mešanice ali

odstranjevanja le-teh iz raztopine; lahko tudi za ugotavljanje specifičnosti vezave molekul.

Po nanosu vzorca s kolone speremo nevezane molekule, vezane pa izperemo (eluiramo) s

spremembo pogojev (pH, ionska moč, kompetitivni agonist,…). Odvisno od namena

zbiramo izprane, specifično vezane molekule (eluat), redkeje pa tudi sprane, nevezane

molekule. Najpogosteje se za stacionarno fazo uporablja substituirana sefaroza z 2, 4 ali

6% vsebnostjo agaroze (od tod tudi poimenovanje: sefaroza 2B, 4B ali 6B). Tu sefaroza ne

deluje kot matriks za ločevanje po velikosti, saj z aktivacijo (npr. z divinilsulfonom,

CNBr,…) lahko nanjo vežemo različne ligande in tako to vrsto gelske kromografije

nadgradimo v afinitetno kromtografijo. Z divinilsufonom aktivirana sefaroza reagira z

amino, hidroksilimi in sulfhidrilnimi skupinami in omogoča vezavo mnogim ligandom.

Pripravili smo 4 različno substituirane sefaroze po sledečem postopku:

100 ml sefaroze 4B (Sepharose 4B, Pharmacia) smo večkrat sprali na nuči z 1 l 0,5 M

Na2CO3 (pH=11), jo nato suspendirali v 100 ml 0,5 M Na2CO3 in po kapljicah dodajali

10 ml divinilsulfona. Po 70 minutah nežnega stresanja na sobni temperaturi smo jo dobro

sprali s približno 2 l 0,5 M Na2CO3 in ponovno suspendirali v 100 ml 0,5 M Na2CO3, ki je

vseboval 10% sladkorja. Pri našem delu smo uporabili laktozo, saharozo, glukozo in

galaktozo. Stresali smo 15 ur pri sobni temperaturi, nato sprali s približno 2 l 0,5 M Na2CO3

in z 1 l pufra za afinitetno kromatograijo (1 ali 2) in nevtralizirali preostala aktivirana

mesta. Shranjevali smo jo v hladni sobi, kot konzervans pa smo uporabljali 10% NaCl v

ustreznem pufru za afinitetno kromatografijo. Skladno z izbiro pufra za izvedbo afinitetne

kromatografije, smo izbrali tudi pufer za spiranje substituirane sefaroze.

Uporabili smo 4 različne raztopine za izvedbo afinitetne kromatografije:

1. pufer za afinitetno 1 (0,3 M NaCl, 0,05 M EDTA, 0,05 M TRIS/HCl pH 7, dH2O)

2. pufer za afinitetno 2 (pufer za afinitetno 1 brez EDTA z 0,005M CaCl2, 0,005M MgCl2)

41


3. raztopina za elucijo (0,02 M NaOH, pH 12)

4. pufer za nevtralizacijo (2 M TRIS/HCl, pH 6,5).

V stekleno kolono (2r=4 cm, h=15 cm) smo nalili 100 ml s sladkorjem substituirane

sefaroze (laktozil, saharozil, glukozil ali galaktozil substituirana) in sprali s pufrom za

afinitetno (1 oziroma 2). 200 ml ekstrakta smo dodali ali 2,92 g EDTA ali 95,2 mg MgCl2

in 147 mg CaCl2 × 2 H2O in nanašali na kolono s približnim pretokom 6 ml/min. Spirali

smo s pufrom za afinitetno (1 oziroma 2) s približnim pretokom 15 ml/min, dokler A280 ni

padla pod vrednost 0,020. V nevezanem ekstraktu so ostali nespecifični lektini, ostali

vodotopni proteini in polisaharidi ter ostale dragocene molekule, zato smo ga ustrezno

označili in shranili na -70°C. Vezane proteine smo izprali s spremembo pH na pH 12 z

0,02 M NaOH. Eluat smo lovili v epruvete (največ po 10 ml na epruveto), v katere smo

predhodno odpipetirali 1 ml pufra za nevtralizacijo s pH 6,5. Pomerili smo A280 in vrednosti

prikazali v grafu. Proteinske vrhove smo ločeno združili in koncentrirali s pomočjo

ultrafiltracije na koncentracijo približno 1 mg/ml proteina. Dobljene proteine smo

koncentrirali in identificirali s Phast SDS-PAGE elektroforezo.

Gelska filtracija

Gelska filtracija je metoda ločevanja komponent vzorca na osnovi razlik v velikosti

molekul. Manjše molekule lažje vstopajo v tekočino, ujeto v porah v gelu in se tako dalj

časa zadržijo na koloni, večje pa potujejo hitreje. Ob tem se predpostavlja, da ni

elektrostatskih in ostalih interakcij med gelom in sestavinami vzorca. Ločba poteka na

poroznem gelu, ki je običajno agaroza, lahko pa tudi dekstran, poliakrilamid ali polistiren.

Dimenzije por določa stopnja zamreženosti polimera.

Kolono z 2r=1,8 cm in h=120 cm smo napolnili z gelom Sephacryl S-200 (Pharmacia) in

sprali s pufrom za gelsko (0,1 M NaAc, 0,3 M NaCl, 0,001 M EDTA, pH=5,5). Nanašali

smo po 5 ml vzorca. Filtracija je potekala 24 ur na 4°C s pretokom 19,4 ml/uro. Frakcije

smo zbirali na kolektorju na 30 min. Proteinske vrhove smo ločeno koncentrirali in

identificirali s Phast SDS-PAGE elektroforezo.

RP-HPLC

Reverznofazana tekočinska kromatografija visoke zmogljivosti spada med kolonske

kromatografske metode. Bistvena razlika je v pritisku, ki lahko znaša do 300 barov.

Prednosti te metode so visoka ločljivost, ponovljivost, hitrost ločbe, občutljivost in možnost

avtomatizacije. Stacionarna faza je hidrofobna, mobilna pa hidrofilna, tako da se

42


komponente vzorca ločijo glede na razlike v njihovi hidrofobnosti. Uporablja se v analitske

(identifikacijske) in prepartivne namene za preverjanje čistosti oziroma z dodatno čiščenje

substanc.

Stacionarno faz je predstavljal silikagel z vezanimi alifatskimi skupinami C8 (kolona

Chromsep). Mobilna faza je bila sestavljena iz dveh raztopin: A= 0,1% TFA in B= 90%

ACN v 0,1% TFA. Ob vklopu sistema se je le-ta spiral z 50% mobilne faze B. Pretok na

koloni je znašal 1 ml/min, T=23°C; za delo smo uporabili tri gradiente.

Prvi, za izpiranje kolone pred nanosom vzorca in po končani seriji ločevanj, je trajal

tblank=17 min, in sicer

0-2 A: 100% B: 0%

2-10 A: 100% →0% B: 0% →100 %

10-15 A: 0% → 100% B: 100% → 0%

15-17 A: 100% B: 0%

Drugi, za preliminarno določitev retencijskih časov lektinov, je trajal tprelim=23 min:

0-2 A: 100% B: 0%

2-17 A: 100% → 0% B: 0% → 100 %

17-21 A: 0% → 100% B: 100% → 0%

21-23 A: 100% B: 0%

Tretji, za ločeno zbiranje proteinskih vrhov, je trajal tlektini=49 min:

0-5 A: 100% B: 0%

5-10 A: 100% →50% B: 0% →50 %

10-40 A: 50% →40% B: 50% →60 %

40-42 A: 40% →0% B: 60% →100 %

42-47 A: 0% → 100% B: 100% → 0%

47-49 A: 100% B: 0%Na kolono smo nanašali po 1 ml razredčenega vzorca (100 μl mešanice lektinov in 900 μl

0,1% TFA). Proteine smo zaznali z dvigom absorpcije pri 215 nm. Vrhove smo ločeno

zbirali, nato pa sušili pod znižanim pritiskom v sistemu SpeedVac. Proteine smo nato

raztopili v pufru za afinitetno 2, preverili aktivnost po HPLC z rekromatografiranjem na

laktozil sefarozi ter identificirali S pomočjo Phast SDS PAGE.

43


Ultrafiltracija – koncentriranje

V ultrafilter (Amicon 8400 ali 8200) smo vstavili membrano (Amicon), ki prepušča samo

molekule manjše od 3,5 kDa, in nalili vzorec. V hladni sobi (T=4°C) smo ga postavili na

magnetno mešalo in priklopili na jeklenko z dušikom pri nadtlaku približno 4 bare. Za

razsoljevanje vzorca smo dolili približno 100 ml dH2O k vzorcu, ko smo le tega že

skoncentrirali na nekaj ml. Skoncentriranemu vzorcu smo določili koncentracijo, signirali

in ga shranili v zamrzovalniku na -70°C.

Določitev koncentracije

Merjenje absorbance pri λ=280 nm (A280)

Pri določanju vsebnosti proteinov v vzorcu izkoriščamo dejstvo, da aromatske aminokisline

(triptofan, fenilalnin in tirozin) absorbirajo svetlobo valovne dolžine 280 nm. Te

aminokisline so v veliki večini proteinov zastopane v zelo podobnih deležih, tako da lahko z

merjenjem absorbance, ki jo povzročajo, enostavno ocenimo približno koncentracijo

proteinov v bistrih raztopinah vzorca. Težava nastopi pri raztopinah, ki vsebujejo druge

aromatske spojine, saj te ravno tako absorbirajo svetlobo istih valovnih dolžin.

Koncentracijo proteinov v vzorcu smo določali spektrofotometrično z merjenjem

absorbance na spoktrofotometru Lambda 11 (Perkin - Elmer) v kvarčnih kivetah pri

λ=280 nm (A280). Za oceno koncentracije smo uporabili Beer-Lambertov zakonenačba 1:

»l« je dolžina optične poti (širina kvarčne kivete), ki je bila povsod enaka (1,00 cm), »ε« je

absorpcijski koeficient. V povprečju imajo proteini s koncentracijo c=1mg/ml A280=1,000.

Tako smo lahko ocenili koncentracije proteinov v naših vzorcih. Ključna prednost metode

je enostavnost in hitrost izvajanja, moti pa jo motnost vzorca (koloidni delci, mehurčki,

obarvanost).

Kvantitativno določanje koncentracije proteinov v vzorcu po Bradfordovi metodi

Ta metoda temelji na vezavi kisle raztopine barvila Coomassie Brilliant Blue na arginin in

hidrofobne aminokislinske ostanke v proteinu. Pri tem pride do premika absorpcijskega

maksimuma z λ=465 nm na λ=595 nm. Kompleks je časovno obstojen. Metoda je

enostavna, je linearna v območju od 2 µg/ml to 120 µg/ml, kar zahteva ustrezno redčenje

44

A=c×l×ε


vzorca. Ne interagira z mnogimi primesmi, moti pa jo prisotnost detergentov in močno

alkalen vzorec.

Vzorec, kateremu smo ocenili koncentracijo z merjenjem A280, smo pripravili v večih

razredčitvah, da bi prišel v območje linearnosti metode. 160 µl razredčenega vzorca smo

dodali 40 µl BioRadovega reagenta za določevanje proteinov (fosforna kislina, metanol in

barvilo Coomassie Brilliant Blue G-250). Po 10 minutah smo merili dvig absorbance pri

595 nm proti slepemu vzorcu. Koncentracije proteinov smo izračunali s pomočjo

umeritvene krivulje, ki smo jo naredili z raztopinami BSA različnih koncentracij v območju

0-100 µg/ml. Za redčenje vzorcev, pripravo umeritvene krivulje in slepe vzorce smo

uporabili tri različne raztopine: pufer za nevtralizacijo (TRIS/HCl pH 6,5) in PBS (NaCl,

Na2HPO4 in NaH2PO4, pH 6,8) in dH2O.

Kontinuirano merjenje absorbance med λ =340 do λ=240 nm (A340-240)

Za natančnejšo določitev koncentracije proteinov v vzorcu smo uporabili računalniško

obdelano spektrofotometrično metodo merjenja absorbance med 340 in 240 nm. Vrednosti

absorbance pri posameznih valovnih dolžinah smo prenesli v Excelov program. Na

območju med 340 in 320 nm smo izmerili nespecifično sipanje svetlobe zaradi ozadja

(koloidni delci). Vrednosti smo ekstrapolirali po enačbi premice in izračunali absorbanco

ozadja pri 280 nm. Dobljeno vrednost smo odšteli od odčitane absorbance pri tej valovni

dolžini. Koncentracijo proteinov smo izračuna po Beer-Lambertovem zakonu, upoštevajoč

redčenje vzorca.

SDS PAGE elektroforeza

Elektroforeza je metoda ločevanja proteinov, ki temelji na potovanju nabitih delcev v

električnem polju v zamreženem separacijskem gelu. Hitrost potovanja nativnega proteina

je odvisna od njihovega celokupnega naboja, velikosti in oblike. Ob dodatku anionskega

detergenta, natrijevega dodecil sulfata (SDS), je hitrost odvisna samo od velikosti (mase)

proteina. SDS poruši nativno konformacijo proteina in se nespecifično veže na povprečno

dve aminokislini in tvori negativno nabit kompleks.

Za izvedbo Phast elektroforeze smo uporabili gradientni 8–25% poliakrilamidni gel

velikosti (43 × 50 × 0,45) mm (LKB). Proteinskim vzorcem (okrog 1 mg/ml) smo dodali

enak volumen 2x nanašalnega pufra (0,02% bromfenol modro, 0,02 M TRIS/HCl pH 8,

0,002 M EDTA, 5 % SDS), segrevali 5 min pri 100°C in nanesli na gel (približno 1µl).

Elektroforeza je potekala v 0,112 M NaAc, 0,112 M TRIS pH 6,4 pri 250 V 30min. Gel

45


smo obarvali s Coomassie Brilliant Blue, nato pa razbarvali v dveh korakih: 30 minut v

30% etanolu in 10 % ocetni kislini in v 10 % etanolu in 5 % ocetni kislini čez noč.

Testiranje ekstraktov in proteinov

Učinkovitost (insekticidno delovanje)

Učinkovitost smo določali po sledeči formuli: enačba 2

Število preživelih je bilo število živih muh po 14 dneh, RS pa je predstavljal relativno

smrtnost. Kot drugi statistični parameter je podan variacijski razmik, izračunan :enačba 3

Variacijski razmik je pokazatelj razpršenosti vzorca, podan pri povprečju preživelih mušic.

xmax je najvišja številčna vrednost preživelih mušic, xmin pa najnižja.

Testiranje liofiliziranih ekstraktov

V gojišča smo po že opisanem postopku (točka III.3.1.4: gojišče 4) vnašali različne zatehte

liofiliziranih ekstraktov in nižali vsebnost liofilizata od 6% do 0,125% v treh poskusnih

serijah. Vsebnost liofiliziranih ekstraktov je podana v utežno-volumskih odstotkih,

pripravljali pa smo po 6 ml gojišča.

V prvi seriji smo pripravili gojišča s 6% vsebnostjo liofilizata. V epico smo natehtali

360 mg liofilizata in ga s pomočjo vorteksa raztopili v 1,25 ml dH2O, vmešali v 4,5 ml

pripravljenega gojišča, nato epico poplaknili še z 0,25 ml dH2O in dobili 6 ml gojišča.

V drugi seriji smo po enakem postopku raztopili 120 mg liofilizata in dobili 2% vsebnost

liofilizata v gojiščih.

V tretji seriji smo pomerili učinek le petim najučinkovitejšim liofilizatom, vsebnosti pa so

bile sledeče: 2%, 1%, 0,5%, 0,25%, 0,125%. Po zgoraj opisanem postopku smo pripravili

46

(št. preživelih v testnem vzorcu) (št. preživelih v kontroli)

RS= 1-

(xmax

- xmin

) 2VR=


12 ml gojišča z vsebnostjo 2% (240 mg liofilizata), nato izvedli postopek redčenja.

Odpipetirali smo 6 ml 2% gojišča in mu dodali 6 ml gojišča 2, pripravljenega po postopku

opisanem v točki III.3.1.2, in dobili 12 ml 1% gojišča. Postopek redčenja smo še tri krat

ponovili. V preglednicah so navedeni liofilizirani ekstraki gob, testirani v različnih serijah.

Preglednica V: Liofilizirani ekstrakti gob, uporabljeni v prvi seriji testiranja; natančneje razloženo v besedilu

prva serija testiranja s 6% vsebnostjo liofilizata v gojišču 2jamičasta mlečnica leponogi goban redkvičasta medlenkakocasta mlečnica orjaški dežnik rjavi ježeveckorenasta medlenka pozna livka vijoličasta kolesnicalepa griva sivorumena mraznica višnjeva koprenka

Preglednica VI: Liofilizirani ekstrakti gob, uporabljeni v drugi seriji testiranja; natančneje razloženo v

besedilu

druga serija testiranja z 2% vsebnostjo liofilizata v gojišču 2betičasta prašnica lepa griva sivorumena mraznicačrnjava golobica leponogi goban redkvičasta medlenkahojeva polževka meglenka resasta zvezdicakolobarniška koprenka orjaški dežnik travniški kukmakkorenasta medlenka ovčarska lupljivka užitna sirovkakrastačja kolobarnica poprova mlečnica vijoličasta kolesnica

Preglednica VII: Liofilizirani ekstrakti gob, uporabljeni v tretji seriji testiranja; natančneje razloženo v

besedilu

tretja serija testiranja z 2% do 0,125% vsebnostjo liofilizata v gojišču 2 korenasta medlenka meglenka vijoličasta kolesnicaleponogi goban poprova mlečnica /

Presejalno testiranje inhibitorjev in laktozil specifičnih lektinov

Testirali smo dva inhibitorja cisteinskih in štiri inhibitorje serinskih proteaz. Inhibitorje iz

bučke CMTI, krompirja PI-2 in meglenke CNSPI so pridobili po modificiranih postopkih,

opisanih v referenčnih člankih [88, 89, 61], krompirjeva PSPI in PCPI ter klitocipin iz

meglenke pa so izolirali po nemodificiranih postopkih [90, 91, 12] v laboratorijih IJS.

Delno očiščene laktozil specifične lektine smo pridobili z izolacijo iz soka meglenke,

opisano v točkah III.3.3.1-3.3.3, slika 10 (IV.3.3.2)

Vse disperzije proteinov so bile bistre, zato smo koncentracijo ocenili spektrofotometrično

(Lambda 11) pri λ= 280 nm in izračunali potreben volumen raztopin vzorcev (enačba 1,

III.3.3.6.1) . Končna koncentracija dodanih proteinov v gojišču je bila 0,5 mg/ml. Pripravili

47


smo ga po postopku opisanem v (III.3.1.5.). Imeli smo dve kontroli: gojišče brez dodatnih

proteinov in gojišče z 0,5 mg/ml BSA.

Preglednica VIII: Količine vgrajenih inhibitorjev proteaz in laktozil specefičnih lektinov

inhibitor ime Tip inhibitorja A280 Vvz v ml VdH2O v mlbučka CMTI serinski 1,140 2,362 0,368krompir PSPI serinski 1,050 2,857 0,143krompir PI 2 serinski 1,260 2,381 0,619krompir PCPI cisteinski 1,700 1,765 1,235meglenka CNSPI serinski 1,940 1,546 1,454meglenka klitocipin cisteinski 1,960 1,531 1,469meglenka laktozil lektini / 1,550 1,935 1,065kontrola 1 dH2O / 0,000 3,000 /kontrola 2 BSA / 1,000 3,000 0,000Legenda:CMTI [88]: Curcubita maxima Trypsin Inhibitor, RMM= 7,5 kDa,

inhibira tripsin in Hagemanov faktor (XIIa)PSPI [90]: Potato Serine Protease Inhibitor, Kunitzov tip 2, RMM= 22 kDa

inhibira serinske proteazePI-2 [89]: potato Protease Inhibitor 2, RMM= 18 kDa

inhibira tripsin in kimotripsinPCPI [91]: Potato Cysteine Protease Inhibitor, Kunitzov tip 2, RMM= 23 kDa inhibira katepsin I, ne pa tripsina in kimotripsina CNSPI [61]: Clitocybe nebularis Serine Protease Inhibitor, nov, še nedefiniran tip, RMM= 22 kDa

inhibira serinske proteazeklitocipin [12]: prvi v soji družini, RMM= 16,8 kDa

inhibira papain, katepsin L , katepsin B in bromelain, ne pa katepsina Hlaktozil lektini delno očiščeni laktozil specifični lektini,

RMM= 19 kDa, 15 kDa in 14 kDa (slika 10, IV.3.3.2)RMM= relativna molekulska masa

Testiranje očiščenih lektinov

Raztopinam očiščenih lektinov smo ocenili koncentracijo in izračunali volumne raztopin, ki

smo jih uporabili za pripravo gojišč. Ločeno smo redčili gojišča C1, C3 in C5 ter ločeno

C2, C4, C2+ in C4+. V gojišča C2+ in C4+ smo dodali tudi komplementarni sladkor v

končni koncentraciji 0,2 M. Naredili smo tudi 5 kontrolnih gojišč, eno brez sladkorja in 4 s

sladkorji v končni koncentraciji 0,2 M. Uporabili smo gojišče 6 in gojišče 7, pripravljali

smo pa samo po 5 ml gojišča. V posodice 2 smo odpipetirali 0,950 ml gojišča z lektini.

Laktozil in galaktozil specifični lektini so sestavljeni iz 3 komponent (n=3), zato je njihova

koncentracija v vseh gojiščih tri krat višja kot koncentracija enokomponentnih saharozil,

glukozil ali laktozil (19) specifičnih lektinov (n=1).

Preglednica IX: Teoretične koncentracije lektinov v gojiščih

C1 C2 C3 C4 C5

48


V=5 ml, n=1 1 mg 0,315 mg 0,1 0,032 mg 0,010 mgkoncentracija 200 µg/ml 63 µg/ml 20 µg/ml 6,3 µg/ml 2,0 µg/mlV=5 ml, n=3 3 mg 0,945 mg 0,3 mg 0,095 mg 0,030 mgkoncentracija 600 µg/ml 189 µg/ml 60 µg/ml 18,9 µg/ml 6,0 µg/mln…število vidnih lis lektinov na elektroforeznem gelu (slika 9, IV.3.3.1 in slika 11:3, IV.3.3.3 ), C…

koncentracija

Na enem primeru je pokazan izračun potrebnih volumnov vzorca in dH2O. Enaki postopek

smo uporabili tudi za izračun količin za ostale vzorce.

Primer galaktozil specifični lektini:

A280=3,75; n=3

1.) priprava C1, C3 in C5

mkončna= 3,330 mg

V(vz135)= 0,888 ml, dodamo 0,222 ml dH2O

Dobimo 1,110 ml C1=3,00 mg/ml

Odvzamemo 0,110 ml C1, dodamo 0,990 ml dH2O. Ostane 1,00 ml C1


Odvzamemo 0,100 ml C3, dodamo 0,900 ml dH2O. Ostane 1,00 ml C3

Dobimo 1 ml C5=0,03 mg/ml

2.) priprava C2, C4, C2+ in C4+

mkončna= 2,080 mg (2x 1,040 mg)

V(vz22+44+)= 0,555 ml, dodamo 1,645 ml dH2O

Dobimo 2,200 ml C2=0,945 mg/ml.

Odvzamemo 0,200 ml C1, dodamo 1,80 ml dH2O. Ostaneta 2,00 ml C2.


K 1 ml C2, k 1 ml C4 in kontrolnemu gojišču dodamo po 180 mg galaktoze

(3 x 180 mg). Dobimo 1 ml C2+ in 1 ml C4+ ter kontrolno gojišče z 0,2 M vsebnostjo

sladkorja.

Vzorec vmešamo v 3,75 ml gojišča 6 ali 7, pripravljenega v 75% predpisane dH2O. Vsako

epico, v kateri smo vzorce pripravili, izplaknemo z 0,250 ml dH2O in to vmešamo v

gojišče.

49


Preglednica X: Količine raztopin lektinov in zatehte sladkorjev, uporabljene v testiranju insekticidnega

učinka; natančneje razloženo v besedilu

laktozil galaktozil saharozil glukozil laktozil (19)A(vzorca)280 4,300 3,750 1,100 1,200 1,130V(vzorca)1,3,5 0,774 ml 0,888 ml 1,011 ml 0,921 ml 0,985 mlV(dH2O/redčenje) 3,534 ml 3,420 ml 3,298 ml 3,388 ml 3,324 mlV(vzorca)2,2+,4,4+ 0,484 ml 0,555 ml 0,631 ml 0,575 ml 0,615 mlV(dH2O/redčenje) 2,208 ml 2,137 ml 2,060 ml 2,116 ml 2,076 mlm(sladkorja) x 3 3 x 360 mg 3 x 180 mg 3 x 342 mg 3 x 198 mg 3 x 360 mgLegenda:

laktozil…laktozil specifični lektini

galaktozil…galaktozil specifični lektini

saharozil…saharozil specifičen lektin

glukozil…glukozil specifičen lektin

laktozil (19)…laktozil specifičen lektin z velikostjo 19 kDa

50

Lara Kandić: diplomska naloga IV Rezultati

III.REZULTATI

1Optimizacija gojenja vinske mušice

Testirali smo tri gojišča, različna po sestavi (opisana v točkah II.3.1.1.-3.1.3, postopek v

III.3.1.8). Poskus smo izvedli v desetih paralelah.

Preglednica XI: Rezultati izbire optimalnega gojišča in zadostnega volumna gojišča

št. gojišča,

V gojišča

gojišče 1,

1 ml

gojišče 2,

l ml

gojišče 3,

1 ml

gojišče 3,

1,5 ml

gojišče 3,

2 mlšt. preživelih mušic ± VR 0 6,6 ± 1,5 4,8 ± 2,0 6,0 ± 2,0 5,4 ± 2,5Izkazalo se je, da se na prvem gojišču larve niti ne zabubijo. Drugo gojišče je dalo boljše

rezultate kot gojišče 3. Pri slednjem je bil tudi variacijski razmik večji. Za testiranje

liofiliziranih ekstraktov smo uporabljali gojišče 2.

Vzporedno smo želeli preveriti razlike med masami bub in metodo uporabiti za natančnejša

opazovanje insekticidnega delovanja vzorcev (npr. zaostanek v rasti, manjša končna masa).

Uporabili smo gojišče 2, ker je vsebovalo največ hranil, v posodicah 1.

Preglednica XII: Izračunane povprečne mase bub, m1=masa posode z gojiščem in razvitimi bubami, m2=masa

posode z gojiščem po odstranitvi razvitih bub, m3=stehtana masa razvitih bub

Preizkusili smo dve možnosti določanja mase bub. V prvi smo jo izračunali iz razlike mas

posodic pred in po odstranitvi bub iz posode (stolpec (m1- m2)), v drugi pa smo odčitali

maso prenesenih bub v starirane posode (m3). Oba rezultata smo delili s številom bub in

dobili povprečne mase ene bube. Mase se med seboj preveč razlikujejo, da bi na osnovi

razlik lahko sklepali na vpliv na razvoj.

Opazili smo, da se gojišča hitro sušijo in strdijo, kar bi lahko negativno vplivalo na razvoj

larv, saj so le-te ponavadi v sočnem sadju, dokler se ne zabubijo. Kot prvi ukrep smo v

51

mase v mgparalela

m1 m2 (m1- m2) m3 št. bub masa 1 bube

iz (m1- m2)

masa 1 bube

iz m3

1 4955 4940 15,0 10,0 8 1,9 1,32 4837 4828 9,0 7,0 5 1,8 1,43 4867 4853 13,0 9,0 6 2,2 1,54 4901 4886 16,0 9,0 7 2,3 1,35 4893 4880 16,0 9,0 6 2,7 1,5skupno / / 67,0 44,0 32 2,1 1,4


inkubator namestili petrijevko, v katero smo dolivali vodo, in povečali vlažnost zraka.

Drugi ukrep je bil optimizacija razmerja (površina izhlapevanja)/(volumen gojišča) in s tem

zmanjšanje površine, s katere lahko voda izhalepeva iz gojišča ter sprememba načina

zapiranja posodice.

Preglednica XIII: Rezultati izbire vrste posode in načina zapiranja za izvedbo testiranj, natančneje razloženo v

besedilu

količina gojišča 2,posodica,zapiranje

1 ml, posodica 1, vata

1 ml,posodica 1, zamašek

2 ml,posodica 1, vata

2 ml, posodica 1, zamašek

1 ml, posodica 2, vata

št. preživelih mušic ± VR

7,2 ±1,0 7,4 ±1,0 7,4 ± 0,5 7,4 ± 1,0 8,4 ± 0,5

V ožji posodici se je gojišče najmanj izsušilo. Ne le, da je dozorelo 14% več jajčec kot v

širših posodicah, tudi variacijski razmik je manjši. Zato smo v nadaljnjih poskusih uporabili

te posodice in jih zapirali z navlaženo vato.

2Priprava liofiliziranih ekstraktov izbranih gliv

Z našim naborom gob smo želeli pokriti čim širši spekter predstavnikov različnih družin iz

vseh treh podrazredov podstavkovnic. Nekatere med njimi so dostopne v manjši količini,

kar posledično pomeni manj ekstrakta, zato smo testiranja izvedli v večih serijah z različno

vsebnostjo liofiliziranega ekstrakta (III.3.4.2).

Zanimale so nas vodotopne makromolekularne substance vključno s proteini, ne pa

sekundarni metaboliti. Vodni ekstrakt smo dializirali v dializni cevi z velikostjo por, ki

zadržijo molekule do 3,5 kDa. Tako smo odstranili manjše molekule, soli, sekundarne

metabolite in manjše peptide, ostali pa so vodotopni polisaharidi in proteini.

Do razlik v začetnih volumnih je prišlo zaradi različne količine dostopnega glivnega

materiala, ki je vseboval tudi različno količino vode, odvisno tako od vrste kot mikro in

makrookolja. Po dializi se je volumen ekstrakta povečal za 15 do 40%, saj skozi dializno

cev potuje voda v obe smeri. To povečanje volumna ni vplivalo na končno količino

liofilizata, je le podaljšalo čas sušenja. Različne mase liofilizatov kljub enakemu začetnemu

volumnu ekstrakta kažejo na različno vsebnost suhe snovi v ekstraktu.Preglednica XIV: Dobljene mase po liofilizaciji dializiranih ekstraktov gob

52


Vzorec (slovensko ime) Začetni volumen Volumen po dializi Masa po liofilizaciji travniški kukmak 100 ml 133 ml 0,42 gorjaški dežnik 100 ml 135 ml 0,77 gleponogi goban 110 ml 154 ml 0,77 govčarska lupljivka 150 ml 190 ml 0,38 gvišnjeva koprenka 100 ml 135 ml 0,95 gkolobarniška koprenka 100 ml 138 ml 0,70 gkorenasta medlenka 100 ml 145 ml 1,03 gredkvičasta medlenka 150 ml 185 ml 1,42 gužitna sirovka 100 ml 130 ml 0,53 gkocasta mlečnica 100 ml 125 ml 0,99 gpoprova mlečnica 85 ml 115 ml 0,73 gjamičasta mlečnica 150 ml 206 ml 1,38 gčrnjava golobica 67 ml 77 ml 0,25 ghojeva polževka 40 ml 68 ml 0,23 gsivorumena mraznica 150 ml 195 ml 0,81 gpozna livka 86 ml 142 ml 1,29 gmeglenka 100 ml 137 ml 0,42 gvijoličasta kolesnica 150 ml 185 ml 0,93 gkrastačja kolobarnica 61 ml 102 ml 0,40 glepa griva 150 ml 195 ml 1,44 grjavi ježevec 100 ml 155 ml 1,33 gresasta zvezdica 53 ml 76 ml 0,13 gbetičasta prašnica 77 ml 103 ml 0,37 g

53


3Izolacija lektinov

Izolacija in čiščenje lektinov iz ekstrakta meglenke

Lektine smo glede na specifičnost vezave štirih različnih saharidov (disaharidov laktoze in

glukoze ter monosaharidov, galaktoze in glukoze) izolirali iz ekstrakta meglenke po

postopkih, opisanih v III.3.3.1-3.3.7.

1 l ekstrakta smo dodali 14,6 g EDTA in spirali s pufrom za afinitetno 1, eluirali pa z

0,02 M NaOH. Postopek smo večkrat ponovili in dobili ponovljive rezultate. Elucijske

vrhove smo ločeno koncentrirali in identificirali s pomočjo Phast SDS-PAGE. Lektine smo

poimenovali glede na specifičnost na saharid in na njihovo navidezno molekulsko maso in

jih uporabili v poskusih, opisanih v točki III.3.4.4.

V primeru laktozil specifičnih lektinov se je po SDS-PAGE izkazalo, da je v prvem vrhu

prisotna lisa z ocenjeno velikostjo 19 kDa (slika 6) v manjši koncentraciji, v drugem pa

smo identificirali tri lise z ocenjenimi velikostmi 19 kDa, 15 kDa in 14 kDa (slika 6).

Koncentrat prvega vrha je bil rjavkasto obarvan in moten, zato ga nismo uporabili v nadalje

obravnavali. Velikost in molsko maso smo ocenili glede na standarde (LMW).

↓

Afinitetna kromatografija laktozil specifičnih lektinov

↓ nanos NaOH ↓sprememba pH

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

0 5 10 15 20 25 30

epruveta

A28

0

06.09.06/pH 7 07.09.06/pH 7 12.09.06/pH 11

Graf 1: Elucija laktozil specifičnih lektinov po afinitetni kromatografiji; pH 7 = za ekstrakcijo soka uporabljena raztopina za ekstrakcijo 1, pH 11= za ekstrakcijo soka uporabljena raztopina za ekstrakcijo 2

54


Lektini imajo v alkalnem mediju manjšo afiniteto do saharidov, zato smo se poslužili

alternativnega postopka priprave soka in zvišali pH raztopine za ekstrakcijo. Tako smo

poskusili izolirati večjo količino lektinov, ki v teh pogojih niso bili več vezani na glivne

saharide. Po nevtralizaciji z 1 M HCl smo vzorec nanesli na pripravljeno sefarozo,

obravnavali po opisanem postopku (III.3.3.3) in identificirali s SDS-PAGE (slika 7).

Na grafu 1 so prikazani elucijski vrhovi laktozil specifičnih lektinov iz soka meglenke,

pripravljenega z raztopino za ekstrakcijo 1 (pH 7) in 2 (pH 11).

1…LMW standard

2…prvi elucijski vrh

3…drugi elucijski vrh

1 2 3

Slika 6: Eluati laktozil specifičnih lektinov

iz laktozil afinitetne kroamtografije

1…LMW standard

2…laktozil specifični lektini

z raztopino za ekstrakcijo 1

(vrh 2 07.09.06/pH 7)

3… laktozil specifični lektini

z raztopino za ekstrakcijo 2

(vrh 2 12.09.06/pH 11)

1 2 3

Slika 7: Eluati laktozil specifičnih lektinov po afinitetni

kromatografiji iz soka, pridobljenega različnimi

ekstrakcijskimi raztopinami

Nekateri lektini za vezavo potrebujejo kofaktorje – ione kalcija, magnezija ali mangana.

Da bi preverili, ali to velja za naše lektine, smo v vzorec dodali EDTA in kelirali prisotne

dvovalentne ione. Izvedli smo afinitetno kromatografijo z laktozil sefarozo s pufrom 1. Kot

protiutež smo drugemu vzorcu dodali CaCl2 in MgCl2, in ga obravnavali enako s pufrom 2.

Lektinom smo po koncentriranju ocenili koncentracijo z A280 in jih identificirali z SDS-

PAGE. Ker se lise na elektroforeznem gelu med seboj niso razlikovale glede na prisotnost

oz. odsotnost ionov, smo sklepali, da laktozil specifični lektini, izolirani iz ekstrakta

meglenke, ne potrebujejo kovinskih kofaktorjev (slika 8).

55


1… laktozil specifični lektini z EDTA

2… laktozil specifični lektini s CaCl2 in MgCl2

3….LMW standard

1 2 3

Slika 8: Vpliv prisotnosti Ca2+ in Mg2+ ionov na afiniteto laktozil specifičnih lektinov

Za izolacijo lektinov, specifičnih za galaktozo, saharozo in glukozo, smo uporabili sok,

pripravljen z raztopino za ekstrakcijo 2. Skoncetrirane elucijske vrhove smo identificirali s

SDS-PAGE in lektine poimenovali glede na specifičnost na saharid in njihovo navidezno

velikost glede na LMW standard.

Afinitetna kromatografija - lektini (preostali 3)

↓ nanos NaOH ↓ sprememba pH

0

100

200

300

400

500

600

0 5 10 15 20 25 30 35

epruveta

A28

0

galaktozil saharozil glukozil

Graf 2: Elucija galaktozil, saharozil in glukozil specifičnih lektinov po afinitetni kromatografiji

56


1… LMW standard

2… galaktozil specifični lektini

3… laktozil specifični lektin

4… glukozil specifični lektin

5… saharozil specifični lektini

1 2 3 4 5

Slika 9: Izolirani lektini iz ekstratka meglenke

Po afinitetni kromatografiji s saharozil in glukozil substituirano sefarozo smo dobili dva

čista lektina: glukozil specifičen z velikostjo 31 kDa in saharozil specifičen 23 kDa. Pri

drugih dveh sefarozah smo iz ekstrakta meglenke izolirali mešanico treh lektinov: tri

laktozil specifične lektine (14 kDa, 15 kDa in 19 kDa) in tri galaktozil specifične lektine z

velikostimi 14 kDa, 15 kDa in 18 kDa (slika 9). Že pri izvedbi afinitetne kromatografije se

je pri eluciji laktozil lektinov iz mešanice delno ločil lektin z ocenjeno maso 19kDa (graf 1,

slika 6). Iz mešanice smo ga želeli vsaj delno očistiti in ločeno izmeriti njegovo

insekticidno delovanje na našem modelu. Kot možni metodi smo izbrali gelsko filtracijo in

reverznofazno HPLC.

Gelska filtracija

Vzorec laktozil lektinov smo poskušali ločiti po molekulski masi s pomočjo gelske

filtracije. Lovili smo frakcije po 10 ml, dobljene proteinske vrhove, ugotovljene z

merjenjem A280, smo skoncentrirali in identificirali z SDS-PAGE. Iz dobljenih rezultatov je

vidno, da je bila delna ločba uspešna.

57


laktozil lektini gelska

0

100

200

300

400

500

600

700

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

epruveta

abso

rban

ca

laktozil lektini

Graf 4: Laktozil lektini po gelski filtraciji

1…začetni vzorec laktozil specifičnih lektinov za gelsko kromatografijo

2…delno očiščen laktozil specifičen lektin 19 kDa (prvi vrh), graf 4

3…vsi trije laktozil specifični lektini (drugi vrh), graf 4

4….LMW standard

1 2 3 4

Slika 10: Laktozil specifični lektini po gelski filtraciji

RP-HPLC

Želeli smo popolnoma ločiti laktozil lektin 19 kDa od drugih dveh (14 kDa in 15 kDa).

Najprej smo morali ugotoviti ali se posamezni lektini med seboj ločijo v gradientu mobilnih

faz (A= 0,1% TFA in B= 90% ACN v 0,1% TFA) od 0% → 100% mobilne faze B in

kakšen retencijski čas imajo oz kolikšen je delež mobilne faze B v gradientu. Za to smo

uporabili preliminarni program (točka III.3.4.2), ki je trajal tprelim=23 min in dobili

58


retencijska časa t1= 9,77 min in t2=9,88 min. Vrhova se nista ločila, zato nismo naredili

elektroforeze.

Graf 5: Preliminarna ločba laktozil specifičnih lektinov na RP-HPLC

Lektinska vrhova smo dobili pri približno 52% mobilne faze B, zato smo ustrezno

prilagodili nov gradientni program (točka III.3.4.2), ki je trajal tlektini=49 min. Nova

retencijska časa sta znašala t1= 15,43 min in t2=16,76 min. Vrhove smo ločeno zbirali, nato

pa sušili pod znižanim pritiskom v sistemu SpeedVac. Proteine smo nato raztopili v pufru

za afinitetno 1 ter identificirali z pomočjo SDS-PAGE.

Graf 6: Ločba laktozil specifičnih lektinov na RP-HPLC

59


1…LMW standard

2…19kDa

3…14 kDa in 15 kDa, ostanki 19 kDa

1 2 3

Slika 11: Ločba laktozil specifičnih lektinov na RP-HPLC

Določitev koncentracije izoliranih lektinov

Izoliranim lektinom v raztopini smo ocenili koncentracijo z merjenjem A280. Oborjene snovi

smo iz vzorca odstranili s centrifugiranjem. V supernanatnu so lahko ostali manjši koloidni

delci, na katerih se svetloba nespecifično sipa. Za natančnejšo določitev koncentracije smo

se odločali med kvntitativnim merjenjem po Bradfordu (BioRad) in med merjenjem

absorbance med 340 in 240 nm. Skupni rezultati so podani v preglednici XV.

Kvantitativno merjenje koncentracije po Bradfordu

Na IJS se za kvantitativno merjenje koncentracije po Bradfordu uporablja metoda BioRad

Protein Assay (opisano v III.3.3.5.2)

Pri pripravi vzorcev z destilirano vodo smo dobili ustrezno umeritveno krivuljo, izračunane

koncentracije proteinov v vzorcu pa so bile nizke (preglednica XVI), kar se ni ujemalo z

rezultati, vidnimi na elektroforeznem gelu.

Pri meritvi s pufrom za nevtralizacijo TRIS/HCl pH 6,5 nismo uspeli dobili niti umeritvene

krivulje, iz česa smo sklepali, da reagent ni kompatibilen s pufrom TRIS/HCl pH 6,5.

S PBS smo dobili ustrezno umeritveno krivuljo. Izračunane koncentracije proteinov v

vzorcih so bile nizke oz pod mejo detekcije.

60


Merjenje absorbance med 340 in 240 nm

S to metodo ocenimo absorbanco ozadja, ki jo odštejemo vrednosti A280. Pri valovni

280 nm dolžini absorbirajo tudi druge aromatske snovi in drugi proteini, katerih

koncentracija je pod mejo detekcije na SDS-PAGE gelu, vendar smo večino odstranili med

dializo in ultrafiltracijo.

Primer A340-A240: laktozil lektini, izračun koncentracije (faktor redčenja = 10)

y= - 0,0003×280 +0,1451=0,0611

A280=0,4917 - 0,0611= 0,4306

c340-240=4,306 mg/ml

laktozil lektini

0,491744

= 0,0611y = -0,0003x + 0,1451

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

230 280 330

Graf 3: Laktozil specifični lektini (A340-A240)

Preglednica XV: Primerjava koncentracij lektinov v vzorcih po treh metodah, natančneje razloženo v besedilu

Pri izračunu potrebnih volumnov raztopin lektinov za dosego teoretične koncentracije v

vzorcu smo upoštevali rezultate merjenja absorbance A340-A240.

61

v mg/ml laktozil galaktozil saharozil glukozil laktozil 19c280 4,930 4,160 1,314 1,467 1,252cBioRad z dH2O 0,278 0,2915 0,065 0,187 0,035cBioRad s PBS 0,194 0,480 pod mejo

detekcijepod mejo detekcije

pod mejo detekcije

c340-240 4,306 3,751 1,098 1,205 1,127


4Testiranje liofiliziranih ekstraktov

Iz ekstraktov smo z dializo odstranili molekule, manjše od 3,5 kDa, in tem zožili nabor

potencialnih učinkovin na pretežno proteine in polisaharide. V tej stopnji nismo preverjali

količino proteinov v suhem ekstraktu. V prvi seriji smo pripravili 6% gojišče, za kar smo

potrebovali 360 mg liofiliziranega ekstrakta. V kolikor bi se ekstrakt pokazal kot učinkovit,

bi ga uvrstili v drugo serijo (2% oziroma 120 mg) in nato še v tretjo (od 2% - 0,125%

oziroma 240 mg zaradi postopka priprave gojišča, točka III.3.4.2). Da bi zagotovili

možnosti izvedbe vseh treh serij je bil kriterij za uvrstitev v prvo serijo vsaj 720 mg

liofilizata.

Preglednica XVI: Učinkovitost liofiliziatov dializiranih ekstraktov gob v 1. in v 2. seriji; rezultati podani kot

št. preživelih mušic ± VR in kot RS, enačbi 2 in 3 ► = nadanjevanje testiranja v naslednjo serijo, ◙ = konec

testiranja

Vzorec (slovensko ime) mliofilizata 1. serija RS 2. serija RSkontrola 1 / 7,2±0,5 / 8,2±0,5 /kontrola 2 – albumin / 7,4±0,5 / 8,4±1,0 /travniški kukmak 0,42 g / 6,4±1,5 0,23 ◙orjaški dežnik 0,77 g 0 1 ► 1,2±1,0 0,86 ◙leponogi goban 0,77 g 0,2 ± 0,5 0,97 ► 0 1 ►ovčarska lupljivka 0,38 g / / 8,8±1,0 0 ◙višnjeva koprenka 0,95 g 5 ± 1,0 0,32 ◙ / /kolobarniška koprenka 0,70 g / / 6,6±1,5 0,20 ◙korenasta medlenka 1,03 g 0 1 ► 0,8±0,5 0,90 ►redkvičasta medlenka 1,42 g 0 1 ► 4,8±1,0 0,42 ◙užitna sirovka 0,53 g / / 8,0±1,0 0,04 ◙kocasta mlečnica 0,99 g 2,4 ±1,0 0,68 ◙ / /poprova mlečnica 0,73 g / / 0 1 ►jamičasta mlečnica 1,38 g 5,4 ±1,5 0,27 ◙ / /črnjava golobica 0,25 g / / 6,8±1,5 0,18 ◙hojeva polževka 0,23 g / / 7,8±1,5 0,06 ◙sivorumena mraznica 0,81 g 1 ± 0,0 0,86 ► 5,6±1,0 0,33 ◙pozna livka 1,29 g 6,2 ± 1,5 0,16 ◙ / /meglenka 0,42 g / / 0 1 ►vijoličasta kolesnica 0,93 g 0 1 ► 0 1 ►krastačja kolobarnica 0,40 g / / 7,2±1,0 0,13 ◙lepa griva 1,44 g 0 1 ► 5,6±1,0 0,33 ◙rjavi ježevec 1,33 g 2,6 ± 1,5 0,65 ◙ / /resasta zvezdica 0,13 g / / 7,4±1,5 0,11 ◙betičasta prašnica 0,37 g / / 7,6±1,5 0,08 ◙

62


Izmed 12 vrst, preskušanih v prvi seriji, smo v drugo uvrstili 7, ki so imele RS vsaj 0,85.

V tretjo serijo smo uvrstili najučinkovitejše gobe iz druge serije. Z nižanjem vsebnosti smo

opazovali padec učinkovitosti in z antilogaritmiranjem odčitane vrednosti pri RS=0,5

izračunali LD50. Najbolj toksična je bila meglenka, zato smo v nadaljevanju iz njenega

ekstrakta testirali posamezne izolirane proteine lektinske in inhibitorne narave.

Preglednica XVII: Učinkovitost liofilizatov dializiranih ekstraktov gob v 3. seriji testiranja, natančneje

razloženo v besedilu; rezultati podani kot št. preživelih mušic ± VR in kot RS, enačbi 2 in 3

vsebnost 2% (20 mg/ml)

1% (10 mg/ml)

0,5% (5 mg/ml)

0,25% (2,5 mg/ml)

0,125% (1,25 mg/ml)

izračunanavsebnost za LD50

leponogi goban

0 0 0 3,2 ± 1,0 4,6 ± 1,0 0,30%1 1 1 0,48 0,26

poprova mlečnica

0 0 0,2 ± 0,5 2,2 ± 0,5 4,4 ± 0,5 0,23%1 1 0,97 0,65 0,29

korenasta medlenka

1,0 ± 1,0 2,6 ± 1,50 4,4 ± 1,0 4,8 ± 1,0 4,6 ± 1,5 0,83%0,88 0,58 0,29 0,24 0,26

meglenka 0 0 0 1,4 ± 1,0 2,6 ± 1,5 0,1%1 1 1 0,77 0,58

vijoličasta kolesnica

0,0 ± 0,00 0,0 ± 0,00 2,8 ± 1,0 3,8 ± 1,0 4,0 ± 1,0 0,43%1 1 0,55 0,38 0,35

0,1

0,3

0,5

0,7

0,9

1,1

-0,4 -0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1- log vsebnosti

RS

Leponogi goban Poprova mlečnica Korenasta medlenkaMeglenka Vijoličasta kolesnica

Graf 7: Insekticidni učinek v odvisnosti od vsebnosti liofilizata v gojišču

63


5Presejalno testiranje inhibitorjev in laktozil specifičnih lektinov

Vse raztopine proteinov so bile bistre, zato smo koncentracijo ocenili spektrofotometrično

pri λ= 280 nm in izračunali potreben volumen raztopin vzorcev. Pripravili smo gojišča s

končna koncetracija dodanih proteinov 0,5 mg/ml po postopku opisnem v (III. 2. 1. 5.).

Imeli smo dve kontroli: gojišče brez dodatkov in gojišče z 0,5 mg/ml BSA.

Preglednica XVIII: Presejalno testiranje proteaznih inhibitorjev in laktozil specifičnih lektinov, rezultati

podani kot št. preživelih mušic ± VR ter RS, enačbi 2 in 3

Vir Ime/tip št. preživelih RSbučka CMTI /serinski 8,0 ± 0,0 0 krompir PSPI/ serinski 4,2 ± 0,5 0,45krompir PI-2/ serinski 0 1krompir PCPI/cisteinski 7,2 ± 1,0 0,05meglenka CNSPI/serinski 3,2 ± 1,0 0,58meglenka klitocipin/cisteinski 7,2 ± 1,5 0,05meglenka laktozil specifični lektini 0 1kontrola BSA / 7,8 ± 0,5 /kontrola / 7,6 ± 0,5 /Najbolj toksična v koncentraciji 0,5 mg proteinov na 1 ml gojišča sta bila PI-2 in laktozil

specifični lektini.

1…LMW standardi

2…CMTI, 7,5 kDa

3…PSPI, 22 kDa

4…PI-2, 18 kDa

5…PCPI, 23 kDa

6…CnSPI, 22 kDa

7…klitocipin, 16 kDa

1 2 3 4 5 6 7

Slika 12: Proteinski inhibitorji proteaz, uporabljeni v presejalnem testiranju

64


6Testiranje očiščenih lektinov

Za testiranje lektinov smo uporabili dve gojišči (III.3.1.6 in 3.1.7), da bi preverili vpliv

dostopnih hranil in komplementarnih sladkorjev. LD50 smo izračinali z antilogaritmiranjem

iz grafa odčitane vrednosti za relativno smrtnost 0,5.

Preglednica XIX: Učinkovitost insekticidnega delovanja lektinov v gojišču 6; rezultati podani kot št.

preživelih mušic ± VR ter RS, enačbi 2 in 3, C=koncentracija, razloženo v besedilu

laktozil (vsi) galaktozil saharozil glukozil laktozil 19C1 1,2±1,5 2,4±1,5 0 4,8±1,5 0

0,76 0,52 1 0,04 1

C2 2,8±1 3,6±1,5 0 5,2±1 1,8±10,44 0,28 1 0 0,64

C3 4,8±1 4,2±1 1±1 5,2±0,5 3,8±1,50,04 0,16 0,8 0 0,24

C4 4,8±0,5 4±1 2,6±1 5±1 4±10,04 0,2 0,32 0 0,2

C5 5±1 4,4±0,5 3,6±0,5 5±1 4±10 0,12 0,28 0 0,2

C2+ 1,6±1,5 3,4±1 0±0,0 4,8±0,5 1,4±0,50,68 0,32 1 0,04 0,72

C4+ 1,2±1 3,6±1 3,8±1 4,8±1 1±10,76 0,28 0,24 0,04 0,80

izračunan LD50 76 μg/ml 182 μg/ml 10 μg/ml / 44 μg/mllaktoza galaktoza saharoza glukoza brez

Kontrola 1,2±1,5 3,6±1,5 4,6±0,5 4,8±1,5 5±2

Pri testiranju insekticidnega učinka letkinov v gojišču 6 je bil najbolj toskičen saharozil

specifičen lektin (izračunan LD50=10 μg/ml), nato očiščen laktozil specifičen lektin 19 kDa

(izračunan LD50=44 μg/ml).

65


lektini gojišče 6

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

-2,3 -1,8 -1,3 -0,8 -0,3 - log vsebnosti

RS

Lakt vsi

Galakt

Saharo

Gluko

Lakt 19

Graf 8: Učinkovitost insekticidnega delovanja lektinov v gojišču 6

Preglednica XX: Učinkovitost insekticidnega delovanja lektinov v gojišču 7; rezultati podani kot št. preživelih

mušic ± VR ter RS, enačbi 2 in 3, C=koncentracija, razloženo v besedilu

laktozil (vsi) galaktozil saharozil glukozil laktozil 19C1 4,0±1,5 3,0±1 5,4±1,5 6,2±1,5 0

0,43 0,58 0,23 0,12 1

C2 6,2±1,5 6,2±1,5 6,4±1 7,2±1 2,0±1,50,12 0,12 0,09 0 0,71

C3 7,0±1 6,8±1 6,4±1 6,8±1 5,0±10,0 0,03 0,09 0,03 0,26

C4 6,8±,5 6,8±1 6,8±,5 7,0±1 6,4±0,50,03 0,03 0,03 0,0 0,13

C5 7,0±1 7,0±1 7,2±0,5 6,8±,5 6,6±10,0 0,0 0,0 0,03 0,62

C2+ 6,6±1 6,4±0,5 6,8±1 7,0±1 4,2±1,50,06 0,09 0,03 0,0 0,4

C4+ 7,2±0,5 7,0±1 6,8±0,5 6,8±1 6,8±0,50,0 0,0 0,03 0,03 0,03

izračunan LD50 252 μg/ml 166 μg/ml 1000 μg/ml / 38 μg/mllaktoza galaktoza saharoza glukoza brez

Kontrola 7,0±1,5 6,8±1,5 7,0±1,0 7,0±1,0 6,8±0,5

66


lektini gojišče 7

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

-2,3 -1,8 -1,3 -0,8 -0,3 - log vsebnosti

RS

Lakt vsi

Galakt

Saharo

Gluko

Lakt 19

Graf 9: Učinkovitost insekticidnega delovanja lektinov v gojišču 7

Gojišče 7 je vsebovalo več hranil (koruzno moko) kot gojišče 6. Tu se je opazno znižal

insektidicni učinek saharozil specifičnih lektinov (izračunan LD50=1000 μg/ml), medtem

ko je izračunan LD50 za laktozil specifičen lektin 19 kDa ostal skoraj enak (38 μg/ml).

V tem gojišču se je izgubil toksični učinek samih sladkorjev.

67

Lara Kandić: diplomska naloga V Razprava

RAZPRAVA

Populacija Zemlje se bliskovito povečuje, potrebe po donosnejših virih hrane, predvsem v

nerazvitem svetu, zahtevajo tudi učinkovitejšo in varnejšo zaščito, saj zavedanje o krhkosti

zdravja prehaja iz besed v dejanja. Danes se vsak uporabnik, ko stoji v trgovini pred polico

s pesticidi, vpraša, ali bo ta pesticid deloval samo na izbran ogranizem, kako bo to vplivalo

na druge in nenazadnje name. Iskanje sožitja in spoštovanje do narave ni le modna muha, je

edini način ponovne vzpostavitve ravnotežja in dolgoročnejšega preživetja mnogih vrst,

vključno z našo, na modrem planetu. Potrebno je ne samo prisluhniti ampak tudi odkriti,

razumeti in premišljeno uporabiti rešitve, ki nam jih ponuja narava.

Proteinski insekticidi imajo v spektru naravnih obrambnih substanc najnatančnejše tarčno

delovanje; naša naloga je odkriti na katere druge tarče poleg osnovne še lahko delujejo,

vgrajeni v transgeno rastlino, aplicirani v obliki aerosola. V obeh primerih je v testiranje

potrebno vključiti več modelnih organizmov. Nabor teh je odvisen od tarčnega organizma,

mehanizma delovanja, verig drugih organizmov, ki so v stiku ali s tarčnim ali z varovanim

organizmom. V presejalnih raziskavah se uporabljajo žuželke, katerih gojenje v

laboratorijih ni kompleksno, sicer pa tarčni škodljivci.

Mi smo z nižanjem vsebnosti liofiliziranih ekstraktov 23 vrst podstavkovnic v gojišču

našega modelnega insekta, vinske mušice, izbrali pet najbolj toksičnih. Tem smo poiskali

LD50 in iz ekstrakta najučinkovitejše, meglenke, testirali inhibitorja proteaz ter jih

primerjali z nekaterimi rastlinskimi. Prav tako smo iz gobe meglenke pripravili ekstrakte in

iz njih s pomočjo afinitetne kromatografije izolirali lektine, specifične za štiri različne

saharide. Tudi tem smo poiskali LD50.

7Optimizacija gojenja vinske mušice

Vinsko mušico gojijo v raziskovalne namene že dobro stoletje. Posamezne kulture divjega

tipa se med seboj razlikujejo celo na istem kontinentu po zemljepisnih širinah [44], prav

tako tudi njihove potrebe po hranilih. V splošnem se v agarozni gel vmeša sladkor, kvas in

konzervans, glede na potrebe kulture in potrebe raziskave pa še različno sadje, gobe, etanol,

koruzna ali sojina moka in razni ekstrakti. Težava je v nepoznavanju splošnih potreb

posameznega divjega tip vinske mušice, kot so minimalna sestava, konsistenca in količina

gojišča, izbira in manipulacija z jajčeci, saj se vinska mušica uporablja predvsem v

genetskih raziskavah (vplivi mutacij na razvoj, fiziologijo ipd). Začeli smo z izbiro gojišča.

68


Gojišče 1 vsebuje malo hranil, je trše od ostalih, rahlo opalescentno in se ne uporablja v

namene vzreje vinske mušice, ampak kot podlaga, na katero mušice odložijo jajčeca.

Gojišče 2 uporabljajo na NIB-u kot hranilno gojišče za vzdrževanje laboratorijske kulture

vinske mušice, kot tudi drugje (Bloomington, Tuscon,…[34]), gojišče 3 pa so uporabili v

podobni raziskavi insekticidnega delovanja ekstraktov različnih gob [77]. Na prvem gojišču

se larve niso niti zabubile, na drugem, ki je vsebovalo več hranil, pa so rezultati bili boljši

(več preživelih, manjši variacijski razmik) kot na tretjem. Za testiranje liofiliziranih

ekstraktov smo uporabljali gojišče 2.

Opazili smo, da so se nekatera gojišča začela kmalu sušiti. V bolj posušenih gojiščih je

ostalo nekaj več bub, neizleženih v posušenem gojišču, kot v manj izsušenih. Domnevali

smo, da bi večja količina gojišča podaljšala čas izsušitve vzorca, saj je razmerje med

površino, s katere voda lahko izhlapeva, in volumnom ugodnejše. Preverili smo, ali bi z

navlaženo vato namesto luknjičastega zamaška zadržali več vlage v gojišču. S tem bi

ohranili gojišče mehkejše in bolj podobno naravnim pogojem. Zmanjšanje razmerja

površina/volumen je pozitivno vplivalo na število preživelih mušic. To razmerje je bilo

najugodnejše v posodicah 2 (2r=1 cm → površina=0,785 cm2) kot v posodicah 1

(2r=2,5 cm → površina=4,908 cm2), tudi če smo uporabili 2 ml gojišča. Uporaba enkrat

navlažene vate namesto zamaškov ni bistveno vplivala na število preživelih mušic, vendar

posodica 2 ni imela pripadajočega zamaška. Hkrati smo izkoristili možnost, da smo vato

navlažili prvi in tretji dan po nanosu jajčec in s tem dodatno ohranili višjo vlažnost.

S tehtanjem bub bi natančneje ovrednotili insekticidni učinek liofiliziranih ekstraktov in

proteinov (upočasnitev rasti, manjša končna masa). Opazili smo, da se izračunane

povprečne mase bub med seboj preveč razlikujejo, da bi na osnovi razlik lahko sklepali na

vpliv na razvoj. Težave smo imeli pri odstranjevanju in prenosu bub. Larve namreč izbirajo

bolj suha mesta, kjer se zabubijo. Ta so v poskusnih posodicah bila ali stene ali zamašek

posodice. Nekatere so se zabubile na robovih posodic in smo jih z odpiranjem poškodovali.

Prav tako je bilo možno, da smo med odstranjevanjem iz posodic ali med prenosom na

tehtnico strli lupinico in tu izgubili del mase vzorca. Tako bi izgubili tudi možnost

zanesljivega štetja preživelih mušic, saj smo dopustili možnost, da se insekticidni učinek

izrazi tudi v tej razvojni stopnji. Zato smo se morali zadovoljiti z vrednotenjem

učinkovitosti le z izračunom relativne smrtnosti.

Rezultati bi gotovo bili boljši, če bi izležena jajčeca prebirali, saj se pod mikroskopom vidi,

ali se v jajčecu razvija larva, ki jo je potrebno pazljivo prenesti na gojišče, da je ne

69


poškodujemo; vendar je ta postopek časovno zamuden. Težavo bi predstavljala tudi

količina potrebnih jajčec, saj je za samo 5 vzorcev v 5 paralelah potrebnih 250 jajčec.

8Testiranje liofiliziranih ekstraktov gob

Gobe so bile nabrane v različnih letnih časih, kar je pomenilo poleg drugačnega

mikrookolja tudi različno količino padavin. Nekatere vrste že same po sebi ne vsebujejo

toliko tekočine v bazidiomu, tako da smo iz enakih zateht pridobili različne količine soka.

Tudi ta je vseboval različno količino ekstrahiranih suhih snovi, ki so se razlikovale tudi po

svoji tendenci po zadrževanju vode.

Pri pripravi liofilizatov so nekateri vzorci vsebovali higroskopne snovi, zaradi katerih so se

dalj časa sušili (kocasta mlečnica, redkvičasta medlenka). Nekateri posušeni ekstrakti so pri

pripravi disperzije bili viskoznejši, vendar brez oborine (korenasta medlenka). Izbrano

gojišče 2 smo vzdrževali na 50°C, ker smo pričakovali, da so naše potencialne insekticidne

učinkovine krajši čas, kolikor je potrebno, da raztopljen vzorec enakomerno zamešamo v

pripravljeno gojišče, dovolj stabilne. Na tej temperaturi je gojišče bilo še vedno dovolj

tekoče, da smo ga lahko odpipetirali v posodice, v katerih smo gojili vinske mušice.

Testirali smo 23 različnih vrst podstavkovnic in sicer začenši z 6% vsebnostjo liofilizata

(preglednice I; V, VI, VII). Podoben pregled insekticidnega učinka so preverili Mier in sod.

(1996) [92], s tem da so testirali nekoliko drugačen nabor posušenih uprašenih gobe. Mi

smo s pripravo ekstrakta izolirali le vodotopne snovi, z dializo pa smo iz njega izločili

substance manjše od 3,5 kDa . Zato rezultatov obeh raziskav ne moremo direktno

primerjati, našli pa smo enak trend pri gobah, ki so bile obdelane pri obeh: količina

posušenega materiala, potrebnega za dosego LD100 je pri meglenki najmanjša, nato ji sledi

vijoličasta kolesnica in zadnje redkvičasta medlenka. Izmed desetih gob, testiranih v obeh

raziskavah, smo v naši opazili insekticidno delovanje pri 6% vsebnosti še pri sivorumeni

mraznici (RS=0,86) in rjavem ježevcu (RS=0,65), vendar ga lahko pripišemo višji

koncentraciji insekticidnih vodotopnih substanc, ki smo jih dobili s postopkom priprave

liofilizata.

Wang in sod. (2002) [77] so testirali insekticidno delovanje vodnih ekstraktov štirinajsith

gob (dve skupni) in določevali LD50 supernatanta, prve oborine in oborine po treh izpiranjih

z destilirano vodo. V njihovih rezultatih je vilojičasta kolesnica bila nekoliko bolj toksična

v primerjavi z meglenko, pri nas pa ravno obratno, vendar bi to lahko pripisali vplivu

mikrookolja ali pa razliki v sestavi gojišča. V vseh primerih je supernatant v primerjavi s

70


prvo oborino v povprečju nosil 85% insekticidnega učinka, kar kaže na vodotopnost

insekticidnih snovi.

Petim liofilizatom od štirinajstih, ki so pri 2% vsebnosti izkazali relativno smrtnost vsaj 0,9,

smo v tretji seriji določili LD50 (preglednica XVII). Mier in sod. [92] so pri ponovitvah

testiranj nekaterih uprašenih gob opazili variabilnost v insekticidnem delovanju tudi za

faktor 3 in več, zato smo v tretji seriji začeli z nižanjem vsebnosti ponovno pri 2%. Najbolj

toksičen je bil liofilizat meglenke oz. poprhnjene livke (preglednici XVI , XVII).

9Presejalno testiranje insekticidnega delovanja inhibitorjev proteaz in

laktozil specifičnih lektinov

Delež proteaz, ki organizmu zagotavljajo esencialne aminokisline, ni zanemarljiv. Rastline

so v obrambne namene razvile nemalo inhibitorjev plenilskih proteaz, izmed katerih smo

izbrali predstavnike inhibitorjev serinski in cisteinskih proteaz. Iz kraljestva gliv smo

skladno z rezultati testiranj liofoliziranih ekstraktov testirali še inhibitorje, izolirane iz

meglenke (preglednici VIII, XVIII).

Cisteinski inhibitorji (PCPI in klitocipin) so bili neučinkoviti, saj ima vinska mušica

pretežno serinske proteaze v svojem prebavnem traktu. Med serinskimi inhibitorji smo

preizkusili 4 različne, od teh je bil bučkin popolnoma neučinkovit, dva (CNSPI iz meglenke

in PSPI iz krompirja) sta v koncentraciji 0,5 mg/ml dosegla približno LD50. V tej

koncentraciji je serinski inhibitor iz krompirja, PI2 dosegel LD100. Iz tega lahko sklepamo,

da so za vinsko mušico (Diptera) bolj škodljivi inhibitroji serinskih proteaz, kar potrjuje

sestavo prebavnih proteaz, hkrati pa smo z različnim insekticidnim učinkom različnih tipov

serinskih inhibitorjev pokazali tudi na specifičnost delovanja proteinskih insekticidov.

PI2 so že testirali na transgeni rastlini iz reda Brassica na modelu Plutella xylostella

(Lepidoptera), kjer je sicer upočasnil rast, a so jo zeljni molji kompenzirali s povečano

konzumacijo, kar je rastlinam še bolj škodovalo. V kolikor sta bila v rastlino vnesena gena

za Bt toksin in PI2, je bil rezultat za rastlino še slabši [93].

V drugi raziskavi so gen za PI2 so vnesli v več vrst riža in po štirih generacijah izolirali

homozigote. V peti generaciji so ponovno testirali odpornost proti plenilskim insektom

(med njimi je najpomembnejši Sesamia inferens), kjer je bila toksičnost riža za škodljivce

celo višja [94].

71


Proteinske inhibitorje proteaz so testirali na številnih žuželkah (redovi Coleoptera,

Lepidoptera, Hemiptera, Orthoptera in Diptera) na umetnih gojiščih, pri nekaterih

transgenih rastlinah pa so se že pred desetimi leti pojavile odporne kulture žuželk [46].

V presejalnem testiranju smo preskusili tudi delno očiščen laktozil lektin (slika 10). Po

učinkovitosti (LD100) se je kosal z najučinkovitejšim rastlinskim inhibitorjem serinskih

proteaz, PI2 iz krompirja.

10Testiranje insekticidnega delovanja različnih lektinov

V testiranju insekticidnega učinka liofiliziranih ekstraktov smo opazili, da se liofilizatom

niža učinkovitost v obliki sigmoidne krivulje v odvisnosti od logaritma vsebnosti. Zato smo

se odločiti v takšnih korakih preveriti insekticidni učinek izoliranih lektinov.

Prve lektine smo izolirali iz ekstrakta meglenke, ki smo ga za presejalno testiranje priravili

z raztopino za ekstrakcijo 1. Ekstrakt smo nanesli na laktozil substituirano sefarozo in jih

eluirali z dvigom pH na 12.

Z naalkaljenjem raztopine za ekstrakcijo smo želeli iz iste količine gobjega tkiva meglenk

sprostiti lektine, vezane na endogene polisaharide, saj ti niso pri tem pH vezani na

komplementarne sladkorje. Elucijski vrh 2 je bil nekoliko višji po nanosu tako

pripravljenega ekstrakta (graf 1, IV.3.3.1), na sliki 7 (IV.3.3.1) pa ni vidnih dodatnih lis pri

vzorcu 3, iz česa sklepamo, da se pri tem pH izolirajo isti lektini, le da v večji količini.

Ekstraktu smo v enem primeru dodali EDTA, v drugem pa dvovalentne ione, saj smo želeli

preveriti, ali naši lektini za vezavo potrebujejo kovinske kofaktorje. Na sliki 8 ne opazimo

nobenih razlik v lisah izoliranih lektinov, iz česa sklepamo, da le-ti ne potrebujejo

kovinskih kofaktorjev. Za metodo izolacije smo izbrali pripravo ekstrakta s pufrom za

ekstrakcijo 2 z dodatkom EDTA.

EDTA bi lahko keliral dvovalentne ione v gojišču ali v prebavilih vinske mušice, saj jih le-

ta potrebuje za sintezo encimov, vendar ga v našem vzorcu ni bilo oziroma je bil v

zanemarljivih koncetracijah, saj smo lektine eluirali z NaOH, eluat pa razsolili.

Delno očiščeni laktozil specifični lektini, testirani hkrati s proteaznimi inhibitorji, so

izkazali LD100 pri ocenjeni koncentraciji 0,5 mg/ml gojišča, kar jih uvrsti med

najučinkovitejše lektine, testirane na modelu vinske mušice. Zato smo pred testiranjem

učinkovitosti preostalih lektinov želeli kvantitaivno določiti koncentracijo lektinov v

72


vzorcih. Z merjenjem A280 smo koncentracijo le ocenili, z metodo BioRad pa nismo dobili

ne ponovljivih ne pričakovanih rezultatov.

Težave bi lahko povzročal v vzorcu prisoten NaOH, s katerim smo lektine eluirali, zato

smo vzorec nevtralizirali z dvema raztopinama: pufrom za nevtralizacijo pH 6,5 in PBS

pH 6,8. V istih raztopinah smo redčili tudi BSA; prav tako smo jih uporabili tudi za slepi

vzorec. Tudi po tem rezultati niso bili zadovoljivi (preglednica XV, IV.3.4.2).

V proizvajalčevih navodilih [95] najdemo preglednico, v kateri se za nekatere proteine

koncentracije določene po Biorad metodi razlikujejo tudi za več kot 300% v primerjavi z

biuretsko metodo oziroma metodo po Lowry-ju. Nekateri proteini sami slabo vežejo barvo

(npr. želatina) in se jih ne more določati po tej metodi. Ne kot zadnje so bile možne tudi

napake pri redčenju vzorca in standarda, vendar smo meritve večkrat ponovili. Izračunane

koncentracije proteinov v nekaterih vzorcih so bile pod mejo detekcije na SDS-PAGE gelu,

barvanem s Coomassie Brilliant Blue barvilom, lise pa so bile na gelu dobro vidne. Za

barvanje SDS-PAGE gela smo uporabili isto barvilo, vendar je bilo za ta namen dodano v

krepko večji količini (gel barvamo v približno 10 ml raztopine barvila Commassie Brilliant

Blue). Za raziskovane lektine ne obstaja standard, s katerim bi eliminirali vsaj nekatere

naštetih težav.

Čeprav je sama metoda po zagotovilih proizvajalca primerljiva z metodo po Lowryju in

biuretsko metodo, nam ni dala ponovljivih rezultatov, niti so koncentracije bile v

pričakovanih razredih. Zato smo pri izračunavanju potrebnih volumnov raztopin lektinov za

pripravo gojišč (preglednica IX, III.3.4.4) upoštevali meritve A340 - 240.

Za izolacijo lektinov iz ekstrakta meglenke smo uporabili štiri različno substituirane

sefaroze za izvedbo afinitetne kromatografije. Z sefrozama, substiruiranima s saharozo in

glukozo, smo dobili po en lektin, laktozil in galaktozil specifični lektini so mešanica treh

proteinov (slika 9, IV.3.1). Čeprav sta dva, ki se pojavljata pri obeh saharidih, po velikost

navidez enaka, ne gre za nespecifično vezavo na sefarozo (ki vsebuje 4% agaroze), ker se

pojavljata le pri sefarozi, substituirani z laktozo oziroma galaktozo in ne pri glukozil ali

saharozil substituirani sefarozi. Za potrditev ali sta enaka ali različna, so potrebni dodatni

testi, med katerimi je najboljša določitev aminokislinkse sekvence in kristalne strukture.

V testiranju insekticidnega učinka lektinov smo uporabili dve različni gojišči, ki sta se v

grobem razlikovali po vsebnosti hranil - gojišče 7 je vsebovalo koruzno moko (III.3.3.1.6 in

73


III.3.3.1.7). Insekticidni učinek pada z logaritmom vsebnosti pri obeh uporabljenih gojiščih,

kot vidimo v grafih 8 in 9 (IV.6), na osnovi katerih smo izračunali LD50.

Preglednica XXI: Primerjava izračunanih LD50 testiranih lektinov v gojiščih 6 in 7 v μg proteina na ml gojišča

laktozil galaktozil saharozil glukozil laktozil 19izračunan LD50, gojišče 6

76 μg/ml 182 μg/ml 10 μg/ml / 44 μg/ml

izračunan LD50, gojišče 7

252 μg/ml 166 μg/ml 1000 μg/ml / 38 μg/ml

faktor razlike 3,32 0,91 100 / 0,86Legenda:

laktozil…laktozil specifični lektini

galaktozil…galaktozil specifični lektini

saharozil…saharozil specifičen lektin

glukozil…glukozil specifičen lektin

laktozil (19)… laktozil specifičen lektin z velikostjo 19 kDa

Saharozil specifični lektini so bili v gojišču 6 najbolj toksični, vendar je ta učinek padel za

faktor 100 v gojišču 7, kar pripisujemo vsebnosti koruzne moke. Razliko smo opazili tudi

pri laktozil specifičnih lektinih, vendar gre tu za faktor 3,32. Za galaktozil specifične

lektine in laktozil specifičen lektin z velikostjo 19 kDa lahko trdimo, da se toksični učinek

ni spremenil.

Paquereau in sod. (2003) [86] so na modelu vinske mušice testirali tri lektine (XCL

-Xerocomus chrysenteron, LOL - Lathyrus ochrus in GNA - Galantus nivalis) na istem

modelu, na gojišču 3. LD50 nativnih lektinov so znašale XCL= 0,40 mg/ml, LOL= 8,5 mg/l

in GNA= 0,87 mg/ml. Rekombinantni XCL je bil za vinsko mušico imel

LD50=0,068 mg/ml. Za drugi testni model, Acyrthosiphon pisum (Hemiptera) se je

rekombinantni XCL izkazal za manj toksičnega kot nativni (rekombinantni

LD50=0,58 mg/ml, nativni LD50=0,23 mg/ml).

Če rezultate primerjamo z našimi, ugotovimo, da so štirje od petih testiranih lektinov

toksični v nižjih koncentracijah na primerjivem gojišču 6, ter trije od petih na gojišču 7

(preglednica XXI). Še več, za laktozil specifičen lektin 19 kDa je ta koncentracija 10 krat

nižja kot za XCL, ne glede na gojišče. Rezultati za rekombinantni XCL nam sugerirajo

testiranje vsaj rekombinantnega laktozil specifičnega lektina 19 kDa, če ne še ostalih,

vsekakor pa ločbo, identifikacijo in testiranje tudi galaktozil specifičnih lektinov in laktozil

specifičnih lektinov z velikostmi 14 kDa in 15 kDa.

74


Gojiščem z dvema različnima vsebnostima lektinov smo dodali še njihove komplementarne

sladkorje, saj so Fournier in sod. [96] opazili, da se lektinu LOL (Lathyrus ochrus lectin),

specifičnem za glukozo, zniža insekticidni učine, če je gojišču dodana glukoza.

Z rezultati testiranj mešanic lektinov in njihovih komplementarnih sladkorjev težko z

gotovostjo trdimo, da se je toksični učinek zaradi zasedbe vezavnih mest lektinov zmanjšal,

razen na primeru saharozil specifičnih lektinov. Namreč ne poznamo konstant vezave

saharidov in lektinov, ki je za nesubstituirane saharide gotovo manjša kot za substituirane

saharide in oligosaharide. Poleg tega ne moremo oceniti ali je do razlik prišlo tudi zaradi

same toskičnosti saharida za modelni organizem (preglednica XXII). Podobno tega niso

mogli oceniti tudi Paquereau in sod. (2003) [86] za XCL, ki je tudi specifičen za laktozo.

Preglednica XXII: Primerjava vpliva vsebnosti različnih saharidov v gojiščih 6 in 7 na število preživelih

mušic; rezultati podani kot št. preživelih mušic ± VR, enačba 3

laktoza galaktoza saharoza glukoza brezKontrola gojišče 6

1,2±1,5 3,6±1,5 4,6±0,5 4,8±1,5 5±2

Kontrola gojišče 7

7,0±1,5 6,8±1,5 7,0±1,0 7,0±1,0 6,8±0,5

Hkrati smo s testiranjem na obeh gojiščih dokazali, da so izolirani lektini iz meglenke

učinkoviti tudi v pogojih, kjer je larvam na razpolago več hranil, v pogojih, ki so bolj

podobni pogojem v naravi in kjer celo ni izraženega toksičnega učinka dodanih saharidov

(preglednica XXII). S testiranjem glukozil specifičnih lektinov, čeprav niso pokazali

toksičnega učinka, smo dokazali, da v vzorcu prisotni ostanki soli uporabljenih pufrov

(NaOH, TRIS/HCl, EDTA) ne vplivajo negativno na razvoj vinske mušice, saj so bili

pridobljeni na enak način kot ostali, število preživelih mušic pa je enako kot v kontroli.

Iz meglenke smo izolirali lektine in inhibitor serinskih proteaz (CnSPI), oboji proteini pa so

v izvedenih testiranjeih insekticidnega delovanja bili učinkoviti. Vsekakor bi bilo smotrno

preveriti, ali imajo kombinacije lektini-CnSPI kumulativni ozirima sinergistični učinek, saj

izhajajo iz istega vira – meglenke. Prav tako bi lahko preizkusili delovanje kombinacije

lektini – PI-2. Za testiranje bi lahko uporabili vinsko mušico ali model iz katerega drugega

reda žuželk (npr. koloradski hrošč – Coleoptera).

75


Mehanizem delovanja inhibitorjev proteaz je precej bolje raziskan kot mehanizem

delovanja lektinov. Tega najpogosteje razlagajo z vezavo na peritrofični matriks v lumnu

prebavil in z interakcijo z glikoproteini celičnih sten epitelija prebavil in vplivom na

absorbcijo hranil in/ali motnjami v delovanju teh celic [97, 98]. Možen je tudi sistemski

učinek, saj so lektine našli v hemolimfi v Malpighijevih tubulih in v maščobnih telescih v

nativni obliki [99]. Identifikacija vezavnega mesta in mehanizma delovanja lahko pretvori

tudi lektine brez insekticidnega učinka v pomembno komponento dostavnega sistema

kakšnga drugega toksina ali pa usmeri raziskave na druga področja uporabe.

Insekticidne lektine lahko apliciramo na rastlino v obliki aerosola, lahko jih vgradimo v

nefitotoksične vehikle in dosežemo sistemsko aplikacijo. Prav tako je genski zapis enega ali

večih lektinov možno vgraditi v ekspresijsko kaseto in z ustreznimi promotorskimi regijami

doseči sintezo lektinov ob napadu škodljivca.

Lektini imajo z zmožnostjo specifične vezave, v svoji stabilnosti na širšem območju pH,

temperaturni stabilnosti in odpornosti proti prebavnim proteazam nekaj prednosti pred

proteinskimi inhibitorji proteaz, vsekakor pa več področij in načinov uporabe. So naslednja

stopnička, ki lahko približa zaščito rastllin k naravi in uporabniku prijaznejšim končnim

izidom. Na gobjih proteinih je narejena le peščica raziskav, kažejo pa na nove razrede in

družine proteinov, ki mogoče skrivajo odgovore na marsikatera vprašanja s področij

fiziologije, patologije in ekologije.

76

Lara Kandić: diplomska naloga VI Sklepi

SKLEPI

Na podlagi zbranih podatkov lahko ugotovimo, da:

1. je za poskuse z vinsko mušico potrebna optimizacija eksperimentalnih pogojev gojenja

kljub stoletnim izkušnjam. Na slabšo viabilnost poleg manipulacije z jajčeci vpliva tudi

vlažnost gojišča in vsebnost hranil.

2. izmed 23 liofiliziranih ekstraktov različnih predstavnikov podstavkovnic, jih 6 (iz petih

različnih redov) na modelu vinske mušice doseže RS>0,85 pri vsebnosti 20 mg/ml

gojišča. Nobena izmed njih ni strupena za človeka, kvečjemu pogojno užitna ali

neužitna. Najbolj toksičen je bil ekstrakt meglenke (Clitocybe nebularis).

3. so za vinsko mušico, ki ima večino prebavnih proteaz serinskega katalitskega tipa,

inhibitorji serinskih proetaz pri vsebnosti 0,5 mg/ml dosegli različne insekticidne

učinke. CMTI ni toksičen, PSPI in CnSPI dosežeta približno RS=0,5, PI-2 pa RS=1,0.

Inhibitorji cisteinskih proteaz niso toksični za modelni insekt.

4. ekstrakt meglenke vsebuje več različno specifičnih lektinov. Izolirani so iz ekstrakta

meglenke pótem štirih afinitetnih kromatografij, gelske filtracije in RP-HPLC. Glukozil

in saharozil specifična lektina sta čista, galaktozil in laktozil specifični lektini pa sta

mešanici treh proteinov. Iz mešanice treh laktozil specifičnih lektinov se na RP-HPLC

loči lektin z velikostjo 19 kDa. Za vezavo ne potrebujejo dvovalentnih kovinskih

kofaktorjev.

5. so lektini dosegli RS=0,5 pri različnih vsebnostih v gojiščih. Glukozil specifični lektini

nimajo insekticidnega učinka. LD50 je bil najnižji za saharozil specifičen lektin v

gojišču z manj hranili (10 μg/ml), stokrat višji pa je bil v gojišču z več hranili. Prav tako

je insekticidni učinek inhibirala gojišču dodana saharoza. To ni veljalo za preostale

lektine, izmed katerih je bil najbolj toksičen laktozil specifičen lektin z velikostjo

19 kDa (LD50=44 μg/ml oz. 38 μg/ml).

77

Lara Kandić: diplomska naloga VII Literatura

Literatura1 http://en.wikipedia.org/wiki/Pesticide, 15.12.20062 http://www.ucmp.berkeley.edu/fungi/fungi.html, 1.12.063 Campbell N. A., Reece J. B.: Biology, sixth edition, 20024 http://www.tolweb.org/Fungi, 1.12.06 5 http://herbarium.usu.edu/fungi/FunFacts/factindx1.htm, 2.12.20066 http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Chytridiomycota, 2.12.20067 http://en.wikipedia.org/wiki/Chytrid, 2.12.20068 http://igitur-archive.library.uu.nl/dissertations/2005-0506-200043/c7.pdf, 3.12.200691 http://www.answers.com/topic/metarhizium-anisopliae, 2.12.200610 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=16506697&

dopt=Abstract, 1.12.200611 Vetter J.: Trypsin inhibitor activity of basidiomycetous mushrooms, European Food Research

and Technology 2000; Vol. 211 (5): 346-34812 Brzin J., Rogelj B., Popovič T., Štrukelj B., Ritonja A.: Clitocypin, a new type of cysteine

proteinase inhibitor from fruit bodies of mushroom Clitocybe nebularis, J Biol Chem 2000,

275: 20104-2010913 www.gobe.si, 21.11.200614 Laessqe T, Del Conte A.: Velika knjiga o gobah, DZS, Ljubljana, 199715 Sage H.J, Vazquez J.J.: Studies on a Hemagglutinin from the Mushroom Agaricus

Campestris, J. Biol Chem 1967, Vol. 242 (1): 123-125

http://www.jbc.org/cgi/reprint/242/1/120, 12.12.200616 Gray A. M., Flatt R.P.: Insulin-releasing and insulin-like activity of Agaricus campestris

(mushroom), Journal of Endocrinology 1998; 157 (1), 259–266

http://joe.endocrinology-journals.org/cgi/content/abstract/157/2/259, 12.12.200617 Jin-Woo Kim, Ick-Dong Yoo, Won-Gon Kim: Free Radical-Scavenging delta-Lactones from

Boletus calopus Planta Med. 2006; Vol. 72(15): 1431-1432.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=17091435&

dopt=Abstract, 12.12.200618 Ribeiro B, Rangel J, Valentao P, Baptista P, Seabra RM, Andrade PB.: Contents of carboxylic

acids and two phenolics and antioxidant activity of dried portuguese wild edible mushrooms ,

J Agric Food Chem. 2006; Vol. 54(22): 8530-8537

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=pubmed, 12.12.2006 19 Geraci C, Piattelli M, Tringali C, Verbist JF, Roussakis C.: Cytotoxic activity of

tetraprenylphenols related to suillin, an antitumor principle from Suillus granulatus, J Nat

Prod. 1992 (12):1772-5

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=pubmed, 12.12.200620 Fujimoto H, Takano Y, Yamazaki M.: Isolation, identification and pharmacological studies on

three toxic metabolites from a mushroom, Hebeloma spoliatum, Chem Pharm Bull (Tokyo).

1992, Vol. 40 (4): 869-72

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=1525943&d

opt=Abstract, 12.12.2006

78

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=pubmed

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=17091435&dopt=Abstract


http://joe.endocrinology-journals.org/cgi/content/abstract/157/2/259

http://www.jbc.org/cgi/reprint/242/1/120

http://www.gobe.si/



http://www.answers.com/topic/metarhizium-anisopliae

http://igitur-archive.library.uu.nl/dissertations/2005-0506-200043/c7.pdf

http://en.wikipedia.org/wiki/Chytrid

http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Chytridiomycota

http://herbarium.usu.edu/fungi/FunFacts/factindx1.htm

http://www.tolweb.org/Fungi

http://www.ucmp.berkeley.edu/fungi/fungi.html

http://en.wikipedia.org/wiki/Pesticide


21 Guillot J, Giollant M, Damez M, Dusser M.: Isolation and characterization of a lectin from the

mushroom, Lactarius deliciosus, J Biochem (Tokyo). 1991; Vol. 109 (6): 840-845;

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=pubmed, 13.12.200622 Giollant M, Guillot J, Damez M, Dusser M, Didier P, Didier E.: Characterization of a Lectin

from Lactarius deterrimus (Research on the Possible Involvement of the Fungal Lectin in

Recognition between Mushroom and Spruce during the Early Stages of Mycorrhizae

Formation). Plant Physiol. 1993; Vol. 101 (2): 513-522

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=pubmed 13.12.200623 Tanaka Y, Kawahara S, Eng AH, Takei A, Ohya N.: Structure of cis-polyisoprene from

Lactarius mushrooms. Acta Biochim Pol. 1994; Vol. 41 (3): 303-309

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=pubmed, 13.12.200624 Bosetti A., Fronza G., Vidari G., Vita-Finzi P.: Norlactarane and lactarane sesquiterpenes from

Lactarius scrobiculatus, Phytochemistry 1989, Vol 28 (5): 1427-1431 25 Lubken T, Schmidt J, Porzel A, Arnold N, Wessjohann L.: Hygrophorones A-G: fungicidal

cyclopentenones from Hygrophorus species (Basidiomycetes) Phytochemistry. 2004;

65(8):1061-71,

www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=15110686&dopt=

Abstract, 13.12.200626 Lee SY, Kim JS, Kim JE, Sapkota K, Shen MH, Kim S, Chun HS, Yoo JC, Choi HS, Kim MK,

Kim SJ.: Purification and characterization of fibrinolytic enzyme from cultured mycelia of

Armillaria mellea. Protein Expr Purif. 2005;43(1):10-7


Abstract, 13.12.200627 Dulger B. , Ergul C. C., Gucin F.: Antimicrobial activity of the macrofungus Lepista nuda

Fitoterapia 2002, Vol 73 (7): 695-697,


Abstract, 14.12.200628 Murcia MA, Martinez-Tome M, Jimenez AM, Vera AM, Honrubia M, Parras P.: Antioxidant

activity of edible fungi (truffles and mushrooms): losses during industrial processing. J Food

Prot. 2002; 65(10):1614-22.


Abstract, 14.12.200629 Mikiashvili N., Elisashvili V., Wasser S. P., Nevo E.: Comparative Study of Lectin Activity of

Higher Basidiomycetes. Int. J. Med. Mushr. 2006, Vol 8: 31-38, http://www.edata-

center.com/journals/708ae68d64b17c52,004dba6c170c81d1,5b86e0892f756e7b.html, 14.12.200630 Comandini O., Haug I, Rinaldi A.C., Kuyper T.W.: Uniting Tricholoma sulphureum and T.

bufonium. Mycol Res. 2004; Vol 08 (10):1162-71.

http://journals.cambridge.org/action/displayAbstract;jsessionid=436704A1601137CE854620E4808

4B748.tomcat1?fromPage=online&aid=249505, 14.12.200631 Lillian Barrosa L., Maria-João Ferreiraa M-J., Bruno Queirósa B., Ferreiraa I.C.F.R., Baptistaa P.:

Total phenols, ascorbic acid, β-carotene and lycopene in Portuguese wild edible mushrooms

79

http://journals.cambridge.org/action/displayAbstract;jsessionid=436704A1601137CE854620E48084B748.tomcat1?fromPage=online&aid=249505

http://journals.cambridge.org/action/displayAbstract;jsessionid=436704A1601137CE854620E48084B748.tomcat1?fromPage=online&aid=249505

http://www.edata-center.com/journals/708ae68d64b17c52,004dba6c170c81d1,5b86e0892f756e7b.html

http://www.edata-center.com/journals/708ae68d64b17c52,004dba6c170c81d1,5b86e0892f756e7b.html













and their antioxidant activities, Food Chemistry 2007; Vol 103 (2): 413-419 32 http://perso.orange.fr/champyves/champignons/fichier_htm/autres/Geastrum_rufescens.html,

7.12.200633 Horejsi V, Kocourek J.: Studies on lectins. XXXVI. Properties of some lectins prepared by

affinity chromatography on O-glycosyl polyacrylamide gels. Biochim Biophys Acta. 1978;

538(2): 299-15,

www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=563738&dopt=A

bstract, 14.12.200634 Tetry A, Sutton E, Moullec J.: Specific anti-A1 phytoagglutinin in fungus Clitocybe nebularis

(Fr.) Quelet. C R Hebd Seances Acad Sci. 1953; 237(23): 1566-1568,


Abstrac, 14.12.200635 Sabotic J, Trcek T, Popovic T, Brzin J.: Basidiomycetes harbour a hidden treasure of

proteolytic diversity. J Biotechnol. 2007, Vol 128(2): 297-30736 http://stockcenter.arl.arizona.edu/index.php?option=com_content&task=view&id=14&Itemid=28,

24.11.200637 http://en.wikipedia.org/wiki/Insect, 23.11.200638 http://www.gea-on.net/clanek.asp?ID=623 30.1.0739 Schneider D.: Using Drosophila as a model insect, Nature 2002, Vol 1: 218-22640 http://en.wikipedia.org/wiki/Drosophila_melanogaster, 23.11.200641 http://animaldiversity.ummz.umich.edu/site/accounts/information/Drosophila_melanogaster.html,

23.11.200642 http://www.anatomy.unimelb.edu.au/researchlabs/whitington/index.html, 23.11.200643 Bochdanovits Z, de Jong G.: Experimental evolution in Drosophila melanogaster: interaction of

temperature and food quality selection regimes. Functional Ecology 2004; Vol. 18, 952–954


dopt=Abstract, 27.11.200644 Reaume C.J., Sokolowski M.B.: The nature of Drosophila melanogaster, Current Biology 2006,

Vol 16: R623-R628

http://www.current-biology.com/content/article/fulltext?uid=PIIS0960982206019099, 23.11.200645 http://www.calorie-count.com/calories/browse/0900.html, 27.11.200646 Jongsma M.A., Bolter C.: The adaptation of insect to plant protease inhibitors, J. Insect.

Physiol. 1997; Vol. 43: 885-89547 http://en.wikipedia.org/wiki/Insecticide, 12.11.200648 http://www.alanwood.net/pesticides/class_insecticides.html, 12.11.200649 http://www.epa.gov/pesticides/biopesticides/, 12.11.200650 http://www.nysaes.cornell.edu/ent/biocontrol/pathogens/bacteria.html, 12.11.200651 R. H. ffrench-Constant, D. J. Bowen.: Novel insecticidal toxins from nematode-symbiotic

bacteria, Cellular and Molecular Life Sciences 2000, Vol 57(5): 828-833

http://www.springerlink.com/content/9atur71aeyt10aun/, 12.11.200652 Carlini C.R., Grossi-de-Sa M.F.: Plant toxic proteins with insecticidal properties. A review on

their potentialities as bioinsecticides. Toxicon 2002; 40:1515-153953 Franco O. J., Rigden D. J., Melo F. R., Grossi-de-Sá M. F.: Plant α-amylase inhibitors and their

interaction with insect α-amylases, Eur. J. Biochem. 2002; 269 (2): 397–412

80

http://www.nysaes.cornell.edu/ent/biocontrol/pathogens/bacteria.html

http://www.epa.gov/pesticides/biopesticides/

http://www.alanwood.net/pesticides/class_insecticides.html

http://en.wikipedia.org/wiki/Insecticide

http://www.calorie-count.com/calories/browse/0900.html

http://www.current-biology.com/content/article/fulltext?uid=PIIS0960982206019099



http://www.anatomy.unimelb.edu.au/researchlabs/whitington/index.html

http://en.wikipedia.org/wiki/Drosophila_melanogaster

http://www.gea-on.net/clanek.asp?ID=623

http://en.wikipedia.org/wiki/Insect

http://stockcenter.arl.arizona.edu/index.php?option=com_content&task=view&id=14&Itemid=28

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=13127230&dopt=Abstrac

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=13127230&dopt=Abstrac



http://perso.orange.fr/champyves/champignons/fichier_htm/autres/Geastrum_rufescens.html


http://content.febsjournal.org/cgi/content/full/269/2/397, 14.1.200754 Rawlings, N.D., Morton, F.R. & Barrett, A.J. (2006) MEROPS: the peptidase database. Nucleic

Acids Res 34, D270-D272 http://merops.sanger.ac.uk/ januar.200755 http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/4/ 14.1.200756 http://www.expasy.org/ 14.1.200757 Ross J, Jiang H, Kanost MR, Wang Y.: Serine proteases and their homologs in the Drosophila

melanogaster genome: an initial analysis of sequence conservation and phylogenetic

relationships. Gene. 2003; Vol. 304: 117-131 58 Lawrence P.K., Koudal K.R.: Plant protease inhibitors in control of phytophagous insects,

Electronic Journal of Biotechnology 2002; Vol 5: 93-109

60 http://www.chem.purdue.edu/LASKOWSKI/#data 18.2.200761 Odani S., Tominaga K., Kondou S., Hori H., Koide T., Hara S., Isemura M., Tsunasawa S.: The

inhibitory properties and primary structure of a novel serine proteinase inhibitor from the

fruiting body of Basidiomycete, Lentinus edodes. Eur J Biochem. 1999; Vol. 262 (3): 915-923.62 Vasconcelos I.M., Oliviera J.T.A: Antinutritional properties of plant lectins, Toxicon 2004; Vol.

44 (4): 385-40363 Perillo N.L:, Marcus M.E., Baum L.G.: Galectins: versatle modulators of cell adhesion, cell

proliferation and cell death. J mol med 1998; Vol 76, (6): 402-412

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=pubmed, 12.1.200764 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=glyco 23.11.200665 http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Gs4_sugar_all.png, 12.1.200766 Kocbek P., Kristl J.: Ciljan vnos učinkovin z uporabo lektinov – korak naprej v razvoju

bioadhezivnih dostavnih sistemov, Farm Vestn 2006; Vol. 57: 162-16867 Zhao C., Sun H., Tong X., Qi-Jun Y.: An antitumour lectin from the edible mushroom

Agrocybe aegerita. Biochem J. 2003; vol. 374(Pt 2): 321–32768 Kosanovic MM, Jankovic MM.: Sialylation and fucosylation of cancer-associated prostate

specific antigen. J Buon. 2005; Vol. 10(2): 247-250

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?DB=pubmed, 14.1.200769 Ytting H., Christensen I.J., Thiel S., Jensenius J.C., Nielsen H.J.: Serum Mannan-Binding Lectin-

Associated Serine Protease 2 Levels in Colorectal Cancer: Relation to Recurrence and

Mortality. Clinical Cancer Research 2005, Vol. 11, 1441-1446

http://clincancerres.aacrjournals.org/cgi/content/full/11/4/1441, 8.1.200770 Ryder S.D., Smith J.A., Rhodes J.M.: Peanut Lectin: A Mitogen for Normal Human Colonic

Epithelium and Human HT29 Colorectal Cancer Cells. Journal of the National Cancer Institute

1992, Vol. 84, (18), 1410-1416

http://jnci.oxfordjournals.org/cgi/content/abstract/84/18/1410?ck=nck, 14.1.200771 Jordinson M., El-Hariry I., Calnan D., Calam J., Pignatellib M.: Vicia faba agglutinin, the lectin

present in broad beans, stimulates differentiation of undifferentiated colon cancer cells. Gut

1999; Vol.44: 709-714

http://gut.bmj.com/cgi/content/full/44/5/709, 14.1.200772 Fritz P, Dippon J, Kierschke T, Siegle I, Mohring A, Moisa A, Murdter TE.: Impact of mistletoe

lectin binding in breast cancer. Anticancer Res. 2004; Vol. 24(2C): 1187-1192

81

http://gut.bmj.com/cgi/content/full/44/5/709

http://jnci.oxfordjournals.org/cgi/content/abstract/84/18/1410?ck=nck

http://clincancerres.aacrjournals.org/cgi/content/full/11/4/1441

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?DB=pubmed

http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Gs4_sugar_all.png

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=glyco


http://www.chem.purdue.edu/LASKOWSKI/#data

http://www.expasy.org/

http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/4/

http://merops.sanger.ac.uk/

http://content.febsjournal.org/cgi/content/full/269/2/397



dopt=Abstract, 14.1.200773 Wang J.H., Kong J., Li W., Molchanova V., Chikalovets I., Belogortseva N., Luk'yanov P., Zheng

Y.T.: A β-galactose-specific lectin isolated from the marine worm Chaetopterus variopedatus

possesses anti-HIV-1 activity. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 2006; Vol 142 (1-2):

111-117 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=pubmed, 14.1.200774 http://www.imperial.ac.uk/research/animallectins, 3.12.200675 http://www.ansci.cornell.edu/plants/toxicagents/lectins/lectins.html, 3.12.200676 Guillot J., Konska G.: Lectins in higher fungi, Biochem Syst Ecol. 1997; 25: 203-23077 Wang M., Triguéros V., Paquereau L., Chavant L., Didier Fournier D.: Proteins as Active

Compounds Involved in Insecticidal Activity of Mushroom Fruitbodies. J. of Econ. Entomol.

2002; Vol. 95(3): 603-60778 http://www.cermav.cnrs.fr/cgi-bin/lectines/list.pl, 3.12.200679 Ban M, Yoon HJ, Demirkan E, Utsumi S, Mikami B, Yagi F.: Structural basis of a fungal

galectin from Agrocybe cylindracea for recognizing sialoconjugate, J. Mol. Biol. 2005; Vol. 351

(4): 695-706 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=pubmed, 7.2.200780 Walser PJ, Haebel PW, Kunzler M, Sargent D, Kues U, Aebi M, Ban N.: Structure and functional

analysis of the fungal galectin CGL2. Structure. 2004; Vol. 12 (4): 689-702.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=pubmed, 27.1.200781 Paaventhan P, Joseph JS, Seow SV, Vaday S, Robinson H, Chua KY, Kolatkar PR.: A 1.7A

structure of Fve, a member of the new fungal immunomodulatory protein family, J. Mol.

Biol., 2003; Vol. 322 (2): 461-470, http://www.medscape.com/medline/abstract/12948495, 7.2.200782 Cioci G, Mitchell EP, Chazalet V, Debray H, Oscarson S, Lahmann M, Gautier C, Breton C, Perez

S, Imberty A.: Beta-propeller crystal structure of Psathyrella velutina lectin: an integrin-like

fungal protein interacting with monosaccharides and calcium. J. Mol. Biol. 2006; Vol. 357 (5):

1575-1591 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=pubmed 7.2.200783 Mancheno JM, Tateno H, Goldstein IJ, Martinez-Ripoll M, Hermoso JA.: Structural analysis of

the Laetiporus sulphureus hemolytic pore-forming lectin in complex with sugars, J. Biol.

Chem. 2005; Vol. 280 (17): 17251-17259

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=pubmed 7.2.200784 Birck C., Damian L., Marty-Detraves C., Lougarre A., Schulze-Briese, C., Koehl P., Fournier D.,

Paquereau L., Samama J-P.: A New Lectin Family with Structure Similarity to Actinoporins

Revealed by the Crystal Structure of Xerocomus chrysenteron Lectin XCL. J. Mol. Biol. 2004;

Vol. 344(5): 1409–1420

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=pubmed, 7.2.200785 Wimmerova M, Mitchell E, Sanchez JF, Gautier C, Imberty A.: Crystal structure of fungal lectin:

six-bladed beta-propeller fold and novel fucose recognition mode for Aleuria aurantia lectin.

J. Biol. Chem. 2003; Vol. 278, 27059-27067

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=pubmed 7.2.200786 Trigueros V., Lougarre A., Ali-Ahmed D., Rahb Y. Guillot J., Chavant L., Fournier D., Paquereau

l.: Xerocomus chrysenteron lectin: identification of a new pesticidal protein, Biochim Biophys

Acta., 2003; Vol. 1621(3): 292-298

82




http://www.medscape.com/medline/abstract/12948495



http://www.cermav.cnrs.fr/cgi-bin/lectines/list.pl

http://www.ansci.cornell.edu/plants/toxicagents/lectins/lectins.html

http://www.imperial.ac.uk/research/animallectins





87 Houston D.R., ShiomiK., Arai N., Mura Satoshi, Peter M.G., Turberg A., Synstad B., Eijsink

V.G.H., van Aalten D.M.F.: High-resolution structures of a chitinase complexed with natural

product cyclopentapeptide inhibitors: mimicry of carbohydrate substrate. Proc Natl Acad Sci

U S A. 2002, Vol.99(14): 9127-32 http://www.pnas.org/cgi/content/full/99/14/9127, 14.1.200788 Krishnamoorthi R., Gong Y.X., Richardson M.: A new protein inhibitor of trypsin and activated

Hageman factor from pumpkin (Cucurbita maxima) seeds. FEBS Lett. 1990; Vol. 273: 163-16789 Bryant J., Green T.R., Gurusaddaiah T., Ryan C.A.: Proteinase inhibitors II from potatoes:

isoaltion, and characterisation of its protomer components, Biochemistray 1976; Vol 15: 3418 -

342490 Brzin J., Meško P., Kregar I.: Potato tubers contain protein inhibitors of cysteine, serine and

aspartatic proteinases. Acta Pharmacologica 1995; Vol. 45: 181-18691 Brzin J., Popovič T., Drobnič-Košorok M., Kotnik M., Turk V.: Inhibitors of cysteine proteinases

from potato. Biological Chamitry Hoppe-Seyler 1988; Vol. 369 (suppl) 233-23892 Mier N, Canete S, Klaebe A, Chavant L, Fournier D.: Insecticidal properties of mushroom and

toadstool carpophores. Phytochemistry. 1996; Vol. 41 (5): 1293-129993 Winterer J, Bergelson J.: Diamondback moth compensatory consumption of protease inhibitor-

transformed plants. Mol Ecol. 2001; Vol. 10(4): 1069-1074

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?DB=pubmed 17.2.200794 Duan X, Li X, Xue Q, Abo-el-Saad M, Xu D, Wu R.: Transgenic rice plants harboring an

introduced potato proteinase inhibitor II gene are insect resistant. Nat Biotechnol. 1996; Vol.

14 (4): 494-498

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=pubmed , 17.2.200795 Instrictions for the BioRad Protein Assay, 1994 BioRad Laboratories,

tudi http://www.fhcrc.org/science/labs/hahn/met hods/biochem_meth/biorad_assay.pdf, 4.11.2006 95 V. Trigueros V., Wang M., Pere D., Paquereau L., Chavant L., Fournier D.: Modulation of a lectin

insecticidal activity by carbohydrates. Arch Insect Biochem Physiol. 2000; Vol. 45 (4): 175-179.


dopt=Abstract, 3.3.200797 Zhu-Salzman K, Shade RE, Koiwa H, Salzman RA, Narasimhan M, Bressan RA, Hasegawa PM,

Murdock LL.: Carbohydrate binding and resistance to proteolysis control insecticidal activity

of Griffonia simplicifolia lectin II. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998; Vol. 95 (25): 15123-15128.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=pubmed 3.3.200798B Gatehouse JA, M R Gatehouse A, Fitches E.: Effects of snowdrop lectin (GNA) delivered via

artificial diet and transgenic plants on the development of tomato moth (Lacanobia oleracea)

larvae in laboratory and glasshouse trials. J Insect Physiol. 1997; Vol. 43 (8): 727-739.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=pubmed 3.3.200799 Fitches E., Woodhouse S.D:, Edwards J.P.. Gatehouse J.A: In vitro and in vivo binding of

snowdrop (Galanthus nivalis agglutinin; GNA) and jackbean (Canavalia ensiformis; Con A)

lectins within tomato moth (Lacanobia oleracea) larvae; mechanisms of insecticidal action. J

Insect Physiol. 2001; Vol. 47 (7): 777-787.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=pubmed 3.3.2007

83






http://www.fhcrc.org/science/labs/hahn/met hods/biochem_meth/biorad_assay.pdf


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?DB=pubmed

http://www.pnas.org/cgi/content/full/99/14/9127


84

Documents

UNIVERZA V LJUBLJANI - gobe.si delovanje proteinov...Vendar se je s tem pri mnogo katerih izgubila odpornost pred naravnimi plenilci in zajedavci. Prvi znani pesticid je bilo elementarno